বর্তমান†ঠিকানা: OX11 0DE, যুক্তরাজ্য, ডায়মন্ড বিল্ডিং, হারওয়েল সায়েন্স অ্যান্ড ইনোভেশন পার্ক, ডায়েটকোট, অক্সফোর্ডশায়ার, যুক্তরাজ্য, ডায়মন্ড লাইট সোর্স কোং, লিমিটেড, ইলেকট্রনিক বায়োলজিক্যাল ইমেজিং সেন্টার।
রিঅ্যাকশন সেন্টার লাইট-হার্ভেস্টিং কমপ্লেক্স ১ (RC-LH1) হলো পার্পল ফটোট্রফিক ব্যাকটেরিয়ার মূল সালোকসংশ্লেষী উপাদান। আমরা রোডোপসিউডোমোনাস প্যালুস্ট্রিস থেকে প্রাপ্ত RC-LH1 কমপ্লেক্সের দুটি ক্রায়ো-ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপি কাঠামো উপস্থাপন করেছি। RC-LH114-W কমপ্লেক্সের ২.৬৫-Å রেজোলিউশনের কাঠামোটিতে RC-কে ঘিরে থাকা ১৪টি সাবইউনিট LH1 লুপ রয়েছে, যা প্রোটিন W দ্বারা বিচ্ছিন্ন। অন্যদিকে, প্রোটিন-W বিহীন কমপ্লেক্সটি RC দ্বারা পরিবেষ্টিত একটি সম্পূর্ণ RC কাঠামো এবং এতে ১৬টি সাবইউনিটের একটি বদ্ধ LH1 লুপ রয়েছে। এই কাঠামোগুলোর তুলনা RC-LH1 কমপ্লেক্সে কুইনোনের গতিশীলতা সম্পর্কে ধারণা দেয়। এর মধ্যে রয়েছে RC-এর QB সাইটে কুইনোন সংযুক্ত হওয়ার সময়কার পূর্বে অনির্ধারিত গঠনগত পরিবর্তন এবং সহায়ক কুইনোন সংযুক্তি স্থানগুলোর অবস্থান, যা কুইনোনকে RC-তে পৌঁছে দিতে সাহায্য করে। W প্রোটিনের অনন্য গঠন LH1 লুপের বন্ধ হওয়াকে প্রতিরোধ করে, যার ফলে কুইনোন/কুইনোলোন বিনিময়কে ত্বরান্বিত করার জন্য একটি চ্যানেল তৈরি হয়।
সালোকসংশ্লেষণ দ্বারা প্রদত্ত শক্তি পৃথিবীর প্রায় সমস্ত জীবনকে টিকিয়ে রাখতে পারে এবং সৌর জৈবপ্রযুক্তিতে এর বিশাল সম্ভাবনা রয়েছে। বিশ্বব্যাপী সালোকসংশ্লেষণকে উৎসাহিত করার পাশাপাশি, বেগুনি আলোকজীবী ব্যাকটেরিয়া বিভিন্ন শক্তি পদ্ধতি এবং বিপাকীয় ক্ষমতাও প্রদর্শন করে। তারা সালোকসংশ্লেষণ এড়িয়ে অন্ধকারে পরজীবী ব্যাকটেরিয়া হিসাবে বৃদ্ধি পেতে পারে, নাইট্রোজেন এবং কার্বন ডাই অক্সাইড সংবন্ধন করতে পারে, হাইড্রোজেন উৎপাদন করতে পারে এবং অ্যারোমেটিক যৌগগুলিকে ভেঙে ফেলতে পারে (১-৩)। এই প্রক্রিয়াগুলির জন্য শক্তি সরবরাহ করতে, আলোকে দ্রুত এবং দক্ষতার সাথে রাসায়নিক শক্তিতে রূপান্তরিত করতে হবে। এই প্রক্রিয়াটি শুরু হয় যখন আলোক-আটকানো অ্যান্টেনা কমপ্লেক্স আলো শোষণ করে এবং আটকে থাকা শক্তিকে বিক্রিয়া কেন্দ্রে (RC) স্থানান্তর করে, যার ফলে চার্জ পৃথকীকরণ শুরু হয় (৪-৭)। বেগুনি আলোকজীবী ব্যাকটেরিয়ার সালোকসংশ্লেষণের মৌলিক একক টাইপ ২ RC দ্বারা গঠিত, যা আলোক-সংগ্রহকারী কমপ্লেক্স ১ (LH1) দ্বারা পরিবেষ্টিত থাকে এবং RC-LH1 কোর কমপ্লেক্স গঠন করে। LH1 বাঁকানো αβ হেটেরোডাইমারের একটি বিন্যাস দ্বারা গঠিত, যার প্রতিটি দুটি ব্যাকটেরিয়াল ক্লোরোফিল (BChl) a অণু এবং এক বা দুটি ক্যারোটিনয়েডকে আবদ্ধ করে (৮-১২)। সবচেয়ে সরল LH1 অ্যান্টেনাটি RC (9-13)-কে একটি বদ্ধ লুপে ঘিরে থাকা 16 বা 17টি αβ হেটেরোডাইমার নিয়ে গঠিত, কিন্তু অন্যান্য কোর কমপ্লেক্সে, ট্রান্সমেমব্রেন পেপটাইডগুলি পার্শ্ববর্তী LH1-এর ধারাবাহিকতায় বাধা দেয়, যার ফলে RC এবং সাইটোক্রোম bc1 কমপ্লেক্সের মধ্যে কুইনোল/কুইনোন ব্যাপন সহজতর হয় (11, 13-15)। বেগুনি আলোকসংশ্লেষী উদ্ভিদ রোডোপসিউডোমোনাস (Rps.) একটি মডেল জীব যা সালোকসংশ্লেষকে সমর্থনকারী শক্তি এবং ইলেকট্রন স্থানান্তর বুঝতে পারে। Rps.-এর প্রথম ক্রিস্টাল কাঠামো। প্যালুস্ট্রিস RC-LH1 কমপ্লেক্সের মডেলটি হল RC, যা 15টি হেটেরোডাইমেরিক LH1 লুপ দ্বারা পরিবেষ্টিত, যা "প্রোটিন W" (14) নামক একটি অজানা প্রোটিন দ্বারা বাধাপ্রাপ্ত। প্রোটিন-W পরবর্তীকালে RPA4402 হিসাবে চিহ্নিত হয়েছিল, যা একটি অচেনা 10.5kDa প্রোটিন যার তিনটি পূর্বাভাসিত ট্রান্সমেমব্রেন হেলিক্স (TMH) রয়েছে (16)। RC-L, M (pufL, pufM) এবং LH1α, β (pufA, pufB) সাবইউনিট এনকোডকারী জিনগুলোর নামকরণের সাথে সামঞ্জস্য রেখে, আমরা প্রোটিন W এনকোডকারী rpa4402 জিনটির নাম পরিবর্তন করে pufW রাখার প্রস্তাব করছি। মজার বিষয় হলো, প্রোটিন-W শুধুমাত্র প্রায় ১০% RC-LH1-এ উপস্থিত থাকে, যা থেকে বোঝা যায় যে Rps. palustris দুটি ভিন্ন RC-LH1 কমপ্লেক্স তৈরি করে। এখানে, আমরা দুটি কোর কমপ্লেক্সের উচ্চ-রেজোলিউশন ক্রায়ো-ইএম (cryo-EM) কাঠামো উপস্থাপন করছি, যার একটিতে প্রোটিন W এবং ১৪টি αβ হেটেরোডাইমার রয়েছে, এবং অন্যটিতে প্রোটিন W নেই এবং একটি বদ্ধ ১৬ হেটেরোডাইমারের LH1 লুপ রয়েছে। আমাদের এই কাঠামোটি Rps. palustris-এর RC-LH1 কমপ্লেক্স সম্পর্কে আমাদের ধারণায় একটি যুগান্তকারী পরিবর্তন এনেছে, কারণ আমরা প্রতিটি ভ্যারিয়েন্টের সমজাতীয় পপুলেশন বিশ্লেষণ করেছি এবং প্রতিটি পেপটাইড, এর সাথে আবদ্ধ রঞ্জক পদার্থ, সম্পর্কিত লিপিড এবং কুইনোনগুলোকে স্পষ্টভাবে চিহ্নিত করার জন্য আমাদের কাছে পর্যাপ্ত রেজোলিউশন রয়েছে। এই গঠনগুলির তুলনা থেকে দেখা যায় যে, তিনটি TMH প্রোটিন-W, যা এখন পর্যন্ত অন্য কোনো RC-LH1 কমপ্লেক্সে পাওয়া যায়নি, কুইনোন/কুইনোলোন বিনিময়কে ত্বরান্বিত করার জন্য একটি কুইনোন চ্যানেল তৈরি করে। বেশ কিছু সংরক্ষিত লিপিড এবং কুইনোন বাইন্ডিং সাইট শনাক্ত করা হয়েছে, এবং আমরা কুইনোন ও RC-এর সংযুক্তির পরে একটি নতুন গঠনগত পরিবর্তন উন্মোচন করেছি, যা অক্সিজেনযুক্ত আলোকজীবী জীবের ফটোসিস্টেম II (PSII) RC-এর জন্য উপযুক্ত হতে পারে। আমাদের এই আবিষ্কার পার্পল আলোকজীবী ব্যাকটেরিয়ার RC-LH1 কোর কমপ্লেক্সে কুইনোন/কুইনোলোন বাইন্ডিং এবং বিনিময়ের গতিবিদ্যা সম্পর্কে নতুন অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে।
Rps. palustris-এ প্রাপ্ত দুটি জটিল যৌগের বিশদ অধ্যয়নের সুবিধার্থে, আমরা জৈব রাসায়নিক পদ্ধতির মাধ্যমে প্রতিটি RC-LH1 পৃথক করি। প্রোটিন W-বিহীন জটিল যৌগটি (এরপরে ΔpufW হিসাবে উল্লেখিত) pufW জিনবিহীন স্ট্রেন থেকে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল (16), এবং শুধুমাত্র একটি RC-LH1 জটিল যৌগ তৈরি করা যেতে পারে। প্রোটিন W-যুক্ত জটিল যৌগটি একটি স্ট্রেন দ্বারা উৎপাদিত হয়। এই স্ট্রেনের প্রোটিন W-কে এর C-টার্মিনাসে একটি 10x His ট্যাগ দিয়ে পরিবর্তিত করা হয়, যাতে প্রোটিন W-যুক্ত জটিল যৌগটি ধাতু স্থিরকরণের মাধ্যমে বেশিরভাগ প্রোটিন W-বিহীন জটিল যৌগের সাথে কার্যকরভাবে সংযুক্ত হতে পারে। জটিল যৌগটি অ্যাফিনিটি ক্রোমাটোগ্রাফি (IMAC) দ্বারা কার্যকরভাবে পৃথক করা হয় (16)।
চিত্র ১-এ যেমন দেখানো হয়েছে, উভয় কমপ্লেক্সেই একটি LH1 অ্যান্টেনা দ্বারা পরিবেষ্টিত তিনটি সাব-ইউনিট RC (RC-L, RC-M এবং RC-H) রয়েছে। প্রোটিন-W বিহীন কমপ্লেক্সটির ২.৮০-Å কাঠামোতে ১৬টি αβ হেটেরোডাইমার দেখা যায়, যা RC-কে সম্পূর্ণরূপে ঘিরে একটি বদ্ধ LH1 লুপ গঠন করে; এটিকে পরবর্তীতে RC-LH116 কমপ্লেক্স হিসাবে উল্লেখ করা হবে। প্রোটিন-W যুক্ত কমপ্লেক্সটির ২.৬৫Å কাঠামোতে একটি ১৪-হেটেরোডাইমার LH1 রয়েছে যা প্রোটিন-W দ্বারা বিচ্ছিন্ন; এটিকে পরবর্তীতে RC-LH114-W হিসাবে উল্লেখ করা হবে।
(A এবং B) যৌগটির পৃষ্ঠীয় উপস্থাপনা। (C এবং D) দণ্ডাকারে প্রকাশিত সংযুক্ত রঞ্জক পদার্থ। (E এবং F) সাইটোপ্লাজমিক পৃষ্ঠ থেকে পর্যবেক্ষণ করা জটিল যৌগগুলিতে পেপটাইড এবং LH1 সাবইউনিটগুলিকে কার্টুনের মাধ্যমে দেখানো হয়েছে, এবং প্রোটিন-W ফাঁক থেকে ঘড়ির কাঁটার দিকে সংখ্যায়িত করা হয়েছে [Rba সংখ্যায়নের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। স্ফেরয়েডস জটিল (13)]। LH1-α এর জন্য, প্রোটিন সাবইউনিটের রঙ হলুদ; LH1-β এর ​​জন্য, প্রোটিন সাবইউনিটের রঙ নীল; প্রোটিন-W এর জন্য, প্রোটিনটি লাল; RC-H এর জন্য, এটি সায়ান; RC-L এর জন্য, এটি কমলা; RC-M এর জন্য, ম্যাজেন্টা। সহ-উপাদানগুলিকে দণ্ডাকারে দেখানো হয়েছে, সবুজ রঙ BChl এবং BPh a অণুগুলিকে, বেগুনি রঙ ক্যারোটিনয়েডগুলিকে, এবং হলুদ রঙ UQ10 অণুগুলিকে নির্দেশ করে। (G এবং H) RC-LH114-W জটিল (G) এবং RC-LH116 জটিল (H)-এর সমতুল্য অঞ্চলে প্রোটিন-W ফাঁকের বিবর্ধিত দৃশ্য। সহ-উপাদানসমূহকে স্থান পূরণকারী হিসেবে দেখানো হয়েছে, চিলেটেড কুইনোনকে নীল রঙে দেখানো হয়েছে। (G)-তে প্রোটিন-W ফাঁকটিকে একটি নীল ড্যাশযুক্ত রেখা দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছে, এবং (H)-তে LH116 বলয়ে কুইনোন/কুইনোললের বিস্তারের ছোট ছিদ্রগুলিকে একটি কালো ড্যাশযুক্ত রেখা দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছে।
চিত্র ১ (A এবং B)-তে RC-কে LH1αβ হেটেরোডাইমারের খোলা বা বন্ধ বিন্যাস দ্বারা পরিবেষ্টিত দেখানো হয়েছে, যার প্রতিটি দুটি BChl এবং একটি ক্যারোটিনয়েডকে আবদ্ধ করে (চিত্র ১, C এবং D)। পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে Rps হলো LH1 কমপ্লেক্স। স্পিরুলিনা জ্যান্থিনের জৈব সংশ্লেষণ পথে, এই প্রজাতিগুলিতে ক্যারোটিনয়েডের মিশ্র জনসংখ্যা থাকে (17)। যাইহোক, স্পাইরোপাইরোক্সান্থিন হলো প্রভাবশালী ক্যারোটিনয়েড এবং এর ঘনত্ব সন্তোষজনক। তাই, আমরা সমস্ত LH1 বাইন্ডিং সাইটে স্পাইরোক্সান্থিনকে মডেল করার সিদ্ধান্ত নিয়েছি। আলফা এবং বিটা পলিপেপটাইডগুলি হলো ছোট ঝিল্লি বাইরের অঞ্চল সহ একক TMH (চিত্র ১, A, B, E, এবং F)। যদিও C-টার্মিনাসে 17 অবশিষ্টাংশের ঘনত্ব পর্যবেক্ষণ করা যায়নি, উভয় কমপ্লেক্সেই আলফা পলিপেপটাইডটি Met1 থেকে Ala46 পর্যন্ত বিভক্ত ছিল। RC-LH116-এ β পলিপেপটাইড Gly4 থেকে Tyr52 পর্যন্ত এবং RC-LH114-W-তে Ser5 থেকে Tyr52 পর্যন্ত হ্রাস পেয়েছিল। ৩ বা ৪টি N-টার্মিনাল অথবা ১৩টি C-টার্মিনাল রেসিডিউ-এর কোনো ঘনত্ব পরিলক্ষিত হয়নি (চিত্র S1)। ওয়াইল্ড-টাইপ স্ট্রেইন থেকে প্রস্তুত মিশ্র RC-LH1 কমপ্লেক্সের ভর বর্ণালিবীক্ষণ বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে অনুপস্থিত অঞ্চলটি এই পেপটাইডগুলির হেটেরোলোগাস ক্লিভেজের ফল (চিত্র S1 এবং S2)। α-Met1-এর N-টার্মিনাল ফর্মাইলেশনও পরিলক্ষিত হয়েছিল (f)। বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে α-পেপটাইডটি fMet1 থেকে Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 পর্যন্ত রেসিডিউ দ্বারা গঠিত এবং β-পেপটাইডটি Ser2 থেকে Ala53 পর্যন্ত রেসিডিউ দ্বারা গঠিত, যা নিম্ন-তাপমাত্রার EM ঘনত্ব মানচিত্রের সাথে ভালোভাবে মিলে যায়।
α-His29 এবং β-His36 এর সমন্বয়ের ফলে BChls মুখোমুখি হয়; প্রতিটি αβ হেটেরোডাইমার তার প্রতিবেশীদের সাথে একত্রিত হয়ে RC-এর চারপাশে একটি খোলা লুপ (RC-LH114-W) বা একটি বন্ধ লুপ (RC-LH116) গঠন করে যা এক্সাইটন কাপলড পিগমেন্ট অ্যারে (চিত্র 1, C এবং D)। RC-LH114-W এর 877 nm ব্যান্ডের তুলনায়, RC-LH116 এর 880 nm শোষণ রেড শিফট 3 nm (চিত্র 2A)। যাইহোক, সার্কুলার ডাইক্রোইজম স্পেকট্রাম প্রায় একই (চিত্র 2B), যা নির্দেশ করে যে খোলা এবং বন্ধ লুপের মধ্যে স্পষ্ট পার্থক্য থাকলেও, BChls এর স্থানীয় পরিবেশ খুব একই রকম। শোষণ রেডশিফট বন্ধ লুপে হ্রাসপ্রাপ্ত তাপীয় গতি এবং বর্ধিত স্থিতিশীলতা (18, 19), বন্ধ লুপের কারণে পিগমেন্ট কাপলিং-এর পরিবর্তন (20, 21), অথবা এই দুটি প্রভাবের সংমিশ্রণের (11) ফলাফল হতে পারে।
(A) অতিবেগুনি/দৃশ্যমান/নিকট-অবলোহিত শোষণ বর্ণালী, যার শীর্ষবিন্দুগুলি তাদের সংশ্লিষ্ট রঞ্জক পদার্থ দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছে এবং ৭৭৫ nm-এ BPh শীর্ষবিন্দুর সাপেক্ষে স্বাভাবিক করা হয়েছে। (B) বৃত্তাকার ডাইক্রোইজম বর্ণালী যা ৮০৫ nm-এ BChl শোষণের সাপেক্ষে স্বাভাবিক করা হয়েছে। (C এবং D) RC-LH114-W জটিল (C) এবং RC-LH116 জটিল (D)-এর সময়-ভিত্তিক শোষণ বর্ণালী থেকে নির্বাচিত ΔA বর্ণালী। আরও ভাল তুলনার জন্য, সমস্ত বর্ণালী ০.২ ps-এ −A-এর ∆A-এর সাপেক্ষে স্বাভাবিক করা হয়েছে। (E) UQ2-এর বিভিন্ন ঘনত্বের উপস্থিতিতে বিকিরণের পরে সাইটোক্রোম c2 জারণের হার (কাঁচা তথ্যের জন্য চিত্র S8 দেখুন)। (F) কম, মাঝারি বা উচ্চ তীব্রতার আলোতে (যথাক্রমে ১০, ৩০ বা ৩০০μMm-2 s-1) বর্ধিত কোষগুলিতে, বিশুদ্ধ জটিল এবং পৃথক ঝিল্লিতে প্রোটিন W এবং RC-L সাবইউনিটের অনুপাত। এসডিএস-পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস এবং ইমিউনোঅ্যাসে-এর মাধ্যমে প্রোটিনের মাত্রা নির্ণয় করুন (কাঁচা তথ্যের জন্য চিত্র S9 দেখুন)। বিশুদ্ধ RC-LH114-W কমপ্লেক্সের সাপেক্ষে অনুপাতটি নির্ণয় করুন। কমপ্লেক্সটির RC-L এবং প্রোটিন-W-এর স্টয়কিওমেট্রিক অনুপাত হলো ১:১।
RC-LH114-W-এর বিকৃত αβ14 লুপের ১ নং অবস্থানে থাকা BChl-গুলো (চিত্র ১, A, C, এবং E) RC-LH116-এর সমতুল্য BChl-গুলোর (চিত্র ১, B, D, এবং F, এবং চিত্র S3) তুলনায় RC-এর প্রাথমিক দাতা (P)-এর ৬.৮Å বেশি নিকটবর্তী; তবে, দুটি কমপ্লেক্সের ক্ষণস্থায়ী শোষণ গতিবিদ্যা দেখায় যে RC-LH114-W এবং RC-LH116-এর জন্য, LH1 থেকে RC-তে উত্তেজনা শক্তি স্থানান্তরের সময় ধ্রুবক যথাক্রমে ৪০ ± ৪ এবং ৪৪ ± ৩ পিকোসেকেন্ড (চিত্র ২, C এবং D, চিত্র S4 এবং সারণি S2)। RC-এর অভ্যন্তরে ইলেকট্রন স্থানান্তরেও কোনো উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নেই (চিত্র S5 এবং সম্পর্কিত পরিপূরক পাঠ্য)। আমরা ধারণা করি যে LH1 এবং RC-P-এর মধ্যে শক্তি স্থানান্তর সময়ের এই ঘনিষ্ঠ মিলের কারণ হলো দুটি LH1 লুপের বেশিরভাগ BChl-এর দূরত্ব, কোণ এবং বিভব শক্তির সাদৃশ্য। মনে হচ্ছে যে, সর্বনিম্ন দূরত্বে পৌঁছানোর জন্য LH1 শক্তি বিন্যাস অন্বেষণ করা, অ-সর্বোত্তম স্থান থেকে RC-তে সরাসরি শক্তি স্থানান্তরের চেয়ে দ্রুততর নয়। RC-LH114-W-এর মুক্ত-লুপ LH1 লুপটি কাঠামোগত বিশ্লেষণের জন্য নিম্ন তাপমাত্রার পরিস্থিতিতে নগণ্য তাপীয় গতির মধ্য দিয়েও যেতে পারে, এবং RC 1-এর অবস্থানে βBChls-এর রঞ্জন দূরত্ব থেকে কক্ষ তাপমাত্রায় একটি দীর্ঘতর αβ14 রিং কনফরমেশন দেখা যায়।
RC-LH116 কমপ্লেক্সটিতে 32টি BChl এবং 16টি ক্যারোটিনয়েড রয়েছে, এবং এর সামগ্রিক বিন্যাস Thermochromatium (Tch.) pidpidum [প্রোটিন ডেটা ব্যাংক (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 স্ট্রেইন (PDB ID 7C9R) (12) এবং সবুজ শৈবাল (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) থেকে প্রাপ্ত বিন্যাসের মতোই। অ্যালাইনমেন্টের পরে, αβ হেটেরোডাইমারগুলির অবস্থানে কেবল সামান্য বিচ্যুতি লক্ষ্য করা গেছে, বিশেষ করে 1-5, 15, এবং 16 (চিত্র S6)। প্রোটিন-W এর উপস্থিতি LH1 এর গঠনের উপর একটি উল্লেখযোগ্য প্রভাব ফেলে। এর তিনটি TMH ছোট লুপ দ্বারা সংযুক্ত, যার N-টার্মিনাল কমপ্লেক্সের লুমেন দিকে এবং C-টার্মিনাল সাইটোপ্লাজমিক দিকে অবস্থিত (চিত্র 1A এবং 3, A থেকে D)। প্রোটিন-W মূলত হাইড্রোফোবিক (চিত্র 3B), এবং TMH2 ও TMH3, LH1αβ-14-এর সাথে মিথস্ক্রিয়া করে একটি ট্রান্সমেমব্রেন পৃষ্ঠ তৈরি করে (চিত্র 3, B এবং E থেকে G)। এই ইন্টারফেসটি ট্রান্সমেমব্রেন অঞ্চলে প্রধানত Phe, Leu এবং Val রেসিডিউ দ্বারা গঠিত। এই রেসিডিউগুলো হাইড্রোফোবিক অ্যামিনো অ্যাসিড এবং αβ-14 পিগমেন্টের সাথে স্তূপীকৃত থাকে। কিছু পোলার রেসিডিউও এই মিথস্ক্রিয়ায় অবদান রাখে, যার মধ্যে কমপ্লেক্স ক্যাভিটির পৃষ্ঠে W-Thr68 এবং β-Trp42-এর মধ্যেকার হাইড্রোজেন বন্ধন অন্যতম (চিত্র 3, F এবং G)। সাইটোপ্লাজমের পৃষ্ঠে, Gln34, αβ-14 ক্যারোটিনয়েডের কিটো গ্রুপের সংলগ্ন থাকে। এছাড়াও, n-ডোডেসিল β-d-মাল্টোসাইড (β-DDM) অণুটি শনাক্ত করা হয়েছে, এবং এর হাইড্রোফোবিক লেজটি প্রোটিন-W এবং αβ-14-এর মধ্যবর্তী ইন্টারফেস পর্যন্ত প্রসারিত, এবং লিপিড লেজটি সম্ভবত দেহের অভ্যন্তরে অবস্থিত। আমরা আরও লক্ষ্য করেছি যে প্রোটিন W এবং RCH-এর C-টার্মিনাল রেজোলিউশন অঞ্চলগুলো খুব কাছাকাছি, কিন্তু নির্দিষ্ট মিথস্ক্রিয়া গঠনের আওতার বাইরে (চিত্র ১, A এবং E)। তবে, এই দুটি প্রোটিনের অমীমাংসিত C-টার্মিনাল অ্যামিনো অ্যাসিডগুলোর মধ্যে মিথস্ক্রিয়া থাকতে পারে, যা RC-LH114-W কমপ্লেক্সটির সমাবেশের সময় প্রোটিন-W-কে অন্তর্ভুক্ত করার একটি প্রক্রিয়া প্রদান করতে পারে।
(A) প্রোটিন-W, যা কার্টুন আকারে LH1αβ14-এর সাথে ইন্টারফেসের মুখোমুখি থাকে, তার একটি দণ্ডাকৃতির পার্শ্ব-শৃঙ্খল (লাল) রয়েছে, যা স্থিরবৈদ্যুতিক বিভব ডায়াগ্রামের (0.13 কন্ট্যুর লেভেল সহ স্বচ্ছ ধূসর পৃষ্ঠ) একটি অংশে প্রদর্শিত হয়েছে। (B) প্রোটিন-W-কে একটি হাইড্রোফোবিক রঙিন পৃষ্ঠ দ্বারা উপস্থাপন করা হয়েছে। পোলার এবং চার্জিত অঞ্চলগুলিকে সায়ান রঙে, হাইড্রোফোবিক অঞ্চলগুলিকে সাদা রঙে এবং তীব্র হাইড্রোফোবিক অঞ্চলগুলিকে কমলা রঙে দেখানো হয়েছে। (C এবং D) প্রোটিন-W-কে কার্টুন আকারে উপস্থাপন করা হয়েছে, এর অভিমুখ (A)-এর মতোই (C), এবং এটিকে 180° ঘোরানো হয়েছে (D)। সিকোয়েন্সে অবস্থান অনুসারে, শনাক্তযোগ্য রেসিডিউগুলি একটি রংধনু রঙের স্কিম গ্রহণ করে, যেখানে N-টার্মিনাল নীল এবং C-টার্মিনাল লাল। (E) প্রোটিন-W-কে (A)-এর মতোই দেখানো হয়েছে, এবং প্রোটিন-W:LH1-এর ইন্টারফেসের রেসিডিউগুলিকে সংযুক্ত চিহ্নসহ দণ্ড দ্বারা উপস্থাপন করা হয়েছে। (F) কার্টুন উপস্থাপনায় প্রোটিন-W-কে (E) এবং LH1αβ14-এর সাপেক্ষে ৯০° ঘোরানো হয়েছে, এবং বার উপস্থাপনায় ইন্টারফেস রেসিডিউগুলোর সাপেক্ষে ঘোরানো হয়েছে। বিটা পলিপেপটাইড থেকে ঝুলে থাকা রেসিডিউগুলোকে চিহ্নিত করা হয়েছে। কোফ্যাক্টরটিকে চিত্র ১-এর রঙের সাথে মিলিয়ে একটি বার হিসাবে দেখানো হয়েছে, বিয়োজিত β-DDM-কে ধূসর রঙে এবং অক্সিজেনকে লাল রঙে দেখানো হয়েছে। (G) (F)-এর দৃশ্যটিকে ১৮০° ঘোরানো হয়েছে, যেখানে চিহ্নিত আলফা পলিপেপটাইডের প্রধান রেসিডিউগুলো দেখানো হয়েছে।
প্রোটিন-W একটি αβ হেটেরোডাইমারকে (চিত্র 1F-এর ১৫তমটি) প্রতিস্থাপন করে, যার ফলে লুপ বন্ধ হওয়া প্রতিরোধ হয় এবং প্রথম তিনটি αβ হেটেরোডাইমার হেলে যায়। এটি পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল যে ফিল্ম নর্মালের সাপেক্ষে প্রথম αβ-1 হেটেরোডাইমারের সর্বোচ্চ হেলানো কোণ ছিল ২৫° থেকে ২৯° (চিত্র 1, A এবং E), যা RC A শার্প কনট্রাস্ট-LH116-এ αβ-1-এর ২° থেকে ৮° হেলানোর ফলে গঠিত হয়েছিল (চিত্র 1, B এবং F)। দ্বিতীয় এবং তৃতীয় হেটেরোডাইমার দুটি যথাক্রমে ১২° থেকে ২২° এবং ৫° থেকে ১০° কোণে হেলে আছে। RC-এর স্থানিক প্রতিবন্ধকতার কারণে, αβ-1-এর হেলানো অবস্থায় αβ-এর দ্বিতীয় জোড়াটি (যা চিত্র 1F-এর ১৬তম αβ-এর অনুরূপ) অন্তর্ভুক্ত হয় না, ফলে LH1 রিং-এ একটি স্পষ্ট ফাঁক তৈরি হয় (চিত্র 1, A এবং E)। দুটি αβ হেটেরোডাইমারের অনুপস্থিতি এবং এর সাথে চারটি BChl ও দুটি ক্যারোটিনয়েডের বিলুপ্তির কারণে, কোনো ক্যারোটিনয়েডই মোচড়ানো αβ-1 সাবইউনিটের সাথে আবদ্ধ হয় না, যার ফলে LH114-W রিং-টিতে ১৩টি ক্যারোটিনয়েড এবং ২৮টি BChl থাকে। αβ1 থেকে 7 অঞ্চলের দুটি কমপ্লেক্সের স্থানীয় রেজোলিউশনের অনুমান LH1 লুপের বাকি অংশের তুলনায় কম, যা RC QB সাইটের সংলগ্ন LH1 সাবইউনিটের সহজাত নমনীয়তাকে প্রতিফলিত করতে পারে (চিত্র 4)।
RC-LH114-W (A এবং B) এবং RC-LH116 (C এবং D)-এর ছবিগুলো চিত্র ১-এর একই টপ ভিউ/সাইড ভিউ (A এবং B) (A এবং C) এবং ক্যাভিটি সারফেস (B এবং D) থেকে দেখানো হয়েছে। রঙিন কীগুলো ডানদিকে দেখানো হয়েছে।
1:14 এর স্টোইকিওমেট্রিক অনুপাত সহ একমাত্র অন্য বৈশিষ্ট্যপূর্ণ কোর কমপ্লেক্স হল রোডোকক্কাস স্ফেরয়েডস (Rba.) RC-LH1-PufX ডাইমার (13)। যাইহোক, প্রোটিন W এবং PufX এর মধ্যে কোনও সুস্পষ্ট হোমোলজি নেই, এবং তাদের নিজ নিজ LH1 কাঠামোর উপর উল্লেখযোগ্য প্রভাব ফেলে। PufX হল একটি একক TMH যার একটি N-টার্মিনাল সাইটোপ্লাজমিক ডোমেন রয়েছে যা Rps. palustris LH116αβ-16 এর অনুরূপ অবস্থানে RC-H সাবইউনিটের (13) সাইটোপ্লাজমিক দিকের সাথে ইন্টারঅ্যাক্ট করে। PufX RC-LH1 এবং সাইটোক্রোম bcl কমপ্লেক্সের মধ্যে কুইনোন/কুইনোলোন বিনিময়ের জন্য একটি চ্যানেল তৈরি করে এবং সমস্ত Rba. স্ফেরয়েডস কোর কমপ্লেক্সে উপস্থিত থাকে (13)। যদিও মনোমার-মনোমার ইন্টারফেস Rba. তে আছে। স্ফেরয়েডস RC-LH1-PufX ডাইমারটি RC-LH114-W-তে প্রোটিন W-এর বাইন্ডিং অবস্থানে অবস্থিত, এবং PufX ও প্রোটিন-W দ্বারা সৃষ্ট ফাঁকটি একটি সমতুল্য অবস্থানে রয়েছে (চিত্র S7A)। RC-LH114-W-এর ফাঁকটি সিউডোমোনাস রোসিয়া LH1-এর কাল্পনিক কুইনোন চ্যানেলের (8) সাথেও সারিবদ্ধ, যা প্রোটিন W বা PufX-এর সাথে সম্পর্কিত নয় এমন পেপটাইড দ্বারা গঠিত (চিত্র S7B)। এছাড়াও, একটি γ সাবইউনিট বাদ দিয়ে গঠিত Blc. দ্য এমারাল্ড গ্রিন LH1-এর (7) কুইনোন চ্যানেলটি একটি অনুরূপ অবস্থানে অবস্থিত (চিত্র S7C)। যদিও বিভিন্ন প্রোটিন দ্বারা মধ্যস্থতা করা হয়েছে, RC-LH1 কমপ্লেক্সে একটি সাধারণ অবস্থানে এই কুইনোন/কুইনোলল চ্যানেলগুলির উপস্থিতি কনভারজেন্ট ইভোলিউশনের একটি উদাহরণ বলে মনে হয়, যা ইঙ্গিত দেয় যে প্রোটিন W দ্বারা সৃষ্ট ফাঁকটি একটি কুইনোন চ্যানেল হিসাবে কাজ করতে পারে।
LH114-W লুপের ফাঁকটি প্রোটিনের মতো প্রোটিন ছিদ্রের মাধ্যমে দুটি ডোমেনকে সংযুক্ত করার পরিবর্তে, RC-LH114-W জটিলটির অভ্যন্তরীণ স্থান এবং মূল ঝিল্লির মধ্যে একটি অবিচ্ছিন্ন ঝিল্লি অঞ্চল গঠনের সুযোগ করে দেয় (চিত্র 1G)। RC-LH116 জটিলটি একটি বন্ধ Tch. সূঁচের মতো জটিলের (22) অনুরূপ (চিত্র 1H)। যেহেতু ঝিল্লির মধ্য দিয়ে কুইনোনের ব্যাপন সংকীর্ণ প্রোটিন চ্যানেলের মধ্য দিয়ে ব্যাপনের চেয়ে দ্রুততর, তাই খোলা LH114-W লুপটি বন্ধ LH116 লুপের চেয়ে দ্রুততর RC টার্নওভারের সুযোগ করে দিতে পারে এবং RC-তে কুইনোনের ব্যাপন আরও সীমাবদ্ধ হতে পারে। প্রোটিন W RC-এর মাধ্যমে কুইনোনের রূপান্তরকে প্রভাবিত করে কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য, আমরা একটি নির্দিষ্ট ঘনত্বের ইউবিকুইনোন 2 (UQ2) (একটি ছোট আইসোপ্রিন লেজ সহ প্রাকৃতিক UQ10-এর একটি অ্যানালগ)-এর উপর একটি সাইটোক্রোম জারণ পরীক্ষা করেছি (চিত্র 2E)। যদিও চিলেটেড কুইনোনের উপস্থিতি আপাত মাইকেলিস ধ্রুবকের সঠিক নির্ধারণে বাধা দেয় (RC-LH114-W এবং RC-LH116 যথাক্রমে 0.2±0.1μM এবং 0.5±0.2μM-এর জন্য উপযুক্ত), RC-LH114-W-এর সর্বোচ্চ হার (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) থেকে 28±5% বেশি।
আমরা প্রাথমিকভাবে অনুমান করেছিলাম যে প্রোটিন-W কোর কমপ্লেক্সের প্রায় 10% অংশে উপস্থিত থাকে (16); এখানে, কম-আলো, মাঝারি-আলো এবং উচ্চ-আলোর বৃদ্ধি কোষগুলির উপস্থিতির হার যথাক্রমে 15±0.6%, 11±1% এবং 0.9±0.5% (চিত্র 2F)। ভর বর্ণালিবীক্ষণের পরিমাণগত তুলনা দেখিয়েছে যে হিস্টিডিন ট্যাগ যোগ করার ফলে ওয়াইল্ড-টাইপ স্ট্রেনের তুলনায় প্রোটিন-W এর আপেক্ষিক প্রাচুর্য হ্রাস পায়নি (P = 0.59), তাই এই মাত্রাগুলি পরিবর্তিত প্রোটিন-W এর কোনো কৃত্রিম ফলাফল নয় (চিত্র S10)। যাইহোক, RC-LH1 কমপ্লেক্সে প্রোটিন-W এর এই কম উপস্থিতি কিছু RC-কে ত্বরান্বিত হারে ফ্লিপ করতে সাহায্য করতে পারে, যার ফলে RC-LH116 কমপ্লেক্সে ধীর কুইনোন/কুইনোলোন বিনিময় প্রশমিত হয়। আমরা লক্ষ্য করেছি যে উচ্চ আলো দখলের হার সাম্প্রতিক ট্রান্সক্রিপ্টোমিক্স ডেটার সাথে অসামঞ্জস্যপূর্ণ, যা নির্দেশ করে যে শক্তিশালী আলোর অধীনে pufW জিনের অভিব্যক্তি বৃদ্ধি পায় (চিত্র S11) (23)। pufW ট্রান্সক্রিপশন এবং RC-LH1 জটিলে প্রোটিন-W অন্তর্ভুক্তির মধ্যে পার্থক্য বিভ্রান্তিকর এবং এটি প্রোটিনের জটিল নিয়ন্ত্রণকে প্রতিফলিত করতে পারে।
RC-LH114-W-তে ৬টি কার্ডিওলিপিন (CDL), ৭টি ফসফ্যাটিডাইলকোলিন (POPC), ১টি ফসফ্যাটিডাইলগ্লিসারল (POPG) এবং ২৯টি β-DDM অণুকে বরাদ্দ ও মডেল করা হয়েছে। এর মধ্যে রয়েছে ৬টি CDL, ২৪টি POPC, ২টি POPG এবং ১২টি βDDM। RC-LH116 (চিত্র ৫, A এবং B)। এই দুটি কাঠামোতে, CDL প্রায় সম্পূর্ণরূপে কমপ্লেক্সটির সাইটোপ্লাজমিক দিকে অবস্থিত, যেখানে POPC, POPG এবং β-DDM প্রধানত লুমিনাল দিকে অবস্থিত। RC-LH114-W কমপ্লেক্সের αβ-1 থেকে αβ-6 অঞ্চলে দুটি লিপিড এবং ডিটারজেন্ট অণু বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল (চিত্র 5A), এবং RC-LH116-এর সমতুল্য অঞ্চলে পাঁচটি বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল (চিত্র 5B)। জটিলটির অপর দিকে আরও লিপিড পাওয়া গেছে, প্রধানত CDL, যা RC এবং αβ-7 থেকে αβ-13 এর মধ্যে জমা হয়েছে (চিত্র 5, A এবং B)। অন্যান্য গঠনগতভাবে নির্ধারিত লিপিড এবং ডিটারজেন্ট LH1 রিং-এর বাইরে অবস্থিত, এবং সুস্পষ্টভাবে নির্ধারিত অ্যাসাইল চেইন LH1 সাবইউনিটগুলির মধ্যে প্রসারিত, যা RC-LH114-W-তে সাময়িকভাবে β-DDM হিসাবে চিহ্নিত এবং RC-তে β-DDM এবং POPC-LH116-এর মিশ্রণ হিসাবে সংজ্ঞায়িত। আমাদের গঠনে কিলেটিং লিপিড এবং ডিটারজেন্টগুলির একই রকম অবস্থান নির্দেশ করে যে সেগুলি শারীরবৃত্তীয়ভাবে প্রাসঙ্গিক বাইন্ডিং সাইট (চিত্র S12A)। Tch-তে সমতুল্য অণুগুলির অবস্থানও বেশ সামঞ্জস্যপূর্ণ। Gentle এবং Trv। স্ট্রেইন 970 RC-LH1s (চিত্র S12, B থেকে E) (9, 12) এবং লিপিড হেড গ্রুপের হাইড্রোজেন-বন্ধনকারী অবশিষ্টাংশগুলি সিকোয়েন্স অ্যালাইনমেন্টে (চিত্র S13) বেশ ভাল সংরক্ষণ দেখিয়েছে, যা ইঙ্গিত করে যে সংরক্ষিত CDL যা RC (24) এর সাথে আবদ্ধ হয়, এই সাইটগুলি RC-LH1 জটিলে সংরক্ষিত থাকতে পারে।
(A এবং B) চিত্র ১-এর রঙের বিন্যাস ব্যবহার করে RC-LH114-W (A) এবং RC-LH116 (B) পেপটাইড দুটিকে কার্টুনের মাধ্যমে এবং রঞ্জক পদার্থগুলোকে দণ্ডাকৃতির মাধ্যমে দেখানো হয়েছে। লিপিডগুলোকে লাল রঙে এবং ডিটারজেন্টগুলোকে ধূসর রঙে দেখানো হয়েছে। RC QA এবং QB সাইটের সাথে আবদ্ধ UQ-কে হলুদ এবং বিচ্ছিন্ন UQ-কে নীল রঙে দেখানো হয়েছে। (C এবং D) (A) এবং (B)-এর মতো একই দৃশ্য, তবে লিপিডগুলো বাদ দেওয়া হয়েছে। (E থেকে G) RC-LH116 থেকে প্রাপ্ত Q1(E), Q2(F) এবং Q3(G)-এর বিবর্ধিত দৃশ্য, যেখানে পার্শ্ব শিকলগুলো পরস্পরকে প্রভাবিত করে। হাইড্রোজেন বন্ধনগুলোকে কালো ড্যাশযুক্ত রেখা দ্বারা দেখানো হয়েছে।
RC-LH116-এ, চার্জ পৃথকীকরণ প্রক্রিয়ায় ইলেকট্রন স্থানান্তরে অংশগ্রহণকারী RC QA এবং QB UQ উভয়ই তাদের বাইন্ডিং সাইটে বিয়োজিত হয়। তবে, RC-LH114-W-তে QB কুইনোনকে পৃথক করা যায়নি এবং এটি নীচে বিস্তারিতভাবে আলোচনা করা হবে। QA এবং QB কুইনোন ছাড়াও, দুটি চিলেটেড UQ অণুকে (RC এবং LH1 রিংগুলির মধ্যে অবস্থিত) RC-LH114-W কাঠামোতে তাদের সুস্পষ্টভাবে পৃথকীকৃত হেড গ্রুপ (যথাক্রমে Q1 এবং Q2-তে অবস্থিত) অনুসারে চিহ্নিত করা হয়েছে (চিত্র 5C)। দুটি আইসোপ্রিন ইউনিটকে Q1 হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছে, এবং ডেনসিটি ম্যাপটি Q2-এর সম্পূর্ণ ১০টি আইসোপ্রিন টেইলকে পৃথক করে। RC-LH116-এর কাঠামোতে, তিনটি চিলেটেড UQ10 অণুকে (Q1 থেকে Q3, চিত্র 5D) পৃথক করা হয়েছে, এবং সমস্ত অণুর টেইল জুড়ে একটি স্পষ্ট ডেনসিটি রয়েছে (চিত্র 5, D থেকে G)। দুটি কাঠামোতেই, Q1 এবং Q2-এর কুইনোন হেড গ্রুপগুলির অবস্থানের মধ্যে চমৎকার সামঞ্জস্য রয়েছে (চিত্র S12F), এবং তারা শুধুমাত্র RC-এর সাথে মিথস্ক্রিয়া করে। Q1, RC-LH114-W-এর W গ্যাপের প্রবেশপথে অবস্থিত (চিত্র 1G এবং 5, C, D এবং E), এবং Q2, QB বাইন্ডিং সাইটের কাছে অবস্থিত (চিত্র 5, C, D এবং F)। সংরক্ষিত L-Trp143 এবং L-Trp269 রেসিডিউগুলি Q1 এবং Q2-এর খুব কাছাকাছি থাকে এবং সম্ভাব্য π-স্ট্যাকিং মিথস্ক্রিয়া প্রদান করে (চিত্র 5, E এবং F, এবং চিত্র S12)। Q1-এর দূরবর্তী অক্সিজেন থেকে 3.0 Å দূরে অবস্থিত L-Gln88 একটি শক্তিশালী হাইড্রোজেন বন্ধন তৈরি করে (চিত্র 5E); এই রেসিডিউটি ​​সবচেয়ে দূরবর্তী সম্পর্কটি ছাড়া বাকি সমস্ত RC-তে সংরক্ষিত থাকে (চিত্র S13)। বেশিরভাগ অন্যান্য RC-তে L-Ser91-কে Thr দ্বারা প্রতিস্থাপিত করা হয় (চিত্র S13), এটি Q1-এর মিথাইল অক্সিজেন থেকে 3.8 অ্যাংস্ট্রম দূরে অবস্থিত এবং দুর্বল হাইড্রোজেন বন্ধন তৈরি করতে পারে (চিত্র 5E)। Q3-এর কোনো নির্দিষ্ট মিথস্ক্রিয়া আছে বলে মনে হয় না, তবে এটি RC-M সাবইউনিট এবং LH1-α সাবইউনিট 5 থেকে 6-এর মধ্যবর্তী হাইড্রোফোবিক অঞ্চলে অবস্থিত (চিত্র 5, D এবং G)। Tch. Gentle, Trv. Strain 970 এবং Blc-তেও Q1, Q2 এবং Q3 বা কাছাকাছি অবস্থিত চিলেটেড কুইনোন শনাক্ত করা হয়েছে। আইরিস কাঠামো (9, 10, 12) RC-LH1 কমপ্লেক্সে একটি সংরক্ষিত সহায়ক কুইনোন বাইন্ডিং সাইটের দিকে নির্দেশ করে (চিত্র S12G)। RC-LH116-এর পাঁচটি বিয়োজিত UQ, হাই পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি (HPLC) দ্বারা নির্ধারিত প্রতিটি কমপ্লেক্সের 5.8±0.7 মানের সাথে ভালোভাবে মিলে যায়, অপরদিকে RC-LH114-W-এর তিনটি বিয়োজিত UQ-এর মান 6.2±0.3 পরিমাপকৃত মানের চেয়ে কম (চিত্র S14), যা নির্দেশ করে যে গঠনটিতে অমীমাংসিত UQ অণু রয়েছে।
ছদ্ম-প্রতিসম L এবং M পলিপেপটাইডগুলির প্রতিটিতে পাঁচটি TMH থাকে এবং একটি হেটেরোডাইমার গঠন করে যা একটি BChl ডাইমার, দুটি BChl মনোমার, দুটি ব্যাকটেরিওফাজ (BPh) মনোমার, এবং একটি নন-হিম আয়রন এবং এক বা দুটি UQ10 অণুকে একত্রিত করে। টার্মিনাল কিটোন গ্রুপে হাইড্রোজেন বন্ধনের উপস্থিতি এবং Rps-এ এর পরিচিত সঞ্চয়ের মাধ্যমে, ক্যারোটিনয়েডগুলি M-সাবইউনিটে অন্তর্ভুক্ত হয়, যার নাম সিস-3,4-ডিহাইড্রোরোডোপিন। প্রজাতি (25)। RC-H এর বাইরের ঝিল্লি ডোমেন একটি একক TMH দ্বারা ঝিল্লিতে নোঙর করা থাকে। সামগ্রিক RC ​​কাঠামোটি সম্পর্কিত প্রজাতির (যেমন Rba) তিন সাবইউনিট RC-এর অনুরূপ। স্ফেরয়েডস (PDB ID: 3I4D)। এই গঠনগুলির রেজোলিউশন পরিসরের মধ্যে BChl এবং BPh-এর ম্যাক্রোসাইকেল, ক্যারোটিনয়েড ব্যাকবোন এবং নন-হিম আয়রন একে অপরের উপর উপরিপাতিত হয়, যেমনটি QA সাইটের UQ10 হেড গ্রুপ এবং RC-LH116-এর QB কুইনোনের ক্ষেত্রেও ঘটে (চিত্র S15)।
ভিন্ন QB সাইট দখলের হার সহ দুটি RC কাঠামোর উপলব্ধতা QB কুইনোন বাইন্ডিংয়ের সাথে সঙ্গতিপূর্ণ গঠনগত পরিবর্তনগুলি পরীক্ষা করার একটি নতুন সুযোগ প্রদান করে। RC-LH116 কমপ্লেক্সে, QB কুইনোন সম্পূর্ণরূপে আবদ্ধ "প্রক্সিমাল" অবস্থানে (26) অবস্থিত, কিন্তু RC-LH114-W এর পৃথকীকরণে QB কুইনোন নেই। RC-LH114-W তে কোনও QB কুইনোন নেই, যা আশ্চর্যজনক কারণ কমপ্লেক্সটি সক্রিয়, কাঠামোগতভাবে সমাধানকৃত QB কুইনোন সহ RC-LH116 কমপ্লেক্সের চেয়েও বেশি। যদিও দুটি LH1 রিং প্রায় ছয়টি কুইনোন চিলেট করে, বন্ধ RC-LH116 রিংয়ে পাঁচটি কাঠামোগতভাবে সমাধানকৃত, যেখানে খোলা RC-LH114-W রিংয়ে মাত্র তিনটি কাঠামোগতভাবে সীমাবদ্ধ। এই বর্ধিত গাঠনিক বিশৃঙ্খলা সম্ভবত RC-LH114-W QB সাইটগুলোর দ্রুততর প্রতিস্থাপন, কমপ্লেক্সের মধ্যে কুইনোনের দ্রুততর গতিবিদ্যা এবং LH1 লুপ অতিক্রম করার বর্ধিত সম্ভাবনাকে প্রতিফলিত করে। আমাদের মতে, RC-LH114-W-এর RC QB সাইটে UQ-এর অনুপস্থিতি একটি অধিকতর জটিল ও সক্রিয় কমপ্লেক্সের ফল হতে পারে, এবং UQ আবর্তনের নির্দিষ্ট পর্যায়ে (QB সাইটের প্রবেশপথ বন্ধ হয়ে গেছে) RC-LH114-W-এর QB সাইটটি তাৎক্ষণিকভাবে স্থির হয়ে গেছে, যা এই সক্রিয়তার গঠনকে প্রতিফলিত করে।
QB ছাড়া, L-Phe217-এর আনুষঙ্গিক ঘূর্ণন এমন একটি অবস্থানে ঘটে যা UQ10 বাইন্ডিং-এর জন্য বেমানান, কারণ এটি লেজের প্রথম আইসোপ্রিন ইউনিটের সাথে একটি স্থানিক সংঘর্ষ ঘটাবে (চিত্র 6A)। এছাড়াও, সুস্পষ্ট প্রধান গঠনগত পরিবর্তনগুলো দৃশ্যমান, বিশেষ করে হেলিক্স ডি (TMH D এবং E-এর মধ্যবর্তী লুপের ছোট হেলিক্স) যেখানে L-Phe217 QB বাইন্ডিং পকেটে স্থানান্তরিত হয় এবং L-Tyr223-এর ঘূর্ণন (চিত্র 6A) M-Asp45 ফ্রেমওয়ার্কের সাথে হাইড্রোজেন বন্ধন ভাঙতে এবং QB বাইন্ডিং সাইটের প্রবেশপথ বন্ধ করতে সাহায্য করে (চিত্র 6B)। হেলিক্স ডি তার গোড়ায় ঘোরে, L-Ser209-এর Cα 0.33Å স্থানান্তরিত হয়, যেখানে L-Val221-এর Cα 3.52Å স্থানান্তরিত হয়। TMH D এবং E-তে কোনো লক্ষণীয় পরিবর্তন নেই, যা উভয় কাঠামোতেই সুপারইম্পোজেবল (চিত্র 6A)। আমাদের জানামতে, প্রাকৃতিক RC-তে এটিই প্রথম কাঠামো যা QB সাইটটিকে বন্ধ করে দেয়। সম্পূর্ণ (QB-আবদ্ধ) কাঠামোর সাথে তুলনা করলে দেখা যায় যে, কুইনোন বিজারিত হওয়ার আগে, এটিকে কুইনোনে প্রবেশ করানোর জন্য একটি গঠনগত পরিবর্তনের প্রয়োজন হয়। L-Phe217 ঘুরে কুইনোন হেড গ্রুপের সাথে একটি π-স্ট্যাকিং মিথস্ক্রিয়া তৈরি করে, এবং হেলিক্সটি বাইরের দিকে সরে যায়, যা L-Gly222-এর কঙ্কাল এবং L-Tyr223-এর পার্শ্বশৃঙ্খলকে একটি স্থিতিশীল হাইড্রোজেন বন্ধন কাঠামোসহ হাইড্রোজেন বন্ধন নেটওয়ার্ক গঠন করতে দেয় (চিত্র ৬, A এবং C)।
(A) হলোগ্রাম (L চেইন, কমলা/M চেইন, ম্যাজেন্টা) এবং অ্যাপো (ধূসর) কাঠামোর ওভারল্যাপিং কার্টুন, যেখানে মূল অবশিষ্টাংশগুলি একটি দণ্ড-সদৃশ উপস্থাপনার আকারে প্রদর্শিত হয়েছে। UQ10 একটি হলুদ বার দ্বারা উপস্থাপিত। ডটেড লাইনটি সম্পূর্ণ কাঠামোতে গঠিত হাইড্রোজেন বন্ধন নির্দেশ করে। (B এবং C) অ্যাপোলিপোপ্রোটিন এবং সম্পূর্ণ রিং কাঠামোর পৃষ্ঠ উপস্থাপনা, যেখানে যথাক্রমে L-Phe217-এর সাইড চেইন অক্সিজেনকে নীল রঙে এবং L-Tyr223-কে লাল রঙে হাইলাইট করা হয়েছে। L সাবইউনিটটি কমলা; M এবং H সাবইউনিটগুলি রঙিন নয়। (D এবং E) অ্যাপোলিপোপ্রোটিন (D) এবং সম্পূর্ণ (E) RC QB সাইট [যথাক্রমে (A) দ্বারা রঙিন] এবং থার্মোফিলাস থার্মোফিলাস PSII (সবুজ, প্লাস্টিক কুইনোন সহ নীল; PDB ID: 3WU2) অ্যালাইন (58)।
অপ্রত্যাশিতভাবে, যদিও LH1 ছাড়া QB-বিহীন RC-এর বেশ কয়েকটি কাঠামো পাওয়া যায়, এই গবেষণায় পর্যবেক্ষণ করা গঠনগত পরিবর্তনগুলি পূর্বে রিপোর্ট করা হয়নি। এর মধ্যে রয়েছে Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) এবং Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) থেকে প্রাপ্ত QB অপসারণ কাঠামো, যেগুলির সবকটিই তাদের সামগ্রিক QB কাঠামোর প্রায় অনুরূপ। 3PRC-এর নিবিড় পর্যবেক্ষণে দেখা গেছে যে LDAO (লরিল ডাইমিথাইল অ্যামাইন অক্সাইড) ডিটারজেন্ট অণুগুলি QB অবস্থানের প্রবেশপথে আবদ্ধ হয়, যা একটি বদ্ধ গঠনে পুনর্বিন্যাসকে বাধা দিতে পারে। যদিও 1EYS বা 1OGV-তে LDAO একই অবস্থানে বিয়োজিত হয় না, এই RC-গুলি একই ডিটারজেন্ট ব্যবহার করে প্রস্তুত করা হয়েছে এবং তাই একই প্রভাব তৈরি করতে পারে। Rba.-এর স্ফটিক কাঠামো। সাইটোক্রোম c2 (PDB ID: 1L9B)-এর সাথে সহ-কেলাসিত স্ফেরয়েডস RC-এরও একটি বদ্ধ QB সাইট আছে বলে মনে হয়। যাইহোক, এই ক্ষেত্রে, RC-M পলিপেপটাইডের N-টার্মিনাল অঞ্চল (যা Q হেলিক্সের Tyr অবশেষের H বন্ধনের মাধ্যমে QB বাইন্ডিং সাইটের সাথে মিথস্ক্রিয়া করে) একটি অস্বাভাবিক গঠন গ্রহণ করে, এবং QB গঠনের পরিবর্তনটি আর অন্বেষণ করা হয়নি (30)। আশ্বস্ত হওয়ার বিষয় হল যে আমরা RC-LH114-W কাঠামোতে M পলিপেপটাইডের এই ধরণের বিকৃতি দেখিনি, যা RC-LH116 RC-এর N-টার্মিনাল অঞ্চলের প্রায় অনুরূপ। এটিও উল্লেখ্য যে ডিটারজেন্ট-ভিত্তিক LH1 অ্যান্টেনা অপসারণের পরে, PDB-তে অ্যাপোলিপোপ্রোটিন RC-গুলি সমাধান করা হয়েছিল, যা RC এবং পার্শ্ববর্তী LH1 রিং-এর অভ্যন্তরীণ পৃষ্ঠের মধ্যবর্তী ফাঁকে অভ্যন্তরীণ কুইনোন পুল এবং লিপিডগুলিকে নির্মূল করেছে (31, 32)। RC কার্যকরী থাকে কারণ এটি পচনশীল QB কুইনোন ব্যতীত সমস্ত সহ-উপাদান ধরে রাখে, যা কম স্থিতিশীল এবং প্রায়শই প্রস্তুতি প্রক্রিয়ার সময় হারিয়ে যায় (33)। এছাড়াও, এটি জানা যায় যে RC থেকে LH1 এবং প্রাকৃতিক চক্রীয় লিপিড অপসারণ করলে এর কার্যকারিতার উপর প্রভাব পড়তে পারে, যেমন চার্জ-বিচ্ছিন্ন P+QB-অবস্থার আয়ুষ্কাল কমে যাওয়া (31, 34, 35)। অতএব, আমরা অনুমান করি যে RC-কে ঘিরে থাকা স্থানীয় LH1 রিং-এর অস্তিত্ব "বদ্ধ" QB সাইট বজায় রাখতে পারে, যার ফলে QB-এর নিকটবর্তী স্থানীয় পরিবেশ সংরক্ষিত থাকে।
যদিও অ্যাপোলিপোপ্রোটিন (QB কুইনোন ছাড়া) এবং সম্পূর্ণ কাঠামোটি একাধিক ঘটনার পরিবর্তে QB সাইটের পরিবর্তনের দুটি স্ন্যাপশট মাত্র, তবুও এমন ইঙ্গিত রয়েছে যে হাইড্রোকুইনোন দ্বারা পুনঃসংযোজন রোধ করতে এবং সাবস্ট্রেট ইনহিবিশনকে বাধা দিতে বাইন্ডিংকে গেট করা যেতে পারে। অ্যাপোলিপোপ্রোটিনের QB সাইটের কাছে কুইনোলল এবং কুইনোনের মিথস্ক্রিয়া ভিন্ন হতে পারে, যা RC দ্বারা এর প্রত্যাখ্যানের দিকে পরিচালিত করে। দীর্ঘদিন ধরে প্রস্তাব করা হয়েছে যে কনফরমেশনাল পরিবর্তনগুলি কুইনোনের বাইন্ডিং এবং রিডাকশনে ভূমিকা পালন করে। ডার্ক অ্যাডাপটেশনের পরে হিমায়িত RC-গুলির কুইনোন রিডিউস করার ক্ষমতা হ্রাস পায় (36); এক্স-রে ক্রিস্টালোগ্রাফি দেখায় যে এই ক্ষতিটি সক্রিয় প্রক্সিমাল অবস্থান থেকে প্রায় 4.5 Å দূরে একটি "ডিস্টাল" কনফরমেশনে QB কুইনোনগুলি আটকে থাকার কারণে হয় (26), 37)। আমরা মনে করি যে এই ডিস্টাল বাইন্ডিং কনফরমেশনটি অ্যাপোলিপোপ্রোটিন এবং সম্পূর্ণ রিং কাঠামোর মধ্যবর্তী অবস্থার একটি স্ন্যাপশট, যা কুইনোনের সাথে প্রাথমিক মিথস্ক্রিয়া এবং QB সাইট খোলার পরে ঘটে।
কিছু আলোকজীবী ব্যাকটেরিয়া এবং সায়ানোব্যাকটেরিয়া, শৈবাল এবং উদ্ভিদের PSII জটিলে পাওয়া টাইপ II RC-এর গঠনগত এবং কার্যকরী সংরক্ষণ রয়েছে (38)। চিত্র 6 (D এবং E)-তে দেখানো গঠনগত সারিবদ্ধকরণ PSII RC এবং ব্যাকটেরিয়াল RC জটিলের QB সাইটের মধ্যেকার সাদৃশ্যকে তুলে ধরে। এই তুলনাটি দীর্ঘদিন ধরে কুইনোন বন্ধন এবং বিজারণের ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত সিস্টেমগুলি অধ্যয়নের জন্য একটি মডেল হিসাবে ব্যবহৃত হয়ে আসছে। পূর্ববর্তী প্রকাশনাগুলি থেকে জানা যায় যে PSII দ্বারা কুইনোনের বিজারণের সাথে গঠনগত পরিবর্তন ঘটে (39, 40)। অতএব, RC-এর বিবর্তনীয় সংরক্ষণ বিবেচনা করে, এই পূর্বে অনাবিষ্কৃত বন্ধন প্রক্রিয়াটি অক্সিজেনযুক্ত আলোকজীবী উদ্ভিদের PSII RC-এর QB সাইটের ক্ষেত্রেও প্রযোজ্য হতে পারে।
Rps ΔpufW (লেবেলবিহীন pufW ডিলিশন) এবং PufW-His (প্রাকৃতিক pufW লোকাস থেকে প্রকাশিত C-টার্মিনাল 10x His-ট্যাগযুক্ত প্রোটিন-W) স্ট্রেইন। palustris CGA009 আমাদের পূর্ববর্তী কাজে (16) বর্ণিত হয়েছে। এই স্ট্রেইনগুলো এবং আইসোজেনিক ওয়াইল্ড-টাইপ প্যারেন্টকে ফ্রিজার থেকে পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল PYE (প্রতিটি 5 গ্রাম লিটার -1) (LB-তে -80 °C তাপমাত্রায় সংরক্ষিত, যাতে 50% (w/v) গ্লিসারল, প্রোটিন, ইস্ট এক্সট্র্যাক্ট এবং সাক্সিনেট রয়েছে) অ্যাগার [1.5% (w/v)] প্লেটে অল্প সংখ্যক কোষ স্ট্রিকিং করে। প্লেটটি অ্যানেরোবিক অবস্থায় ঘরের তাপমাত্রায় অন্ধকারে সারারাত ইনকিউবেট করা হয়েছিল, এবং তারপরে OSRAM 116-W হ্যালোজেন বাল্ব (RS Components, UK) দ্বারা সরবরাহকৃত সাদা আলো (~50 μmolm-2 s-1) দিয়ে 3 থেকে 5 দিন আলোকিত করা হয়েছিল যতক্ষণ না একটি একক কলোনি দেখা যায়। একটি একক কলোনি ব্যবহার করে 0.1% (w/v) ক্যাসামিনো অ্যাসিড (এরপরে M22 হিসাবে উল্লেখিত) সহ 10 মিলি M22+ মিডিয়ামে (41) ইনোকুলেশন করা হয়েছিল। কালচারটি কম অক্সিজেন পরিবেশে, অন্ধকারে 34°C তাপমাত্রায় 180 rpm গতিতে ঝাঁকিয়ে 48 ঘন্টা ধরে বৃদ্ধি করা হয়েছিল, এবং তারপরে 70 মিলি কালচার একই পরিস্থিতিতে 24 ঘন্টার জন্য ইনোকুলেশন করা হয়েছিল। 1 মিলি আয়তনের একটি আধা-বায়বীয় কালচার ব্যবহার করে একটি 30 মিলি সার্বজনীন স্ক্রু-টপ স্বচ্ছ কাচের বোতলে 30 মিলি M22 মিডিয়ামে ইনোকুলেশন করা হয় এবং জীবাণুমুক্ত চৌম্বকীয় বল প্রয়োগকারী স্টিরিং রড দ্বারা 48 ঘন্টা ধরে আলোড়ন (~50μmolm-2 s-1) সহ বিকিরণ করা হয়। এরপর একই পরিস্থিতিতে প্রায় ১ লিটার কালচার দিয়ে ৩০ মিলি কালচারকে ইনোকুলেট করা হয়, যা পরবর্তীতে ~২০০ μmolm-2 s-1 তীব্রতায় ৭২ ঘণ্টা আলোকিত প্রায় ৯ লিটার কালচারে ইনোকুলেট করতে ব্যবহৃত হয়। কোষগুলোকে ৭১৩২ RCF গতিতে ৩০ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউগেশন করে সংগ্রহ করা হয়, প্রায় ১০ মিলি ২০ mM ট্রিস-এইচসিএল (pH ৮.০)-এ পুনরায় সাসপেন্ড করা হয় এবং প্রয়োজন না হওয়া পর্যন্ত -২০°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়।
বরফ গলানোর পর, পুনরায় সাসপেন্ড করা কোষগুলিতে কিছু ডিঅক্সিরাইবোনিউক্লিয়েজ I (মার্ক, ইউকে), লাইসোজাইম (মার্ক, ইউকে) এবং দুটি রোশ হলোএনজাইম প্রোটিয়েজ ইনহিবিটর ট্যাবলেট (মার্ক, ইউকে) যোগ করুন। একটি ২০,০০০ পিএসআই ফ্রেঞ্চ প্রেশার সেলে (অ্যামিনকো, ইউএসএ) কোষগুলিকে ৮ থেকে ১২ বার ভাঙা হয়েছিল। ৪° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ১৫ মিনিটের জন্য ১৮,৫০০ আরসিএফ-এ সেন্ট্রিফিউগেশন করে অক্ষত কোষ এবং অদ্রবণীয় আবর্জনা অপসারণ করার পর, ৪৩,০০০° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ২ ঘন্টার জন্য ১১৩,০০০ আরসিএফ-এ সেন্ট্রিফিউগেশন করে রঞ্জিত লাইসেট থেকে মেমব্রেনটিকে অধঃক্ষিপ্ত করা হয়েছিল। দ্রবণীয় অংশটি ফেলে দিন এবং রঙিন মেমব্রেনটিকে ১০০ থেকে ২০০ মিলি ২০ এমএম ট্রিস-এইচসিএল (পিএইচ ৮.০)-এ পুনরায় সাসপেন্ড করুন এবং কোনো দৃশ্যমান পিণ্ড না থাকা পর্যন্ত সমজাতীয় করুন। সাসপেন্ডেড মেমব্রেনটিকে 20 mM ট্রিস-এইচসিএল (pH 8.0) (অ্যানাট্রেস, ইউএসএ) দ্রবণে 2% (w/v) β-DDM সহ 4°C তাপমাত্রায় অন্ধকারে 1 ঘন্টা ধরে হালকা নাড়াচাড়া করে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। তারপর অবশিষ্ট অদ্রবণীয় পদার্থ অপসারণের জন্য 4°C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টা ধরে 70°C তাপমাত্রায় সেন্ট্রিফিউজ করে 150,000 RCF দ্রবীভূত করা হয়েছিল।
ΔpufW স্ট্রেইন থেকে প্রাপ্ত সলিউবিলাইজিং মেমব্রেনটি একটি ৫০ মিলি ডিইএই সেফারোজ আয়ন এক্সচেঞ্জ কলামে তিন কলাম ভলিউম (CV) বাইন্ডিং বাফার [২০ mM ট্রিস-এইচসিএল (pH ৮.০) যাতে ০.০৩% (w/v) β-DDM রয়েছে] সহ প্রয়োগ করা হয়েছিল। কলামটি দুই CV বাইন্ডিং বাফার দিয়ে ধৌত করুন, এবং তারপর কলামটি ৫০ mM NaCl যুক্ত দুই বাইন্ডিং বাফার দিয়ে ধৌত করুন। RC-LH116 কমপ্লেক্সটি ১.৭৫ CV-তে ১৫০ থেকে ৩০০ mM NaCl (বাইন্ডিং বাফারে) এর একটি লিনিয়ার গ্রেডিয়েন্ট দ্বারা এলুটেড করা হয়েছিল, এবং অবশিষ্ট বাইন্ডিং কমপ্লেক্সটি ০.৫ CV-তে ৩০০ mM NaCl যুক্ত একটি বাইন্ডিং বাফার দ্বারা এলুটেড করা হয়েছিল। ২৫০ থেকে ১০০০ nm-এর মধ্যে শোষণ বর্ণালী সংগ্রহ করুন, ৮৮০ থেকে ২৮০ nm-এর মধ্যে ১-এর বেশি শোষণ অনুপাত (A880/A280) যুক্ত অংশটি রাখুন, এটিকে বাইন্ডিং বাফারে দ্বিগুণ পাতলা করুন এবং DEAE কলামে বিশুদ্ধকরণের জন্য আবার একই পদ্ধতি ব্যবহার করুন। ১.৭-এর বেশি A880/A280 অনুপাত এবং ৩.০-এর বেশি A880/A805 অনুপাতযুক্ত অংশগুলিকে পাতলা করুন, তৃতীয় দফা আয়ন বিনিময় সম্পাদন করুন এবং ২.২-এর বেশি A880/A280 অনুপাত এবং ৫.০-এর বেশি A880/A805 অনুপাতযুক্ত অংশগুলি ধরে রাখুন। আংশিকভাবে বিশুদ্ধ জটিল যৌগটিকে একটি অ্যামিকন ১০০,০০০ আণবিক ওজন কাট-অফ (MWCO) সেন্ট্রিফিউগাল ফিল্টারে (মার্চ, ইউকে) প্রায় ২ মিলিলিটার পর্যন্ত ঘনীভূত করা হয়েছিল এবং ২০০ mM NaCl বাফারযুক্ত একটি সুপারডেক্স ২০০ ১৬/৬০০ সাইজ এক্সক্লুশন কলামে (জিই হেলথকেয়ার, ইউএস) লোড করা হয়েছিল, এবং তারপর একই বাফারে ১.৫ CV-তে এলুশন করা হয়েছিল। সাইজ এক্সক্লুশন ফ্র্যাকশনের শোষণ বর্ণালী সংগ্রহ করুন, এবং যে শোষণ বর্ণালীগুলির A880/A280 অনুপাত ২.৪-এর বেশি এবং A880/A805 অনুপাত ৫.৮-এর বেশি, সেগুলিকে ১০০ A880-তে ঘনীভূত করুন এবং অবিলম্বে ক্রায়ো-টিইএম গ্রিড প্রস্তুতির জন্য ব্যবহার করুন অথবা প্রয়োজন না হওয়া পর্যন্ত -৮০°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করুন।
PufW-His স্ট্রেইন থেকে প্রাপ্ত দ্রবণীয় ঝিল্লিটি একটি ২০ মিলি HisPrep FF Ni-NTA সেফারোজ কলামে (২০ mM ট্রিস-এইচসিএল (pH ৮.০) যাতে ২০০ mM NaCl এবং ০.০৩% (w/w) রয়েছে) IMAC বাফারে (GE Healthcare) প্রয়োগ করা হয়েছিল। v) β-DDM]। কলামটি IMAC বাফারের পাঁচটি CV দিয়ে, এবং তারপর ১০ mM হিস্টিডিনযুক্ত IMAC বাফারের পাঁচটি CV দিয়ে ধৌত করা হয়েছিল। কোর কমপ্লেক্সটি ১০০ mM হিস্টিডিনযুক্ত পাঁচটি IMAC বাফার দিয়ে কলাম থেকে ইলিউটেড করা হয়েছিল। RC-LH114-W কমপ্লেক্সযুক্ত অংশটিকে একটি Amicon 100,000 MWCO ফিল্টার (Merck, UK) যুক্ত আলোড়িত ট্যাঙ্কে প্রায় ১০ মিলি পর্যন্ত ঘনীভূত করা হয়, বাইন্ডিং বাফার দিয়ে ২০ গুণ লঘু করা হয়, এবং তারপর ২৫ মিলি DEAE সেফারোজ কলামে যোগ করা হয়, যেখানে বাফারের সাথে আবদ্ধ চারটি CV আগে থেকেই ব্যবহার করা হয়। চারটি CV বাইন্ডিং বাফার দিয়ে কলামটি ধৌত করুন, তারপর 0 থেকে 100 mM NaCl (বাইন্ডিং বাফারে) এর একটি লিনিয়ার গ্রেডিয়েন্টে আটটি CV-তে কমপ্লেক্সটি এল্যুট করুন, এবং অবশিষ্ট চারটি CV-তে 100 mM বাইন্ডিং বাফার রাখুন। সোডিয়াম ক্লোরাইডে এল্যুট হওয়া অবশিষ্ট কমপ্লেক্সগুলো, যেগুলোর A880/A280 অনুপাত 2.4-এর বেশি এবং A880/A805 অনুপাত 4.6-এর বেশি ছিল, সেগুলোকে একটি Amicon 100,000 MWCO সেন্ট্রিফিউগাল ফিল্টারে প্রায় 2 ml পর্যন্ত ঘনীভূত করুন, এবং আগে থেকে বাফার দিয়ে সমতাকৃত Superdex 200 16/600 সাইজ এক্সক্লুশন কলামটি 1.5 CV IMAC দিয়ে পূর্ণ করুন, এবং তারপর একই বাফারে 1.5 CV-এর উপর দিয়ে এল্যুট করুন। আকার-বর্জিত ভগ্নাংশগুলির শোষণ বর্ণালী সংগ্রহ করুন এবং 2.1-এর বেশি A880/A280 অনুপাত ও 4.6-এর বেশি A880/A805 অনুপাতযুক্ত শোষণ বর্ণালীগুলিকে 100 A880-তে ঘনীভূত করুন, যা অবিলম্বে হিমায়িত TEM গ্রিড তৈরির জন্য ব্যবহৃত হয় অথবা প্রয়োজন না হওয়া পর্যন্ত -80°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়।
নিম্ন তাপমাত্রার টিইএম গ্রিড প্রস্তুত করার জন্য একটি লাইকা ইএম জিপি ইমার্সন ফ্রিজার ব্যবহার করা হয়েছিল। জটিল যৌগটিকে আইম্যাক বাফারে (IMAC buffer) ৫০ A880 অনুপাতে লঘু করা হয়েছিল, এবং তারপর একটি সদ্য গ্লো-ডিসচার্জ করা কোয়ান্টিফয়েল ১.২/১.৩ কার্বন-কোটেড কপার মেশের (অ্যাগার সায়েন্টিফিক, ইউকে) উপর ৫ মাইক্রোলিটার (μl) লোড করা হয়েছিল। গ্রিডটিকে ২০° সেলসিয়াস তাপমাত্রা এবং ৬০% আপেক্ষিক আর্দ্রতায় ৩০ সেকেন্ডের জন্য ইনকিউবেট করা হয়, তারপর ৩ সেকেন্ডের জন্য ব্লটিং পেপার দিয়ে মুছে শুকানো হয়, এবং সবশেষে -১৭৬° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় তরল ইথেনে ডুবিয়ে দ্রুত শীতল করা হয়।
RC-LH114-W কমপ্লেক্সের ডেটা eBIC (ইলেকট্রনিক বায়োইমেজিং সেন্টার) (ব্রিটিশ ডায়মন্ড লাইট সোর্স)-এ একটি Titan Krios মাইক্রোস্কোপের সাহায্যে রেকর্ড করা হয়েছিল, যা 300kV ত্বরণ ভোল্টেজে, 130,000× নামমাত্র বিবর্ধনে এবং 20 eV গ্যাপ শক্তিতে কাজ করে। ডেটা সংগ্রহের জন্য কাউন্টিং মোডে ছবি রেকর্ড করতে K2 পিক ডিটেক্টর সহ একটি Gatan 968 GIF Quantum ব্যবহার করা হয়েছিল। ক্যালিব্রেটেড পিক্সেল সাইজ হল 1.048Å, এবং ডোজ রেট হল 3.83 e-Å-2s-1। মুভিটি 11 সেকেন্ডে সংগ্রহ করে 40টি অংশে ভাগ করা হয়েছিল। মাইক্রোস্কোপ রিফোকাস করার জন্য কার্বন-কোটেড এলাকা ব্যবহার করা হয় এবং তারপর প্রতিটি হোল থেকে তিনটি করে মুভি সংগ্রহ করা হয়। মোট 3130টি মুভি সংগ্রহ করা হয়েছিল, যার ডিফোকাস মান ছিল -1 থেকে -3μm-এর মধ্যে।
অ্যাস্টারবারি বায়োস্ট্রাকচার ল্যাবরেটরিতে (ইউনিভার্সিটি অফ লিডস, ইউকে) একই মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে RC-LH116 কমপ্লেক্সের ডেটা সংগ্রহ করা হয়েছিল। ডেটাটি কাউন্টিং মোডে ১৩০ k বিবর্ধনে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং পিক্সেল সাইজ ১.০৬৫ Å-এ ক্যালিব্রেট করা হয়েছিল, সাথে ডোজ ছিল ৪.৬ e-Å-2s-1। মুভিটি ১২ সেকেন্ডে রেকর্ড করা হয়েছিল এবং ৪৮টি অংশে বিভক্ত ছিল। মোট ৩৩৫৯টি ফিল্ম সংগ্রহ করা হয়েছিল, যেগুলোর ডিফোকাস মান ছিল -১ থেকে -৩μm-এর মধ্যে।
সমস্ত ডেটা প্রসেসিং Relion 3.0 পাইপলাইনে (42) সম্পন্ন করা হয়। ডোজ ওয়েটিং দ্বারা বিম মোশন সংশোধন করতে Motioncorr 2 (43) ব্যবহার করুন, এবং তারপর CTF (কনট্রাস্ট ট্রান্সফার ফাংশন) প্যারামিটার নির্ধারণ করতে CTFFIND 4.1 (44) ব্যবহার করুন। এই প্রাথমিক প্রসেসিং পর্যায়গুলির পরের সাধারণ ফটোমাইক্রোগ্রাফগুলি চিত্র 2. S16-এ দেখানো হয়েছে। স্বয়ংক্রিয় নির্বাচন টেমপ্লেটটি একটি 250-পিক্সেল ফ্রেমে 1000 কণার মধ্যে থেকে প্রায় 250 পিক্সেল ম্যানুয়ালি নির্বাচন করে তৈরি করা হয় এবং কোনও রেফারেন্স দ্বি-মাত্রিক (2D) শ্রেণিবিন্যাস ছাড়াই, যার ফলে নমুনা দূষণযুক্ত বা কোনও সুস্পষ্ট বৈশিষ্ট্য নেই এমন শ্রেণিবিন্যাসগুলি বাতিল করা হয়। তারপর, সমস্ত মাইক্রোফটোগ্রাফের উপর স্বয়ংক্রিয় নির্বাচন করা হয়েছিল, এবং RC-LH114-W-তে 849,359টি কণা এবং RC-LH116 কমপ্লেক্সে 476,547টি কণা ছিল। সমস্ত নির্বাচিত কণা দুই রাউন্ড নন-রেফারেন্স ২ডি ক্লাসিফিকেশনের মধ্য দিয়ে গেছে, এবং প্রতিটি রানের পরে, কার্বন এলাকা, নমুনা দূষণ, কোনো সুস্পষ্ট বৈশিষ্ট্যের অভাব বা তীব্রভাবে ওভারল্যাপিং কণাগুলিকে বাতিল করা হয়েছে, যার ফলে যথাক্রমে RC-LH114-W এবং RC-LH116 এর ৩ডি ক্লাসিফিকেশনের জন্য ৭৭২,০৩৩ (৯০.৯%) এবং ৩৫৯,৬৭৮ (৭৫.৫%) কণা ব্যবহৃত হয়েছে। প্রাথমিক ৩ডি রেফারেন্স মডেলটি স্টোকাস্টিক গ্রেডিয়েন্ট ডিসেন্ট পদ্ধতি ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল। প্রাথমিক মডেলটিকে রেফারেন্স হিসাবে ব্যবহার করে, নির্বাচিত কণাগুলিকে ৩ডি-তে চারটি বিভাগে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়। এই বিভাগের মডেলটিকে রেফারেন্স হিসাবে ব্যবহার করে, বৃহত্তম বিভাগের কণাগুলির উপর ৩ডি রিফাইনিং করা হয়, তারপর দ্রাবক এলাকা কভার করার জন্য প্রাথমিক ১৫Å লো-পাস ফিল্টার ব্যবহার করা হয়, ৬ পিক্সেলের সফট এজ যোগ করা হয়, এবং টপ ডিটেক্টরের Gatan K2 পিক মডুলেশন ট্রান্সফার ফাংশন সংশোধন করার জন্য পিক্সেলগুলিকে পোস্ট-প্রসেস করা হয়। RC-LH114-W ডেটাসেটের জন্য, এই প্রাথমিক মডেলটিকে মাস্কের প্রান্তের শক্তিশালী ঘনত্ব (UCSF Chimera-তে মূল জটিল ঘনত্ব থেকে বিচ্ছিন্ন) অপসারণ করে পরিবর্তন করা হয়েছিল। ফলস্বরূপ মডেলগুলি (RC-LH114-W এবং RC-LH116-এর রেজোলিউশন যথাক্রমে ৩.৯১ এবং ৪.১৬ Å) ৩ডি শ্রেণিবিন্যাসের দ্বিতীয় রাউন্ডের জন্য একটি রেফারেন্স হিসাবে ব্যবহৃত হয়। ব্যবহৃত কণাগুলিকে প্রাথমিক ৩ডি শ্রেণিতে দলবদ্ধ করা হয়েছে এবং প্রতিবেশের সাথে তাদের কোনো শক্তিশালী সম্পর্ক নেই। কোনো ওভারল্যাপ বা সুস্পষ্ট কাঠামোগত বৈশিষ্ট্যের অভাব রয়েছে। ৩ডি শ্রেণিবিন্যাসের দ্বিতীয় রাউন্ডের পরে, সর্বোচ্চ রেজোলিউশনযুক্ত বিভাগটি নির্বাচন করা হয়েছিল [RC-LH114-W-এর জন্য, একটি বিভাগে ৩৭৭,৭০৩টি কণা (৪৪.৫%), RC-LH116-এর জন্য, দুটি বিভাগ রয়েছে, মোট ২৬০,৭৫২টি কণা (৫৪.৭%), যেখানে প্রাথমিক ঘূর্ণনের পরে সারিবদ্ধ করলে তারা সামান্য পার্থক্য সহ একই হয়]। নির্বাচিত কণাগুলোকে একটি ৪০০-পিক্সেল বাক্সে পুনরায় নিষ্কাশন করা হয় এবং ৩ডি রিফাইনিং দ্বারা সূক্ষ্ম করা হয়। প্রাথমিক ১৫Å লো-পাস ফিল্টার, ৩ পিক্সেল ম্যাপ এক্সপ্যানশন এবং ৩ পিক্সেল সফট মাস্ক ব্যবহার করে সলভেন্ট মাস্ক তৈরি করা হয়। প্রতিটি ধাপের পরে প্রাপ্ত টেক্সচারকে আরও সূক্ষ্ম করার জন্য পার-পার্টিকেল সিটিএফ রিফাইনমেন্ট, পার-পার্টিকেল মোশন কারেকশন এবং দ্বিতীয় রাউন্ডের পার-পার্টিকেল সিটিএফ রিফাইনমেন্ট, ৩ডি রিফাইনমেন্ট, সলভেন্ট মাস্কিং এবং পোস্ট-প্রসেসিং করা হয়। ০.১৪৩-এর এফএসসি (ফুরিয়ার শেল কোরিলেশন কোএফিসিয়েন্ট) কাট-অফ মান ব্যবহার করে, RC-LH114-W এবং RC-LH116-এর চূড়ান্ত মডেলগুলোর রেজোলিউশন যথাক্রমে ২.৬৫ এবং ২.৮০Å। চূড়ান্ত মডেলের এফএসসি কার্ভটি চিত্র ২.এস১৭-তে দেখানো হয়েছে।
সমস্ত প্রোটিন সিকোয়েন্স UniProtKB থেকে ডাউনলোড করা হয়েছে: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3)। RC-এর একটি হোমোলজি মডেল তৈরি করতে SWISS-MODEL (45) ব্যবহার করা হয়েছিল, যাতে RC-L, RC-M এবং RC-H-এর প্রোটিন সিকোয়েন্স এবং Rba-এর ক্রিস্টাল স্ট্রাকচার রয়েছে। sphaeroides RC একটি টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল (PDB ID: 5LSE) (46)। UCSF Chimera-তে “fit map” টুল ব্যবহার করে তৈরি করা মডেলটিকে ম্যাপের (47) সাথে ফিট করুন, প্রোটিনের গঠন উন্নত করুন, এবং Coot (48) ব্যবহার করে কোফ্যাক্টর [4×BChl a (মনোমার লাইব্রেরির রেসিডিউ নাম = BCL), 2×BPh a (BPH), এক বা দুই ধরনের UQ10 (U10), একটি নন-হিম আয়রন (Fe) এবং একটি 3,4-ডাইহাইড্রোহেক্সাকার্বনিলকোলিন (QAK)] যোগ করুন। যেহেতু QAK মনোমার লাইব্রেরিতে পাওয়া যায় না, তাই PHENIX (49)-এর eLBOW টুল ব্যবহার করে এটিকে প্যারামিটারাইজ করা হয়েছিল।
এরপর, LH1 সাবইউনিটটি তৈরি করা হয়েছিল। প্রাথমিকভাবে, PHENIX (49)-এর স্বয়ংক্রিয় নির্মাণ সরঞ্জামটি ব্যবহার করে, ম্যাপ এবং LH1-α ও LH1-β প্রোটিন সিকোয়েন্সকে ইনপুট হিসাবে নিয়ে LH1 সিকোয়েন্সের একটি অংশ স্বয়ংক্রিয়ভাবে তৈরি করা হয়েছিল। সবচেয়ে সম্পূর্ণ LH1 সাবইউনিটটি নির্বাচন করে, সেটিকে এক্সট্র্যাক্ট করে Coot-এ লোড করা হয়, এতে অনুপস্থিত সিকোয়েন্সটি ম্যানুয়ালি যোগ করা হয়, এবং দুটি BCl a (BCL) ও একটি স্পিরিলোক্সান্থিন (CRT) যোগ করার আগে সম্পূর্ণ কাঠামোটি ম্যানুয়ালি পরিমার্জন করা হয় [প্রাসঙ্গিক Rps প্রজাতি (17) অনুসারে LH1 কমপ্লেক্সের ঘনত্ব এবং পরিচিত ক্যারোটিনয়েড উপাদানের উপর ভিত্তি করে]। সম্পূর্ণ LH1 সাবইউনিটটি কপি করে, UCSF Chimera-এর “ডকিং ম্যাপ টুল” ব্যবহার করে LH1 ঘনত্বের সংলগ্ন নন-মডেল এলাকায় ডক করা হয়, এবং তারপর Coot-এ এটিকে পরিমার্জন করা হয়; সমস্ত LH1 সাবইউনিট মডেল করা না হওয়া পর্যন্ত এই প্রক্রিয়াটি পুনরাবৃত্তি করা হয়। RC-LH114-W কাঠামোর জন্য, Coot-এ অনাবন্টিত ঘনত্ব নিষ্কাশন করে, USCF কাইমেরা ম্যাপে অবশিষ্ট অ-প্রোটিন উপাদানগুলি থেকে প্রোটিনকে বিভক্ত করা হয় এবং প্রাথমিক মডেল স্থাপন করার জন্য অটোবিল্ড টুল ব্যবহার করা হয়, এবং PHENIX (49)-এ অবশিষ্ট সাবইউনিটগুলির (প্রোটিন-W) মডেলিং করা হয়। Coot (48)-এ প্রাপ্ত মডেলে যেকোনো অনুপস্থিত সিকোয়েন্স যোগ করা হয়, এবং তারপর সম্পূর্ণ সাবইউনিটটিকে ম্যানুয়ালি পরিমার্জন করা হয়। অবশিষ্ট অনাবন্টিত ঘনত্ব লিপিড (PDB মনোমার লাইব্রেরি ID CDL = CDL, POPC = 6PL এবং POPG = PGT), β-DDM ডিটারজেন্ট (LMT) এবং UQ10 অণু (U10)-এর সংমিশ্রণের সাথে খাপ খায়। PHENIX অপ্টিমাইজেশন (49) এবং Coot (48)-এ ম্যানুয়াল অপ্টিমাইজেশন ব্যবহার করে সম্পূর্ণ প্রাথমিক মডেলটিকে নিখুঁত করা হয় যতক্ষণ না মডেলের পরিসংখ্যান এবং ফিটের ভিজ্যুয়াল গুণমান আরও উন্নত করা যায়। অবশেষে, স্থানীয় মানচিত্রকে আরও স্পষ্ট করার জন্য LocScale (50) ব্যবহার করুন এবং তারপরে বরাদ্দহীন ঘনত্বের মডেলিং এবং স্বয়ংক্রিয় এবং ম্যানুয়াল অপ্টিমাইজেশনের আরও কয়েকটি চক্র সম্পাদন করুন।
চিত্র ১ এবং ২-এর S18 থেকে S23 অংশে, নিজ নিজ ঘনত্বের মধ্যে ডক করা সংশ্লিষ্ট পেপটাইড, কোফ্যাক্টর এবং অন্যান্য লিপিড ও কুইনোনসমূহ দেখানো হয়েছে। চূড়ান্ত মডেলের পরিসংখ্যানগত তথ্য সারণি S1-এ দেখানো হয়েছে।
অন্যথায় নির্দিষ্ট করা না থাকলে, UV/Vis/NIR শোষণ বর্ণালীগুলি একটি Cary60 স্পেকট্রোফটোমিটার (Agilent, USA) ব্যবহার করে 250 nm থেকে 1000 nm পর্যন্ত 1 nm ব্যবধানে এবং 0.1 সেকেন্ড ইন্টিগ্রেশন সময়ে সংগ্রহ করা হয়েছিল।
একটি ২ মিমি পথবিশিষ্ট কোয়ার্টজ কিউভেটে নমুনাটিকে A880-এর ১ গুণ ঘনত্বে লঘু করুন এবং ৪০০ থেকে ১০০০ nm-এর মধ্যে শোষণ বর্ণালী সংগ্রহ করুন। সার্কুলার ডাইক্রোইক বর্ণালীগুলো একটি Jasco 810 স্পেকট্রোপোলারাইমিটার (Jasco, Japan) ব্যবহার করে ৪০০ nm থেকে ৯৫০ nm-এর মধ্যে ১ nm ব্যবধানে ২০ nm min-1 স্ক্যান হারে সংগ্রহ করা হয়েছিল।
কোর কমপ্লেক্সকে প্রায় ৫০ এর A880 তে লঘু করে মোলার এক্সটিংশন কোএফিসিয়েন্ট নির্ধারণ করা হয়। ১০μl আয়তনকে ৯৯০μl বাইন্ডিং বাফার বা মিথানলে লঘু করুন, এবং BChl অবক্ষয় কমাতে অবিলম্বে শোষণ বর্ণালী সংগ্রহ করুন। প্রতিটি মিথানল নমুনার BChl পরিমাণ ৭৭১ nm এ ৫৪.৮ mM-1 cm-1 এর এক্সটিংশন কোএফিসিয়েন্ট দ্বারা গণনা করা হয়েছিল, এবং এক্সটিংশন কোএফিসিয়েন্ট নির্ধারণ করা হয়েছিল (51)। কোর কমপ্লেক্সের ঘনত্ব নির্ধারণ করতে পরিমাপ করা BChl ঘনত্বকে ৩২ (RC-LH114-W) বা ৩৬ (RC-LH116) দিয়ে ভাগ করুন, যা পরবর্তীতে বাফারে সংগৃহীত একই নমুনার শোষণ বর্ণালীর এক্সটিংশন কোএফিসিয়েন্ট নির্ধারণ করতে ব্যবহৃত হয়। সমান্তরালভাবে। প্রতিটি নমুনার জন্য তিনটি পুনরাবৃত্ত পরিমাপ নেওয়া হয়েছিল, এবং গণনার জন্য BChl Qy সর্বোচ্চের গড় শোষণ ব্যবহার করা হয়েছিল। ৮৭৮ nm-এ পরিমাপকৃত RC-LH114-W-এর বিলোপ গুণাঙ্ক হলো ৩২৮০±১৪০ mM-1 cm-1, অপরদিকে ৮৮০ nm-এ পরিমাপকৃত RC-LH116-এর বিলোপ গুণাঙ্ক হলো ৩৮০০±৩০ mM-1 cm-1।
(52) এ বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে UQ10 এর পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, Agilent 1200 HPLC সিস্টেম ব্যবহার করে রিভার্স ফেজ HPLC (RP-HPLC) করা হয়েছিল। প্রায় 0.02 nmol RC-LH116 বা RC-LH114-W 50μl 50:50 মিথানল:ক্লোরোফর্মে দ্রবীভূত করুন যাতে 0.02% (w/v) ফেরিক ক্লোরাইড রয়েছে, এবং একটি ×25 সেমি কলামে 40°C তাপমাত্রায় HPLC দ্রাবকে (80:20 মিথানল:2-প্রোপানল) 1 ml-1 min-1 হারে প্রি-ইকুইলিব্রেটেড Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm দ্রবীভূত ইনজেক্ট করুন। 1 ঘন্টা ধরে 275 nm (UQ10), 450 nm (ক্যারোটিনয়েড) এবং 780 nm (BChl) এ শোষণ পর্যবেক্ষণ করার জন্য HPLC দ্রাবকে আইসোক্র্যাটিক এলুশন সম্পাদন করুন। ২৫.৫ মিনিটে ২৭৫ nm ক্রোমাটোগ্রামের সর্বোচ্চ মানটি ইন্টিগ্রেট করা হয়েছিল, যেটিতে অন্য কোনো শনাক্তযোগ্য যৌগ ছিল না। ০ থেকে ৫.৮ nmol পর্যন্ত বিশুদ্ধ স্ট্যান্ডার্ড ইনজেকশনের মাধ্যমে গণনা করা ক্যালিব্রেশন কার্ভের সাপেক্ষে নিষ্কাশিত UQ10-এর মোলার পরিমাণ গণনা করার জন্য ইন্টিগ্রেটেড ক্ষেত্রফলটি ব্যবহার করা হয় (চিত্র S14)। প্রতিটি নমুনা তিনটি পুনরাবৃত্তিতে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল, এবং রিপোর্ট করা ত্রুটিটি গড়ের স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন (SD)-এর অনুরূপ।
সর্বোচ্চ ০.১ Qy শোষণযুক্ত RC-LH1 কমপ্লেক্স ধারণকারী একটি দ্রবণ ৩০ μM রিডিউসড হর্স হার্ট সাইটোক্রোম c2 (মার্চ, ইউকে) এবং ০ থেকে ৫০ μM UQ2 (মার্চ, ইউকে) দিয়ে প্রস্তুত করা হয়েছিল। প্রতিটি UQ2 ঘনত্বের জন্য তিনটি ১-মিলি নমুনা প্রস্তুত করা হয়েছিল এবং পরিমাপের আগে অন্ধকারের সাথে সম্পূর্ণ অভিযোজন নিশ্চিত করার জন্য সেগুলোকে ৪°C তাপমাত্রায় সারারাত অন্ধকারে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। দ্রবণটি একটি OLIS RSM1000 মডুলার স্পেকট্রোফটোমিটারে লোড করা হয়েছিল, যা একটি ৩০০ nm ফ্লেম/৫০০ লাইন গ্রেটিং, ১.২৪ মিমি ইনলেট, ০.১২ মিমি মিডল এবং ০.৬ মিমি আউটলেট স্লিট দিয়ে সজ্জিত ছিল। এক্সাইটেশন আলো বাদ দেওয়ার জন্য নমুনা ফটোটিউব এবং রেফারেন্স ফটোমাল্টিপ্লায়ার টিউবের প্রবেশপথে একটি ৬০০ nm লং পাস ফিল্টার স্থাপন করা হয়েছিল। ০.১৫ সেকেন্ড ইন্টিগ্রেশন সময় নিয়ে ৫৫০ nm-এ অ্যাবজর্বেন্স পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। উদ্দীপক আলো ৮৮০ nm M880F2 LED (লাইট এমিটিং ডায়োড) (থরল্যাবস লিমিটেড, ইউকে) থেকে একটি ফাইবার অপটিক কেবলের মাধ্যমে ৯০% তীব্রতায় একটি DC2200 কন্ট্রোলার (থরল্যাবস লিমিটেড, ইউকে) দ্বারা নির্গত হয় এবং আলোক উৎসের দিকে ৯০° কোণে নির্গত হয়। পরিমাপক রশ্মিটি আয়নার বিপরীতে থাকে, যাতে নমুনা দ্বারা প্রাথমিকভাবে শোষিত না হওয়া যেকোনো আলো ফিরে আসে। ৫০ সেকেন্ডের আলোকসজ্জার ১০ সেকেন্ড আগে শোষণ পর্যবেক্ষণ করুন। তারপর, কুইনোলল স্বতঃস্ফূর্তভাবে সাইটোক্রোম c23+ কে কী পরিমাণে হ্রাস করে তা মূল্যায়ন করার জন্য অন্ধকারে আরও ৬০ সেকেন্ড ধরে শোষণ পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল (কাঁচা ডেটার জন্য চিত্র S8 দেখুন)।
UQ2 ঘনত্বের উপর নির্ভর করে ০.৫ থেকে ১০ সেকেন্ডের মধ্যে একটি রৈখিক প্রাথমিক হার ফিট করে এবং প্রতিটি UQ2 ঘনত্বে তিনটি নমুনার হারের গড় নিয়ে ডেটা প্রক্রিয়াকরণ করা হয়েছিল। সংশ্লিষ্ট এক্সটিংশন কোএফিসিয়েন্ট দ্বারা গণনা করা RC-LH1 ঘনত্ব ব্যবহার করে হারকে অনুঘটকীয় দক্ষতায় রূপান্তরিত করা হয়েছিল, যা Origin Pro 2019 (OriginLab, USA)-এ প্লট করা হয় এবং আপাত Km ও Kcat মান নির্ধারণের জন্য মাইকেলিস-মেন্টেন মডেলে ফিট করা হয়।
ট্রানজিয়েন্ট অ্যাবজর্পশন পরিমাপের জন্য, RC-LH1 নমুনাটিকে IMAC বাফারে ~2μM ঘনত্বে লঘু করা হয়েছিল, যেটিতে 50 mM সোডিয়াম অ্যাসকরবেট (Merck, USA) এবং 0.4 mM টারবুটিন (Merck, USA) ছিল। অ্যাসকরবিক অ্যাসিড একটি স্যাক্রিফিসিয়াল ইলেকট্রন ডোনার হিসেবে এবং টারট-বিউটাক্লোফেন একটি QB ইনহিবিটর হিসেবে ব্যবহৃত হয়, যাতে পরিমাপ প্রক্রিয়া জুড়ে প্রধান RC ডোনারটি রিডিউসড (অর্থাৎ, ফটোঅক্সিডাইজড নয়) থাকে। প্রায় 3 ml নমুনা একটি কাস্টম রোটেটিং সেলে (ব্যাস প্রায় 0.1 মিটার, 350 RPM) যোগ করা হয়, যার অপটিক্যাল পথের দৈর্ঘ্য 2 mm, যাতে লেজার পথের মধ্যে থাকা নমুনাটি এক্সাইটেশন পালসগুলোর মাঝে ডার্ক অ্যাডাপটেশনের জন্য যথেষ্ট সময় পায়। Ti: Sapphire লেজার সিস্টেমকে (Spectra Physics, USA) বিবর্ধিত করতে ~100-fs লেজার পালস ব্যবহার করা হয়, যা 880 nm তরঙ্গদৈর্ঘ্যে 1 kHz রিপিটেশন রেটে নমুনাটিকে এক্সাইট করে (NIR-এর জন্য 20 nJ বা Vis-এর জন্য 100 nJ)। ডেটা সংগ্রহের আগে, নমুনাটিকে প্রায় ৩০ মিনিটের জন্য উদ্দীপক আলোর সংস্পর্শে আনুন। এই সংস্পর্শের ফলে QA নিষ্ক্রিয় হয়ে যাবে (সম্ভবত QA একবার বা দুইবার হ্রাস পাবে)। তবে অনুগ্রহ করে মনে রাখবেন যে এই প্রক্রিয়াটি বিপরীতমুখী, কারণ দীর্ঘ সময় ধরে অন্ধকারে রাখার পর, RC ধীরে ধীরে QA সক্রিয়তায় ফিরে আসবে। -১০ থেকে ৭০০০ পিকোসেকেন্ড বিলম্ব সময় সহ ট্রানজিয়েন্ট স্পেকট্রা পরিমাপ করার জন্য একটি হেলিওস স্পেকট্রোমিটার (আল্ট্রাফাস্ট সিস্টেমস, ইউএসএ) ব্যবহার করা হয়েছিল। ডেটা সেটগুলোকে আলাদা করতে, তারপর একত্রিত ও মানসম্মত করতে সারফেস এক্সপ্লোরার সফটওয়্যার (আল্ট্রাফাস্ট সিস্টেমস, ইউএসএ) ব্যবহার করুন। ক্ষয় সম্পর্কিত ডিফারেনশিয়াল স্পেকট্রা পাওয়ার জন্য সম্মিলিত ডেটা সেট ব্যবহার করতে কার্পেটভিউ সফটওয়্যার প্যাকেজ (লাইট কনভার্সন লিমিটেড, লিথুয়ানিয়া) ব্যবহার করুন, অথবা অরিজিন (অরিজিনল্যাব, ইউএসএ)-এ একক-তরঙ্গদৈর্ঘ্যের স্পেকট্রাল বিবর্তন ফিট করার জন্য এমন একটি ফাংশন ব্যবহার করুন যা যন্ত্রের প্রতিক্রিয়ার সাথে একাধিক এক্সপোনেন্টকে কনভলভ করে।
উপরে উল্লিখিত (53) অনুযায়ী, RC এবং পেরিফেরাল LH2 অ্যান্টেনা উভয়ই অনুপস্থিত LH1 কমপ্লেক্স ধারণকারী একটি সালোকসংশ্লেষী ফিল্ম প্রস্তুত করা হয়েছিল। মেমব্রেনটিকে 20 mM ট্রিস (pH 8.0) এ পাতলা করা হয়েছিল এবং তারপরে 2 মিমি অপটিক্যাল পথ সহ একটি কোয়ার্টজ কিউভেটে লোড করা হয়েছিল। নমুনাটিকে 540 nm এ উত্তেজিত করার জন্য -10 থেকে 7000 ps বিলম্ব সময় সহ একটি 30nJ লেজার পালস ব্যবহার করা হয়েছিল। Rps. pal নমুনার জন্য বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে ডেটা সেটটি প্রক্রিয়া করুন।
ঝিল্লিটিকে 4°C তাপমাত্রায় 2 ঘন্টা ধরে 150,000 RCF গতিতে সেন্ট্রিফিউগেশন করে জমাটবদ্ধ করা হয়েছিল, এবং তারপর 880 nm-এ এর শোষণমাত্রা 20 mM ট্রিস-এইচসিএল (pH 8.0) এবং 200 mM NaCl-এ পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল। 4°C তাপমাত্রায় অন্ধকারে 1 ঘন্টা ধরে 2% (w/v) β-DDM-এ ধীরে ধীরে নাড়িয়ে ঝিল্লিটিকে দ্রবীভূত করা হয়েছিল। নমুনাটিকে 100 mM ট্রাইইথাইলঅ্যামোনিয়াম কার্বনেট (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK)-এ 2.5 mg ml-1 (Bio-Rad বিশ্লেষণ) প্রোটিন ঘনত্বে লঘু করা হয়েছিল। পরবর্তী প্রক্রিয়াকরণ পূর্বে প্রকাশিত পদ্ধতি (54) থেকে করা হয়েছিল, যা 1% (w/v) সোডিয়াম লরেট (Merck, UK) ধারণকারী মোট 50 μl TEAB-এ 50 μg প্রোটিন লঘু করার মাধ্যমে শুরু হয়েছিল। ৬০ সেকেন্ড ধরে সনিকেশনের পর, এটিকে ৩৭°C তাপমাত্রায় ৩০ মিনিটের জন্য ৫ mM ট্রিস(২-কার্বক্সিইথাইল)ফসফিন (মার্ক, ইউকে) দিয়ে বিজারিত করা হয়েছিল। এস-অ্যালকাইলেশনের জন্য, নমুনাটিকে ১০ mM মিথাইল এস-মিথাইলথায়োমিথেনসালফোনেট (মার্ক, ইউকে) দিয়ে ইনকিউবেট করা হয় এবং এটি ২০০ mM আইসোপ্রোপানল স্টক দ্রবণ থেকে যোগ করে কক্ষ তাপমাত্রায় ১০ মিনিটের জন্য রাখা হয়। ২ μg ট্রিপসিন/এন্ডোপ্রোটিনেজ লাইস-সি মিশ্রণ (প্রোমেগা ইউকে) যোগ করে প্রোটিওলাইটিক ডাইজেশন সম্পন্ন করা হয় এবং ৩৭°C তাপমাত্রায় ৩ ঘন্টা ইনকিউবেট করা হয়। ৫০ μl ইথাইল অ্যাসিটেট এবং ১০ μl ১০% (v/v) এলসি গ্রেড ট্রাইফ্লুরোঅ্যাসিটিক অ্যাসিড (টিএফএ; থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ইউকে) যোগ করে ৬০ সেকেন্ড ধরে ভর্টেক্সিং করার মাধ্যমে লরেট সারফ্যাক্ট্যান্ট নিষ্কাশন করা হয়। ১৫,৭০০ RCF গতিতে ৫ মিনিট ধরে সেন্ট্রিফিউগেশন করে ফেজ পৃথকীকরণ ত্বরান্বিত করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে, পেপটাইডযুক্ত নিম্ন ফেজটিকে সাবধানে অ্যাসপিরেট ও ডিসল্ট করার জন্য একটি C18 স্পিন কলাম (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ইউকে) ব্যবহার করা হয়েছিল। ভ্যাকুয়াম সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা শুকানোর পর, নমুনাটিকে ০.৫% TFA এবং ৩% অ্যাসিটোনাইট্রাইলে দ্রবীভূত করা হয় এবং পূর্বে বর্ণিত সিস্টেম প্যারামিটার ব্যবহার করে মাস স্পেকট্রোমেট্রির সাথে সংযুক্ত ন্যানোফ্লো RP ক্রোমাটোগ্রাফির মাধ্যমে ৫০০ ন্যানোগ্রাম নমুনা বিশ্লেষণ করা হয়।
প্রোটিন শনাক্তকরণ এবং পরিমাণ নির্ধারণের জন্য MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ব্যবহার করে Rps. palustris প্রোটিওম ডেটাবেস (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) অনুসন্ধান করুন। ভর বর্ণালিবীক্ষণ প্রোটিওমিক্স ডেটা PRIDE অংশীদার সংগ্রহস্থলের (http://proteomecentral.proteomexchange.org) মাধ্যমে ProteomeXchange Alliance-এ PXD020402 ডেটাসেট শনাক্তকারীর অধীনে জমা দেওয়া হয়েছে।
ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়োনাইজেশন মাস স্পেকট্রোমেট্রির সাথে সংযুক্ত RPLC দ্বারা বিশ্লেষণের জন্য, ওয়াইল্ড-টাইপ Rps থেকে RC-LH1 কমপ্লেক্সটি প্রস্তুত করা হয়েছিল। পূর্বে প্রকাশিত পদ্ধতি (16) ব্যবহার করে, প্যালুস্ট্রিস কোষে উৎপাদিত প্রোটিনের ঘনত্ব ছিল 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl এবং 0.03% (w/v) β- (বায়ো-র‍্যাড বিশ্লেষণ) ) DDM-এ 2 mg ml-1। প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে, অধঃক্ষেপণ পদ্ধতিতে 10 μg প্রোটিন নিষ্কাশন করতে 2D পিউরিফিকেশন কিট (GE Healthcare, USA) ব্যবহার করা হয়, এবং অধঃক্ষেপটিকে 20 μl 60% (v/v) ফর্মিক অ্যাসিড (FA), 20% (v/v) অ্যাসিটোনাইট্রাইল এবং 20% (v/v) জলে দ্রবীভূত করা হয়। পাঁচ মাইক্রোলিটার নমুনা মাস স্পেকট্রোমেট্রি (Maxis UHR-TOF, Bruker) এর সাথে সংযুক্ত RPLC (Dionex RSLC) দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ৬০°C তাপমাত্রায় এবং ১০০μlmin⁻¹ প্রবাহ হারে পৃথকীকরণের জন্য MabPac ১.২×১০০ মিমি কলাম (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ইউকে) ব্যবহার করুন। এক্ষেত্রে ৮৫% (v/v) সলভেন্ট A [০.১% (v/v) FA এবং ০.০২% (V/v) TFA-এর জলীয় দ্রবণ] থেকে ৮৫% (v/v) সলভেন্ট B [৯০% (v/v) অ্যাসিটোনাইট্রাইলে ০.১% (v/v) FA এবং ০.০২% (v/v) TFA]-এর একটি গ্রেডিয়েন্ট প্রয়োগ করুন। স্ট্যান্ডার্ড ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়োনাইজেশন সোর্স এবং ডিফল্ট প্যারামিটার ব্যবহার করে ৬০ মিনিটের বেশি সময় ধরে পরীক্ষা চালালে, মাস স্পেকট্রোমিটার ১০০ থেকে ২৭৫০ m/z (ভর-থেকে-চার্জ অনুপাত) মান অর্জন করে। ExPASy বায়োইনফরমেটিক্স রিসোর্স পোর্টালের FindPept টুলের (https://web.expasy.org/findpept/) সাহায্যে, কমপ্লেক্সটির সাবইউনিটগুলোতে মাস স্পেকট্রামটি ম্যাপ করুন।
কোষগুলোকে ৭২ ঘন্টা ধরে ১০০ মিলি এনএফ-নিম্ন (১০μMm-2 s-1), মাঝারি (৩০μMm-2 s-1) বা উচ্চ (৩০০μMm-2 s-1) আলোর অধীনে বৃদ্ধি করা হয়েছিল। একটি ১০০ মিলি স্ক্রু-টপ বোতলে (23) M22 মাধ্যম (M22 মাধ্যম যেখানে অ্যামোনিয়াম সালফেট বাদ দেওয়া হয়েছে এবং সোডিয়াম সাক্সিনেটের পরিবর্তে সোডিয়াম অ্যাসিটেট ব্যবহার করা হয়েছে)। পাঁচটি ৩০-সেকেন্ডের চক্রে, কোষগুলোকে লাইস করার জন্য ১:১ আয়তন অনুপাতে ০.১ মাইক্রন কাঁচের পুঁতি যোগ করা হয়েছিল এবং ৫ মিনিটের জন্য বরফে রেখে ঠান্ডা করা হয়েছিল। একটি বেঞ্চটপ মাইক্রোসেন্ট্রিফিউজে ১৬,০০০ RCF গতিতে ১০ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউগেশন করে অদ্রবণীয় পদার্থ, অক্ষত কোষ এবং কাঁচের পুঁতি অপসারণ করা হয়েছিল। মেমব্রেনটিকে একটি Ti 70.1 রোটরে ১০০,০০০ RCF গতিতে ২০ mM ট্রিস-এইচসিএল (pH ৮.০) দ্রবণে ৪০/১৫% (w/w) সুক্রোজ গ্রেডিয়েন্ট ব্যবহার করে ১০ ঘণ্টা ধরে পৃথক করা হয়েছিল।
আমাদের পূর্ববর্তী কাজে বর্ণিত হিসাবে, PufW (16)-তে His ট্যাগের ইমিউনোডিটেকশন করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, বিশুদ্ধ কোর কমপ্লেক্স (11.8 nM) অথবা একই ঘনত্বের RC (অক্সিডেশন দ্বারা নির্ধারিত, হ্রাসকৃত পার্থক্য বর্ণালী বিয়োগ করে এবং স্টেইন করা জেলের লোডের সাথে মিলিয়ে) ধারণকারী মেমব্রেনকে 2x SDS লোডিং বাফারে (Merck, UK) দ্বিগুণ পাতলা করা হয়েছিল। প্রোটিনগুলিকে একটি রেপ্লিকা 12% বিস-ট্রিস নু-পেজ জেলে (Thermo Fisher Scientific, UK) পৃথক করা হয়েছিল। RC-L সাবইউনিট লোড এবং দৃশ্যমান করার জন্য জেলটিকে কুমাশি ব্রিলিয়ান্ট ব্লু (Bio-Rad, UK) দিয়ে স্টেইন করা হয়েছিল। ইমিউনোঅ্যাসের জন্য দ্বিতীয় জেলের প্রোটিনটিকে মিথানল-অ্যাক্টিভেটেড পলিভিনাইলিডিন ফ্লোরাইড (PVDF) মেমব্রেনে (Thermo Fisher Scientific, UK) স্থানান্তর করা হয়েছিল। PVDF মেমব্রেনটিকে 50 mM ট্রিস-এইচসিএল (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) টুইন-20 এবং 5% (w/v) স্কিমড মিল্ক পাউডার দিয়ে ব্লক করা হয়েছিল, এবং তারপর অ্যান্টি-হিস প্রাইমারি অ্যান্টিবডির (অ্যান্টিবডি বাফার [50 mM ট্রিস-এইচসিএল (pH 7.6), 150 mM NaCl এবং 0.05% (v/v) টুইন-20] 1:1000 অনুপাতে পাতলা করে A190-114A, বেথিল ল্যাবরেটরিজ, ইউএসএ) সাথে ৪ ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। অ্যান্টিবডি বাফারে ৫ মিনিট করে ৩ বার ধোয়ার পর, মেমব্রেনটিকে হর্সরেডিশ পারঅক্সিডেজ (সিগমা-অলড্রিচ, ইউকে) অ্যান্টি-মাউস সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডির (অ্যান্টিবডি বাফারে ১:১০,০০০ অনুপাতে লঘুকৃত) সাথে সংযুক্ত করা হয়। ওয়েস্টার ইটিএ সি ২.০ কেমিলুমিনেসেন্স সাবস্ট্রেট (সায়ানাজেন, ইতালি) এবং অ্যামারশ্যাম ইমেজার ৬০০ (জিই হেলথকেয়ার, ইউকে) ব্যবহার করে শনাক্তকরণের জন্য ইনকিউবেট করা হয় (অ্যান্টিবডি বাফারে ৩ বার ধোয়ার পর ৫ মিনিট)।
প্রতিটি স্টেইনড জেল বা ইমিউনোঅ্যাসে লেনের ইনটেনসিটি ডিস্ট্রিবিউশন অঙ্কন করে, পিকের নীচের ক্ষেত্রফলকে ইন্টিগ্রেট করে এবং RC-L (স্টেইনড জেল) এবং প্রোটিন-W (ইমিউনোঅ্যাসে)-এর ইনটেনসিটি অনুপাত গণনা করে, ImageJ (57)-তে চিত্রটি প্রসেস করুন। বিশুদ্ধ RC-LH114-W নমুনায় RC-L এবং প্রোটিন-W-এর অনুপাত 1:1 ধরে নিয়ে এবং সেই অনুযায়ী সম্পূর্ণ ডেটা সেটকে নর্মালাইজ করে এই অনুপাতগুলিকে মোলার অনুপাতে রূপান্তরিত করা হয়েছিল।
এই প্রবন্ধের সম্পূরক উপকরণের জন্য, অনুগ্রহ করে http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 দেখুন।
এটি ক্রিয়েটিভ কমন্স অ্যাট্রিবিউশন লাইসেন্সের শর্তাবলীর অধীনে বিতরণ করা একটি উন্মুক্ত প্রবেশাধিকার নিবন্ধ। মূল কাজটি যথাযথভাবে উদ্ধৃত করার শর্তে, নিবন্ধটি যেকোনো মাধ্যমে অবাধ ব্যবহার, বিতরণ এবং পুনরুৎপাদনের অনুমতি দেয়।
দ্রষ্টব্য: আমরা শুধুমাত্র আপনার ইমেল ঠিকানাটি এই কারণে প্রদান করতে অনুরোধ করছি, যাতে আপনি যাকে এই পেজটি সুপারিশ করছেন, তিনি যেন জানতে পারেন যে আপনি চান তিনি ইমেলটি দেখুন এবং এটি কোনো স্প্যাম নয়। আমরা কোনো ইমেল ঠিকানা সংগ্রহ করব না।
আপনি একজন পরিদর্শক কিনা তা যাচাই করতে এবং স্বয়ংক্রিয় স্প্যাম জমা হওয়া রোধ করতে এই প্রশ্নটি ব্যবহার করা হয়।
ডেভিড জে কে সোয়েনসবেরি, পার্ক কিয়ান, ফিলিপ জে জ্যাকসন, কেইটলিন এম ফারিস, ডারিয়াস এম নিডজউইডজকি, এলিজাবেথ সি মার্টিন, ডেভিড এ ফার্মার, লর্না এ ম্যালোন, রেবেকা এফ থম্পসন, নিল এ র‍্যানসন, ড্যানিয়েল পি ক্যানিফ, মার্ক জে ডিকম্যান, ডিউই হোল্টেন, ক্রিস্টিন কিরমায়ার, অ্যান্ড্রু হিচকক, সি নিল হান্টার
বিক্রিয়া কেন্দ্রে অবস্থিত লাইট ট্র্যাপ ১ কমপ্লেক্সের উচ্চ-রেজোলিউশন কাঠামো কুইনোন গতিবিদ্যা সম্পর্কে নতুন অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে।
ডেভিড জে কে সোয়েনসবেরি, পার্ক কিয়ান, ফিলিপ জে জ্যাকসন, কেইটলিন এম ফারিস, ডারিয়াস এম নিডজউইডজকি, এলিজাবেথ সি মার্টিন, ডেভিড এ ফার্মার, লর্না এ ম্যালোন, রেবেকা এফ থম্পসন, নিল এ র‍্যানসন, ড্যানিয়েল পি ক্যানিফ, মার্ক জে ডিকম্যান, ডিউই হোল্টেন, ক্রিস্টিন কিরমায়ার, অ্যান্ড্রু হিচকক, সি নিল হান্টার
বিক্রিয়া কেন্দ্রে অবস্থিত লাইট ট্র্যাপ ১ কমপ্লেক্সের উচ্চ-রেজোলিউশন কাঠামো কুইনোন গতিবিদ্যা সম্পর্কে নতুন অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে।
©2021 আমেরিকান অ্যাসোসিয়েশন ফর দ্য অ্যাডভান্সমেন্ট অফ সায়েন্স। সমস্ত অধিকার সংরক্ষিত AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef এবং COUNTER এর অংশীদার। Science Advances ISSN 2375-2548.