বর্তমান†বর্তমান ঠিকানা: OX11 0DE, যুক্তরাজ্য, ডায়মন্ড বিল্ডিং, হারওয়েল সায়েন্স অ্যান্ড ইনোভেশন পার্ক, ডায়েটকোট, অক্সফোর্ডশায়ার, যুক্তরাজ্য, ডায়মন্ড লাইট সোর্স কোং লিমিটেড, ইলেকট্রনিক বায়োলজিক্যাল ইমেজিং সেন্টার।
বিক্রিয়া কেন্দ্র আলোক-সংগ্রহ জটিল ১ (RC-LH1) হল বেগুনি আলোক-সংশ্লেষণকারী ব্যাকটেরিয়ার মূল সালোকসংশ্লেষণকারী উপাদান। আমরা রোডোপসিউডোমোনাস প্যালাস্ট্রিস থেকে RC-LH1 কমপ্লেক্সের দুটি ক্রায়ো-ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপি কাঠামো চালু করেছি। RC-LH114-W কমপ্লেক্সের 2.65-Å রেজোলিউশন কাঠামোতে RC-কে ঘিরে 14টি সাবইউনিট LH1 লুপ রয়েছে, যা প্রোটিন W দ্বারা বাধাগ্রস্ত হয়, যখন প্রোটিন-W ছাড়া জটিলটি সম্পূর্ণরূপে RC দ্বারা বেষ্টিত RC রচনা। বন্ধ 16 সাবইউনিট LH1 লুপ। এই কাঠামোর তুলনা RC-LH1 কমপ্লেক্সে কুইননের গতিবিদ্যা সম্পর্কে অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে, যার মধ্যে RC QB সাইটে কুইনোন বাঁধার সময় পূর্বে অনির্ধারিত গঠনগত পরিবর্তনগুলি, সেইসাথে সহায়ক কুইনোন বাঁধাই স্থানগুলির অবস্থান অন্তর্ভুক্ত রয়েছে, যা তাদের RC-তে প্রেরণ করতে সহায়তা করে। W প্রোটিনের অনন্য কাঠামো LH1 লুপ বন্ধ হওয়া রোধ করে, যার ফলে কুইনোন/কুইনোলোন বিনিময় ত্বরান্বিত করার জন্য একটি চ্যানেল তৈরি করে।
সালোকসংশ্লেষণের মাধ্যমে প্রদত্ত শক্তি পৃথিবীর প্রায় সমস্ত জীবনকে টিকিয়ে রাখতে পারে এবং সৌর জৈবপ্রযুক্তির জন্য এর প্রচুর সম্ভাবনা রয়েছে। বিশ্বব্যাপী সালোকসংশ্লেষণকে উৎসাহিত করার পাশাপাশি, বেগুনি ফটোট্রফিক ব্যাকটেরিয়া বিভিন্ন শক্তির ধরণ এবং বিপাকীয় ক্ষমতাও প্রদর্শন করে। তারা সালোকসংশ্লেষণ এড়াতে পারে এবং অন্ধকারে হেটেরোট্রফিক ব্যাকটেরিয়া হিসেবে বৃদ্ধি পেতে পারে, নাইট্রোজেন এবং কার্বন ডাই অক্সাইড ঠিক করতে পারে, হাইড্রোজেন তৈরি করতে পারে এবং সুগন্ধযুক্ত যৌগগুলিকে হ্রাস করতে পারে (1-3)। এই প্রক্রিয়াগুলির জন্য শক্তি সরবরাহ করার জন্য, আলোকে দ্রুত এবং দক্ষতার সাথে রাসায়নিক শক্তিতে রূপান্তরিত করতে হবে। এই প্রক্রিয়াটি শুরু হয় যখন আলোক-ট্র্যাপিং অ্যান্টেনা কমপ্লেক্স আলো শোষণ করে এবং আটকে থাকা শক্তিকে বিক্রিয়া কেন্দ্রে (RC) স্থানান্তর করে, যার ফলে চার্জ পৃথকীকরণ শুরু হয় (4-7)। বেগুনি ফটোট্রফিক ব্যাকটেরিয়ায় সালোকসংশ্লেষণের মৌলিক একক টাইপ 2 RC দ্বারা গঠিত, যা আলোক-সংগ্রহ জটিল 1 (LH1) দ্বারা বেষ্টিত, RC-LH1 কোর জটিল গঠন করে। LH1 বাঁকা αβ হেটেরোডাইমারের একটি অ্যারে দ্বারা গঠিত, যার প্রতিটি দুটি ব্যাকটেরিয়া ক্লোরোফিল (BChl) অণু এবং একটি বা দুটি ক্যারোটিনয়েড (8-12) কে আবদ্ধ করে। সবচেয়ে সহজ LH1 অ্যান্টেনাটিতে 16 বা 17 αβ হেটেরোডাইমার থাকে যা একটি বন্ধ লুপে RC (9-13) কে ঘিরে রাখে, কিন্তু অন্যান্য মূল কমপ্লেক্সে, ট্রান্সমেমব্রেন পেপটাইডগুলি আশেপাশের LH1 এর ধারাবাহিকতা ব্যাহত করে, যার ফলে RC এবং সাইটোক্রোম bc1 কমপ্লেক্সের মধ্যে কুইনল/কুইনোন বিস্তার বৃদ্ধি পায় (11, 13-15)। বেগুনি ফটোট্রফিক উদ্ভিদ রোডোপসিউডোমোনাস (Rps.) একটি মডেল জীব যা সালোকসংশ্লেষণকে সমর্থন করে এমন শক্তি এবং ইলেকট্রন স্থানান্তর বুঝতে পারে। Rps-এর প্রথম স্ফটিক কাঠামো। প্যালাস্ট্রিস RC-LH1 কমপ্লেক্সের মডেল হল RC, যা 15টি হেটেরোডাইমেরিক LH1 লুপ দ্বারা বেষ্টিত, যা "প্রোটিন W" (14) নামক একটি অজানা প্রোটিন দ্বারা বাধাগ্রস্ত হয়। প্রোটিন-W পরবর্তীতে RPA4402 হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছিল, যা তিনটি পূর্বাভাসিত ট্রান্সমেমব্রেন হেলিসেস (TMH) (16) সহ একটি অ-চরিত্রযুক্ত 10.5kDa প্রোটিন। আমরা RPA4402 জিন এনকোডিং প্রোটিন W-এর নাম পরিবর্তন করে pufW করার প্রস্তাব করছি যাতে RC-L, M (pufL, pufM) এবং LH1α, β (pufA, pufB) সাবইউনিট এনকোডিং জিনের জন্য ব্যবহৃত নামকরণের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ হয়। মজার বিষয় হল, প্রোটিন-W RC-LH1-এর প্রায় 10%-এ উপস্থিত থাকে, যা প্রকাশ করে যে Rps. palustris দুটি ভিন্ন RC-LH1 কমপ্লেক্স তৈরি করে। এখানে, আমরা দুটি মূল কমপ্লেক্সের উচ্চ-রেজোলিউশন ক্রায়ো-EM (cryo-EM) কাঠামোর প্রতিবেদন করছি, একটিতে প্রোটিন W এবং 14 αβ হেটেরোডাইমার রয়েছে, অন্যটিতে প্রোটিন W নেই এবং একটি বদ্ধ 16 হেটেরোডাইমার LH1 লুপ রয়েছে। আমাদের কাঠামো Rps. palustris-এর RC-LH1 কমপ্লেক্সের বোঝাপড়ার একটি ধাপ পরিবর্তনের প্রতিনিধিত্ব করে, কারণ আমরা প্রতিটি রূপের সমজাতীয় জনসংখ্যা বিশ্লেষণ করেছি এবং প্রতিটি পেপটাইড এবং আবদ্ধ রঙ্গক এবং সম্পর্কিত লিপিড এবং কুইনোন স্পষ্টভাবে নির্ধারণ করার জন্য পর্যাপ্ত রেজোলিউশন রয়েছে। এই কাঠামোর তুলনা করলে দেখা যায় যে, তিনটি TMH প্রোটিন-W, যা এখনও পর্যন্ত অন্য কোনও RC-LH1 কমপ্লেক্সে পাওয়া যায়নি, কুইনোন/কুইনোলোন বিনিময় ত্বরান্বিত করার জন্য একটি কুইনোন চ্যানেল তৈরি করে। বেশ কিছু সংরক্ষিত লিপিড এবং কুইনোন বাইন্ডিং সাইট চিহ্নিত করা হয়েছে এবং কুইনোন এবং RC এর সংমিশ্রণের পরে আমরা একটি নতুন গঠনগত পরিবর্তন প্রকাশ করেছি, যা অক্সিজেনযুক্ত ফটোট্রফিক জীবের ফটোসিস্টেম II (PSII) RC এর জন্য উপযুক্ত হতে পারে। আমাদের অনুসন্ধানগুলি বেগুনি ফটোট্রফিক ব্যাকটেরিয়ার RC-LH1 কোর কমপ্লেক্সে কুইনোন/কুইনোলোন বাইন্ডিং এবং বিনিময়ের গতিবিদ্যা সম্পর্কে নতুন অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে।
Rps. palustris-এ পাওয়া দুটি কমপ্লেক্সের বিস্তারিত অধ্যয়নের সুবিধার্থে, আমরা জৈব রাসায়নিক পদ্ধতিতে প্রতিটি RC-LH1 আলাদা করেছি। প্রোটিন W-ঘাটতি কমপ্লেক্স (এরপরে ΔpufW হিসাবে উল্লেখ করা হয়েছে) pufW জিনের অভাবযুক্ত স্ট্রেন থেকে শুদ্ধ করা হয়েছিল (16), এবং শুধুমাত্র একটি RC-LH1 কমপ্লেক্স তৈরি করা যেতে পারে। প্রোটিন W-ধারণকারী কমপ্লেক্স একটি স্ট্রেন দ্বারা উত্পাদিত হয়। এই স্ট্রেনের প্রোটিন W তার C-টার্মিনাসে 10x His ট্যাগ দিয়ে পরিবর্তিত হয়, যাতে প্রোটিন W-ধারণকারী কমপ্লেক্সটি ধাতুকে স্থির করে বেশিরভাগ অভাবযুক্ত প্রোটিন W-এর সাথে কার্যকরভাবে মিলিত হতে পারে। কমপ্লেক্সটি কার্যকরভাবে পৃথক করা হয় (16) অ্যাফিনিটি ক্রোমাটোগ্রাফি (IMAC)।
চিত্র ১-এ দেখানো হয়েছে, উভয় কমপ্লেক্সে একটি তিনটি উপ-ইউনিট RC (RC-L, RC-M এবং RC-H) রয়েছে যা একটি LH1 অ্যান্টেনা দ্বারা বেষ্টিত। প্রোটিন-W অভাবযুক্ত কমপ্লেক্সের 2.80-A কাঠামোতে 16 αβ হেটেরোডাইমার দেখা যায়, যা RC কে সম্পূর্ণরূপে ঘিরে একটি বন্ধ LH1 লুপ তৈরি করে, যা পরবর্তীতে RC-LH116 কমপ্লেক্স হিসাবে উল্লেখ করা হয়েছে। প্রোটিন-W-ধারণকারী কমপ্লেক্সের 2.65Å কাঠামোতে একটি 14-হেটেরোডাইমার LH1 রয়েছে যা প্রোটিন-W দ্বারা বাধাগ্রস্ত, যা পরবর্তীতে RC-LH114-W হিসাবে উল্লেখ করা হয়েছে।
(A এবং B) যৌগের পৃষ্ঠ উপস্থাপনা। (C এবং D) রডগুলিতে প্রকাশিত বন্ধনীযুক্ত রঞ্জক। (E এবং F) সাইটোপ্লাজমিক পৃষ্ঠ থেকে পর্যবেক্ষণ করা জটিলগুলিতে কার্টুনে প্রদর্শিত পেপটাইড এবং LH1 সাবইউনিট রয়েছে এবং প্রোটিন-W ফাঁক থেকে ঘড়ির কাঁটার দিকে সংখ্যাযুক্ত [Rba সংখ্যার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। sphaeroides জটিল (13)]। LH1-α এর জন্য, প্রোটিন সাবইউনিটের রঙ হলুদ; LH1-β এর ​​জন্য, প্রোটিন সাবইউনিটের রঙ নীল; প্রোটিন-W এর জন্য, প্রোটিন লাল; RC-H এর জন্য, এটি সায়ান; RC-L এর জন্য, এটি কমলা; RC-M এর জন্য, ম্যাজেন্টা। সহ-উপাদানগুলি রড দ্বারা প্রতিনিধিত্ব করা হয়, সবুজ BChl এবং BPh a অণুকে প্রতিনিধিত্ব করে, বেগুনি ক্যারোটিনয়েডকে প্রতিনিধিত্ব করে এবং হলুদ UQ10 অণুকে প্রতিনিধিত্ব করে। (G এবং H) RC-LH114-W কমপ্লেক্স (G) এবং RC-LH116 কমপ্লেক্স (H) এর সমতুল্য অঞ্চলে প্রোটিন-W ফাঁকের বিবর্ধিত দৃশ্য। কোফ্যাক্টরগুলি স্থান পূরণের আকারে প্রদর্শিত হয়, চিলেটেড কুইনোন নীল রঙে প্রদর্শিত হয়। প্রোটিন-W ফাঁকটি (G) তে একটি নীল ড্যাশযুক্ত রেখা দ্বারা হাইলাইট করা হয়, এবং LH116 রিংয়ে কুইনোন/কুইনোল ছড়িয়ে থাকা ছোট ছোট ছিদ্রগুলি (H) তে একটি কালো ড্যাশযুক্ত রেখা দ্বারা হাইলাইট করা হয়।
চিত্র ১ (A এবং B) RC কে LH1αβ হেটেরোডাইমারের খোলা বা বন্ধ অ্যারে দ্বারা বেষ্টিত দেখায়, যার প্রতিটি দুটি BChl এবং একটি ক্যারোটিনয়েডকে আবদ্ধ করে (চিত্র ১, C এবং D)। পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে Rps হল LH1 জটিল। স্পিরুলিনা জ্যান্থিনের জৈব সংশ্লেষণ পথের মধ্যে, এই প্রজাতিগুলিতে ক্যারোটিনয়েডের মিশ্র জনসংখ্যা থাকে (17)। তবে, স্পিরোপাইরক্সানথিন হল প্রধান ক্যারোটিনয়েড এবং এর ঘনত্ব সন্তোষজনক। অতএব, আমরা সমস্ত LH1 বাঁধাই স্থানে স্পিরোক্সানথিন মডেল করার সিদ্ধান্ত নিয়েছি। আলফা এবং বিটা পলিপেপটাইডগুলি ছোট ঝিল্লি বহিরাগত অঞ্চল সহ একক TMH (চিত্র ১, A, B, E, এবং F)। যদিও C-টার্মিনাসে 17 টি অবশিষ্টাংশের ঘনত্ব পরিলক্ষিত হয়নি, উভয় জটিলতায় আলফা পলিপেপটাইড Met1 থেকে Ala46 এ বিভক্ত ছিল। RC-LH116-তে Gly4 থেকে Tyr52-তে β পলিপেপটাইড এবং RC-LH114-W-তে Ser5 থেকে Tyr52-তে β পলিপেপটাইড হ্রাস করা হয়েছিল। 3 বা 4 N-টার্মিনাল বা 13টি C-টার্মিনাল অবশিষ্টাংশের ঘনত্ব পরিলক্ষিত হয়নি (চিত্র S1)। বন্য-প্রকারের স্ট্রেন থেকে প্রস্তুত মিশ্র RC-LH1 কমপ্লেক্সের ভর স্পেকট্রোমেট্রি বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে অনুপস্থিত অঞ্চলটি এই পেপটাইডগুলির হেটেরোলগাস ক্লিভেজের ফলাফল (চিত্র S1 এবং S2)। α-Met1-এর N-টার্মিনাল ফর্মাইলেশনও পরিলক্ষিত হয়েছে (f)। বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে α-পেপটাইডে fMet1 থেকে Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 অবশিষ্টাংশ থাকে এবং β-পেপটাইডে Ser2 থেকে Ala53 অবশিষ্টাংশ থাকে, যা নিম্ন-তাপমাত্রার EM ঘনত্ব মানচিত্রের সাথে ভালোভাবে সামঞ্জস্যপূর্ণ।
α-His29 এবং β-His36 এর সমন্বয় BChls কে মুখোমুখি করে তোলে; প্রতিটি αβ হেটেরোডাইমার তার প্রতিবেশীদের সাথে একত্রিত হয়ে RC এর চারপাশে একটি খোলা লুপ (RC-LH114-W) অথবা একটি বন্ধ লুপ (RC-LH116) তৈরি করে। এক্সাইটন কাপলড পিগমেন্ট অ্যারে (চিত্র 1, C এবং D)। RC-LH114-W এর 877 nm ব্যান্ডের তুলনায়, RC-LH116 এর 880 nm শোষণ লাল স্থানান্তর 3 nm (চিত্র 2A)। যাইহোক, বৃত্তাকার দ্বি-দ্বিভাষা বর্ণালী প্রায় একই (চিত্র 2B), যা নির্দেশ করে যে খোলা এবং বন্ধ লুপের মধ্যে স্পষ্ট পার্থক্য থাকলেও, BChls এর স্থানীয় পরিবেশ খুব একই রকম। শোষণ লাল স্থানান্তর হ্রাস তাপীয় গতি এবং বন্ধ লুপের স্থিতিশীলতা বৃদ্ধির ফলাফল হতে পারে (18, 19), বন্ধ লুপের কারণে রঙ্গক সংযোগের পরিবর্তন (20, 21), অথবা এই দুটি প্রভাবের সংমিশ্রণ (11)।
(A) অতিবেগুনী/দৃশ্যমান/ইনফ্রারেডের কাছাকাছি শোষণ বর্ণালী, যার শিখরগুলি তাদের সংশ্লিষ্ট রঙ্গক দ্বারা চিহ্নিত করা হয় এবং 775 nm এ BPh শীর্ষে স্বাভাবিক করা হয়। (B) বৃত্তাকার দ্বি-দ্বিভূজ বর্ণালী 805 nm এ BChl শোষণে স্বাভাবিক করা হয়। (C এবং D) RC-LH114-W কমপ্লেক্স (C) এবং RC-LH116 কমপ্লেক্স (D) এর সময়-সমাধানকৃত শোষণ বর্ণালী থেকে নির্বাচিত ΔA বর্ণালী। আরও ভাল তুলনার জন্য, সমস্ত বর্ণালী 0.2 ps এ ∆A এর ∆A তে স্বাভাবিক করা হয়। (E) UQ2 এর বিভিন্ন ঘনত্বের উপস্থিতিতে বিকিরণের পরে সাইটোক্রোম c2 জারণের হার (কাঁচা তথ্যের জন্য চিত্র S8 দেখুন)। (F) নিম্ন, মাঝারি বা উচ্চ তীব্রতার আলোতে (যথাক্রমে 10, 30 বা 300μMm-2 s-1) বৃদ্ধিপ্রাপ্ত কোষগুলিতে, প্রোটিন W এবং RC-L বিশুদ্ধ জটিল এবং পৃথক ঝিল্লি অনুপাতের মধ্যে উপ-ইউনিট। SDS-পলিয়াক্রিলামাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস এবং ইমিউনোঅ্যাসে দ্বারা প্রোটিনের স্তর নির্ধারণ করুন (কাঁচা তথ্যের জন্য চিত্র S9 দেখুন)। পরিশোধিত RC-LH114-W কমপ্লেক্সের সাপেক্ষে অনুপাত নির্ধারণ করুন। কমপ্লেক্সের প্রোটিন-W এর সাথে RC-L এর স্টোইচিওমেট্রিক অনুপাত 1:1।
RC-LH114-W (চিত্র 1, A, C, এবং E) এর বিকৃত αβ14 লুপে অবস্থান 1-এ থাকা BChlগুলি RC-LH116 (চিত্র 1, B, D, এবং F, এবং চিত্র S3) এর সমতুল্য BChlগুলির তুলনায় RC প্রাথমিক দাতা (P) এর 6.8Å কাছাকাছি; তবে, দুটি কমপ্লেক্সের ক্ষণস্থায়ী শোষণ গতিবিদ্যা দেখায় যে RC-LH114-W এবং RC-LH116 এর জন্য, LH1 থেকে RC তে উত্তেজনা শক্তি স্থানান্তর সময় ধ্রুবক 40 ±4 এবং 44±3 ps (চিত্র 2)। , C এবং D, চিত্র S4 এবং সারণি S2)। RC এর মধ্যে ইলেকট্রনিক স্থানান্তরেও কোনও উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নেই (চিত্র S5 এবং সম্পর্কিত পরিপূরক পাঠ্য)। আমরা সন্দেহ করি যে LH1 এবং RC-P এর মধ্যে শক্তি স্থানান্তর সময়ের ঘনিষ্ঠ সঙ্গতি দুটি LH1 লুপের বেশিরভাগ BChl এর একই দূরত্ব, কোণ এবং সম্ভাব্য শক্তির কারণে। মনে হচ্ছে LH1 শক্তি প্যাটার্ন অন্বেষণ করে সর্বনিম্ন দূরত্বে পৌঁছানো সাবঅপ্টিমাল সাইট থেকে RC-তে সরাসরি শক্তি স্থানান্তরের চেয়ে দ্রুততর নয়। RC-LH114-W-তে ওপেন-লুপ LH1 লুপটি কাঠামোগত বিশ্লেষণের জন্য নিম্ন তাপমাত্রার পরিস্থিতিতেও তুচ্ছ তাপীয় গতির মধ্য দিয়ে যেতে পারে এবং RC 1-এর অবস্থানে βBChls-এর পিগমেন্টেশন দূরত্ব থেকে ঘরের তাপমাত্রায় দীর্ঘ αβ14 রিং কনফর্মেশন থাকে।
RC-LH116 কমপ্লেক্সে 32 BChls এবং 16 ক্যারোটিনয়েড রয়েছে এবং এর সামগ্রিক বিন্যাস থার্মোক্রোমাটিয়াম (Tch.) পিডপিডাম [প্রোটিন ডেটা ব্যাংক (PDB) ID 5Y5S] (9), থিওরহোডোভিব্রিও (Trv.) 970 স্ট্রেন (PDB ID 7C9R) (12) এবং সবুজ শৈবাল (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) থেকে প্রাপ্ত বিন্যাসের মতোই। সারিবদ্ধকরণের পরে, αβ হেটেরোডাইমারের অবস্থানে কেবলমাত্র ছোট বিচ্যুতি পরিলক্ষিত হয়েছিল, বিশেষ করে 1-5, 15 এবং 16 (চিত্র S6)। প্রোটিন-W এর উপস্থিতি LH1 এর গঠনের উপর উল্লেখযোগ্য প্রভাব ফেলে। এর তিনটি TMH ছোট লুপ দ্বারা সংযুক্ত, কমপ্লেক্সের লুমেন পাশে N-টার্মিনাল এবং সাইটোপ্লাজমিক পাশে C-টার্মিনাল (চিত্র 1A এবং 3, A থেকে D)। প্রোটিন-ডব্লিউ মূলত হাইড্রোফোবিক (চিত্র 3B), এবং TMH2 এবং TMH3 LH1αβ-14 এর সাথে মিথস্ক্রিয়া করে একটি ট্রান্সমেমব্রেন পৃষ্ঠ তৈরি করে (চিত্র 3, B এবং E থেকে G)। ইন্টারফেসটি মূলত ট্রান্সমেমব্রেন অঞ্চলে Phe, Leu এবং Val অবশিষ্টাংশ দ্বারা গঠিত। এই অবশিষ্টাংশগুলি হাইড্রোফোবিক অ্যামিনো অ্যাসিড এবং αβ-14 রঙ্গক দ্বারা সজ্জিত। কিছু মেরু অবশিষ্টাংশও মিথস্ক্রিয়ায় অবদান রাখে, যার মধ্যে জটিল গহ্বরের পৃষ্ঠে W-Thr68 এবং β-Trp42 এর মধ্যে হাইড্রোজেন বন্ধন অন্তর্ভুক্ত (চিত্র 3, F এবং G)। সাইটোপ্লাজমের পৃষ্ঠে, Gln34 αβ-14 ক্যারোটিনয়েডের কেটো গ্রুপের সংলগ্ন। এছাড়াও, n-ডোডেসিল β-d-ম্যাল্টোসাইড (β-DDM) অণুটি দ্রবীভূত হয়েছিল, এবং এর হাইড্রোফোবিক লেজ প্রোটিন-ডব্লিউ এবং αβ-14 এর মধ্যে ইন্টারফেসে প্রসারিত হয়েছিল এবং লিপিড লেজটি শরীরে অবস্থিত হতে পারে। আমরা আরও লক্ষ্য করেছি যে প্রোটিন W এবং RCH-এর C-টার্মিনাল রেজোলিউশন অঞ্চলগুলি খুব কাছাকাছি, কিন্তু নির্দিষ্ট মিথস্ক্রিয়া গঠনের সুযোগের মধ্যে নয় (চিত্র 1, A এবং E)। তবে, এই দুটি প্রোটিনের অমীমাংসিত C-টার্মিনাল অ্যামিনো অ্যাসিডে মিথস্ক্রিয়া থাকতে পারে, যা RC-LH114-W কমপ্লেক্সের সমাবেশের সময় প্রোটিন-W নিয়োগের জন্য একটি প্রক্রিয়া প্রদান করতে পারে।
(A) কার্টুন আকারে LH1αβ14 এর সাথে ইন্টারফেসের মুখোমুখি প্রোটিন-W এর একটি রড-আকৃতির পার্শ্ব শৃঙ্খল (লাল) রয়েছে, যা ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক বিভব চিত্রের একটি অংশে প্রদর্শিত হয় (স্বচ্ছ ধূসর পৃষ্ঠ যার কনট্যুর স্তর 0.13)। (B) প্রোটিন-W একটি জল-বিভব রঙের পৃষ্ঠ দ্বারা প্রতিনিধিত্ব করা হয়। মেরু এবং চার্জিত অঞ্চলগুলি সায়ান রঙে প্রদর্শিত হয়, জল-বিভব অঞ্চলগুলি সাদা রঙে প্রদর্শিত হয় এবং তীব্র জল-বিভব অঞ্চলগুলি কমলা রঙে প্রদর্শিত হয়। (C এবং D) কার্টুনে প্রতিনিধিত্ব করা প্রোটিন-W, এর অভিমুখ (A) (C) এর মতোই, এবং 180° (D) দ্বারা ঘোরানো হয়। ক্রমানুসারে অবস্থান অনুসারে, পার্থক্যযোগ্য অবশিষ্টাংশগুলি একটি রংধনু রঙের স্কিম গ্রহণ করে, যেখানে N-টার্মিনাল নীল এবং C-টার্মিনাল লাল। (E) প্রোটিন-W (A) এর মতো একই দৃশ্যে, এবং প্রোটিন-W:LH1 এর ইন্টারফেসের অবশিষ্টাংশগুলি সংযুক্ত চিহ্ন সহ রড দ্বারা প্রতিনিধিত্ব করা হয়। (F) কার্টুন উপস্থাপনায় (E) এবং LH1αβ14 এর সাপেক্ষে প্রোটিন-W কে 90° ঘোরানো হয়েছে, এবং বার উপস্থাপনায় ইন্টারফেস অবশিষ্টাংশের সাপেক্ষে। বিটা পলিপেপটাইড থেকে ঝুলন্ত অবশিষ্টাংশগুলিকে লেবেল করা হয়েছে। চিত্র 1 এর রঙের সাথে মিলে যাওয়া একটি বার হিসাবে সহ-উপাদানটি দেখানো হয়েছে, পচনশীল β-DDM ধূসর রঙে দেখানো হয়েছে এবং অক্সিজেন লাল রঙে দেখানো হয়েছে। (G) (F) এর দৃশ্যটি 180° ঘোরানো হয়েছে, লেবেলযুক্ত আলফা পলিপেপটাইডের বিশিষ্ট অবশিষ্টাংশ সহ।
প্রোটিন-ডব্লিউ একটি αβ হেটেরোডাইমার (চিত্র 1F-এ 15তম) প্রতিস্থাপন করে, যার ফলে লুপ বন্ধ হওয়া রোধ হয় এবং প্রথম তিনটি αβ হেটেরোডাইমার কাত হয়। দেখা গেছে যে ফিল্ম নরমালের সাপেক্ষে প্রথম αβ-1 হেটেরোডাইমারের সর্বাধিক প্রবণতা কোণ ছিল 25° থেকে 29° (চিত্র 1, A এবং E), যা RC A-তে αβ-1-এর 2° থেকে 8° প্রবণতা দ্বারা গঠিত হয়েছিল তীব্র বৈপরীত্য-LH116 (চিত্র 1, B এবং F)। দ্বিতীয় এবং তৃতীয় হেটেরোডাইমারগুলি যথাক্রমে 12° থেকে 22° এবং 5° থেকে 10°-এ ঝুঁকে থাকে। RC-এর স্টেরিক বাধার কারণে, αβ-1-এর ঝুঁকিতে αβ-এর দ্বিতীয় জোড়া অন্তর্ভুক্ত থাকে না (যা চিত্র 1F-এ 16তম αβ-এর সাথে মিলে যায়), এইভাবে LH1 রিংয়ে একটি স্পষ্ট ফাঁক তৈরি হয় (চিত্র 1, A এবং E)। দুটি αβ হেটেরোডাইমারের অভাবের কারণে, চারটি BChl এবং দুটি ক্যারোটিনয়েডের ক্ষতির সাথে সাথে, কোনও ক্যারোটিনয়েডই বাঁকানো αβ-1 সাবইউনিটের সাথে আবদ্ধ হয় না, যার ফলে 13টি ক্যারোটিনয়েড নিরামিষ এবং 28টি BChl ধারণকারী একটি LH114-W রিং তৈরি হয়। αβ1 থেকে 7 অঞ্চলের দুটি কমপ্লেক্সের স্থানীয় রেজোলিউশন অনুমান LH1 লুপের বাকি অংশের তুলনায় কম, যা RC QB সাইটের সংলগ্ন LH1 সাবইউনিটের অন্তর্নিহিত প্লাস্টিসিটি প্রতিফলিত করতে পারে (চিত্র 4)।
চিত্র ১ (খ এবং ঘ) এর একই উপরের দৃশ্য/পার্শ্ব দৃশ্য (ক এবং খ) (ক এবং গ) এবং গহ্বর পৃষ্ঠ থেকে RC-LH114-W (ক এবং গ) এবং RC-LH116 (ক এবং গ) এর ছবিগুলি দেখানো হয়েছে। ডানদিকে রঙিন কীগুলি দেখানো হয়েছে।
১:১৪ স্টোইকিওমেট্রিক অনুপাত সহ একমাত্র বৈশিষ্ট্যযুক্ত কোর কমপ্লেক্স হল রোডোকোকাস স্ফেরোয়েডস (Rba.) RC-LH1-PufX ডাইমার (13)। তবে, প্রোটিন W এবং PufX এর কোনও স্পষ্ট সমরূপতা নেই এবং তাদের নিজ নিজ LH1 কাঠামোর উপর উল্লেখযোগ্য প্রভাব রয়েছে। PufX হল একটি একক TMH যার একটি N-টার্মিনাল সাইটোপ্লাজমিক ডোমেন রয়েছে যা Rps. palustris LH116αβ-16 এর সাথে সম্পর্কিত অবস্থানে RC-H সাবইউনিট (13) এর সাইটোপ্লাজমিক দিকের সাথে মিথস্ক্রিয়া করে। PufX RC-LH1 এবং সাইটোক্রোম bcl কমপ্লেক্সের মধ্যে কুইনোন/কুইনোলোন বিনিময়ের জন্য একটি চ্যানেল তৈরি করে এবং সমস্ত Rba. sphaeroides কোর কমপ্লেক্সে (13) উপস্থিত থাকে। যদিও মনোমার-মনোমার ইন্টারফেস Rba-তে রয়েছে। স্ফেরয়েডস RC-LH1-PufX ডাইমারটি RC-LH114-W-তে প্রোটিন W-এর বাঁধাই অবস্থানে অবস্থিত, এবং PufX এবং প্রোটিন-W দ্বারা প্ররোচিত ফাঁকটি সমতুল্য অবস্থানে রয়েছে (চিত্র S7A)। RC-LH114-W-তে ফাঁকটি Pseudomonas rosea LH1-এর কাল্পনিক কুইনোন চ্যানেল (8) এর সাথেও সংযুক্ত, যা প্রোটিন W বা PufX-এর সাথে সম্পর্কিত নয় এমন পেপটাইড দ্বারা গঠিত (চিত্র S7B)। এছাড়াও, Blc-তে কুইনোন চ্যানেল। একটি γ সাবইউনিট (7) বাদ দিয়ে গঠিত পান্না সবুজ LH1 একই অবস্থানে অবস্থিত (চিত্র S7C)। যদিও বিভিন্ন প্রোটিন দ্বারা মধ্যস্থতা করা হয়েছে, RC-LH1 কমপ্লেক্সে একটি সাধারণ অবস্থানে এই কুইনোন/কুইনোলল চ্যানেলগুলির উপস্থিতি অভিসারী বিবর্তনের একটি উদাহরণ বলে মনে হয়, যা নির্দেশ করে যে প্রোটিন W দ্বারা সৃষ্ট ফাঁকটি একটি কুইনোন চ্যানেল হিসাবে কাজ করতে পারে।
LH114-W লুপের ফাঁক RC-LH114-W কমপ্লেক্সের অভ্যন্তরীণ স্থান এবং বাল্ক মেমব্রেনের (চিত্র 1G) মধ্যে একটি অবিচ্ছিন্ন মেমব্রেনের অঞ্চল গঠনের অনুমতি দেয়, প্রোটিনের মতো প্রোটিন ছিদ্রের মাধ্যমে দুটি ডোমেনকে সংযুক্ত করার পরিবর্তে। RC-LH116 কমপ্লেক্সটি একটি বদ্ধ Tch. সূঁচের মতো কমপ্লেক্সের (22) (চিত্র 1H) অনুরূপ। যেহেতু ঝিল্লির মাধ্যমে কুইননের বিস্তার সংকীর্ণ প্রোটিন চ্যানেলের মাধ্যমে বিস্তারের চেয়ে দ্রুত, তাই খোলা LH114-W লুপ বন্ধ LH116 লুপের তুলনায় দ্রুত RC টার্নওভারের অনুমতি দিতে পারে এবং RC-তে কুইননের বিস্তার আরও সীমিত হতে পারে। প্রোটিন W RC-এর মাধ্যমে কুইনোনগুলির রূপান্তরকে প্রভাবিত করে কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য, আমরা ubiquinone 2 (UQ2) (প্রাকৃতিক UQ10 এর একটি অ্যানালগ যার একটি ছোট আইসোপ্রিন লেজ) (চিত্র 2E) এর একটি নির্দিষ্ট ঘনত্বের উপর একটি সাইটোক্রোম জারণ পরীক্ষা করেছি। যদিও চিলেটেড কুইননের উপস্থিতি আপাত মাইকেলিস ধ্রুবকের সঠিক নির্ণয়ে বাধা সৃষ্টি করে (RC-LH114-W এবং RC-LH116 যথাক্রমে 0.2±0.1μM এবং 0.5±0.2μM এর জন্য উপযুক্ত), RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) এর সর্বোচ্চ হার RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) এর চেয়ে 28±5% বেশি।
আমরা প্রাথমিকভাবে অনুমান করেছিলাম যে কোর কমপ্লেক্সের প্রায় ১০% তে প্রোটিন-ডব্লিউ উপস্থিত রয়েছে (১৬); এখানে, কম আলো, মাঝারি আলো এবং উচ্চ আলো বৃদ্ধির কোষের দখলের হার যথাক্রমে ১৫±০.৬%, ১১±১% এবং ০.৯±০.৫, % (চিত্র ২F)। ভর বর্ণালীর পরিমাণগত তুলনা দেখিয়েছে যে হিস্টিডিন ট্যাগ যোগ করার ফলে বন্য-প্রকারের স্ট্রেনের তুলনায় প্রোটিন-ডব্লিউ-এর আপেক্ষিক প্রাচুর্য হ্রাস পায়নি (P = ০.৫৯), তাই এই স্তরগুলি পরিবর্তিত প্রোটিন-ডব্লিউ-এর একটি নিদর্শন নয় (চিত্র S10)। যাইহোক, RC-LH1 কমপ্লেক্সে প্রোটিন-ডব্লিউ-এর এই কম দখল কিছু RC-কে ত্বরিত হারে উল্টে যেতে দেয়, যার ফলে RC-LH116 কমপ্লেক্সে ধীর কুইনোন/কুইনোলোন বিনিময় হ্রাস পায়। আমরা লক্ষ্য করেছি যে উচ্চ আলো ধারণের হার সাম্প্রতিক ট্রান্সক্রিপ্টমিক্স তথ্যের সাথে অসঙ্গতিপূর্ণ, যা নির্দেশ করে যে তীব্র আলোতে pufW জিনের প্রকাশ বৃদ্ধি পায় (চিত্র S11) (23)। RC-LH1 কমপ্লেক্সে pufW ট্রান্সক্রিপশন এবং প্রোটিন-W অন্তর্ভুক্তির মধ্যে পার্থক্য বিভ্রান্তিকর এবং প্রোটিনের জটিল নিয়ন্ত্রণকে প্রতিফলিত করতে পারে।
RC-LH114-W তে, 6টি কার্ডিওলিপিন (CDL), 7টি ফসফ্যাটিডিলকোলিন (POPC), 1টি ফসফ্যাটিডিলগ্লিসারল (POPG) এবং 29টি β-DDM অণু বরাদ্দ করা হয়েছে এবং এতে 6টি CDL, 24টি POPC, 2টি POPG এবং 12টি βDDM মডেল করা হয়েছে। RC-LH116 (চিত্র 5, A এবং B)। এই দুটি কাঠামোতে, CDL প্রায় কমপ্লেক্সের সাইটোপ্লাজমিক দিকে অবস্থিত, যেখানে POPC, POPG এবং β-DDM বেশিরভাগই লুমিনাল দিকে অবস্থিত। RC-LH114-W কমপ্লেক্সের αβ-1 থেকে αβ-6 অঞ্চলে দুটি লিপিড এবং ডিটারজেন্ট অণু বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল (চিত্র 5A), এবং পাঁচটি RC-LH116 (চিত্র 5B) এর সমতুল্য অঞ্চলে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। কমপ্লেক্সের অন্য দিকে আরও লিপিড পাওয়া গেছে, প্রধানত CDL, যা RC এবং αβ-7 থেকে αβ-13 এর মধ্যে জমা হয়েছে (চিত্র 5, A এবং B)। অন্যান্য কাঠামোগতভাবে দ্রবীভূত লিপিড এবং ডিটারজেন্টগুলি LH1 রিংয়ের বাইরে অবস্থিত, এবং ভালভাবে দ্রবীভূত অ্যাসিল শৃঙ্খলগুলি LH1 সাবইউনিটগুলির মধ্যে প্রসারিত, যা RC-LH114-W তে β-DDM হিসাবে অস্থায়ীভাবে মনোনীত করা হয়েছে এবং RC তে β-DDM হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছে। β-DDM এবং POPC-LH116 এর মিশ্রণ। আমাদের কাঠামোতে চেলেটিং লিপিড এবং ডিটারজেন্টের অনুরূপ অবস্থান নির্দেশ করে যে তারা শারীরবৃত্তীয়ভাবে প্রাসঙ্গিক বাঁধাই স্থান (চিত্র S12A)। Tch-তে সমতুল্য অণুর অবস্থানগুলিতেও ভাল সামঞ্জস্য রয়েছে। মৃদু এবং Trv। স্ট্রেন 970 RC-LH1s (চিত্র S12, B থেকে E) (9, 12) এবং লিপিড হেড গ্রুপের হাইড্রোজেন-বন্ধন অবশিষ্টাংশগুলি ক্রম সারিবদ্ধকরণে (চিত্র S13) মোটামুটি ভাল সংরক্ষণ দেখিয়েছে, যা নির্দেশ করে যে RC (24) এর সাথে আবদ্ধ সংরক্ষিত CDL, এই স্থানগুলি RC-LH1 কমপ্লেক্সে সংরক্ষণ করা যেতে পারে।
(A এবং B) RC-LH114-W (A) এবং RC-LH116 (B) পেপটাইডগুলিকে কার্টুন দ্বারা প্রতিনিধিত্ব করা হয়েছে, এবং রঙ্গকগুলিকে রড দ্বারা প্রতিনিধিত্ব করা হয়েছে, চিত্র 1-এর রঙ স্কিম ব্যবহার করে। লিপিডগুলিকে লাল রঙে দেখানো হয়েছে, এবং ডিটারজেন্টগুলিকে ধূসর রঙে দেখানো হয়েছে। RC QA এবং QB সাইটের সাথে আবদ্ধ UQ হলুদ, যেখানে বিচ্ছিন্ন UQ নীল। (C এবং D) লিপিড বাদ দিয়ে (A) এবং (B) এর মতো একই দৃশ্য। (E থেকে G) RC-LH116 থেকে Q1(E), Q2(F) এবং Q3(G) এর বর্ধিত দৃশ্য, যার পার্শ্ব শৃঙ্খল একে অপরকে প্রভাবিত করে। হাইড্রোজেন বন্ধনগুলিকে কালো ড্যাশযুক্ত রেখা হিসাবে দেখানো হয়েছে।
RC-LH116-তে, চার্জ পৃথকীকরণ প্রক্রিয়ায় ইলেকট্রন স্থানান্তরে অংশগ্রহণকারী RC QA এবং QB UQ উভয়ই তাদের বাঁধাই স্থানে পচে যায়। তবে, RC-LH114-W-তে, QB কুইনোন সমাধান করা হয়নি এবং নীচে বিস্তারিত আলোচনা করা হবে। QA এবং QB কুইনোন ছাড়াও, দুটি চেলেটেড UQ অণু (RC এবং LH1 রিংয়ের মধ্যে অবস্থিত) তাদের সু-সমাধানিত হেড গ্রুপ (যথাক্রমে Q1 এবং Q2-তে অবস্থিত) অনুসারে RC-LH114-W কাঠামোতে বরাদ্দ করা হয়েছে। চিত্র 5C)। Q1-তে দুটি আইসোপ্রিন ইউনিট বরাদ্দ করা হয়েছে, এবং ঘনত্ব মানচিত্র Q2-এর সম্পূর্ণ 10টি আইসোপ্রিন লেজ সমাধান করে। RC-LH116-এর কাঠামোতে, তিনটি চেলেটেড UQ10 অণু (Q1 থেকে Q3, চিত্র 5D) সমাধান করা হয়েছিল, এবং সমস্ত অণুর লেজ জুড়ে একটি স্পষ্ট ঘনত্ব রয়েছে (চিত্র 5, D থেকে G)। দুটি কাঠামোতে, Q1 এবং Q2 এর কুইনোন হেড গ্রুপের অবস্থানগুলি চমৎকার সামঞ্জস্যপূর্ণ (চিত্র S12F), এবং তারা কেবল RC এর সাথে মিথস্ক্রিয়া করে। Q1 RC-LH114-W (চিত্র 1G এবং 5, C, D এবং E) এর W ফাঁকের প্রবেশপথে অবস্থিত, এবং Q2 QB বাইন্ডিং সাইটের কাছে অবস্থিত (চিত্র 5, C, D) এবং F)। সংরক্ষিত L-Trp143 এবং L-Trp269 অবশিষ্টাংশ Q1 এবং Q2 এর খুব কাছাকাছি এবং সম্ভাব্য π-স্ট্যাকিং মিথস্ক্রিয়া প্রদান করে (চিত্র 5, E এবং F, এবং চিত্র S12)। Q1 এর দূরবর্তী অক্সিজেন থেকে L-Gln88, 3.0 Å, একটি শক্তিশালী হাইড্রোজেন বন্ধন প্রদান করে (চিত্র 5E); এই অবশিষ্টাংশ সবচেয়ে দূরবর্তী সম্পর্ক (চিত্র S13) ছাড়া সমস্ত RC তে সংরক্ষিত। অন্যান্য বেশিরভাগ RC-তে (চিত্র S13) Thr-এর পরিবর্তে L-Ser91 ব্যবহার করা হয়, যা Q1-এর মিথাইল অক্সিজেন থেকে 3.8 অ্যাংস্ট্রোম, এবং দুর্বল হাইড্রোজেন বন্ধন প্রদান করতে পারে (চিত্র 5E)। Q3-এর কোনও নির্দিষ্ট মিথস্ক্রিয়া নেই বলে মনে হয়, তবে এটি RC-M সাবইউনিট এবং LH1-α সাবইউনিট 5 থেকে 6 (চিত্র 5, D এবং G) এর মধ্যে হাইড্রোফোবিক অঞ্চলে অবস্থিত। Q1, Q2 এবং Q3 অথবা কাছাকাছি চেলেটেড কুইনোনগুলি Tch. Gentle, Trv. Strain 970 এবং Blc-তেও সমাধান করা হয়েছে। আইরিস গঠন (9, 10, 12) RC-LH1 কমপ্লেক্সে (চিত্র S12G) একটি সংরক্ষিত সহায়ক কুইনোন বাইন্ডিং সাইটের দিকে নির্দেশ করে। RC-LH116-এর পাঁচটি পচনশীল UQ উচ্চ কর্মক্ষমতাসম্পন্ন তরল ক্রোমাটোগ্রাফি (HPLC) দ্বারা নির্ধারিত প্রতিটি জটিলের 5.8±0.7 এর সাথে ভালোভাবে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যেখানে RC-LH114-W-এর তিনটি পচনশীল UQ 6.2±0.3 (চিত্র S14) এর পরিমাপিত মান থেকে কম নির্দেশ করে যে কাঠামোতে অমীমাংসিত UQ অণু রয়েছে।
ছদ্ম-প্রতিসম L এবং M পলিপেপটাইডগুলিতে পাঁচটি করে TMH থাকে এবং একটি হেটেরোডাইমার তৈরি করে যা একটি BChl ডাইমার, দুটি BChl মনোমার, দুটি ব্যাকটেরিওফেজ (BPh) মনোমার এবং একটি নন-হিম আয়রন এবং এক বা দুটি UQ10 অণুকে একত্রিত করে। টার্মিনাল কিটোন গ্রুপে হাইড্রোজেন বন্ধনের উপস্থিতি এবং Rps-এ এর পরিচিত জমার মাধ্যমে, ক্যারোটিনয়েডগুলি M-সাবইউনিটে অন্তর্ভুক্ত হয়, যা cis-3,4-ডিহাইড্রোঅরহোডোপিন নামে পরিচিত। প্রজাতি (25)। RC-H এর বাইরের ঝিল্লি ডোমেন একটি একক TMH দ্বারা ঝিল্লির সাথে নোঙর করা হয়। সামগ্রিক RC ​​কাঠামো সম্পর্কিত প্রজাতির (যেমন Rba) তিনটি সাবইউনিট RC-এর অনুরূপ। sphaeroides (PDB ID: 3I4D)। এই কাঠামোর রেজোলিউশন পরিসরের মধ্যে BChl এবং BPh, ক্যারোটিনয়েড ব্যাকবোন এবং নন-হিম আয়রনের ম্যাক্রোসাইকেলগুলি ওভারল্যাপ করে, যেমন QA সাইটে UQ10 হেড গ্রুপ এবং RC-LH116 (চিত্র S15) এ QB কুইনোন।
ভিন্ন QB সাইট দখল হার সহ দুটি RC কাঠামোর প্রাপ্যতা QB কুইনোন বাইন্ডিংয়ের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ গঠনগত পরিবর্তনগুলি পরীক্ষা করার জন্য একটি নতুন সুযোগ প্রদান করে। RC-LH116 কমপ্লেক্সে, QB কুইনোন সম্পূর্ণরূপে আবদ্ধ "প্রক্সিমাল" অবস্থানে অবস্থিত (26), কিন্তু RC-LH114-W এর বিচ্ছেদে QB কুইনোন থাকে না। RC-LH114-W তে কোনও QB কুইনোন নেই, যা আশ্চর্যজনক কারণ জটিলটি সক্রিয়, কাঠামোগতভাবে সমাধান করা QB কুইনোন সহ RC-LH116 কমপ্লেক্সের চেয়েও বেশি। যদিও দুটি LH1 রিং প্রায় ছয়টি কুইনোনকে চেলেট করে, পাঁচটি বন্ধ RC-LH116 রিংয়ে কাঠামোগতভাবে সমাধান করা হয়, যেখানে খোলা RC-LH114-W রিংয়ে কেবল তিনটি কাঠামোগতভাবে সীমাবদ্ধ। এই বর্ধিত কাঠামোগত ব্যাধি RC-LH114-W QB সাইটগুলির দ্রুত প্রতিস্থাপন, জটিলটিতে দ্রুত কুইনোন গতিবিদ্যা এবং LH1 লুপ অতিক্রম করার সম্ভাবনা বৃদ্ধিকে প্রতিফলিত করতে পারে। আমরা পরামর্শ দিচ্ছি যে RC-LH114-W এর RC QB সাইটে UQ এর অভাব আরও জটিল এবং আরও সক্রিয় জটিলতার ফলাফল হতে পারে এবং RC-LH114-W এর QB সাইটটি UQ টার্নওভারে অবিলম্বে হিমায়িত হয়ে গেছে। নির্দিষ্ট পর্যায় (QB সাইটের প্রবেশদ্বার বন্ধ করা হয়েছে) এই কার্যকলাপের গঠন প্রতিফলিত করে।
QB ছাড়া, L-Phe217 এর সাথে ঘূর্ণন এমন একটি অবস্থানে যা UQ10 বাইন্ডিংয়ের সাথে অসঙ্গতিপূর্ণ, কারণ এটি লেজের প্রথম আইসোপ্রিন ইউনিটের সাথে একটি স্থানিক সংঘর্ষের কারণ হবে (চিত্র 6A)। এছাড়াও, সুস্পষ্ট প্রধান গঠনগত পরিবর্তনগুলি স্পষ্ট, বিশেষ করে হেলিক্স ডি (TMH D এবং E এর মধ্যে লুপে সংক্ষিপ্ত হেলিক্স) যেখানে L-Phe217 QB বাইন্ডিং পকেটে স্থানান্তরিত হয় এবং L-Tyr223 এর ঘূর্ণন (চিত্র 6A) M-Asp45 ফ্রেমওয়ার্কের সাথে হাইড্রোজেন বন্ধন ভেঙে QB বাইন্ডিং সাইটের প্রবেশদ্বার বন্ধ করতে (চিত্র 6B)। হেলিক্স ডি এর ভিত্তির উপর পিভট করে, L-Ser209 এর Cα 0.33Å দ্বারা স্থানান্তরিত হয়, যখন L-Val221Cα 3.52Å দ্বারা স্থানান্তরিত হয়। TMH D এবং E তে কোনও পর্যবেক্ষণযোগ্য পরিবর্তন নেই, যা উভয় কাঠামোতেই সুপারইম্পোজেবল (চিত্র 6A)। আমরা যতদূর জানি, প্রাকৃতিক RC-তে এটিই প্রথম কাঠামো যা QB সাইটটিকে বন্ধ করে দেয়। সম্পূর্ণ (QB-আবদ্ধ) কাঠামোর সাথে তুলনা করলে দেখা যায় যে কুইনোন হ্রাস করার আগে, এটিকে কুইনোনে প্রবেশ করার জন্য একটি গঠনগত পরিবর্তন প্রয়োজন। L-Phe217 কুইনোন হেড গ্রুপের সাথে একটি π-স্ট্যাকিং মিথস্ক্রিয়া তৈরি করতে ঘোরে এবং হেলিক্স বাইরের দিকে সরে যায়, যার ফলে L-Gly222 এর কঙ্কাল এবং L-Tyr223 এর পার্শ্ব শৃঙ্খল একটি স্থিতিশীল হাইড্রোজেন বন্ধন কাঠামো সহ একটি হাইড্রোজেন বন্ধন নেটওয়ার্ক তৈরি করতে পারে (চিত্র 6, A এবং C)।
(A) হলোগ্রাম (L শৃঙ্খল, কমলা/M শৃঙ্খল, ম্যাজেন্টা) এবং apo (ধূসর) কাঠামোর ওভারল্যাপিং কার্টুন, যেখানে মূল অবশিষ্টাংশগুলি রডের মতো উপস্থাপনা আকারে প্রদর্শিত হয়। UQ10 একটি হলুদ বার দ্বারা প্রতিনিধিত্ব করা হয়। বিন্দুযুক্ত রেখাটি সমগ্র কাঠামোতে গঠিত হাইড্রোজেন বন্ধন নির্দেশ করে। (B এবং C) অ্যাপোলিপোপ্রোটিন এবং পুরো রিং কাঠামোর পৃষ্ঠ উপস্থাপনা, যথাক্রমে নীল রঙে L-Phe217 এবং লাল রঙে L-Tyr223 এর পার্শ্ব শৃঙ্খল অক্সিজেনকে হাইলাইট করে। L সাবইউনিট কমলা; M এবং H সাবইউনিটগুলি রঙিন নয়। (D এবং E) অ্যাপোলিপোপ্রোটিন (D) এবং সম্পূর্ণ (E) RC QB সাইটগুলি [যথাক্রমে (A) দ্বারা রঙ করা] এবং থার্মোফিলাস থার্মোফিলাস PSII (প্লাস্টিক কুইনোন সহ সবুজ, নীল; PDB ID: 3WU2) সারিবদ্ধ (58)।
অপ্রত্যাশিতভাবে, যদিও LH1 ছাড়া QB-ঘাটতি RC-এর বেশ কয়েকটি কাঠামো পাওয়া যায়, এই গবেষণায় পরিলক্ষিত গঠনগত পরিবর্তনগুলি আগে রিপোর্ট করা হয়নি। এর মধ্যে রয়েছে Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) এবং Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) থেকে QB হ্রাস কাঠামো, যার সবগুলিই তাদের সামগ্রিক QB কাঠামোর মতো প্রায় একই। 3PRC-এর নিবিড় পরিদর্শন থেকে জানা গেছে যে LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ডিটারজেন্ট অণুগুলি QB অবস্থানের প্রবেশদ্বারে আবদ্ধ হয়, যা একটি বদ্ধ গঠনে পুনর্বিন্যাস রোধ করতে পারে। যদিও LDAO 1EYS বা 1OGV-তে একই অবস্থানে পচে না, এই RCগুলি একই ডিটারজেন্ট ব্যবহার করে প্রস্তুত করা হয় এবং তাই একই প্রভাব তৈরি করতে পারে। Rba-এর স্ফটিক কাঠামো। সাইটোক্রোম c2 (PDB ID: 1L9B) এর সাথে সহ-স্ফটিকায়িত Sphaeroides RC-এর একটি বন্ধ QB সাইটও রয়েছে বলে মনে হয়। তবে, এই ক্ষেত্রে, RC-M পলিপেপটাইডের N-টার্মিনাল অঞ্চল (Q হেলিক্সে Tyr অবশিষ্টাংশের H বন্ধনের মাধ্যমে QB বাইন্ডিং সাইটের সাথে মিথস্ক্রিয়া করে) একটি অপ্রাকৃতিক গঠন গ্রহণ করে এবং QB গঠনগত পরিবর্তনটি আরও অনুসন্ধান করা হয় না (30)। আশ্বস্ত করার বিষয় হল যে আমরা RC-LH114-W কাঠামোতে M পলিপেপটাইডের এই ধরণের বিকৃতি দেখিনি, যা প্রায় RC-LH116 RC-এর N-টার্মিনাল অঞ্চলের মতো। এটিও উল্লেখ করা উচিত যে ডিটারজেন্ট-ভিত্তিক LH1 অ্যান্টেনা নির্মূল করার পরে, PDB-তে অ্যাপোলিপোপ্রোটিন RC গুলি সমাধান করা হয়েছিল, যা RC এবং পার্শ্ববর্তী LH1 রিংয়ের অভ্যন্তরীণ পৃষ্ঠের মধ্যে ফাঁকে অভ্যন্তরীণ কুইনোন পুল এবং লিপিডগুলিকে নির্মূল করেছিল (31, 32)। RC কার্যকর থাকে কারণ এটি সমস্ত সহ-উপাদান ধরে রাখে, পচনশীল QB কুইনোন ব্যতীত, যা কম স্থিতিশীল এবং প্রস্তুতি প্রক্রিয়ার সময় প্রায়শই হারিয়ে যায় (33)। এছাড়াও, এটি জানা যায় যে RC থেকে LH1 এবং প্রাকৃতিক চক্রীয় লিপিড অপসারণ ফাংশনের উপর প্রভাব ফেলতে পারে, যেমন চার্জ-বিচ্ছিন্ন P+QB-অবস্থার সংক্ষিপ্ত জীবনকাল (31, 34, 35)। অতএব, আমরা অনুমান করি যে RC-কে ঘিরে স্থানীয় LH1 বলয়ের অস্তিত্ব "বন্ধ" QB সাইটটি বজায় রাখতে পারে, যার ফলে QB-এর কাছাকাছি স্থানীয় পরিবেশ সংরক্ষণ করা যেতে পারে।
যদিও অ্যাপোলিপোপ্রোটিন (QB কুইনোন ছাড়া) এবং সম্পূর্ণ গঠন QB সাইটের টার্নওভারের মাত্র দুটি স্ন্যাপশট উপস্থাপন করে, একাধিক ঘটনার পরিবর্তে, এমন ইঙ্গিত রয়েছে যে হাইড্রোকুইনোন দ্বারা রিবাইন্ডিং প্রতিরোধ করার জন্য বাঁধাইকে গেট করা যেতে পারে সাবস্ট্রেট ইনহিবিশনকে বাধা দেওয়ার জন্য। অ্যাপোলিপোপ্রোটিনের QB সাইটের কাছে কুইনোল এবং কুইননের মিথস্ক্রিয়া ভিন্ন হতে পারে, যা RC দ্বারা এর প্রত্যাখ্যানের দিকে পরিচালিত করে। দীর্ঘদিন ধরে প্রস্তাব করা হয়েছে যে গঠনগত পরিবর্তনগুলি কুইনোনগুলির বাঁধাই এবং হ্রাসে ভূমিকা পালন করে। অন্ধকার অভিযোজনের পরে হিমায়িত RC-এর কুইনোন হ্রাস করার ক্ষমতা ব্যাহত হয় (36); এক্স-রে স্ফটিকগ্রাফি দেখায় যে এই ক্ষতি QB কুইনোনগুলি সক্রিয় প্রক্সিমাল অবস্থান থেকে প্রায় 4.5 Å "দূরবর্তী" গঠনে আটকে থাকার কারণে (26), 37)। আমরা পরামর্শ দিচ্ছি যে এই দূরবর্তী বাঁধাই গঠনটি অ্যাপোলিপোপ্রোটিন এবং পূর্ণ রিং কাঠামোর মধ্যবর্তী অবস্থার একটি স্ন্যাপশট, যা কুইননের সাথে প্রাথমিক মিথস্ক্রিয়া এবং QB সাইট খোলার পরে ঘটে।
নির্দিষ্ট কিছু ফটোট্রফিক ব্যাকটেরিয়া এবং সায়ানোব্যাকটেরিয়া, শৈবাল এবং উদ্ভিদের PSII কমপ্লেক্সে পাওয়া টাইপ II RC-এর কাঠামোগত এবং কার্যকরী সংরক্ষণ রয়েছে (38)। চিত্র 6 (D এবং E) তে দেখানো কাঠামোগত সারিবদ্ধতা PSII RC এবং ব্যাকটেরিয়া RC কমপ্লেক্সের QB সাইটের মধ্যে মিলের উপর জোর দেয়। এই তুলনাটি দীর্ঘদিন ধরে কুইনোন বাঁধাই এবং হ্রাসের ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত সিস্টেমগুলি অধ্যয়নের জন্য একটি মডেল। পূর্ববর্তী প্রকাশনাগুলি পরামর্শ দিয়েছিল যে কুইনোনগুলির PSII হ্রাসের সাথে গঠনমূলক পরিবর্তনগুলিও ঘটে (39, 40)। অতএব, RC-এর বিবর্তনীয় সংরক্ষণ বিবেচনা করে, এই পূর্বে অদৃশ্য বাঁধাই প্রক্রিয়াটি অক্সিজেনযুক্ত ফটোট্রফিক উদ্ভিদের PSII RC-এর QB সাইটের ক্ষেত্রেও প্রযোজ্য হতে পারে।
Rps ΔpufW (লেবেলবিহীন pufW মুছে ফেলা) এবং PufW-His (C-টার্মিনাল 10x His-ট্যাগযুক্ত প্রোটিন-W প্রাকৃতিক pufW লোকাস থেকে প্রকাশিত) স্ট্রেন। palustris CGA009 আমাদের পূর্ববর্তী কাজ (16) এ বর্ণনা করা হয়েছিল। এই স্ট্রেনগুলি এবং আইসোজেনিক ওয়াইল্ড-টাইপ প্যারেন্ট ফ্রিজার থেকে PYE (প্রতিটি 5 গ্রাম লিটার -1) (-80 °C তাপমাত্রায় LB-তে সঞ্চিত, 50% (w/v) গ্লিসারল) প্রোটিন, ইস্ট এক্সট্র্যাক্ট এবং সাক্সিনেট) আগর [1.5% (w/v)] প্লেটে অল্প সংখ্যক কোষ স্ট্রিক করে উদ্ধার করা হয়েছিল। অ্যানেরোবিক পরিস্থিতিতে ঘরের তাপমাত্রায় অন্ধকারে রাতারাতি প্লেটটি ইনকিউবেট করা হয়েছিল, এবং তারপর OSRAM 116-W হ্যালোজেন বাল্ব (RS Components, UK) দ্বারা সরবরাহিত সাদা আলো (~50 μmolm-2 s-1) দিয়ে 3 থেকে 5 দিনের জন্য আলোকিত করা হয়েছিল যতক্ষণ না একটি একক কলোনি উপস্থিত হয়। একটি একক কলোনি ব্যবহার করে ১০ মিলি M22+ মিডিয়াম (৪১) ০.১% (w/v) ক্যাসামিনো অ্যাসিড (এরপর থেকে M22 নামে পরিচিত) দিয়ে টিকা দেওয়া হয়। কালচারটি কম অক্সিজেনের পরিবেশে অন্ধকারে ৩৪°C তাপমাত্রায় ১৮০ rpm-এ ৪৮ ঘন্টা ধরে ঝাঁকানো হয় এবং তারপর ৭০ মিলি কালচার একই পরিবেশে ২৪ ঘন্টা ধরে টিকা দেওয়া হয়। ১ মিলি আয়তনের একটি আধা-বায়বীয় কালচার ব্যবহার করে ৩০ মিলি সর্বজনীন স্ক্রু-টপ স্বচ্ছ কাচের বোতলে ৩০ মিলি M22 মিডিয়াম টিকা দেওয়া হয় এবং জীবাণুমুক্ত চৌম্বক বল স্টিরিং রড দ্বারা ৪৮ ঘন্টা ধরে আন্দোলন (~৫০μmolm-২ s-১) দিয়ে বিকিরণ করা হয়। তারপর ৩০ মিলি কালচারে একই পরিবেশে প্রায় ১ লিটার কালচার ব্যবহার করা হয়, যা পরে ৭২ ঘন্টা ধরে ~২০০ μmolm-২ s-১-এ আলোকিত প্রায় ৯ লিটার কালচার টিকা দেওয়া হয়। কোষগুলিকে 7132 RCF তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে সংগ্রহ করা হয়েছিল, ~10 মিলি 20 mM tris-HCl (pH 8.0) এ পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং প্রয়োজন না হওয়া পর্যন্ত -20°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল।
গলানোর পর, পুনঃস্থাপিত কোষগুলিতে ডিঅক্সিরাইবোনিউক্লিজ I (Merck, UK), লাইসোজাইম (Merck, UK) এবং দুটি রোশ হোলোএনজাইম প্রোটিজ ইনহিবিটর ট্যাবলেট (Merck, UK) এর কিছু স্ফটিক যোগ করুন। একটি 20,000 psi ফরাসি চাপ কোষে (Aminco, USA), কোষগুলি 8 থেকে 12 বার ব্যাহত হয়েছিল। 4°C তাপমাত্রায় 15 মিনিটের জন্য 18,500 RCF তাপমাত্রায় সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে অবিচ্ছিন্ন কোষ এবং অদ্রবণীয় ধ্বংসাবশেষ অপসারণের পরে, 43,000°C তাপমাত্রায় 2 ঘন্টার জন্য 113,000 RCF তাপমাত্রায় সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে পিগমেন্টেড লাইসেট থেকে ঝিল্লিটি অবক্ষয়িত হয়েছিল। দ্রবণীয় ভগ্নাংশটি ফেলে দিন এবং রঙিন ঝিল্লিটি 100 থেকে 200 মিলি 20 mM tris-HCl (pH 8.0) এর মধ্যে পুনরায় সাসপেন্ড করুন এবং কোনও দৃশ্যমান সমষ্টি না পাওয়া পর্যন্ত একজাত করুন। ঝুলন্ত ঝিল্লিটি ২০ মিলিমিটার ট্রিস-এইচসিএল (পিএইচ ৮.০) (অ্যানাট্রেস, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) এ ২% (ডাব্লু/ভি) β-ডিডিএম ধারণকারী অবস্থায় ৪° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ১ ঘন্টা অন্ধকারে মৃদু নাড়তে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। তারপর ৭০° সেলসিয়াসে সেন্ট্রিফিউজ করে ১৫০,০০০ আরসিএফ দ্রবীভূত করে ৪° সেলসিয়াসে ১ ঘন্টা ধরে অবশিষ্ট অদ্রবণীয় পদার্থ অপসারণ করা হয়েছিল।
ΔpufW স্ট্রেন থেকে দ্রাব্য ঝিল্লিটি 50 মিলি DEAE সেফারোজ আয়ন বিনিময় কলামে প্রয়োগ করা হয়েছিল যার তিনটি কলাম ভলিউম (CV) বাইন্ডিং বাফার [20 mM tris-HCl (pH 8.0) যার মধ্যে 0.03% (w / v) β-DDM] রয়েছে। দুটি CV বাইন্ডিং বাফার দিয়ে কলামটি ধুয়ে ফেলুন, এবং তারপর 50 mM NaCl ধারণকারী দুটি বাইন্ডিং বাফার দিয়ে কলামটি ধুয়ে ফেলুন। RC-LH116 কমপ্লেক্সটি 1.75 CV-তে 150 থেকে 300 mM NaCl (বাইন্ডিং বাফারে) এর রৈখিক গ্রেডিয়েন্ট দিয়ে এলিউট করা হয়েছিল, এবং অবশিষ্ট বাইন্ডিং কমপ্লেক্সটি 0.5 CV-তে 300 mM NaCl ধারণকারী একটি বাইন্ডিং বাফার দিয়ে এলিউট করা হয়েছিল। ২৫০ থেকে ১০০০ এনএম এর মধ্যে শোষণ বর্ণালী সংগ্রহ করুন, শোষণ অনুপাত (A880/A280) সহ ভগ্নাংশটি ১ এর বেশি ৮৮০ থেকে ২৮০ এনএম এ রাখুন, এটিকে বাইন্ডিং বাফারে দুবার পাতলা করুন এবং DEAE কলামে একই পদ্ধতি আবার ব্যবহার করুন অন পিউরিফিকেশন। ১.৭ এর চেয়ে বেশি A880/A280 অনুপাত এবং ৩.০ এর চেয়ে বেশি A880/A805 অনুপাত সহ ভগ্নাংশগুলিকে পাতলা করুন, আয়ন বিনিময়ের তৃতীয় রাউন্ড সম্পাদন করুন এবং ২.২ এর চেয়ে বেশি A880/A280 অনুপাত এবং ৫.০ এর চেয়ে বেশি A880/A805 অনুপাত সহ ভগ্নাংশগুলি ধরে রাখুন। আংশিকভাবে পরিশোধিত কমপ্লেক্সটি একটি Amicon 100,000 আণবিক ওজন কাট-অফ (MWCO) সেন্ট্রিফিউগাল ফিল্টার (Merck, UK) এ ~2 মিলি ঘনীভূত করা হয়েছিল এবং 200 mM NaCl বাফার ধারণকারী একটি Superdex 200 16/600 আকারের এক্সক্লুশন কলামে (GE Healthcare, US) লোড করা হয়েছিল, এবং তারপর একই বাফারে 1.5 CV এ এলিউট করা হয়েছিল। আকার এক্সক্লুশন ভগ্নাংশের শোষণ বর্ণালী সংগ্রহ করুন, এবং A880/A280 অনুপাত 2.4 এর বেশি এবং A880/A805 অনুপাত 5.8 থেকে 100 A880 এর বেশি দিয়ে শোষণ বর্ণালী ঘনীভূত করুন, এবং অবিলম্বে ক্রায়ো-TEM গ্রিড প্রস্তুতি বা সংরক্ষণের জন্য ব্যবহার করুন যতক্ষণ না প্রয়োজন -80°C তাপমাত্রায় রাখুন।
PufW-His স্ট্রেইন থেকে দ্রাব্য ঝিল্লিটি IMAC বাফারে (GE Healthcare) 20 মিলি HisPrep FF Ni-NTA Sepharose কলামে (20 mM tris-HCl (pH 8.0) 200 mM NaCl এবং 0.03% (w/w)) প্রয়োগ করা হয়েছিল। কলামটি IMAC বাফারের পাঁচটি CV দিয়ে ধোয়া হয়েছিল, এবং তারপর 10 mM হিস্টিডিন ধারণকারী IMAC বাফারের পাঁচটি CV দিয়ে। কোর কমপ্লেক্সটি 100 mM হিস্টিডিন ধারণকারী পাঁচটি IMAC বাফার দিয়ে কলাম থেকে বের করা হয়েছিল। RC-LH114-W কমপ্লেক্স ধারণকারী ভগ্নাংশটি Amicon 100,000 MWCO ফিল্টার (Merck, UK) দিয়ে সজ্জিত একটি স্টির্ড ট্যাঙ্কে ~10 মিলি ঘনীভূত করা হয়, বাইন্ডিং বাফার দিয়ে 20 বার পাতলা করা হয় এবং তারপর 25 মিলিতে যোগ করা হয়। DEAE Sepharose কলামে, বাফারের সাথে আবদ্ধ চারটি CV আগে থেকে ব্যবহার করা হয়। চারটি CV বাইন্ডিং বাফার দিয়ে কলামটি ধুয়ে ফেলুন, তারপর আটটি CV-তে 0 থেকে 100 mM NaCl (বাইন্ডিং বাফারে) রৈখিক গ্রেডিয়েন্টে কমপ্লেক্সটি এলুট করুন, এবং বাকি চারটি CV-তে 100 mM বাইন্ডিং বাফার রয়েছে। সোডিয়াম ক্লোরাইডের উপর এলুট করা অবশিষ্ট কমপ্লেক্সগুলিকে 2.4-এর চেয়ে বেশি A880/A280 অনুপাত এবং 4.6-এর চেয়ে বেশি A880/A805 অনুপাতের সাথে মিলিত করে একটি Amicon 100,000 MWCO সেন্ট্রিফিউগাল ফিল্টারে ~2 মিলিতে ঘনীভূত করা হয়েছিল, এবং 1.5 CV IMAC দিয়ে আগে থেকে পূরণ করা হয়েছিল। বাফারটি সুপারডেক্স 200 16/600 আকারের এক্সক্লুশন কলামে ভারসাম্যপূর্ণ ছিল, এবং তারপর 1.5 CV-এর উপরে একই বাফারে এলুট করা হয়েছিল। আকার-বর্জন ভগ্নাংশের শোষণ বর্ণালী সংগ্রহ করুন এবং A880/A280 অনুপাত 2.1 এর বেশি এবং A880/A805 অনুপাত 4.6 থেকে 100 এর বেশি A880 দিয়ে শোষণ বর্ণালীকে কেন্দ্রীভূত করুন, যা তাৎক্ষণিকভাবে হিমায়িত TEM গ্রিড প্রস্তুতির জন্য ব্যবহার করা হয় অথবা প্রয়োজন না হওয়া পর্যন্ত -80°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়।
কম তাপমাত্রার TEM গ্রিড তৈরি করতে একটি Leica EM GP নিমজ্জন ফ্রিজার ব্যবহার করা হয়েছিল। কমপ্লেক্সটি IMAC বাফারে ৫০ এর A880 তে মিশ্রিত করা হয়েছিল, এবং তারপর 5μl একটি নতুন গ্লো-ডিসচার্জড QUANTIFOIL 1.2/1.3 কার্বন-কোটেড তামার জালে লোড করা হয়েছিল (Agar Scientific, UK)। গ্রিডটি 20°C এবং 60% আপেক্ষিক আর্দ্রতায় 30 সেকেন্ডের জন্য ইনকিউব করুন, তারপর 3 সেকেন্ডের জন্য এটি শুকিয়ে নিন, এবং তারপর -176°C তাপমাত্রায় তরল ইথেনে এটি নিভিয়ে দিন।
RC-LH114-W কমপ্লেক্সের তথ্য eBIC (ইলেকট্রনিক বায়োইমেজিং সেন্টার) (ব্রিটিশ ডায়মন্ড লাইট সোর্স) এ টাইটান ক্রিয়োস মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে রেকর্ড করা হয়েছিল, যা 300kV এর ত্বরণকারী ভোল্টেজে কাজ করে, যার নামমাত্র ম্যাগনিফিকেশন 130,000× এবং শক্তি - 20 eV এর একটি ফাঁক নির্বাচন করুন। তথ্য সংগ্রহের জন্য গণনা মোডে ছবি রেকর্ড করার জন্য একটি Gatan 968 GIF কোয়ান্টাম K2 পিক ডিটেক্টর ব্যবহার করা হয়েছিল। ক্যালিব্রেটেড পিক্সেলের আকার 1.048Å, এবং ডোজ রেট 3.83 e-Å-2s-1। 11 সেকেন্ডের মধ্যে মুভিটি সংগ্রহ করে 40টি অংশে ভাগ করা হয়েছে। মাইক্রোস্কোপটি পুনরায় ফোকাস করার জন্য কার্বন-কোটেড এলাকা ব্যবহার করুন এবং তারপর প্রতি গর্তে তিনটি মুভি সংগ্রহ করুন। মোট 3130টি মুভি সংগ্রহ করা হয়েছিল, যার ডিফোকাস মান -1 এবং -3μm এর মধ্যে ছিল।
RC-LH116 কমপ্লেক্সের তথ্য সংগ্রহ করা হয়েছিল অ্যাস্টারবেরি বায়োস্ট্রাকচার ল্যাবরেটরিতে (লিডস বিশ্ববিদ্যালয়, যুক্তরাজ্য) একই মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে। তথ্য সংগ্রহ করা হয়েছিল গণনা মোডে 130 k ম্যাগনিফিকেশন সহ, এবং পিক্সেলের আকার 1.065 Å তে ক্যালিব্রেট করা হয়েছিল 4.6 e-Å-2s-1 এর ডোজ সহ। চলচ্চিত্রটি 12 সেকেন্ডে রেকর্ড করা হয়েছিল এবং 48টি অংশে বিভক্ত করা হয়েছিল। মোট, 3359টি চলচ্চিত্র সংগ্রহ করা হয়েছিল, যার ডিফোকাস মান -1 এবং -3μm এর মধ্যে ছিল।
সমস্ত ডেটা প্রক্রিয়াকরণ Relion 3.0 পাইপলাইনে (42) সঞ্চালিত হয়। ডোজ ওজন নির্ধারণের মাধ্যমে বিমের গতি সংশোধন করতে Motioncorr 2 (43) ব্যবহার করুন, এবং তারপর CTF (কনট্রাস্ট ট্রান্সফার ফাংশন) প্যারামিটার নির্ধারণ করতে CTFFIND 4.1 (44) ব্যবহার করুন। এই প্রাথমিক প্রক্রিয়াকরণ পর্যায়ের পরে সাধারণ ফটোমাইক্রোগ্রাফগুলি চিত্র 2. S16-এ দেখানো হয়েছে। স্বয়ংক্রিয় নির্বাচন টেমপ্লেটটি 250-পিক্সেল ফ্রেমে 1000 কণার প্রায় 250 পিক্সেল ম্যানুয়ালি নির্বাচন করে এবং কোনও রেফারেন্স দ্বি-মাত্রিক (2D) শ্রেণীবিভাগ ছাড়াই তৈরি করা হয়, যার ফলে নমুনা দূষণ পূরণ করে এমন শ্রেণীবিভাগগুলি প্রত্যাখ্যান করা হয় বা কোনও স্পষ্ট বৈশিষ্ট্য নেই। তারপর, সমস্ত মাইক্রোফটোগ্রাফে স্বয়ংক্রিয় নির্বাচন করা হয়েছিল, এবং RC-LH114-W ছিল 849,359 কণা, এবং RC-LH116 কমপ্লেক্স ছিল 476,547 কণা। সমস্ত নির্বাচিত কণা দুটি রাউন্ড নন-রেফারেন্স 2D শ্রেণীবিভাগের মধ্য দিয়ে গেছে, এবং প্রতিটি রানের পরে, কার্বন এলাকা, নমুনা দূষণ, কোনও স্পষ্ট বৈশিষ্ট্য বা দৃঢ়ভাবে ওভারল্যাপিং কণা পূরণকারী কণাগুলি প্রত্যাখ্যান করা হয়েছে, যার ফলে যথাক্রমে 772,033 (90.9%) এবং 359,678 (75.5%) কণাগুলি RC-LH114-W এবং RC-LH116 এর 3D শ্রেণীবিভাগের জন্য ব্যবহৃত হয়। প্রাথমিক 3D রেফারেন্স মডেলটি স্টোকাস্টিক গ্রেডিয়েন্ট ডিসেন্ট পদ্ধতি ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল। প্রাথমিক মডেলটিকে রেফারেন্স হিসাবে ব্যবহার করে, নির্বাচিত কণাগুলিকে 3D তে চারটি বিভাগে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছে। এই বিভাগের মডেলটিকে রেফারেন্স হিসাবে ব্যবহার করে, বৃহত্তম বিভাগের কণাগুলিতে 3D পরিশোধন সম্পাদন করুন, তারপর দ্রাবক এলাকাটি কভার করার জন্য প্রাথমিক 15Å লো-পাস ফিল্টার ব্যবহার করুন, 6 পিক্সেল নরম প্রান্ত যোগ করুন এবং শীর্ষ ডিটেক্টরের Gatan K2 পিক মড্যুলেশন ট্রান্সফার ফাংশন সংশোধন করতে পিক্সেলগুলি প্রক্রিয়াকরণের পরে। RC-LH114-W ডেটাসেটের জন্য, এই প্রাথমিক মডেলটি মাস্কের প্রান্তে শক্তিশালী ঘনত্ব (UCSF Chimera-তে মূল জটিল ঘনত্ব থেকে বিচ্ছিন্ন) অপসারণ করে সংশোধন করা হয়েছিল। ফলস্বরূপ মডেলগুলি (RC-LH114-W এবং RC-LH116-এর রেজোলিউশন যথাক্রমে 3.91 এবং 4.16 Å) 3D শ্রেণীবিভাগের দ্বিতীয় রাউন্ডের জন্য একটি রেফারেন্স হিসাবে ব্যবহৃত হয়। ব্যবহৃত কণাগুলিকে প্রাথমিক 3D শ্রেণীতে গোষ্ঠীভুক্ত করা হয়েছে এবং প্রতিবেশীর সাথে শক্তিশালী সম্পর্ক নেই। ওভারল্যাপ বা স্পষ্ট কাঠামোগত বৈশিষ্ট্যের অভাব। 3D শ্রেণীবিভাগের দ্বিতীয় রাউন্ডের পরে, সর্বোচ্চ রেজোলিউশন সহ বিভাগটি নির্বাচন করা হয়েছিল [RC-LH114-W-এর জন্য, একটি বিভাগ হল 377,703 কণা (44.5%), RC-LH116-এর জন্য, দুটি বিভাগ রয়েছে, মোট 260,752 কণা (54.7%) , যেখানে তারা শুধুমাত্র একটি ছোট পার্থক্য সহ প্রাথমিক ঘূর্ণনের পরে সারিবদ্ধ হলে একই থাকে]। নির্বাচিত কণাগুলিকে একটি 400-পিক্সেল বাক্সে পুনরায় বের করে 3D রিফাইনিং দ্বারা পরিশোধিত করা হয়। প্রাথমিক 15Å লো-পাস ফিল্টার, 3 পিক্সেল ম্যাপ এক্সপেনশন এবং 3 পিক্সেল সফট মাস্ক ব্যবহার করে দ্রাবক মাস্ক তৈরি করা হয়। প্রতি-কণা CTF পরিশোধন, প্রতি-কণা গতি সংশোধন এবং প্রতি-কণা CTF পরিশোধনের দ্বিতীয় রাউন্ড ব্যবহার করে, 3D পরিশোধন, দ্রাবক মাস্কিং এবং পোস্ট-প্রসেসিং প্রতিটি ধাপের পরে ফলস্বরূপ টেক্সচারকে আরও পরিমার্জিত করার জন্য করা হয়। FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) কাট-অফ মান 0.143 ব্যবহার করে, RC-LH114-W এবং RC-LH116 এর চূড়ান্ত মডেলগুলির রেজোলিউশন যথাক্রমে 2.65 এবং 2.80Å। চূড়ান্ত মডেলের FSC বক্ররেখা চিত্র 2. S17 এ দেখানো হয়েছে।
সমস্ত প্রোটিন সিকোয়েন্স UniProtKB থেকে ডাউনলোড করা হয়েছে: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3)। SWISS-MODEL (45) RC-L, RC-M এবং RC-H এর প্রোটিন সিকোয়েন্স এবং Rba এর স্ফটিক কাঠামো ধারণ করে RBa এর একটি হোমোলজি মডেল তৈরি করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। sphaeroides RC একটি টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল (PDB ID: 5LSE) (46)। UCSF Chimera-তে "fit map" টুল ব্যবহার করে তৈরি মডেলটিকে মানচিত্রে ফিট করুন (47), প্রোটিন কাঠামো উন্নত করুন এবং cofactor [4×BChl a (monomer library residue name = BCL), 2×BPh a (BPH), এক বা দুই ধরণের UQ10 (U10), একটি নন-হিম আয়রন (Fe) এবং একটি 3,4-ডাইহাইড্রোহেক্সাকার্বোনিলকোলিন (QAK)] যোগ করার জন্য Coot (48) ব্যবহার করুন। যেহেতু QAK মনোমার লাইব্রেরিতে উপলব্ধ নয়, তাই PHENIX (49) এ eLBOW টুল ব্যবহার করে এটি প্যারামিটারাইজ করা হয়েছিল।
এরপর, LH1 সাবইউনিট তৈরি করা হয়েছিল। প্রাথমিকভাবে, PHENIX (49) এর স্বয়ংক্রিয় নির্মাণ সরঞ্জামটি LH1 সিকোয়েন্সের অংশটি স্বয়ংক্রিয়ভাবে মানচিত্র এবং LH1-α এবং LH1-β প্রোটিন সিকোয়েন্সগুলিকে ইনপুট হিসাবে ব্যবহার করে তৈরি করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। সবচেয়ে সম্পূর্ণ LH1 সাবইউনিটটি নির্বাচন করুন, এটি বের করুন এবং Coot-এ লোড করুন, এতে অনুপস্থিত সিকোয়েন্সটি ম্যানুয়ালি যোগ করুন এবং দুটি BCls a (BCL) এবং একটি স্পিরিলোক্সানথিন (CRT) যোগ করার আগে সম্পূর্ণ কাঠামোটি ম্যানুয়ালি পরিমার্জন করুন [প্রাসঙ্গিক Rps অনুসারে LH1 কমপ্লেক্সের ঘনত্ব এবং পরিচিত ক্যারোটিনয়েড সামগ্রী। প্রজাতি (17)]। সম্পূর্ণ LH1 সাবইউনিটটি অনুলিপি করুন, এবং LH1 ঘনত্বের সংলগ্ন নন-মডেল এলাকায় ডক করতে UCSF কাইমেরা "ডকিং ম্যাপ টুল" ব্যবহার করুন, এবং তারপর Coot-এ এটি পরিমার্জন করুন; সমস্ত LH1 সাবইউনিট মডেল না হওয়া পর্যন্ত প্রক্রিয়াটি পুনরাবৃত্তি করুন। RC-LH114-W কাঠামোর জন্য, Coot-এ অনির্ধারিত ঘনত্ব বের করে, প্রোটিনকে USCF Chimera মানচিত্রের অবশিষ্ট অ-প্রোটিন উপাদানগুলি থেকে ভাগ করা হয় এবং অটোবিল্ড টুলটি প্রাথমিক মডেল এবং অবশিষ্ট সাবইউনিট (প্রোটিন-W) মডেলিং স্থাপন করতে ব্যবহৃত হয়। PHENIX (49) তে। Coot (48) তে ফলাফল মডেলে যেকোনো অনুপস্থিত ক্রম যোগ করুন, এবং তারপর সম্পূর্ণ সাবইউনিটটি ম্যানুয়ালি পরিমার্জন করুন। অবশিষ্ট অনির্ধারিত ঘনত্ব লিপিডের সংমিশ্রণে ফিট করে (CDL = CDL, POPC = 6PL এবং POPG = PGT এর PDB মনোমার লাইব্রেরি ID), β-DDM ডিটারজেন্ট (LMT) এবং UQ10 অণু (U10)। সম্পূর্ণ প্রাথমিক মডেলটি নিখুঁত করতে Coot (49) এবং ম্যানুয়াল অপ্টিমাইজেশন ব্যবহার করুন যতক্ষণ না মডেল পরিসংখ্যান এবং ফিটের ভিজ্যুয়াল গুণমান আরও উন্নত করা যায়। অবশেষে, স্থানীয় মানচিত্রটি তীক্ষ্ণ করতে LocScale (50) ব্যবহার করুন, এবং তারপরে অনির্ধারিত ঘনত্ব এবং স্বয়ংক্রিয় এবং ম্যানুয়াল অপ্টিমাইজেশন মডেলিংয়ের আরও কয়েকটি চক্র সম্পাদন করুন।
সংশ্লিষ্ট পেপটাইড, সহ-ফ্যাক্টর এবং অন্যান্য লিপিড এবং কুইনোনগুলি তাদের নিজ নিজ ঘনত্বের মধ্যে ডক করা হয়েছে চিত্র 1 এবং 2 এ দেখানো হয়েছে। S18 থেকে S23। চূড়ান্ত মডেলের পরিসংখ্যানগত তথ্য সারণি S1 এ দেখানো হয়েছে।
অন্যথায় নির্দিষ্ট না করা হলে, UV/Vis/NIR শোষণ বর্ণালী একটি Cary60 স্পেকট্রোফটোমিটারে (Agilent, USA) 250 nm থেকে 1000 nm পর্যন্ত 1 nm ব্যবধানে এবং 0.1s এর একীকরণ সময়কালে সংগ্রহ করা হয়েছিল।
নমুনাটিকে একটি কোয়ার্টজ কিউভেটে 2 মিমি পথ দিয়ে পাতলা করুন যার A880 তে 1 এর পথ রয়েছে এবং 400 এবং 1000 nm এর মধ্যে শোষণ বর্ণালী সংগ্রহ করুন। বৃত্তাকার ডাইক্রোয়িক বর্ণালীটি একটি Jasco 810 বর্ণালীমিটারে (Jasco, জাপান) সংগ্রহ করা হয়েছিল 400 nm এবং 950 nm এর মধ্যে 1 nm ব্যবধানে 20 nm min-1 এর স্ক্যান হারে।
মোলার এক্সটিনশন সহগ নির্ধারণ করা হয় কোর কমপ্লেক্সকে প্রায় ৫০ এর A880 এ পাতলা করে। 990μl বাইন্ডিং বাফার বা মিথানলে 10μl আয়তন পাতলা করুন এবং BChl অবক্ষয় কমাতে অবিলম্বে শোষণ বর্ণালী সংগ্রহ করুন। প্রতিটি মিথানল নমুনার BChl সামগ্রী 54.8 mM-1 cm-1 এর 771 nm এ এক্সটিনশন সহগ দ্বারা গণনা করা হয়েছিল এবং এক্সটিনশন সহগ নির্ধারণ করা হয়েছিল (51)। কোর কমপ্লেক্স ঘনত্ব নির্ধারণ করতে পরিমাপ করা BChl ঘনত্বকে 32 (RC-LH114-W) বা 36 (RC-LH116) দ্বারা ভাগ করুন, যা পরে বাফার এক্সটিনশন সহগে সংগৃহীত একই নমুনার শোষণ বর্ণালী নির্ধারণ করতে ব্যবহৃত হয়। সমান্তরাল। প্রতিটি নমুনার জন্য তিনটি পুনরাবৃত্তি পরিমাপ নেওয়া হয়েছিল, এবং গণনার জন্য BChl Qy সর্বোচ্চের গড় শোষণ ব্যবহার করা হয়েছিল। ৮৭৮ nm পরিমাপ করা RC-LH114-W এর বিলুপ্তি সহগ হল ৩২৮০±১৪০ mM-১ cm-১, যেখানে ৮৮০ nm পরিমাপ করা RC-LH116 এর বিলুপ্তি সহগ হল ৩৮০০±৩০ mM-১ cm-১।
(52) পদ্ধতি অনুসারে UQ10 পরিমাপ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, Agilent 1200 HPLC সিস্টেম ব্যবহার করে বিপরীত পর্যায় HPLC (RP-HPLC) সঞ্চালিত হয়েছিল। 0.02% (w/v) ফেরিক ক্লোরাইড ধারণকারী 50μl 50:50 মিথানল: ক্লোরোফর্মে RC-LH116 বা RC-LH114-W এর প্রায় 0.02 nmol দ্রবীভূত করুন এবং পূর্ব-ভারসাম্যযুক্ত বেকম্যান কুল্টার আল্ট্রাস্ফিয়ার ODS 4.6 মিমি ×25 সেমি কলামে HPLC দ্রাবক (80:20 মিথানল:2-প্রোপানল) 40°C তাপমাত্রায় 1 মিলি-1 মিনিট-1 এ দ্রবীভূত করুন। 275 nm (UQ10), 450 nm (ক্যারোটিনয়েড) এবং 780 nm (BChl) এ শোষণ পর্যবেক্ষণ করার জন্য একটি HPLC দ্রাবকে 1 ঘন্টার জন্য আইসোক্র্যাটিক এলিউশন করুন। ২৫.৫ মিনিটে ২৭৫ এনএম ক্রোমাটোগ্রামের সর্বোচ্চ স্তরটি সংহত করা হয়েছিল, যেখানে অন্য কোনও সনাক্তযোগ্য যৌগ ছিল না। ০ থেকে ৫.৮ এনএমওল (চিত্র S14) পর্যন্ত বিশুদ্ধ মানগুলির ইনজেকশন থেকে গণনা করা ক্যালিব্রেশন বক্ররেখার রেফারেন্সে নিষ্কাশিত UQ10 এর মোলার পরিমাণ গণনা করতে সমন্বিত এলাকাটি ব্যবহার করা হয়। প্রতিটি নমুনা তিনটি প্রতিলিপিতে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল, এবং রিপোর্ট করা ত্রুটি গড়ের SD এর সাথে মিলে যায়।
RC-LH1 কমপ্লেক্স ধারণকারী একটি দ্রবণ তৈরি করা হয়েছিল যার সর্বোচ্চ Qy শোষণ 0.1 ছিল, যার মধ্যে 30 μM হ্রাসকৃত হর্স হার্ট সাইটোক্রোম c2 (Merck, UK) এবং 0 থেকে 50 μMUQ2 (Merck, UK) ছিল। প্রতিটি UQ2 ঘনত্বে তিনটি 1-মিলি নমুনা প্রস্তুত করা হয়েছিল এবং পরিমাপের আগে অন্ধকারের সাথে সম্পূর্ণ অভিযোজন নিশ্চিত করার জন্য রাতভর 4°C তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করা হয়েছিল। দ্রবণটি একটি OLIS RSM1000 মডুলার স্পেকট্রোফটোমিটারে লোড করা হয়েছিল যা 300 nm শিখা/500 লাইন গ্রেটিং, 1.24 mm ইনলেট, 0.12 mm মিডল এবং 0.6 mm আউটলেট স্লিট দিয়ে সজ্জিত ছিল। নমুনা ফটোটিউব এবং রেফারেন্স ফটোমাল্টিপ্লায়ার টিউবের প্রবেশপথে একটি 600 nm লম্বা পাস ফিল্টার স্থাপন করা হয়েছে যাতে উত্তেজনা আলো বাদ দেওয়া যায়। 0.15 সেকেন্ডের ইন্টিগ্রেশন সময় সহ 550 nm এ শোষণ পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। উত্তেজনা আলো 880 nm M880F2 LED (আলো নির্গমনকারী ডায়োড) (থরল্যাবস লিমিটেড, যুক্তরাজ্য) থেকে 90% তীব্রতার সাথে একটি ফাইবার অপটিক কেবলের মাধ্যমে DC2200 কন্ট্রোলারের (থরল্যাবস লিমিটেড, যুক্তরাজ্য) মাধ্যমে নির্গত হয় এবং 90° কোণে আলোক উৎসে নির্গত হয়। পরিমাপক রশ্মিটি আয়নার বিপরীতে থাকে যাতে নমুনা দ্বারা প্রাথমিকভাবে শোষিত না হওয়া যেকোনো আলো ফিরিয়ে আনা যায়। 50 সেকেন্ডের আলোকসজ্জার আগে 10 সেকেন্ড শোষণ পর্যবেক্ষণ করুন। তারপর অন্ধকারে 60 সেকেন্ডের জন্য শোষণ আরও পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল যাতে কুইনোল স্বতঃস্ফূর্তভাবে সাইটোক্রোম c23 + কতটা হ্রাস করে তা মূল্যায়ন করা যায় (কাঁচা তথ্যের জন্য চিত্র S8 দেখুন)।
০.৫ থেকে ১০ সেকেন্ডের মধ্যে একটি রৈখিক প্রাথমিক হার স্থাপন করে (UQ2 ঘনত্বের উপর নির্ভর করে) এবং প্রতিটি UQ2 ঘনত্বে তিনটি নমুনার গড় হার নির্ধারণ করে ডেটা প্রক্রিয়া করা হয়েছিল। সংশ্লিষ্ট বিলুপ্তি সহগ দ্বারা গণনা করা RC-LH1 ঘনত্ব হারকে অনুঘটক দক্ষতায় রূপান্তর করতে ব্যবহার করা হয়েছিল, যা Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) তে প্লট করা হয়েছিল, এবং মাইকেলিস-মেন্টেন মডেলে লাগানো হয়েছিল যাতে আপাত Km এবং Kcat মান নির্ধারণ করা যায়।
ক্ষণস্থায়ী শোষণ পরিমাপের জন্য, RC-LH1 নমুনাটি IMAC বাফারে ~2μM এ পাতলা করা হয়েছিল যার মধ্যে 50 mM সোডিয়াম অ্যাসকরবেট (Merck, USA) এবং 0.4 mM Terbutin (Merck, USA) ছিল। অ্যাসকরবিক অ্যাসিড একটি বলিদানকারী ইলেকট্রন দাতা হিসাবে ব্যবহৃত হয়, এবং tert-butaclofen একটি QB ইনহিবিটর হিসাবে ব্যবহৃত হয় যাতে পরিমাপ প্রক্রিয়া জুড়ে প্রধান RC দাতা হ্রাস পায় (অর্থাৎ, ফটোঅক্সিডাইজড নয়)। প্রায় 3 মিলি নমুনা একটি কাস্টম ঘূর্ণায়মান কোষে (প্রায় 0.1 মিটার ব্যাস, 350 RPM) যোগ করা হয় যাতে 2 মিমি অপটিক্যাল পাথ দৈর্ঘ্য থাকে তা নিশ্চিত করা যায় যে লেজার পাথের নমুনাটি উত্তেজনা পালসের মধ্যে অন্ধকার অভিযোজনের জন্য পর্যাপ্ত সময় পায়। Ti: Sapphire লেজার সিস্টেম (Spectra Physics, USA) প্রশস্ত করতে ~100-fs লেজার পালস ব্যবহার করুন যাতে 880 nm এ নমুনাটি 1 kHz (NIR এর জন্য 20 nJ বা Vis এর জন্য 100 nJ) পুনরাবৃত্তি হারে উত্তেজিত হয়। তথ্য সংগ্রহের আগে, নমুনাটিকে প্রায় 30 মিনিটের জন্য উত্তেজনা আলোতে রাখুন। এক্সপোজারের ফলে QA নিষ্ক্রিয় হয়ে যাবে (সম্ভবত একবার বা দুবার QA হ্রাস পাবে)। তবে দয়া করে মনে রাখবেন যে এই প্রক্রিয়াটি বিপরীতমুখী কারণ দীর্ঘ সময় ধরে অন্ধকার অভিযোজনের পরে, RC ধীরে ধীরে QA কার্যকলাপে ফিরে আসবে। -10 থেকে 7000 ps বিলম্বের সময় সহ ক্ষণস্থায়ী বর্ণালী পরিমাপ করার জন্য একটি Helios স্পেকট্রোমিটার (Ultrafast Systems, USA) ব্যবহার করা হয়েছিল। ডেটা সেটগুলিকে অগোষ্ঠীভুক্ত করতে, তারপর একত্রিত করতে এবং মানসম্মত করতে Surface Xplorer সফ্টওয়্যার (Ultrafast Systems, USA) ব্যবহার করুন। ক্ষয় সম্পর্কিত ডিফারেনশিয়াল বর্ণালী পেতে সম্মিলিত ডেটা সেট ব্যবহার করতে CarpetView সফ্টওয়্যার প্যাকেজ (Light Conversion Ltd., Lithuania) ব্যবহার করুন, অথবা এমন একটি ফাংশন ব্যবহার করুন যা অরিজিন (OriginLab, USA) এ একক-তরঙ্গদৈর্ঘ্য বর্ণালী বিবর্তনের সাথে মানানসই করার জন্য যন্ত্রের প্রতিক্রিয়ার সাথে একাধিক সূচককে একত্রিত করে।
উপরে উল্লিখিত (53), RC এবং পেরিফেরাল LH2 অ্যান্টেনা উভয়ই ছাড়াই LH1 কমপ্লেক্স ধারণকারী একটি সালোকসংশ্লেষণকারী ফিল্ম প্রস্তুত করা হয়েছিল। ঝিল্লিটি 20 mM ট্রিসে (pH 8.0) পাতলা করা হয়েছিল এবং তারপর 2 মিমি অপটিক্যাল পাথ সহ একটি কোয়ার্টজ কিউভেটে লোড করা হয়েছিল। -10 থেকে 7000 ps বিলম্বের সময় সহ 540 nm এ নমুনাটি উত্তেজিত করার জন্য একটি 30nJ লেজার পালস ব্যবহার করা হয়েছিল। Rps. pal নমুনার জন্য বর্ণিত ডেটা সেটটি প্রক্রিয়া করুন।
৪°C তাপমাত্রায় ২ ঘন্টার জন্য ১৫০,০০০ RCF তাপমাত্রায় সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে ঝিল্লিটি পেল্ট করা হয় এবং তারপর ৮৮০ nm তাপমাত্রায় এর শোষণ ক্ষমতা ২০ mM tris-HCl (pH 8.0) এবং ২০০ mM NaCl-তে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়। ৪°C তাপমাত্রায় অন্ধকারে ১ ঘন্টার জন্য ২% (w/v) β-DDM-এ ধীরে ধীরে নাড়িয়ে ঝিল্লিটি দ্রবীভূত করুন। নমুনাটি ১০০ mM ট্রাইথাইলামোনিয়াম কার্বনেট (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) দিয়ে ২.৫ mg ml-১ (বায়ো-র‍্যাড বিশ্লেষণ) প্রোটিন ঘনত্বে মিশিয়ে আনা হয়। পূর্বে প্রকাশিত পদ্ধতি (54) থেকে আরও প্রক্রিয়াকরণ করা হয়, ৫০ μg প্রোটিনকে ১% (w/v) সোডিয়াম লরেট (Merck, UK) ধারণকারী মোট ৫০ μl TEAB-তে মিশিয়ে মোট ১% (w/v) সোডিয়াম লরেট (Merck, UK) মিশিয়ে আনা হয়। আরও প্রক্রিয়াকরণ করা হয়েছিল ৫০ μg প্রোটিনকে ১% (w/v) সোডিয়াম লরেট (Merck, UK) ধারণকারী ৫০ μl TEAB-তে মিশিয়ে। ৬০ সেকেন্ড ধরে সোনিকেশনের পর, এটি ৫ মিলিমিটার ট্রিস (২-কারবক্সিইথাইল) ফসফিন (মার্ক, ইউকে) দিয়ে ৩৭° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ৩০ মিনিটের জন্য কমানো হয়েছিল। এস-অ্যালকাইলেশনের জন্য, নমুনাটিকে ১০ মিলিমিটার মিথাইল এস-মিথাইলথিওমেথেনেসালফোনেট (মার্ক, ইউকে) দিয়ে ইনকিউবেট করুন এবং ২০০ মিলিমিটার আইসোপ্রোপানল স্টক দ্রবণ থেকে ঘরের তাপমাত্রায় ১০ মিনিটের জন্য যোগ করুন। প্রোটিওলাইটিক হজম ২ μg ট্রিপসিন/এন্ডোপ্রোটিনেজ লাইস-সি মিশ্রণ (প্রোমেগা ইউকে) যোগ করে সম্পন্ন করা হয়েছিল এবং ৩৭° সেলসিয়াসে ৩ ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। ৫০ μl ইথাইল অ্যাসিটেট এবং ১০ μl ১০% (v/v) এলসি গ্রেড ট্রাইফ্লুরোএসেটিক অ্যাসিড (TFA; থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ইউকে) যোগ করে এবং ৬০ সেকেন্ডের জন্য ঘূর্ণিঝড় করে লরেট সার্ফ্যাক্ট্যান্টটি বের করা হয়েছিল। ১৫,৭০০ RCF তাপমাত্রায় ৫ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে পর্যায় পৃথকীকরণকে উৎসাহিত করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে, পেপটাইড ধারণকারী নিম্ন পর্যায়ে সাবধানে অ্যাসপিরেট এবং ডিসল্ট করার জন্য একটি C18 স্পিন কলাম (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ইউকে) ব্যবহার করা হয়েছিল। ভ্যাকুয়াম সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা শুকানোর পরে, নমুনাটি 0.5% TFA এবং 3% অ্যাসিটোনিট্রাইলে দ্রবীভূত করা হয়েছিল, এবং পূর্বে বিশদভাবে বর্ণিত সিস্টেম পরামিতিগুলি ব্যবহার করে ন্যানোফ্লো RP ক্রোমাটোগ্রাফি এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি দ্বারা 500 ng বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
প্রোটিন শনাক্তকরণ এবং পরিমাণ নির্ধারণের জন্য MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ব্যবহার করে Rps. palustris proteomes ডাটাবেস (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) অনুসন্ধান করুন। ভর স্পেকট্রোমেট্রি প্রোটিওমিক্স ডেটা PRIDE পার্টনার রিপোজিটরি (http://proteomecentral.proteomexchange.org) এর মাধ্যমে ডেটাসেট শনাক্তকারী PXD020402 এর অধীনে প্রোটিওমএক্সচেঞ্জ অ্যালায়েন্সে জমা করা হয়েছে।
RPLC দ্বারা ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়নাইজেশন ভর স্পেকট্রোমেট্রির সাথে বিশ্লেষণের জন্য, RC-LH1 কমপ্লেক্সটি বন্য-প্রকার Rps থেকে প্রস্তুত করা হয়েছিল। পূর্বে প্রকাশিত পদ্ধতি (16) ব্যবহার করে, প্যালাস্ট্রিস কোষে উৎপাদিত প্রোটিন ঘনত্ব ছিল 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl এবং 0.03% (w/v) β- (বায়ো-র্যাড বিশ্লেষণ) ) DDM-এ 2 mg ml-1। প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে, বৃষ্টিপাত পদ্ধতি দ্বারা 10 μg প্রোটিন নিষ্কাশন করতে 2D পরিশোধন কিট (GE Healthcare, USA) ব্যবহার করুন এবং 20 μl 60% (v / v) ফর্মিক অ্যাসিড (FA), 20% (v / v) অ্যাসিটোনাইট্রাইল এবং 20% (v / v) জলে অবক্ষেপ দ্রবীভূত করুন। ভর বর্ণালী (Maxis UHR-TOF, Bruker) এর সাথে মিলিত হয়ে RPLC (Dionex RSLC) দ্বারা পাঁচটি মাইক্রোলিটার বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ৯০%(v/v) অ্যাসিটোনিট্রাইল TFA-তে ৮৫%(v/v) দ্রাবক A [0.1%(v/v) FA এবং 0.02%(V/v) জলীয় দ্রবণ] থেকে ৮৫%(v/v) দ্রাবক B [0.1%(v/v) FA এবং 0.02%(v/v) এর গ্রেডিয়েন্ট সহ ৬০°C এবং ১০০μlmin -১ তাপমাত্রায় পৃথকীকরণের জন্য MabPac 1.2×100 মিমি কলাম (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, যুক্তরাজ্য) ব্যবহার করুন। স্ট্যান্ডার্ড ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়নাইজেশন সোর্স এবং ডিফল্ট প্যারামিটার ব্যবহার করে ৬০ মিনিটেরও বেশি সময় ধরে, ভর স্পেকট্রোমিটার ১০০ থেকে ২৭৫০ m/z (ভর-থেকে-চার্জ অনুপাত) অর্জন করে। ExPASy বায়োইনফরমেটিক্স রিসোর্স পোর্টাল FindPept টুল (https://web.expasy.org/findpept/) এর সাহায্যে, ভর বর্ণালীকে কমপ্লেক্সের সাবইউনিটগুলিতে ম্যাপ করুন।
১০০ মিলি NF-নিম্ন (১০μMm-২ s-১), মাঝারি (৩০μMm-২ s-১) অথবা উচ্চ (৩০০μMm-২ s-১) আলোতে ৭২ ঘন্টা ধরে কোষগুলিকে বড় করা হয়েছিল। ১০০ মিলি স্ক্রু-টপ বোতলে (২৩) M22 মাঝারি (M22 মাঝারি যেখানে অ্যামোনিয়াম সালফেট বাদ দেওয়া হয় এবং সোডিয়াম সাক্সিনেট সোডিয়াম অ্যাসিটেট দ্বারা প্রতিস্থাপিত হয়)। পাঁচটি ৩০-সেকেন্ড চক্রে, কোষগুলিকে লিজ করার জন্য 0.1 মাইক্রন কাচের পুঁতিগুলিকে ১:১ আয়তনের অনুপাতে পুঁতি দেওয়া হয়েছিল এবং ৫ মিনিটের জন্য বরফে ঠান্ডা করা হয়েছিল। অদ্রবণীয় পদার্থ, অখণ্ড কোষ এবং কাচের পুঁতিগুলিকে একটি বেঞ্চটপ মাইক্রোসেন্ট্রিফিউজে ১০ মিনিটের জন্য ১৬,০০০ RCF-তে সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে অপসারণ করা হয়েছিল। ঝিল্লিটি একটি Ti 70.1 রোটারে 100,000 RCF সহ 20 mM tris-HCl (pH 8.0) তে 40/15% (w/w) সুক্রোজ গ্রেডিয়েন্ট সহ 10 ঘন্টার জন্য আলাদা করা হয়েছিল।
আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণায় বর্ণিত হয়েছে, PufW (16) তে His ট্যাগের ইমিউনোডিটেকশন। সংক্ষেপে, 2x SDS লোডিং বাফারে (Merck, UK) দুবার পাতলা করে RC এর একই ঘনত্ব (জারণের মাধ্যমে নির্ধারিত হ্রাসকৃত পার্থক্য বর্ণালী বিয়োগ করে এবং দাগযুক্ত জেলের লোডের সাথে মিলিত) ধারণকারী বিশুদ্ধ কোর কমপ্লেক্স (11.8 nM) অথবা ঝিল্লি। প্রোটিনগুলিকে একটি প্রতিরূপ 12% bis-tris NuPage জেল (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, UK) এ আলাদা করা হয়েছিল। RC-L সাবইউনিট লোড এবং কল্পনা করার জন্য Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) দিয়ে একটি জেল দাগ দেওয়া হয়েছিল। দ্বিতীয় জেলের প্রোটিনটি ইমিউনোঅ্যাসের জন্য মিথানল-সক্রিয় পলিভিনাইলিডিন ফ্লোরাইড (PVDF) ঝিল্লিতে (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, UK) স্থানান্তরিত করা হয়েছিল। PVDF মেমব্রেনটি ৫০ মিলিমিটার ট্রিস-এইচসিএল (pH ৭.৬), ১৫০ মিলিমিটার NaCl, ০.২% (v / v) টিউন-২০ এবং ৫% (w / v) স্কিমড মিল্ক পাউডারে ব্লক করা হয়েছিল, এবং তারপর অ্যান্টি-হিস প্রাইমারি অ্যান্টিবডি (ডিলুট দ্য অ্যান্টিবডি বাফার [৫০ মিলিমিটার ট্রিস-এইচসিএল (pH ৭.৬), ১৫০ মিলিমিটার NaCl এবং ০.০৫% (v / v) টিউন-২০] দিয়ে ১:১০০০ A190-114A, বেথাইল ল্যাবরেটরিজ, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) ৪ ঘন্টার জন্য ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল। অ্যান্টিবডি বাফারে ৫ মিনিট ধরে ৩ বার ধোয়ার পর, ঝিল্লিটি হর্সরাডিশ পেরোক্সিডেস (সিগমা-অ্যালড্রিচ, যুক্তরাজ্য) অ্যান্টি-মাউস সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (অ্যান্টিবডি বাফারে ১:১০,০০০ মিশ্রিত) এর সাথে একত্রিত করা হয়েছিল। ওয়েস্টার ইটিএ সি ২.০ কেমিলুমিনেসেন্স সাবস্ট্রেট (সায়ানাজেন, ইতালি) এবং আমেরশাম ইমেজার ৬০০ (জিই হেলথকেয়ার, যুক্তরাজ্য) ব্যবহার করে সনাক্তকরণের অনুমতি দেওয়ার জন্য (অ্যান্টিবডি বাফারে ৩টি ধোয়ার ৫ মিনিট পরে) ইনকিউবেট করা হয়েছিল।
ImageJ (57) তে প্রতিটি দাগযুক্ত জেল বা ইমিউনোঅ্যাসে লেনের তীব্রতা বন্টন অঙ্কন করে, পিকের নীচের এলাকাটি একীভূত করে এবং RC-L (দাগযুক্ত জেল) এবং প্রোটিন-W (ইমিউনোঅ্যাসে) এর তীব্রতা অনুপাত গণনা করে চিত্রটি প্রক্রিয়া করুন। এই অনুপাতগুলিকে মোলার অনুপাতগুলিতে রূপান্তরিত করা হয়েছিল, ধরে নেওয়া হয়েছিল যে বিশুদ্ধ RC-LH114-W নমুনায় RC-L এবং প্রোটিন-W এর অনুপাত 1:1 ছিল এবং সেই অনুযায়ী সমগ্র ডেটা সেটকে স্বাভাবিক করা হয়েছিল।
এই প্রবন্ধের জন্য সম্পূরক উপকরণের জন্য, অনুগ্রহ করে http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 দেখুন।
এটি একটি উন্মুক্ত প্রবেশাধিকার নিবন্ধ যা ক্রিয়েটিভ কমন্স অ্যাট্রিবিউশন লাইসেন্সের শর্তাবলীর অধীনে বিতরণ করা হয়েছে। মূল কাজটি সঠিকভাবে উদ্ধৃত করা হলে নিবন্ধটি যেকোনো মাধ্যমে অবাধ ব্যবহার, বিতরণ এবং পুনরুৎপাদনের অনুমতি দেয়।
দ্রষ্টব্য: আমরা আপনাকে কেবল আপনার ইমেল ঠিকানাটি সরবরাহ করতে বলব যাতে আপনি পৃষ্ঠাটিতে যাকে সুপারিশ করবেন তিনি জানেন যে আপনি চান যে তারা ইমেলটি দেখুক এবং এটি স্প্যাম নয়। আমরা কোনও ইমেল ঠিকানা ক্যাপচার করব না।
এই প্রশ্নটি আপনি একজন ভিজিটর কিনা তা পরীক্ষা করতে এবং স্বয়ংক্রিয় স্প্যাম জমা প্রতিরোধ করতে ব্যবহৃত হয়।
ডেভিড জে কে সোয়েন্সবারি, পার্ক কিয়ান, ফিলিপ জে. জ্যাকসন, কেইটলিন এম. ফ্যারিস, দারিউস এম. নিডজউইডজকি, এলিজাবেথ সি. মার্টিন, ডেভিড এ. ফার্মার, লর্না এ. ম্যালোন, রেবেকা এফ. থম্পসন, নীল এ. র‍্যানসন, ড্যানিয়েল পি. ক্যানিফ, মার্ক জে. ডিকম্যান, ডিউই হোল্টেন, ক্রিস্টিন কিরমায়ার, অ্যান্ড্রু হিচকক, সি. নীল হান্টার
বিক্রিয়া কেন্দ্রে আলোক ফাঁদ ১ কমপ্লেক্সের উচ্চ-রেজোলিউশন কাঠামো কুইনোন গতিবিদ্যা সম্পর্কে নতুন অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে।
ডেভিড জে কে সোয়েন্সবারি, পার্ক কিয়ান, ফিলিপ জে. জ্যাকসন, কেইটলিন এম. ফ্যারিস, দারিউস এম. নিডজউইডজকি, এলিজাবেথ সি. মার্টিন, ডেভিড এ. ফার্মার, লর্না এ. ম্যালোন, রেবেকা এফ. থম্পসন, নীল এ. র‍্যানসন, ড্যানিয়েল পি. ক্যানিফ, মার্ক জে. ডিকম্যান, ডিউই হোল্টেন, ক্রিস্টিন কিরমায়ার, অ্যান্ড্রু হিচকক, সি. নীল হান্টার
বিক্রিয়া কেন্দ্রে আলোক ফাঁদ ১ কমপ্লেক্সের উচ্চ-রেজোলিউশন কাঠামো কুইনোন গতিবিদ্যা সম্পর্কে নতুন অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে।
©2021 আমেরিকান অ্যাসোসিয়েশন ফর দ্য অ্যাডভান্সমেন্ট অফ সায়েন্স। সমস্ত অধিকার সংরক্ষিত AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef এবং COUNTER এর অংশীদার। Science Advances ISSN 2375-2548.