বর্তমান ঠিকানা: কোলন ৫০৯৩১, জার্মানি, কোলন এক্সিলেন্স ক্লাস্টার রিসার্চ অন সেলুলার স্ট্রেস রেসপন্স ইন এজিং-রিলেটেড ডিজিজেস (সিইসিএডি)।
মাইটোকন্ড্রিয়াল রোগের কারণে সৃষ্ট নিউরোডিজেনারেশনকে অপরিবর্তনীয় বলে মনে করা হয়, কারণ নিউরনের মেটাবলিক প্লাস্টিসিটি সীমিত। কিন্তু শরীরে নিউরোনাল মেটাবলিজমের সেল অটোনমির উপর মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিসফাংশনের প্রভাব সম্পর্কে খুব কমই জানা যায়। এখানে, আমরা বিঘ্নিত মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিউশন ডায়নামিক্সের কারণে সৃষ্ট ক্রমবর্ধমান OXPHOS ঘাটতিযুক্ত পারকিনজে নিউরনের কোষ-নির্দিষ্ট প্রোটিওম উপস্থাপন করছি। আমরা দেখেছি যে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিসফাংশন প্রোটিওমিক্সের ক্ষেত্রে একটি গভীর পরিবর্তন এনেছে, যা শেষ পর্যন্ত কোষ মৃত্যুর আগে সুনির্দিষ্ট মেটাবলিক প্রোগ্রামগুলোর ক্রমিক সক্রিয়করণের দিকে পরিচালিত করেছে। অপ্রত্যাশিতভাবে, আমরা পাইরুভেট কার্বক্সিলেজ (PCx) এবং অন্যান্য অ্যান্টি-এজিং এনজাইমের সুস্পষ্ট ইন্ডাকশন নির্ধারণ করেছি, যা TCA চক্রের মধ্যবর্তী উপাদানগুলোকে পরিপূরক করে। PCx-এর ইনহিবিশন অক্সিডেটিভ স্ট্রেস এবং নিউরোডিজেনারেশনকে আরও বাড়িয়ে দিয়েছে, যা ইঙ্গিত করে যে OXPHOS-বিহীন নিউরনে অ্যাথেরোস্ক্লেরোসিসের একটি প্রতিরক্ষামূলক প্রভাব রয়েছে। চূড়ান্তভাবে ডিজেনারেটেড নিউরনে মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিউশন পুনরুদ্ধার করলে এই মেটাবলিক বৈশিষ্ট্যগুলো সম্পূর্ণরূপে বিপরীত হয়ে যায়, যার ফলে কোষ মৃত্যু প্রতিরোধ করা সম্ভব হয়। আমাদের এই গবেষণা পূর্বে অজানা এমন কিছু পথ চিহ্নিত করে যা মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিসফাংশনের বিরুদ্ধে প্রতিরোধ ক্ষমতা প্রদান করে এবং দেখায় যে রোগের শেষ পর্যায়েও নিউরোডিজেনারেশনকে বিপরীতমুখী করা সম্ভব।
মানুষের মাইটোকন্ড্রিয়াল রোগগুলির সাথে সম্পর্কিত ব্যাপক স্নায়বিক লক্ষণগুলি নিউরোনাল শক্তি বিপাক বজায় রাখতে মাইটোকন্ড্রিয়ার কেন্দ্রীয় ভূমিকার উপর জোর দেয়। এই রোগগুলির বেশিরভাগই জিন মিউটেশনের কারণে ঘটে যা মাইটোকন্ড্রিয়াল জিনের প্রকাশকে নিয়ন্ত্রণ করে (1, 2) অথবা মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্সের সাথে সম্পর্কিত জিন ধ্বংসের কারণে, যা পরোক্ষভাবে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ (mtDNA)-এর স্থিতিশীলতাকে প্রভাবিত করে (3, 4)। প্রাণীর মডেলের উপর করা গবেষণায় দেখা গেছে যে পার্শ্ববর্তী টিস্যুতে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার প্রতিক্রিয়ায়, রক্ষণশীল বিপাকীয় পথগুলি (5-7) সক্রিয় হতে পারে, যা এই জটিল রোগগুলির প্যাথোজেনেসিস গভীরভাবে বোঝার জন্য গুরুত্বপূর্ণ তথ্য সরবরাহ করে। এর সম্পূর্ণ বিপরীতে, মস্তিষ্কের মাইটোকন্ড্রিয়াল অ্যাডেনোসিন ট্রাইফসফেট (ATP) উৎপাদনের সাধারণ ব্যর্থতার কারণে নির্দিষ্ট কোষের বিপাকীয় পরিবর্তন সম্পর্কে আমাদের জ্ঞান মৌলিক (8), যা রোগ প্রতিরোধ বা প্রতিরোধের জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে এমন থেরাপিউটিক লক্ষ্যগুলি চিহ্নিত করার প্রয়োজনীয়তার উপর জোর দেয়। নিউরোডিজেনারেশন প্রতিরোধ করুন (9)। তথ্যের অভাবের কারণ হল, পার্শ্ববর্তী টিস্যুর কোষের তুলনায় স্নায়ু কোষগুলির বিপাকীয় নমনীয়তা খুব সীমিত বলে ব্যাপকভাবে মনে করা হয় (10)। যেহেতু এই কোষগুলি সিনাপটিক ট্রান্সমিশনকে উন্নত করতে এবং আঘাত ও রোগের অবস্থার প্রতি সাড়া দেওয়ার জন্য নিউরনে মেটাবোলাইটের সরবরাহ সমন্বয় সাধনে একটি কেন্দ্রীয় ভূমিকা পালন করে, তাই মস্তিষ্কের টিস্যুর প্রতিকূল অবস্থার সাথে কোষের বিপাককে খাপ খাইয়ে নেওয়ার ক্ষমতা প্রায় সম্পূর্ণরূপে গ্লিয়াল কোষের মধ্যেই সীমাবদ্ধ (11-14)। এছাড়াও, মস্তিষ্কের টিস্যুর সহজাত কোষীয় ভিন্নতা নির্দিষ্ট নিউরোনাল উপগোষ্ঠীতে ঘটে যাওয়া বিপাকীয় পরিবর্তনগুলির অধ্যয়নকে ব্যাপকভাবে বাধাগ্রস্ত করে। ফলস্বরূপ, নিউরনে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার সঠিক কোষীয় এবং বিপাকীয় পরিণতি সম্পর্কে খুব কমই জানা যায়।
মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার বিপাকীয় পরিণতি বোঝার জন্য, আমরা মাইটোকন্ড্রিয়াল বাইরের ঝিল্লি ফিউশন (Mfn2) ধ্বংসের কারণে সৃষ্ট স্নায়ুক্ষয়ের বিভিন্ন পর্যায়ে পারকিনজে নিউরন (PNs) বিচ্ছিন্ন করেছি। যদিও মানুষের মধ্যে Mfn2 মিউটেশন শার্কো-মেরি-টুথ টাইপ 2A (15) নামে পরিচিত এক ধরণের বংশগত মোটর সংবেদী স্নায়ুরোগের সাথে সম্পর্কিত, ইঁদুরের মধ্যে Mfn2 এর শর্তসাপেক্ষ ধ্বংস জারণ ফসফোরাইলেশন (OXPHOS) কর্মহীনতা প্ররোচিত করার একটি সুপরিচিত পদ্ধতি। বিভিন্ন নিউরোনাল উপপ্রকার (16-19) এবং এর ফলে সৃষ্ট স্নায়ুক্ষয়ী ফেনোটাইপের সাথে প্রগতিশীল স্নায়বিক লক্ষণ, যেমন চলাচলের ব্যাধি (18, 19) বা সেরেবেলার অ্যাটাক্সিয়া (16) দেখা যায়। লেবেল-ফ্রি কোয়ান্টিটেটিভ (LFQ) প্রোটিওমিক্স, মেটাবোলোমিক্স, ইমেজিং এবং ভাইরোলজিক্যাল পদ্ধতির সমন্বিত ব্যবহারের মাধ্যমে আমরা দেখিয়েছি যে, ক্রমবর্ধমান নিউরোডিজেনারেশন ইন ভিভোতে PN-এর আর্টেরিওস্ক্লেরোসিসের সাথে জড়িত পাইরুভেট কার্বক্সিলেজ (PCx) এবং অন্যান্য ফ্যাক্টর এনজাইমের এক্সপ্রেশনকে তীব্রভাবে প্ররোচিত করে। এই আবিষ্কারের প্রাসঙ্গিকতা যাচাই করার জন্য, আমরা বিশেষভাবে Mfn2-এর ঘাটতিযুক্ত PN-এ PCx-এর এক্সপ্রেশন কমিয়ে দিয়েছি এবং দেখেছি যে এই প্রক্রিয়াটি অক্সিডেটিভ স্ট্রেসকে আরও বাড়িয়ে দিয়েছে এবং নিউরোডিজেনারেশনকে ত্বরান্বিত করেছে, যা প্রমাণ করে যে অ্যাজোস্পার্মিয়া কোষের মৃত্যুর সাথে বিপাকীয় অভিযোজন ক্ষমতা প্রদান করে। MFN2-এর তীব্র এক্সপ্রেশন মারাত্মক OXPHOS ঘাটতি, মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ-র ব্যাপক ক্ষয় এবং দৃশ্যত ভাঙা মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কসহ টার্মিনাল ডিজেনারেশনে থাকা PN-কে সম্পূর্ণরূপে পুনরুদ্ধার করতে পারে, যা আরও জোর দিয়ে বলে যে এই ধরনের নিউরোডিজেনারেশন কোষের মৃত্যুর আগে রোগের উন্নত পর্যায়েও পুনরুদ্ধার হতে পারে।
Mfn2 নকআউট PN-গুলিতে মাইটোকন্ড্রিয়াকে দৃশ্যমান করার জন্য, আমরা এমন একটি মাউস স্ট্রেন ব্যবহার করেছি যা Cre-নির্ভর মাইটোকন্ড্রিয়াকে টার্গেট ইয়েলো ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন (YFP) (mtYFP) (20) Cre এক্সপ্রেশন করতে দেয় এবং ইন ভিভোতে মাইটোকন্ড্রিয়ার আকারবিদ্যা পরীক্ষা করেছি। আমরা দেখেছি যে PN-গুলিতে Mfn2 জিনের ধ্বংস মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কের ধীরে ধীরে বিভাজনের দিকে পরিচালিত করে (চিত্র S1A), এবং প্রথম পরিবর্তনটি ৩ সপ্তাহ বয়সে দেখা যায়। বিপরীতে, PN কোষ স্তরের উল্লেখযোগ্য অবক্ষয়, যা ক্যালবাইন্ডিন ইমিউনোস্টেইনিং-এর বিলুপ্তি দ্বারা প্রমাণিত, ১২ সপ্তাহ বয়সের আগে শুরু হয়নি (চিত্র 1, A এবং B)। মাইটোকন্ড্রিয়ার আকারবিদ্যার প্রথম পরিবর্তন এবং নিউরোনাল মৃত্যুর দৃশ্যমান সূত্রপাতের মধ্যে সময়ের এই অমিল আমাদেরকে কোষ মৃত্যুর আগে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার কারণে সৃষ্ট বিপাকীয় পরিবর্তনগুলি তদন্ত করতে উৎসাহিত করেছে। আমরা YFP (YFP+) প্রকাশকারী PN (চিত্র 1C) এবং নিয়ন্ত্রক ইঁদুর (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), যা পরবর্তীতে CTRL হিসাবে উল্লেখ করা হয়েছে (চিত্র S1B), পৃথক করার জন্য একটি ফ্লুরোসেন্স-অ্যাক্টিভেটেড সেল সর্টিং (FACS)-ভিত্তিক কৌশল তৈরি করেছি। YFP সংকেতের আপেক্ষিক তীব্রতার উপর ভিত্তি করে গেটিং কৌশলের অপ্টিমাইজেশন আমাদেরকে নন-PN (YFPneg) (চিত্র S1B) বা সম্ভাব্য ফ্লুরোসেন্ট অ্যাক্সন/ডেনড্রাইটিক খণ্ডাংশ (YFPlow; চিত্র S1D, বামে) থেকে PN-এর YFP+ অংশ (YFPhigh) বিশুদ্ধ করতে সাহায্য করে, যা কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছে (চিত্র S1D, ডানে)। শ্রেণীবদ্ধ পপুলেশনের পরিচয় যাচাই করার জন্য, আমরা LFQ প্রোটিওমিক্স এবং তারপর প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট অ্যানালাইসিস পরিচালনা করেছি এবং দেখেছি যে YFPhigh এবং YFPneg কোষগুলির মধ্যে একটি স্পষ্ট বিভাজন রয়েছে (চিত্র S1C)। YFPhigh কোষগুলিতে পরিচিত PNs মার্কারগুলির (যেমন Calb1, Pcp2, Grid2 এবং Itpr3) (21, 22) একটি নেট সমৃদ্ধি দেখা গেছে, কিন্তু নিউরন বা অন্যান্য কোষের ধরণে সাধারণত প্রকাশিত প্রোটিনের কোনও সমৃদ্ধি দেখা যায়নি (চিত্র 1D)। স্বাধীন পরীক্ষাগুলিতে সংগৃহীত শ্রেণীবদ্ধ YFPhigh কোষগুলির নমুনাগুলির মধ্যে একটি তুলনা > 0.9 এর একটি পারস্পরিক সম্পর্ক সহগ দেখিয়েছে, যা জৈবিক প্রতিলিপিগুলির মধ্যে ভাল পুনরুৎপাদনযোগ্যতা প্রদর্শন করে (চিত্র S1E)। সংক্ষেপে, এই তথ্যগুলি কার্যকর PN এর তীব্র এবং নির্দিষ্ট বিচ্ছিন্নকরণের জন্য আমাদের পরিকল্পনাকে বৈধতা দিয়েছে। যেহেতু ব্যবহৃত L7-cre ড্রাইভার সিস্টেমটি ডেলিভারির প্রথম সপ্তাহে মোজাইক রিকম্বিনেশন প্ররোচিত করে (23), আমরা CTRL এবং শর্তাধীন (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) থেকে নিউরন সংগ্রহ করা শুরু করেছি। রিকম্বিনেশন সম্পূর্ণ হওয়ার পরে, 4 সপ্তাহ বয়সে এটিকে Mfn2cKO বলা হয়। শেষ বিন্দু হিসেবে, আমরা ৮ সপ্তাহ বয়স বেছে নিয়েছি যখন স্পষ্ট মাইটোকন্ড্রিয়াল খণ্ডন সত্ত্বেও পিএন স্তর অক্ষত ছিল (চিত্র 1B এবং চিত্র S1A)। মোট, আমরা ৩০১৩টি প্রোটিনের পরিমাণ নির্ধারণ করেছি, যার মধ্যে প্রায় ২২% ছিল মাইটোকন্ড্রিয়া প্রোটিওমের উপর ভিত্তি করে মাইটোকার্টা ২.০ টীকা অনুসারে মাইটোকন্ড্রিয়া (চিত্র 1E) (24)। ৮ম সপ্তাহে সম্পাদিত ডিফারেনশিয়াল জিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে সমস্ত প্রোটিনের মধ্যে মাত্র ১০.৫%-এর উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন হয়েছে (চিত্র 1F এবং চিত্র S1F), যার মধ্যে ১৯৫টি প্রোটিন ডাউন-রেগুলেটেড এবং ১২০টি প্রোটিন আপ-রেগুলেটেড হয়েছে (চিত্র 1F)। এটি লক্ষণীয় যে এই ডেটা সেটের "উদ্ভাবনী পথ বিশ্লেষণ" দেখায় যে ডিফারেনশিয়ালি এক্সপ্রেসড জিনগুলি প্রধানত নির্দিষ্ট বিপাকীয় পথের একটি সীমাবদ্ধ সেটের অন্তর্গত (চিত্র 1G)। মজার ব্যাপার হলো, যদিও OXPHOS এবং ক্যালসিয়াম সিগন্যালিং সম্পর্কিত পাথওয়েগুলোর ডাউনরেগুলেশন ফিউশন-বিহীন পিএন-গুলোতে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার প্রবর্তনকে নিশ্চিত করে, অন্যান্য বিভাগগুলো, যেগুলো প্রধানত অ্যামিনো অ্যাসিড বিপাকের সাথে জড়িত, সেগুলো উল্লেখযোগ্যভাবে আপরেগুলেটেড হয়, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল পিএন-গুলোর রিওয়্যারিং-এ সংঘটিত বিপাকের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ।
(A) CTRL এবং Mfn2cKO ইঁদুরের সেরিবেলার অংশের প্রতিনিধিত্বমূলক কনফোকাল ফটোগ্রাফ, যেখানে PN-এর (ক্যালবিন্ডিন, ধূসর) ক্রমবর্ধমান ক্ষয় দেখা যাচ্ছে; নিউক্লিয়াসগুলোকে DAPI দিয়ে কাউন্টারস্টেইন করা হয়েছিল। (B) (A)-এর পরিমাণ নির্ধারণ (একমুখী বৈশ্লেষিক ভেদ, ***P<0.001; তিনটি ইঁদুর থেকে প্রাপ্ত ৪ থেকে ৬টি বৃত্ত)। (C) পরীক্ষামূলক কার্যপ্রবাহ। (D) পারকিনজে (উপরে) এবং অন্যান্য কোষের (মাঝে) জন্য নির্দিষ্ট মার্কারগুলোর হিট ম্যাপ বিন্যাস। (E) শ্রেণীবদ্ধ PN-এ শনাক্তকৃত মাইটোকন্ড্রিয়াল প্রোটিনের সংখ্যা প্রদর্শনকারী ভেন ডায়াগ্রাম। (F) ৮ সপ্তাহে Mfn2cKO নিউরনে ভিন্নভাবে প্রকাশিত প্রোটিনের ভলকানো প্লট (গুরুত্বপূর্ণতার কাট-অফ মান ১.৩)। (G) সৃজনশীলতা পাথওয়ে বিশ্লেষণটি ৮ সপ্তাহ হিসেবে শ্রেণীবদ্ধ Mfn2cKO PN-এ পাঁচটি সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ আপ-রেগুলেশন (লাল) এবং ডাউন-রেগুলেশন (নীল) পাথওয়ে প্রদর্শন করে। প্রতিটি শনাক্তকৃত প্রোটিনের গড় প্রকাশের মাত্রা দেখানো হয়েছে। গ্রেস্কেল হিট ম্যাপ: সমন্বয়কৃত P মান। ns, গুরুত্বপূর্ণ নয়।
প্রোটিওমিক্স ডেটা দেখিয়েছে যে কমপ্লেক্স I, III, এবং IV-এর প্রোটিন এক্সপ্রেশন ক্রমান্বয়ে হ্রাস পেয়েছে। কমপ্লেক্স I, III, এবং IV সবকটিতেই অপরিহার্য mtDNA-এনকোডেড সাবইউনিট ছিল, যেখানে কমপ্লেক্স II, যা শুধুমাত্র নিউক্লিয়ার-কোডেড ছিল, তা মূলত অপরিবর্তিত ছিল (চিত্র 2A এবং চিত্র S2A)। প্রোটিওমিক্স ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্য রেখে, সেরিবেলার টিস্যু সেকশনের ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি দেখিয়েছে যে PN-এ কমপ্লেক্স IV-এর MTCO1 (মাইটোকন্ড্রিয়াল সাইটোক্রোম C অক্সিডেজ সাবইউনিট 1) সাবইউনিটের মাত্রা ক্রমান্বয়ে হ্রাস পেয়েছে (চিত্র 2B)। mtDNA-এনকোডেড সাবইউনিট Mtatp8 উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে (চিত্র S2A), যেখানে নিউক্লিয়ার-এনকোডেড ATP সিন্থেজ সাবইউনিটের স্থির-অবস্থার মাত্রা অপরিবর্তিত ছিল, যা mtDNA এক্সপ্রেশন স্থিতিশীল থাকাকালীন পরিচিত স্থিতিশীল ATP সিন্থেজ সাবঅ্যাসেম্বলি F1 কমপ্লেক্স গঠনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। ইন্টারাপ্ট (7)। রিয়েল-টাইম পলিমারেজ চেইন রিঅ্যাকশন (qPCR) দ্বারা বাছাইকৃত Mfn2cKO PN-গুলিতে mtDNA-এর মাত্রা মূল্যায়নে mtDNA কপি সংখ্যার ক্রমান্বয়িক হ্রাস নিশ্চিত হয়েছে। নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর তুলনায়, ৮ সপ্তাহ বয়সে mtDNA-এর মাত্রার মাত্র প্রায় ২০% বজায় ছিল (চিত্র ২সি)। এই ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্য রেখে, DNA শনাক্ত করার জন্য Mfn2cKO PN-গুলির কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি স্টেইনিং ব্যবহার করা হয়েছিল, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল নিউক্লিওটাইডের সময়-নির্ভর ব্যবহার প্রদর্শন করে (চিত্র ২ডি)। আমরা দেখেছি যে শুধুমাত্র মাইটোকন্ড্রিয়াল প্রোটিন অবক্ষয় এবং স্ট্রেস প্রতিক্রিয়ার সাথে জড়িত কিছু ক্যান্ডিডেটের মাত্রা বৃদ্ধি পেয়েছে, যার মধ্যে রয়েছে Lonp1, Afg3l2 ও Clpx এবং OXPHOS কমপ্লেক্স অ্যাসেম্বলি ফ্যাক্টরসমূহ। অ্যাপোপটোসিসের সাথে জড়িত প্রোটিনগুলির মাত্রায় কোনো উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন শনাক্ত করা যায়নি (চিত্র এস২বি)। একইভাবে, আমরা দেখেছি যে ক্যালসিয়াম পরিবহনের সাথে জড়িত মাইটোকন্ড্রিয়া এবং এন্ডোপ্লাজমিক রেটিকুলাম চ্যানেলগুলিতে শুধুমাত্র সামান্য পরিবর্তন হয়েছে (চিত্র এস২সি)। এছাড়াও, অটোফ্যাজি-সম্পর্কিত প্রোটিনের মূল্যায়নে কোনো উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন পাওয়া যায়নি, যা ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি এবং ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপির মাধ্যমে ইন ভিভোতে পর্যবেক্ষণ করা অটোফ্যাগোসোমের দৃশ্যমান আবেশনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ (চিত্র S3)। তবে, পিএন-গুলিতে ক্রমবর্ধমান OXPHOS কর্মহীনতার সাথে সুস্পষ্ট আল্ট্রাস্ট্রাকচারাল মাইটোকন্ড্রিয়াল পরিবর্তন দেখা যায়। ৫ এবং ৮ সপ্তাহ বয়সী Mfn2cKO পিএন-গুলির কোষদেহ এবং ডেনড্রাইটিক ট্রি-তে মাইটোকন্ড্রিয়াল ক্লাস্টার দেখা যায় এবং অভ্যন্তরীণ ঝিল্লির গঠনে গভীর পরিবর্তন ঘটেছে (চিত্র S4, A এবং B)। এই আল্ট্রাস্ট্রাকচারাল পরিবর্তন এবং mtDNA-এর উল্লেখযোগ্য হ্রাসের সাথে সামঞ্জস্য রেখে, টেট্রামিথাইলরোডামিন মিথাইল এস্টার (TMRM) দিয়ে অ্যাকিউট সেরেব্রেলার স্লাইসের বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে Mfn2cKO পিএন-গুলিতে মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেন পটেনশিয়াল উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে (চিত্র S4C)।
(A) OXPHOS কমপ্লেক্সের এক্সপ্রেশন লেভেলের সময়ক্রম বিশ্লেষণ। শুধুমাত্র ৮ সপ্তাহে P<0.05 থাকা প্রোটিনগুলো বিবেচনা করা হয়েছে (টু-ওয়ে অ্যানোভা)। ডটেড লাইন: CTRL-এর তুলনায় কোনো সমন্বয় করা হয়নি। (B) বামে: অ্যান্টি-MTCO1 অ্যান্টিবডি দিয়ে লেবেল করা একটি সেরিবেলার সেকশনের উদাহরণ (স্কেল বার, ২০ μm)। পারকিনজি কোষের দেহ দ্বারা দখলকৃত এলাকাটি হলুদ রঙে দেখানো হয়েছে। ডানে: MTCO1 লেভেলের পরিমাণ নির্ণয় (ওয়ান-ওয়ে অ্যানালাইসিস অফ ভ্যারিয়েন্স; তিনটি ইঁদুর থেকে ৭ থেকে ২০টি কোষ বিশ্লেষণ করা হয়েছে)। (C) বাছাই করা PN-এ mtDNA কপি সংখ্যার qPCR বিশ্লেষণ (ওয়ান-ওয়ে অ্যানালাইসিস অফ ভ্যারিয়েন্স; ৩ থেকে ৭টি ইঁদুর থেকে)। (D) বামে: একটি অ্যান্টি-DNA অ্যান্টিবডি দিয়ে লেবেল করা একটি সেরিবেলার স্লাইসের উদাহরণ (স্কেল বার, ২০ μm)। পারকিনজি কোষের দেহ দ্বারা দখলকৃত এলাকাটি হলুদ রঙে দেখানো হয়েছে। ডানে: mtDNA লেশনের পরিমাণ নির্ণয় (ওয়ান-ওয়ে অ্যানালাইসিস অফ ভ্যারিয়েন্স; তিনটি ইঁদুর থেকে ৫ থেকে ৯টি কোষ থেকে)। (E) একটি হোল-সেল প্যাচ ক্ল্যাম্প রেকর্ডিং-এ মাইটোওয়াইএফপি + পারকিনজে কোষ (তীরচিহ্ন) দেখানো একটি অ্যাকিউট সেরিবেলার সেকশনের উদাহরণ। (F) IV কার্ভের পরিমাণ নির্ণয়। (G) CTRL এবং Mfn2cKO পারকিনজে কোষে ডিপোলারাইজিং কারেন্ট ইনজেকশনের প্রতিনিধিত্বমূলক রেকর্ডিং। উপরের ট্রেস: প্রথম পালস যা AP ট্রিগার করেছে। নিচের ট্রেস: সর্বোচ্চ AP ফ্রিকোয়েন্সি। (H) পোস্টসিন্যাপটিক স্পন্টেনিয়াস ইনপুট (sPSP)-এর পরিমাণ নির্ণয়। প্রতিনিধিত্বমূলক রেকর্ডিং ট্রেস এবং এর জুম অনুপাত (I)-তে দেখানো হয়েছে। ওয়ান-ওয়ে অ্যানালাইসিস অফ ভ্যারিয়েন্স তিনটি ইঁদুর থেকে n = ৫ থেকে ২০টি কোষ বিশ্লেষণ করেছে। ডেটা গড়±SEM হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছে; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001। (J) পারফোরেটেড প্যাচ ক্ল্যাম্প মোড ব্যবহার করে রেকর্ড করা স্পন্টেনিয়াস AP-এর প্রতিনিধিত্বমূলক ট্রেস। উপরের ট্রেস: সর্বোচ্চ AP ফ্রিকোয়েন্সি। নিচের ট্রেস: একটি একক AP-এর জুম। (K) (J) অনুযায়ী গড় এবং সর্বোচ্চ AP ফ্রিকোয়েন্সির পরিমাণ নির্ণয় করুন। ম্যান-হুইটনি পরীক্ষা; চারটি ইঁদুর থেকে n = ৫টি কোষ বিশ্লেষণ করা হয়েছে। উপাত্ত গড়±প্রমিত ত্রুটি (SEM) হিসেবে প্রকাশ করা হয়েছে; যা গুরুত্বপূর্ণ নয়।
৮-সপ্তাহ বয়সী Mfn2cKO PN-এ সুস্পষ্ট OXPHOS ক্ষতি শনাক্ত করা হয়েছিল, যা নির্দেশ করে যে নিউরনের শারীরবৃত্তীয় কার্যকারিতা গুরুতরভাবে অস্বাভাবিক। তাই, আমরা ৪ থেকে ৫ সপ্তাহ এবং ৭ থেকে ৮ সপ্তাহ বয়সে অ্যাকিউট সেরিবেলার স্লাইসে হোল-সেল প্যাচ ক্ল্যাম্প রেকর্ডিং সম্পাদন করে OXPHOS-এর ঘাটতিযুক্ত নিউরনের প্যাসিভ বৈদ্যুতিক বৈশিষ্ট্য বিশ্লেষণ করেছি (চিত্র ২E)। অপ্রত্যাশিতভাবে, Mfn2cKO নিউরনের গড় রেস্টিং মেমব্রেন পটেনশিয়াল এবং ইনপুট রেজিস্ট্যান্স কন্ট্রোলের মতোই ছিল, যদিও কোষগুলোর মধ্যে সূক্ষ্ম পার্থক্য ছিল (সারণি ১)। একইভাবে, ৪ থেকে ৫ সপ্তাহ বয়সে, কারেন্ট-ভোল্টেজ সম্পর্কে (IV কার্ভ) কোনো উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন পাওয়া যায়নি (চিত্র ২F)। তবে, ৭ থেকে ৮ সপ্তাহ বয়সী কোনো Mfn2cKO নিউরনই IV পদ্ধতি (হাইপারপোলারাইজেশন ধাপ) থেকে বেঁচে থাকেনি, যা নির্দেশ করে যে এই শেষ পর্যায়ে হাইপারপোলারাইজেশন পটেনশিয়ালের প্রতি একটি স্পষ্ট সংবেদনশীলতা রয়েছে। বিপরীতে, Mfn2cKO নিউরনে, ডিপোলারাইজিং কারেন্ট যা পুনরাবৃত্তিমূলক অ্যাকশন পটেনশিয়াল (AP) ডিসচার্জ ঘটায়, তা ভালোভাবে সহ্য করা হয়, যা নির্দেশ করে যে তাদের সামগ্রিক ডিসচার্জ প্যাটার্ন ৮-সপ্তাহ-বয়সী কন্ট্রোল নিউরনের থেকে উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন নয় (সারণী ১ এবং চিত্র ২জি)। একইভাবে, স্বতঃস্ফূর্ত পোস্টসিন্যাপটিক কারেন্টের (sPSCs) ফ্রিকোয়েন্সি এবং অ্যামপ্লিচিউড কন্ট্রোল গ্রুপের সাথে তুলনীয় ছিল, এবং ইভেন্টের ফ্রিকোয়েন্সি ৪ সপ্তাহ থেকে ৫ সপ্তাহ, ৭ সপ্তাহ এবং ৮ সপ্তাহে একই রকম বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র ২, এইচ এবং আই)। PNs-এ সিন্যাপটিক পরিপক্কতার সময়কাল (২৫)। ছিদ্রযুক্ত PNs প্যাচের পরেও একই রকম ফলাফল পাওয়া গেছে। এই কনফিগারেশন কোষীয় ATP ত্রুটির সম্ভাব্য ক্ষতিপূরণ প্রতিরোধ করে, যা হোল-সেল প্যাচ ক্ল্যাম্প রেকর্ডিংয়ে ঘটতে পারে। বিশেষ করে, Mfn2cKO নিউরনের রেস্টিং মেমব্রেন পটেনশিয়াল এবং স্বতঃস্ফূর্ত ফায়ারিং ফ্রিকোয়েন্সি প্রভাবিত হয়নি (চিত্র ২, জে এবং কে)। সারসংক্ষেপে, এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে সুস্পষ্ট OXPHOS কর্মহীনতাযুক্ত PN-গুলি উচ্চ-কম্পাঙ্কের নিঃসরণ বিন্যাসের সাথে ভালোভাবে মানিয়ে নিতে পারে, যা প্রমাণ করে যে এমন একটি ক্ষতিপূরণ ব্যবস্থা রয়েছে যা তাদের প্রায়-স্বাভাবিক তড়িৎশারীরবৃত্তীয় প্রতিক্রিয়া বজায় রাখতে সাহায্য করে।
উপাত্ত গড় ± SEM হিসেবে প্রকাশ করা হয়েছে (একমুখী ভেদাঙ্ক বিশ্লেষণ, হোম-সিডাকের বহুবিধ তুলনা পরীক্ষা; *P<0.05)। একক সংখ্যা বন্ধনীর মধ্যে নির্দেশিত।
আমরা তদন্ত করতে চেয়েছিলাম যে প্রোটিওমিক্স ডেটাসেটের (চিত্র 1G) কোনও বিভাগে এমন পথ (pathways) অন্তর্ভুক্ত আছে কিনা যা গুরুতর OXPHOS ঘাটতিকে প্রতিহত করতে পারে, যার ফলে ব্যাখ্যা করা যায় কেন আক্রান্ত PN প্রায়-স্বাভাবিক ইলেক্ট্রোফিজিওলজি বজায় রাখতে পারে (চিত্র 2, E থেকে K)। প্রোটিওমিক্স বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে শাখাযুক্ত অ্যামিনো অ্যাসিড (BCAA) এর ক্যাটাবলিজমের সাথে জড়িত এনজাইমগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে আপ-রেগুলেটেড হয়েছে (চিত্র 3A এবং চিত্র S5A), এবং চূড়ান্ত পণ্য অ্যাসিটাইল-CoA (CoA) বা সাক্সিনাইল CoA আর্টেরিওস্ক্লেরোসিস অ্যাসিড (TCA) চক্রে ট্রাইকার্বোক্সিলেটগুলিকে পরিপূরক করতে পারে। আমরা দেখেছি যে BCAA ট্রান্সঅ্যামিনেজ 1 (BCAT1) এবং BCAT2 উভয়ের পরিমাণই বৃদ্ধি পেয়েছে। তারা α-কেটোগ্লুটারেট থেকে গ্লুটামেট তৈরি করে BCAA ক্যাটাবলিজমের প্রথম ধাপকে অনুঘটক করে (26)। ব্রাঞ্চড চেইন কিটো অ্যাসিড ডিহাইড্রোজিনেজ (BCKD) কমপ্লেক্স গঠনকারী সমস্ত সাবইউনিটের আপরেগুলেশন ঘটে (এই কমপ্লেক্সটি ফলস্বরূপ BCAA কার্বন কঙ্কালের পরবর্তী এবং অপরিবর্তনীয় ডিকার্বক্সিলেশনকে অনুঘটক করে) (চিত্র 3A এবং চিত্র S5A)। তবে, বাছাই করা PN-গুলিতে BCAA-এর নিজের মধ্যে কোনও সুস্পষ্ট পরিবর্তন পাওয়া যায়নি, যা এই অপরিহার্য অ্যামিনো অ্যাসিডগুলির বর্ধিত কোষীয় গ্রহণ অথবা TCA চক্রকে পরিপূরণ করার জন্য অন্যান্য উৎস (গ্লুকোজ বা ল্যাকটিক অ্যাসিড) ব্যবহারের কারণে হতে পারে (চিত্র S5B)। OXPHOS-বিহীন PN-গুলিতে ৮ সপ্তাহ বয়সে গ্লুটামিন পচন এবং ট্রান্সঅ্যামিনেশন কার্যকলাপও বৃদ্ধি পেয়েছিল, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল এনজাইম গ্লুটামিনেজ (GLS) এবং গ্লুটামিন পাইরুভেট ট্রান্সঅ্যামিনেজ 2 (GPT2)-এর আপ-রেগুলেশনের মাধ্যমে প্রতিফলিত হতে পারে (চিত্র 3, A এবং C)। এটি উল্লেখযোগ্য যে GLS-এর আপ-রেগুলেশন শুধুমাত্র স্প্লাইসড আইসোফর্ম গ্লুটামিনেজ C (GLS-GAC)-এর মধ্যেই সীমাবদ্ধ (Mfn2cKO/CTRL-এর পরিবর্তন প্রায় 4.5-গুণ, P = 0.05), এবং ক্যান্সার টিস্যুতে এর নির্দিষ্ট আপ-রেগুলেশন মাইটোকন্ড্রিয়াল জৈবশক্তিকে সমর্থন করতে পারে। (27)।
(A) হিট ম্যাপটি ৮ সপ্তাহে নির্দিষ্ট পথে প্রোটিনের মাত্রার ফোল্ড পরিবর্তন দেখায়। (B) অ্যান্টি-PCx অ্যান্টিবডি দিয়ে লেবেল করা একটি সেরিবেলার স্লাইসের উদাহরণ (স্কেল বার, ২০ μm)। হলুদ তীরটি পারকিনজে কোষের মূল অংশ নির্দেশ করে। (C) অ্যাথেরোস্ক্লেরোসিসের জন্য একটি গুরুত্বপূর্ণ ক্যান্ডিডেট হিসাবে চিহ্নিত টাইম কোর্স প্রোটিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ (মাল্টিপল টি-টেস্ট, *FDR <৫%; n = ৩-৫টি ইঁদুর)। (D) উপরে: [1-13C]পাইরুভেট ট্রেসারে থাকা লেবেলযুক্ত কার্বনের প্রবেশের বিভিন্ন পথ (যেমন, PDH বা ট্রান্স-আর্টেরিয়াল রুটের মাধ্যমে) দেখানো একটি স্কিম্যাটিক ডায়াগ্রাম। নিচে: ভায়োলিন চার্টটি [1-13C]পাইরুভেট দিয়ে অ্যাকিউট সেরিবেলার স্লাইস লেবেল করার পর একক-লেবেলযুক্ত কার্বনের (M1) শতকরা হার অ্যাসপার্টিক অ্যাসিড, সাইট্রিক অ্যাসিড এবং ম্যালিক অ্যাসিডে রূপান্তরিত হওয়া দেখায় (পেয়ার্ড টি-টেস্ট; ** P <০.০১)। (E) নির্দেশিত পথের ব্যাপক টাইম হিস্ট্রি বিশ্লেষণ। শুধুমাত্র ৮ সপ্তাহে P<0.05 মানযুক্ত প্রোটিনগুলো বিবেচনা করুন। ড্যাশযুক্ত রেখা: কোনো সমন্বয় মান নেই (দ্বিমুখী বৈশ্লেষিক ভেদ; * P <0.05; *** P <0.001)। উপাত্ত গড়±SEM হিসেবে প্রকাশ করা হয়েছে।
আমাদের বিশ্লেষণে, BCAA ক্যাটাবলিজম অন্যতম প্রধান আপ-রেগুলেশন পথ হিসেবে আবির্ভূত হয়েছে। এই ঘটনাটি জোরালোভাবে ইঙ্গিত দেয় যে OXPHOS-বিহীন PN-গুলিতে TCA চক্রে প্রবেশকারী ভেন্টিলেশন ভলিউম পরিবর্তিত হতে পারে। এটি নিউরোনাল মেটাবলিক রিওয়্যারিং-এর একটি প্রধান রূপ হতে পারে, যা গুরুতর OXPHOS কর্মহীনতার সময় নিউরোনাল ফিজিওলজি এবং বেঁচে থাকার উপর সরাসরি প্রভাব ফেলতে পারে। এই অনুমানের সাথে সঙ্গতি রেখে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে প্রধান অ্যান্টি-অ্যাথেরোস্ক্লেরোটিক এনজাইম PCx আপ-রেগুলেটেড হয়েছে (Mfn2cKO/CTRL প্রায় ১.৫ গুণ পরিবর্তিত হয়; চিত্র 3A), যা পাইরুভেটকে অক্সালোঅ্যাসিটেটে রূপান্তরে অনুঘটকের কাজ করে (28), এবং যা মস্তিষ্কের টিস্যুতে অ্যাস্ট্রোসাইটের মধ্যে সীমাবদ্ধ বলে মনে করা হয় (29, 30)। প্রোটিওমিক্স ফলাফলের সাথে সঙ্গতি রেখে, কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি দেখিয়েছে যে OXPHOS-বিহীন PN-গুলিতে PCx এক্সপ্রেশন বিশেষভাবে এবং উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে, যেখানে PCx রিঅ্যাকটিভিটি প্রধানত কন্ট্রোলের সংলগ্ন বার্গম্যান গ্লিয়াল কোষগুলিতে সীমাবদ্ধ ছিল (চিত্র 3B)। PCx-এর পর্যবেক্ষণকৃত আপরেগুলেশনের কার্যকারিতা পরীক্ষা করার জন্য, আমরা একিউট সেরিবেলার স্লাইসগুলোকে [1-13C]পাইরুভেট ট্রেসার দিয়ে ট্রিট করেছি। যখন পাইরুভেট ডিহাইড্রোজিনেজ (PDH) দ্বারা পাইরুভেট জারিত হয়, তখন এর আইসোটোপ লেবেল অদৃশ্য হয়ে যায়, কিন্তু যখন ভাস্কুলার বিক্রিয়ার মাধ্যমে পাইরুভেট মেটাবোলাইজড হয়, তখন এটি TCA সাইকেলের ইন্টারমিডিয়েটগুলোর মধ্যে অন্তর্ভুক্ত হয় (চিত্র 3D)। আমাদের প্রোটিওমিক্স ডেটার সমর্থনে, আমরা Mfn2cKO স্লাইসের অ্যাসপার্টিক অ্যাসিডে এই ট্রেসার থেকে প্রাপ্ত প্রচুর সংখ্যক মার্কার পর্যবেক্ষণ করেছি, যদিও সাইট্রিক অ্যাসিড এবং ম্যালিক অ্যাসিডেও একটি মাঝারি প্রবণতা দেখা গেছে, তবে তা তাৎপর্যপূর্ণ ছিল না (চিত্র 3D)।
ডোপামিন নিউরনের নির্দিষ্ট মাইটোকন্ড্রিয়াল ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর A জিন (Tfam) ধ্বংস করার মাধ্যমে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা সৃষ্টি করে MitoPark ইঁদুরের ডোপামিন নিউরনে PCx এক্সপ্রেশনও উল্লেখযোগ্যভাবে আপ-রেগুলেটেড হয়েছিল (31), যা ইঙ্গিত করে যে অ্যাসিটোন অ্যাসিড আর্টেরিওস্ক্লেরোসিস রোগের সংঘটন শরীরে নিউরোনাল OXPHOS-এর কর্মহীনতার সময় নিয়ন্ত্রিত হয়। এটি লক্ষণীয় যে, এটি পাওয়া গেছে যে আর্টেরিওস্ক্লেরোসিসের সাথে সম্পর্কিত হতে পারে এমন নিউরনে প্রকাশিত হতে পারে এমন অনন্য এনজাইমগুলি (32-34) OXPHOS-এর অভাবযুক্ত PN-গুলিতে উল্লেখযোগ্যভাবে আপ-রেগুলেটেড হয়, যেমন প্রোপিওনাইল-কোএ কার্বক্সিলেজ (PCC-A), যা প্রোপিওনাইল-কোএ-কে সাক্সিনাইল-কোএ-তে রূপান্তরিত করে এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ম্যালিক এনজাইম 3 (ME3), যার প্রধান ভূমিকা হল ম্যালেট থেকে পাইরুভেট পুনরুদ্ধার করা (চিত্র 3, A এবং C) (33, 35)। এছাড়াও, আমরা Pdk3 এনজাইমের উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি দেখতে পেয়েছি, যা PDH-কে ফসফোরাইলেট করে এবং নিষ্ক্রিয় করে (36), যদিও PDH-কে সক্রিয়কারী Pdp1 এনজাইম বা PDH এনজাইম কমপ্লেক্সের নিজের মধ্যে কোনও পরিবর্তন সনাক্ত করা যায়নি (চিত্র 3A)। সঙ্গতিপূর্ণভাবে, Mern2cKO PNs-এ, PDH কমপ্লেক্সের পাইরুভেট ডিহাইড্রোজিনেজ E1 উপাদানের α1 সাবইউনিট α (PDHE1α)-এর Ser293-এ ফসফোরাইলেশন (যা PDH-এর এনজাইম কার্যকলাপকে বাধা দেয় বলে পরিচিত) বৃদ্ধি পেয়েছিল (চিত্র S6C)। পাইরুভেটের কোনও ভাস্কুলার অ্যাক্সেস নেই।
অবশেষে, আমরা দেখতে পেলাম যে, রিপোর্ট অনুযায়ী, অ্যাক্টিভেশন প্রক্রিয়ার সময় সেরিন এবং গ্লাইসিন জৈব সংশ্লেষণের সুপার পাথওয়ে, সম্পর্কিত মাইটোকন্ড্রিয়াল ফোলেট (1C) চক্র এবং প্রোলিন জৈব সংশ্লেষণ (চিত্র 1G এবং চিত্র S5C) সবই উল্লেখযোগ্যভাবে আপ-রেগুলেটেড হয়। পার্শ্ববর্তী টিস্যুগুলো মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিসফাংশনের সাথে সক্রিয় হয় (5-7)। এই প্রোটিওমিক্স ডেটাকে সমর্থনকারী কনফোকাল বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে, OXPHOS অনুপস্থিত PN-এ, ৮-সপ্তাহ বয়সী ইঁদুরের সেরিবেলার স্লাইসগুলোকে মাইটোকন্ড্রিয়াল ফোলেট চক্রের একটি মূল এনজাইম সেরিন হাইড্রোক্সিমিথাইলট্রান্সফেরেজ 2 (SHMT2)-এর সংস্পর্শে আনা হলে একটি উল্লেখযোগ্য ইমিউন প্রতিক্রিয়া দেখা যায় (চিত্র S5D)। 13 CU-গ্লুকোজ-ইনকিউবেটেড অ্যাকিউট সেরিবেলার স্লাইসগুলোতে মেটাবলিক ট্রেসিং পরীক্ষা সেরিন এবং প্রোলিন জৈব সংশ্লেষণের আপ-রেগুলেশনকে আরও নিশ্চিত করেছে, যা নির্দেশ করে যে সেরিন এবং প্রোলিনে কার্বন আইসোফর্মের প্রবাহ বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র S5E)। যেহেতু GLS এবং GPT2 দ্বারা প্রভাবিত বিক্রিয়াগুলো গ্লুটামিন থেকে গ্লুটামেট সংশ্লেষণ এবং গ্লুটামেট ও α-কিটোগ্লুটারেটের মধ্যে ট্রান্সঅ্যামিনেশনের জন্য দায়ী, তাই এদের আপরেগুলেশন নির্দেশ করে যে OXPHOS-এর ঘাটতিযুক্ত নিউরনগুলোতে গ্লুটামেটের চাহিদা বৃদ্ধি পায়। এর উদ্দেশ্য হতে পারে প্রোলিনের বর্ধিত জৈব সংশ্লেষণ বজায় রাখা (চিত্র S5C)। এই পরিবর্তনগুলোর বিপরীতে, PN-নির্দিষ্ট Mfn2cKO ইঁদুরের সেরিবেলার অ্যাস্ট্রোসাইটের একটি প্রোটিওমিক বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে এই পথগুলো (সমস্ত অ্যান্টিপেরোক্সিডেস সহ) অভিব্যক্তিতে উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হয়নি, যা প্রমাণ করে যে এই বিপাকীয় পুনর্নির্দেশনাটি ক্ষয়প্রাপ্ত PN-এর প্রতি নির্বাচনী (চিত্র S6, D থেকে G)।
সারসংক্ষেপে, এই বিশ্লেষণগুলি পিএন-গুলিতে নির্দিষ্ট বিপাকীয় পথগুলির টেম্পোরাল অ্যাক্টিভেশনের উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন প্যাটার্ন প্রকাশ করেছে। যদিও অস্বাভাবিক নিউরোনাল মাইটোকন্ড্রিয়াল ফাংশন প্রাথমিক এথেরোস্ক্লেরোসিস এবং 1C রিমডেলিং (চিত্র 3E এবং চিত্র S5C) ঘটাতে পারে, এবং এমনকি I এবং IV কমপ্লেক্সের এক্সপ্রেশনে পূর্বাভাসযোগ্য পরিবর্তনও আনতে পারে, সেরিন ডি নভো সংশ্লেষণের পরিবর্তনগুলি কেবল শেষ পর্যায়েই স্পষ্ট হয়ে ওঠে। OXPHOS ডিসফাংশন (চিত্র 3E এবং চিত্র S5C)। এই ফলাফলগুলি একটি অনুক্রমিক প্রক্রিয়াকে সংজ্ঞায়িত করে যেখানে স্ট্রেস-প্ররোচিত মাইটোকন্ড্রিয়াল (1C চক্র) এবং সাইটোপ্লাজমিক (সেরিন বায়োসিন্থেসিস) প্রতিক্রিয়া TCA চক্রে এথেরোস্ক্লেরোসিস বৃদ্ধির সাথে সমন্বিতভাবে কাজ করে নিউরোনাল মেটাবলিজমকে নতুন রূপ দেয়।
৮-সপ্তাহ-বয়সী OXPHOS-এর ঘাটতিযুক্ত প্রাইমারি নিউরন (PN) উচ্চ-ফ্রিকোয়েন্সির উদ্দীপনা কার্যকলাপ বজায় রাখতে পারে এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার ক্ষতিপূরণের জন্য উল্লেখযোগ্য বিপাকীয় পুনঃসংযোগ ঘটাতে পারে। এই আবিষ্কারটি একটি আকর্ষণীয় সম্ভাবনা তৈরি করে যে, এই মুহূর্তেও এই কোষগুলি নিউরোডিজেনারেশন বিলম্বিত বা প্রতিরোধ করার জন্য থেরাপিউটিক হস্তক্ষেপ পেতে পারে। আমরা দুটি স্বাধীন হস্তক্ষেপের মাধ্যমে এই সম্ভাবনাটি সমাধান করেছি। প্রথম পদ্ধতিতে, আমরা একটি Cre-নির্ভর অ্যাডিনো-অ্যাসোসিয়েটেড ভাইরাস (AAV) ভেক্টর ডিজাইন করেছি যাতে MFN2 ইন ভিভোতে OXPHOS-এর ঘাটতিযুক্ত প্রাইমারি নিউরনে বেছে বেছে প্রকাশ করা যায় (চিত্র S7A)। MFN2 এবং ফ্লুরোসেন্ট রিপোর্টার জিন mCherry (Mfn2-AAV) এনকোডকারী AAV-টি ইন ভিট্রোতে প্রাইমারি নিউরন কালচারে যাচাই করা হয়েছিল, যা MFN2-কে একটি Cre-নির্ভর পদ্ধতিতে প্রকাশ করে এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজি পুনরুদ্ধার করে, যার ফলে Mfn2cKO নিউরনে নিউরোমিউটেশন প্রতিরোধ করা হয় (চিত্র S7, B, D এবং E)। এরপর, আমরা Mfn2cKO এবং কন্ট্রোল ইঁদুরের সেরিবেলার কর্টেক্সে ৮-সপ্তাহ বয়সী Mfn2-AAV স্টেরিওট্যাক্টিকভাবে পৌঁছে দেওয়ার জন্য ইন ভিভো পরীক্ষা পরিচালনা করি এবং ১২-সপ্তাহ বয়সী ইঁদুর বিশ্লেষণ করি (চিত্র 4A)। চিকিৎসাপ্রাপ্ত Mfn2cKO ইঁদুরগুলো মারা গিয়েছিল (চিত্র 1, A এবং B) (16)। ইন ভিভো ভাইরাল ট্রান্সডাকশনের ফলে কিছু সেরিবেলার সার্কেলে PN-এর নির্বাচনী প্রকাশ ঘটে (চিত্র S7, G এবং H)। শুধুমাত্র mCherry প্রকাশকারী কন্ট্রোল AAV (Ctrl-AAV) ইনজেকশনের ফলে Mfn2cKO প্রাণীদের নিউরোডিজেনারেশনের মাত্রার উপর কোনো উল্লেখযোগ্য প্রভাব পড়েনি। বিপরীতে, Mfn2-AAV দ্বারা ট্রান্সডিউসড Mfn2cKO-এর বিশ্লেষণে PN কোষ স্তরের একটি উল্লেখযোগ্য প্রতিরক্ষামূলক প্রভাব দেখা গেছে (চিত্র 4, B এবং C)। বিশেষ করে, নিউরনের ঘনত্ব কন্ট্রোল প্রাণীদের থেকে প্রায় অভিন্ন বলে মনে হয় (চিত্র 4, B এবং C, এবং চিত্র S7, H এবং I)। MFN1-এর প্রকাশ নিউরোনাল মৃত্যু রোধে সমানভাবে কার্যকর, কিন্তু MFN2-এর ক্ষেত্রে তা নয় (চিত্র 4C এবং চিত্র S7, C ও F), যা নির্দেশ করে যে এক্টোপিক MFN1-এর প্রকাশ কার্যকরভাবে MFN2-এর অভাব পূরণ করতে পারে। একক PN পর্যায়ে আরও বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে Mfn2-AAV মূলত মাইটোকন্ড্রিয়ার আল্ট্রাস্ট্রাকচার পুনরুদ্ধার করেছে, mtDNA-এর মাত্রা স্বাভাবিক করেছে এবং অ্যান্টি-অ্যাঞ্জিওজেনেসিস মার্কার PCx-এর উচ্চ প্রকাশকে বিপরীতমুখী করেছে (চিত্র 4, C থেকে E)। বিশ্রামরত অবস্থায় পুনরুদ্ধারকৃত Mfn2cKO ইঁদুরদের চাক্ষুষ পর্যবেক্ষণে দেখা গেছে যে তাদের অঙ্গবিন্যাস এবং মোটর উপসর্গ (চলাচল S1 থেকে S3) উন্নত হয়েছে। উপসংহারে, এই পরীক্ষাগুলো দেখায় যে OXPHOS-এর তীব্র ঘাটতিযুক্ত PN-গুলোতে MFN2-এর বিলম্বিত পুনঃপ্রবর্তন mtDNA-এর ক্ষয়কে বিপরীতমুখী করতে এবং অ্যাথেরোস্ক্লেরোসিস প্ররোচিত করতে যথেষ্ট, যার ফলে ইন ভিভোতে অ্যাক্সন অবক্ষয় এবং নিউরোনাল মৃত্যু প্রতিরোধ করা যায়।
(A) নির্দেশিত বিপাকীয় পথটি সক্রিয় হলে MFN2 এনকোডিংকারী AAV ইনজেকশনের পরীক্ষামূলক সময়সূচী প্রদর্শনকারী একটি পরিকল্পনা। (B) Mfn2cKO ইঁদুরের ১২-সপ্তাহ-বয়সী সেরিবেলার স্লাইসের প্রতিনিধিত্বমূলক কনফোকাল চিত্র, যা ৮ সপ্তাহে ট্রান্সডিউস করা হয়েছে এবং অ্যান্টি-ক্যালবাইন্ডিন অ্যান্টিবডি দিয়ে লেবেল করা হয়েছে। ডানদিকে: অ্যাক্সন ফাইবারের স্কেলিং। অ্যাক্সন জুমের স্কেল হলো ৪৫০ এবং ৭৫ μm। (C) বামদিকে: AAV ট্রান্সডাকশন লুপে (AAV+) পারকিনজি কোষের ঘনত্বের পরিমাণ নির্ধারণ (একমুখী বৈশ্লেষিক ভেদ; n = ৩টি ইঁদুর)। ডানদিকে: ১২ সপ্তাহে ট্রান্সডিউসড PN-এ mtDNA ফোকাস বিশ্লেষণ (আনপেয়ার্ড টি-টেস্ট; তিনটি ইঁদুর থেকে n = ৬টি কোষ)। * P <০.০৫; ** P <০.০১। (D) নির্দেশিত ভাইরাল ভেক্টর দ্বারা ট্রান্সডিউসড Mfn2cKO সেরিবেলার সেকশনের PN-এর প্রতিনিধিত্বমূলক ট্রান্সমিশন ইলেকট্রন মাইক্রোগ্রাফ। গোলাপী মাস্কটি ডেনড্রাইট দ্বারা অধিকৃত এলাকা নির্দেশ করে, এবং হলুদ বিন্দুযুক্ত বর্গক্ষেত্রটি ডানদিকে প্রদত্ত জুম নির্দেশ করে; n নিউক্লিয়াসকে বোঝায়। স্কেল বার, ১μm। (E) ১২ সপ্তাহে ট্রান্সডিউসড PN-এ PCx স্টেইনিং-এর একটি উদাহরণ দেখায়। স্কেল বার, ২০μm। OE, ওভারএক্সপ্রেশন; FC, ফোল্ড চেঞ্জ।
অবশেষে, আমরা OXPHOS কর্মহীনতার শিকার হওয়া PN-গুলিতে পারঅক্সিডেস-প্ররোচিত কোষ বেঁচে থাকার গুরুত্ব অনুসন্ধান করেছি। আমরা বিশেষভাবে মাউস PCx mRNA-কে লক্ষ্য করে AAV-shRNA (শর্ট হেয়ারপিন RNA) এনকোডকারী mCherry (AAV-shPCx) তৈরি করেছি এবং ভাইরাসটি বা এর স্ক্র্যাম্বলড কন্ট্রোল (AAV-scr) Mfn2cKO মাউসের সেরিবেলামে ইনজেক্ট করেছি। ইনজেকশনটি চার সপ্তাহ বয়সে (চিত্র 5A) করা হয়েছিল, যাতে PCx-এর কার্যকর নকডাউন সেই সময়ে করা যায় যখন PCx-এর এক্সপ্রেশন বৃদ্ধি পায় (চিত্র 3C) এবং PN কোষ স্তরটি তখনও অক্ষত থাকে (চিত্র 1A)। এটি লক্ষণীয় যে PCx-কে নকডাউন করলে (চিত্র S8A) PN-এর মৃত্যু উল্লেখযোগ্যভাবে ত্বরান্বিত হয়, যা শুধুমাত্র সংক্রমিত রিং-এর মধ্যেই সীমাবদ্ধ থাকে (চিত্র 5, B এবং C)। PCx আপ-রেগুলেশন দ্বারা প্ররোচিত বিপাকীয় প্রভাবের প্রক্রিয়া বোঝার জন্য, আমরা PCx নকডাউনের পরে PNs-এর রিডক্স অবস্থা অধ্যয়ন করেছি এবং একই সাথে AAV-মধ্যস্থ অপটিক্যাল বায়োসেন্সর Grx1-roGFP2 প্রকাশ করেছি (চিত্র S8, B থেকে D) গ্লুটাথায়ন পেপটাইড রিডক্স পটেনশিয়ালের আপেক্ষিক পরিবর্তন মূল্যায়ন করার জন্য (38)। তারপর, FLIM শর্ত যাচাই করার পরে সাইটোপ্লাজমিক রিডক্স অবস্থার সম্ভাব্য পরিবর্তন সনাক্ত করার জন্য আমরা 7-সপ্তাহ বয়সী Mfn2cKO বা নিয়ন্ত্রণ লিটারমেটদের মস্তিষ্কের স্লাইসে টু-ফোটন ফ্লুরোসেন্স লাইফটাইম ইমেজিং মাইক্রোস্কোপি (FLIM) করেছি (চিত্র S8, E থেকে G)। বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে PCx এক্সপ্রেশনবিহীন একক Mfn2cKO PNs-এর জারণ অবস্থায় উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি ঘটেছে, যা নিয়ন্ত্রণ নিউরন বা শুধুমাত্র স্ক্র্যাম্বলড shRNA প্রকাশকারী Mfn2cKO PNs থেকে ভিন্ন (চিত্র 5, D এবং E)। যখন PCx-এর প্রকাশ কমিয়ে দেওয়া হয়েছিল, তখন উচ্চমাত্রায় জারিত অবস্থা প্রদর্শনকারী Mfn2cKO PN-এর শতাংশ তিন গুণেরও বেশি বেড়ে গিয়েছিল (চিত্র 5E), যা নির্দেশ করে যে PCx-এর উচ্চমাত্রার নিয়ন্ত্রণ অবক্ষয়প্রাপ্ত নিউরনের জারণ-বিজারণ ক্ষমতা বজায় রেখেছিল।
(A) নির্দেশিত বিপাকীয় পথটি সক্রিয় হলে shPCx এনকোডিংকারী AAV ইনজেকশনের পরীক্ষামূলক সময়সূচী প্রদর্শনকারী একটি পরিকল্পনা। (B) ৪ সপ্তাহে অ্যান্টি-ক্যালসিনিউরিন অ্যান্টিবডি দ্বারা ট্রান্সডিউসড এবং লেবেলযুক্ত Mfn2cKO ইঁদুরের ৮-সপ্তাহ-বয়সী সেরিবেলার অংশের প্রতিনিধিত্বমূলক কনফোকাল ফটোগ্রাফ। স্কেল বার, ৪৫০μm। (C) AAV-ট্রান্সডিউসড লুপগুলিতে পারকিনজে কোষের ঘনত্বের পরিমাণ নির্ধারণ (একমুখী বৈশ্লেষিক বিশ্লেষণ; n = ৩ থেকে ৪টি ইঁদুর)। ডেটা গড়±SEM হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছে; ***P<০.০০১। (D) নির্দিষ্ট পরীক্ষামূলক পরিস্থিতিতে গ্লুটাথায়ন রিডক্স সেন্সর Grx1-roGFP2 প্রকাশকারী ৭-সপ্তাহ-বয়সী PN-এর গড় জীবনকাল প্রদর্শনকারী একটি প্রতিনিধিত্বমূলক FLIM ছবি। LUT (লুক-আপ টেবিল) অনুপাত: বেঁচে থাকার সময়কাল (পিকোসেকেন্ডে)। স্কেল বার, ২৫μm। (E) হিস্টোগ্রামটি (D) থেকে প্রাপ্ত Grx1-roGFP2 জীবনকালের মানগুলোর বিন্যাস দেখায় (প্রতিটি শর্তের অধীনে দুটি ইঁদুরের ১৫৮ থেকে ৩৬৮টি কোষ)। প্রতিটি হিস্টোগ্রামের উপরের পাই চার্টটি উল্লেখযোগ্যভাবে দীর্ঘতর (লাল, জারিত) বা খাটো (নীল, বিজারিত) জীবনকালের মানযুক্ত কোষের সংখ্যা দেখায়, যা CTRL-AAV-scr-এর গড় জীবনকালের মানের ১ স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন (SD) অতিক্রম করে। (F) প্রস্তাবিত মডেলটি নিউরোনাল PCx-এর আপরেগুলেশনের প্রতিরক্ষামূলক প্রভাব প্রদর্শন করে।
সর্বোপরি, আমরা এখানে যে তথ্য প্রদান করছি তা থেকে দেখা যায় যে, MFN2-এর পুনঃপ্রকাশ গুরুতর OXPHOS ঘাটতি, গুরুতর mtDNA হ্রাস এবং অত্যন্ত অস্বাভাবিক ista-সদৃশ গঠনযুক্ত উন্নত PN-কে সম্পূর্ণরূপে পুনরুদ্ধার করতে পারে, যার ফলে এমনকি উন্নত রোগেও অবিচ্ছিন্ন অগ্রগতি সাধিত হয়। নিউরোডিজেনারেশন কোষ মৃত্যুর পূর্ববর্তী পর্যায়ের পরিবর্তনযোগ্য প্রমাণ প্রদান করে। বিপাকীয় নমনীয়তার এই মাত্রা আরও জোরদার হয় নিউরনের অ্যাথেরোস্ক্লেরোসিস (TCA চক্রের একটি পুনর্গঠন) প্ররোচিত করার ক্ষমতা দ্বারা, যা OXPHOS-বিহীন PN-গুলিতে PCx-এর প্রকাশকে বাধা দেয় এবং কোষ মৃত্যুকে ত্বরান্বিত করে, যার ফলে এটি একটি প্রতিরক্ষামূলক ভূমিকা পালন করে (চিত্র 5F)।
এই গবেষণায় আমরা প্রমাণ দিয়েছি যে, OXPHOS কর্মহীনতার প্রতি PN-এর প্রতিক্রিয়া হলো মেটাবলিক প্রোগ্রাম দ্বারা সক্রিয় ডিফারেনশিয়াল অ্যাক্টিভেশন পথের মাধ্যমে ধীরে ধীরে TCA চক্রের অ্যাথেরোস্ক্লেরোসিসের দিকে অগ্রসর হওয়া। আমরা অনেক পরিপূরক পদ্ধতির মাধ্যমে প্রোটিওমিক বিশ্লেষণ নিশ্চিত করেছি এবং প্রকাশ করেছি যে, গুরুতর মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার সম্মুখীন হলে নিউরনগুলো এক ধরনের পূর্বে অজানা মেটাবলিক স্থিতিস্থাপকতা প্রদর্শন করে। আমাদের অবাক করে দিয়ে, এই সম্পূর্ণ রিওয়্যারিং প্রক্রিয়াটি অগত্যা সেই চূড়ান্ত মেটাবলিক অবস্থাকে চিহ্নিত করে না যা ধীরে ধীরে এবং অপরিবর্তনীয়ভাবে নিউরোডিজেনারেশনের সাথে আসে, বরং আমাদের তথ্য ইঙ্গিত দেয় যে এটি কোষ মৃত্যুর পূর্ববর্তী পর্যায়েও একটি রক্ষণাবেক্ষণকারী নিউরন কার্যকরী ক্ষতিপূরণ প্রক্রিয়া গঠন করতে পারে। এই আবিষ্কার ইঙ্গিত দেয় যে শরীরে নিউরনের যথেষ্ট পরিমাণে মেটাবলিক প্লাস্টিসিটি রয়েছে। এই ঘটনাটি প্রমাণ করে যে পরবর্তীকালে MFN2-এর পুনঃপ্রবর্তন মূল মেটাবলিক মার্কারগুলোর প্রকাশকে বিপরীত করতে পারে এবং PN-এর অবক্ষয় প্রতিরোধ করতে পারে। বিপরীতে, এটি অ্যাথেরোস্ক্লেরোসিসকে বাধা দেয় এবং স্নায়ুর রূপান্তরকে ত্বরান্বিত করে।
আমাদের গবেষণার সবচেয়ে আকর্ষণীয় আবিষ্কারগুলির মধ্যে একটি হল যে OXPHOS-এর অভাবযুক্ত PN গুলি আর্টেরিওস্ক্লেরোসিসকে বিশেষভাবে উদ্দীপিত করে এমন এনজাইমগুলিকে আপ-রেগুলেট করার মাধ্যমে TCA চক্রের বিপাককে পরিবর্তন করতে পারে। বিপাকীয় পুনর্বিন্যাস ক্যান্সার কোষের একটি সাধারণ বৈশিষ্ট্য, যার মধ্যে কিছু কোষ রিডিউসিং ইকুইভ্যালেন্ট তৈরি করার জন্য TCA চক্রের মধ্যবর্তী পদার্থগুলিকে পরিপূরক করতে গ্লুটামিনের উপর নির্ভর করে, যা শ্বসন শৃঙ্খলকে চালিত করে এবং লিপিড এবং নিউক্লিওটাইড জৈব সংশ্লেষণের পূর্বসূরীর উৎপাদন বজায় রাখে (39, 40)। একটি সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে OXPHOS কর্মহীনতার সম্মুখীন পেরিফেরাল টিস্যুগুলিতে, গ্লুটামিন/গ্লুটামেট বিপাকের পুনঃসংযোগও একটি বিশিষ্ট বৈশিষ্ট্য (5, 41), যেখানে TCA চক্রে গ্লুটামিনের প্রবেশের দিকটি OXPHOS ক্ষতির তীব্রতার উপর নির্ভর করে (41)। যাইহোক, শরীরে নিউরোনাল বিপাকীয় প্লাস্টিসিটির কোনও সাদৃশ্য এবং রোগের প্রেক্ষাপটে এর সম্ভাব্য প্রাসঙ্গিকতার উপর স্পষ্ট প্রমাণের অভাব রয়েছে। সাম্প্রতিক একটি ইন ভিট্রো গবেষণায় দেখা গেছে যে, প্রাইমারি কর্টিকাল নিউরনগুলি নিউরোট্রান্সমিশনের জন্য গ্লুটামেট পুলগুলিকে একত্রিত করে, যার ফলে বিপাকীয় চাপের পরিস্থিতিতে অক্সিডেটিভ মেটাবলিজম এবং এথেরোস্ক্লেরোসিস বৃদ্ধি পায় (42)। এটি উল্লেখযোগ্য যে, TCA চক্রের এনজাইম সাক্সিনেট ডিহাইড্রোজিনেজের ফার্মাকোলজিক্যাল ইনহিবিশনের অধীনে, পাইরুভেট কার্বক্সিলেশন কালচারড সেরিবেলার গ্র্যানিউল নিউরনে অক্সালোঅ্যাসিটেটের সংশ্লেষণ বজায় রাখে বলে মনে করা হয় (34)। যাইহোক, মস্তিষ্কের টিস্যুর জন্য এই প্রক্রিয়াগুলির শারীরবৃত্তীয় প্রাসঙ্গিকতা (যেখানে এথেরোস্ক্লেরোসিস প্রধানত অ্যাস্ট্রোসাইটগুলিতে সীমাবদ্ধ বলে মনে করা হয়) এখনও গুরুত্বপূর্ণ শারীরবৃত্তীয় তাৎপর্য বহন করে (43)। এই ক্ষেত্রে, আমাদের ডেটা দেখায় যে শরীরে OXPHOS দ্বারা ক্ষতিগ্রস্ত PN গুলি BCAA অবক্ষয় এবং পাইরুভেট কার্বক্সিলেশনে রূপান্তরিত হতে পারে, যা TCA পুল ইন্টারমিডিয়েটগুলির সরবরাহের দুটি প্রধান উৎস। যদিও নিউরোনাল শক্তি বিপাকে BCAA ক্যাটাবলিজমের সম্ভাব্য অবদানের প্রস্তাব করা হয়েছে, নিউরোট্রান্সমিশনের জন্য গ্লুটামেট এবং GABA-এর ভূমিকার পাশাপাশি (44), ইন ভিভোতে এই প্রক্রিয়াগুলির এখনও কোনও প্রমাণ নেই। অতএব, এটি অনুমান করা সহজ যে ত্রুটিপূর্ণ PN গুলি অ্যাথেরোস্ক্লেরোসিস বৃদ্ধির মাধ্যমে অ্যাসিমিলেশন প্রক্রিয়া দ্বারা চালিত TCA মধ্যবর্তীগুলির ব্যবহারের জন্য স্বয়ংক্রিয়ভাবে ক্ষতিপূরণ দিতে পারে। বিশেষ করে, অ্যাসপার্টিক অ্যাসিডের বর্ধিত চাহিদা বজায় রাখার জন্য PCx-এর আপরেগুলেশন প্রয়োজন হতে পারে, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা সহ প্রসারিত কোষগুলিতে প্রস্তাবিত (45)। যাইহোক, আমাদের মেটাবোলোমিক্স বিশ্লেষণ Mfn2cKO PN-গুলিতে অ্যাসপার্টিক অ্যাসিডের স্থির-অবস্থার স্তরে কোনও উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন প্রকাশ করেনি (চিত্র S6A), যা সম্ভবত প্রসারিত কোষ এবং পোস্ট-মাইটোসিস নিউরনের মধ্যে অ্যাসপার্টিক অ্যাসিডের ভিন্ন বিপাকীয় ব্যবহারকে প্রতিফলিত করে। যদিও ভিভোতে অকার্যকর নিউরনে PCx আপরেগুলেশনের সঠিক প্রক্রিয়া এখনও চিহ্নিত করা বাকি, আমরা দেখিয়েছি যে এই অকাল প্রতিক্রিয়া নিউরনের রিডক্স অবস্থা বজায় রাখতে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে, যা সেরিবেলার স্লাইসের উপর FLIM পরীক্ষায় প্রদর্শিত হয়েছে। বিশেষ করে, PNs-কে PCx আপ-রেগুলেট করা থেকে বিরত রাখলে তা আরও জারিত অবস্থার দিকে নিয়ে যেতে পারে এবং কোষের মৃত্যুকে ত্বরান্বিত করতে পারে। BCAA অবক্ষয়ের সক্রিয়করণ এবং পাইরুভেটের কার্বক্সিলেশন মাইটোকন্ড্রিয়াল অকার্যকারিতার পেরিফেরাল টিস্যু চিহ্নিত করার উপায় নয় (7)। অতএব, এগুলি OXPHOS-ঘাটতিযুক্ত নিউরনের একটি অগ্রাধিকারমূলক বৈশিষ্ট্য বলে মনে হয়, যদিও এটিই একমাত্র বৈশিষ্ট্য নয়, যা নিউরোডিজেনারেশনের জন্য গুরুত্বপূর্ণ।
সেরেবেলার রোগ হলো এক ভিন্নধর্মী নিউরোডিজেনারেটিভ রোগ যা সাধারণত অ্যাটাক্সিয়া হিসেবে প্রকাশ পায় এবং প্রায়শই পিএন (PN) ক্ষতিগ্রস্ত করে (46)। এই নিউরন জনগোষ্ঠী মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার প্রতি বিশেষভাবে সংবেদনশীল কারণ ইঁদুরের মধ্যে এদের নির্বাচিত অবক্ষয় মানুষের স্পাইনোসেরেবেলার অ্যাটাক্সিয়ার বৈশিষ্ট্যযুক্ত অনেক মোটর উপসর্গ পুনরুৎপাদন করার জন্য যথেষ্ট (16, 47, 48)। প্রতিবেদন অনুসারে, একটি মিউট্যান্ট জিন সহ একটি ট্রান্সজেনিক ইঁদুরের মডেল মানুষের স্পাইনোসেরেবেলার অ্যাটাক্সিয়ার সাথে সম্পর্কিত এবং এতে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা রয়েছে (49, 50), যা পিএনপিএইচ (PNPH)-এ OXPHOS ঘাটতির পরিণতি অধ্যয়নের গুরুত্বের উপর জোর দেয়। অতএব, এই অনন্য নিউরন জনগোষ্ঠীকে কার্যকরভাবে বিচ্ছিন্ন করা এবং অধ্যয়ন করা বিশেষভাবে উপযুক্ত। যাইহোক, যেহেতু পিএন (PN) চাপের প্রতি খুব সংবেদনশীল এবং সমগ্র সেরেবেলার কোষ জনসংখ্যার একটি ছোট অংশ গঠন করে, তাই অনেক ওমিক্স-ভিত্তিক গবেষণার জন্য, সম্পূর্ণ কোষ হিসাবে তাদের নির্বাচনী পৃথকীকরণ এখনও একটি চ্যালেঞ্জিং দিক। যদিও অন্যান্য কোষের প্রকার (বিশেষ করে প্রাপ্তবয়স্ক টিস্যু) থেকে দূষণের সম্পূর্ণ অভাব অর্জন করা প্রায় অসম্ভব, আমরা পরবর্তী প্রোটিওমিক্স বিশ্লেষণের জন্য পর্যাপ্ত সংখ্যক কার্যকর নিউরন পেতে FACS-এর সাথে একটি কার্যকর বিয়োজন ধাপকে একত্রিত করেছি, এবং সম্পূর্ণ সেরিবেলামের বিদ্যমান ডেটা সেটের (51) তুলনায় বেশ উচ্চ প্রোটিন কভারেজ (প্রায় 3000 প্রোটিন) পেয়েছি। সম্পূর্ণ কোষের কার্যকারিতা বজায় রেখে, আমাদের প্রদত্ত পদ্ধতিটি কেবল মাইটোকন্ড্রিয়ার বিপাকীয় পথের পরিবর্তনগুলিই নয়, এর সাইটোপ্লাজমিক প্রতিরূপগুলির পরিবর্তনগুলিও পরীক্ষা করার সুযোগ দেয়, যা জটিল টিস্যুতে মাইটোকন্ড্রিয়ার সংখ্যা নির্ণয়ের জন্য কোষের প্রকার সমৃদ্ধ করতে মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেন ট্যাগের ব্যবহারকে পরিপূরক করে (52, 53)। আমাদের বর্ণিত পদ্ধতিটি কেবল পারকিনজে কোষের অধ্যয়নের সাথেই সম্পর্কিত নয়, বরং মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার অন্যান্য মডেল সহ যেকোনো ধরনের কোষে রোগাক্রান্ত মস্তিষ্কের বিপাকীয় পরিবর্তনগুলি নির্ণয়ের জন্য এটি সহজেই প্রয়োগ করা যেতে পারে।
অবশেষে, আমরা এই বিপাকীয় পুনর্বিন্যাস প্রক্রিয়ার সময় একটি চিকিৎসাগত সুযোগ চিহ্নিত করেছি, যা কোষীয় চাপের মূল লক্ষণগুলোকে সম্পূর্ণরূপে বিপরীত করতে এবং স্নায়ুকোষের অবক্ষয় প্রতিরোধ করতে পারে। অতএব, এখানে বর্ণিত এই পুনর্গঠনের কার্যকরী প্রভাবগুলো বোঝা গেলে তা মাইটোকন্ড্রিয়াল অকার্যকারিতার সময় স্নায়ুকোষের সজীবতা বজায় রাখার সম্ভাব্য চিকিৎসা সম্পর্কে মৌলিক অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করতে পারে। অন্যান্য স্নায়বিক রোগে এই নীতির প্রয়োগযোগ্যতা সম্পূর্ণরূপে উন্মোচন করার জন্য মস্তিষ্কের অন্যান্য কোষের শক্তি বিপাকের পরিবর্তনগুলো বিশ্লেষণ করার লক্ষ্যে ভবিষ্যৎ গবেষণা প্রয়োজন।
MitoPark ইঁদুর সম্পর্কে পূর্বে বর্ণনা করা হয়েছে (31)। loxP ফ্ল্যাঙ্কিং Mfn2 জিন সহ C57BL/6N ইঁদুর সম্পর্কে পূর্বে বর্ণনা করা হয়েছে (18) এবং L7-Cre ইঁদুরের সাথে ক্রস করানো হয়েছে (23)। ফলস্বরূপ ডাবল হেটেরোজাইগাস বংশধরদের তারপর হোমোজাইগাস Mfn2loxP/Mfn2loxP ইঁদুরের সাথে ক্রস করানো হয়েছিল Mfn2 এর জন্য পারকিনজে-নির্দিষ্ট জিন নকআউট তৈরি করতে (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre)। সঙ্গমের একটি উপসেটে, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP অ্যালিল (stop-mtYFP) অতিরিক্ত ক্রসিংয়ের মাধ্যমে প্রবেশ করানো হয়েছিল (20)। সমস্ত প্রাণী পদ্ধতি ইউরোপীয়, জাতীয় এবং প্রাতিষ্ঠানিক নির্দেশিকা অনুসারে সম্পাদিত হয়েছিল এবং জার্মানির নর্থ রাইন-ওয়েস্টফালিয়ার LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল। প্রাণী সংক্রান্ত কাজ ইউরোপীয় ফেডারেশন অফ ল্যাবরেটরি অ্যানিমেল সায়েন্সেস অ্যাসোসিয়েশনস-এর নির্দেশিকাও অনুসরণ করে।
গর্ভবতী মহিলার ঘাড়ের হাড় অবশ করার পর, অবেদন প্রয়োগ করে ইঁদুরের ভ্রূণটি (E13) আলাদা করা হয়। কর্টেক্সটি ১০ mM হেপেস-সহ হ্যাঙ্কস ব্যালান্সড সল্ট সলিউশন (HBSS)-এ বিচ্ছিন্ন করা হয় এবং প্যাপেইন (২০ U/ml) ও সিস্টেইন (১μg/ml) যুক্ত ডুলবেকো'স মডিফায়েড ঈগল'স মিডিয়ামে চালনা করা হয়। টিস্যুটি DMEM-এ ইনকিউবেট করা হয় এবং এনজাইমেটিক পরিপাকের মাধ্যমে বিচ্ছিন্ন করা হয়। ৩৭°C তাপমাত্রায় ২০ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করার পর, এটিকে ১০% ফিটাল বোভাইন সিরাম-সহ DMEM-এ যান্ত্রিকভাবে চূর্ণ করা হয়। কোষগুলিকে পলিলাইসিন-এর প্রলেপযুক্ত কাচের কভারস্লিপের উপর প্রতি ৬ সেমি কালচার ডিশে ২×১০⁶ কোষের ঘনত্বে অথবা ইমেজিং বিশ্লেষণের জন্য প্রতি বর্গ সেমিতে ০.৫×১০⁵ কোষের ঘনত্বে স্থাপন করা হয়। ৪ ঘন্টা পর, মিডিয়ামটি ১% B27 সাপ্লিমেন্ট এবং ০.৫ mM গ্লুটাম্যাক্স যুক্ত নিউরোবেসাল সিরাম-মুক্ত মিডিয়াম দ্বারা প্রতিস্থাপন করা হয়েছিল। এরপর পুরো পরীক্ষা চলাকালীন নিউরনগুলোকে ৩৭°C এবং ৫% CO2-তে রাখা হয়েছিল এবং সপ্তাহে একবার খাবার দেওয়া হয়েছিল। ইন ভিট্রোতে রিকম্বিনেশন প্ররোচিত করার জন্য, ইন ভিট্রোর দ্বিতীয় দিনে নিউরনগুলোকে ট্রিট করতে ৩μl (২৪-ওয়েল কালচার ডিশ) বা ০.৫μl (২৪-ওয়েল প্লেট) নিম্নলিখিত AAV9 ভাইরাস ভেক্টর ব্যবহার করা হয়েছিল: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, ক্যাটালগ নম্বর 105530-AAV9) এবং AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, ক্যাটালগ নম্বর 105545-AAV9)।
মাউস Mfn1 এবং Mfn2 কমপ্লিমেন্টারি ডিএনএ (যথাক্রমে Addgene প্লাজমিড #23212 এবং #23213 থেকে প্রাপ্ত) C-টার্মিনাসে V5 সিকোয়েন্স (GKPIPNPLLGLDST) দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছে, এবং T2A সিকোয়েন্সের মাধ্যমে mCherry-এর সাথে ইন-ফ্রেম ফিউজ করা হয়েছে। Grx1-roGFP2 হলো হাইডেলবার্গ TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum)-এর পক্ষ থেকে একটি উপহার। প্রচলিত ক্লোনিং পদ্ধতি ব্যবহার করে tdTomato ক্যাসেটটি প্রতিস্থাপন করে, ক্যাসেটটিকে pAAV-CAG-FLEX-tdTomato ব্যাকবোনে (Addgene রেফারেন্স নম্বর 28306) সাবক্লোন করা হয়েছিল, যার ফলে pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 এবং pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 ভেক্টরগুলো তৈরি হয়। কন্ট্রোল ভেক্টর pAAV-CAG-FLEX-mCherry তৈরি করার জন্যও একই ধরনের কৌশল ব্যবহার করা হয়েছিল। AAV-shPCx কনস্ট্রাক্টটি তৈরি করার জন্য একটি প্লাজমিড AAV ভেক্টর (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) প্রয়োজন, যেটিতে মাউস PCx-কে টার্গেট করে shRNA এনকোডকারী DNA সিকোয়েন্স (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) থাকে। U6 প্রোমোটারের নিয়ন্ত্রণে mCherry ব্যবহৃত হয় এবং এটি CMV প্রোমোটারের অধীনে থাকে। সহায়ক AAV ভেক্টরগুলোর উৎপাদন প্রস্তুতকারকের (Cell Biolabs) নির্দেশাবলী অনুসারে সম্পন্ন করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, ক্যালসিয়াম ফসফেট পদ্ধতি ব্যবহার করে mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) অথবা Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) কোডিং জিন, সেইসাথে কোডিং AAV1 ক্যাপসিড প্রোটিন এবং অ্যাক্সেসরি প্রোটিন প্যাকেজিং প্লাজমিড বহনকারী ট্রান্সফার প্লাজমিড ব্যবহার করে 293AAV কোষগুলিতে ক্ষণস্থায়ীভাবে ট্রান্সফেকশন করা হয়। ড্রাই আইস/ইথানল বাথে ফ্রিজ-থ সাইকেলের মাধ্যমে অপরিশোধিত ভাইরাস সুপারন্যাট্যান্ট সংগ্রহ করা হয় এবং ফসফেট বাফার্ড স্যালাইন (PBS)-এ কোষগুলিকে লাইস করা হয়। AAV ভেক্টরটি ডিসকন্টিনিউয়াস আয়োডিক্সানল গ্রেডিয়েন্ট আল্ট্রাসেন্ট্রিফিউগেশন (৩২,০০০ rpm গতিতে এবং ৪°C তাপমাত্রায় ২৪ ঘন্টা) দ্বারা বিশুদ্ধ করা হয়েছিল এবং একটি অ্যামিকন আল্ট্রা-১৫ সেন্ট্রিফিউগাল ফিল্টার ব্যবহার করে ঘনীভূত করা হয়েছিল। AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [২.৯×১০¹³ জিনোম কপি (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (৬.১×১০¹² GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-MFN1-V5 (১.৯×১০¹³ GC/ml) এবং AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (৮.৯×১০¹² GC/ml)-এর জিনোম টাইটার রিয়েল-টাইম কোয়ান্টিটেটিভ পিসিআর (qPCR) দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল, যা পূর্বে বর্ণিত (54) পদ্ধতি অনুযায়ী ছিল।
প্রাথমিক নিউরনগুলোকে বরফ-ঠান্ডা 1x PBS-এ চেঁছে তুলে, সেন্ট্রিফিউজ করে জমাট বাঁধানো হয় এবং তারপর ফসফাটেজ ও প্রোটিয়েজ ইনহিবিটর (রোশ) যুক্ত 0.5% ট্রাইটন X-100 / 0.5% সোডিয়াম ডিঅক্সিকোলেট/PBS লাইসিস বাফারে হোমোজিনাইজ করা হয়। বাইসিনকোনিক অ্যাসিড অ্যাসে (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে প্রোটিনের পরিমাণ নির্ণয় করা হয়। এরপর প্রোটিনগুলোকে SDS-পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিসের মাধ্যমে পৃথক করা হয় এবং তারপর একটি পলিভিনাইলিডিন ফ্লোরাইড মেমব্রেনে (জিই হেলথকেয়ার) ব্লট করা হয়। নন-স্পেসিফিক সাইটগুলো ব্লক করুন এবং TBST (ট্রিস-বাফারড স্যালাইন উইথ টুইন)-এ ৫% দুধে প্রাইমারি অ্যান্টিবডির (বিস্তারিত জানতে টেবিল S1 দেখুন) সাথে ইনকিউবেট করুন, এরপর ধৌতকরণ এবং TBST-তে সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউবেট করুন। +4°C তাপমাত্রায় সারারাত প্রাইমারি অ্যান্টিবডির সাথে ইনকিউবেট করুন। ধৌত করার পর, ঘরের তাপমাত্রায় ২ ঘণ্টার জন্য সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি প্রয়োগ করুন। পরবর্তীতে, একই ব্লটকে একটি অ্যান্টি-β-অ্যাকটিন অ্যান্টিবডির সাথে ইনকিউবেট করে একই লোডিং নিশ্চিত করা হয়। কেমিলুমিনেসেন্সে রূপান্তর এবং কেমিলুমিনেসেন্স বর্ধনের মাধ্যমে সনাক্তকরণ (জিই হেলথকেয়ার)।
গ্লাস কভারস্লিপে আগে থেকে স্থাপন করা নিউরনগুলোকে নির্দিষ্ট সময়ে কক্ষ তাপমাত্রায় ১০ মিনিটের জন্য ৪% প্যারাফর্মালডিহাইড (পিএফএ)/পিবিএস দিয়ে ফিক্স করা হয়েছিল। কভারস্লিপগুলোকে প্রথমে কক্ষ তাপমাত্রায় ৫ মিনিটের জন্য ০.১% ট্রাইটন এক্স-১০০/পিবিএস দিয়ে এবং তারপর ব্লকিং বাফারে [৩% বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন (বিএসএ)/পিবিএস] প্রবেশ করানো হয়। দ্বিতীয় দিনে, কভারস্লিপগুলোকে ব্লকিং বাফার দিয়ে ধুয়ে কক্ষ তাপমাত্রায় ২ ঘণ্টার জন্য উপযুক্ত ফ্লুরোফোর-সংযুক্ত সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডির সাথে ইনকিউবেট করা হয়; অবশেষে, নমুনাগুলোকে পিবিএস-এ ভালোভাবে ধুয়ে ৪′,৬-ডায়ামিডিনো-২-ফেনাইলিন্ডোল (ডিপিআই) দিয়ে কাউন্টারস্টেইন করা হয় এবং তারপর অ্যাকোয়া-পলি/মাউন্ট ব্যবহার করে মাইক্রোস্কোপ স্লাইডে ফিক্স করা হয়।
পুরুষ ও স্ত্রী ইঁদুরদের ইন্ট্রাপেরিটোনিয়াল ইনজেকশনের মাধ্যমে কেটামিন (১৩০ মিগ্রা/কেজি) এবং জাইলাজিন (১০ মিগ্রা/কেজি) দিয়ে অবেদন দেওয়া হয় এবং ত্বকের নিচে কারপ্রোফেন অ্যানালজেসিক (৫ মিগ্রা/কেজি) প্রয়োগ করা হয়। এরপর তাদের একটি উষ্ণ প্যাডযুক্ত স্টেরিওট্যাকটিক যন্ত্রে (কফ) রাখা হয়। মাথার খুলি উন্মুক্ত করে একটি ডেন্টাল ড্রিল ব্যবহার করে সেরেবেলার কর্টেক্সের সেই অংশটি পাতলা করা হয় যা মাইস অস্থির (mish bone) সাথে সঙ্গতিপূর্ণ (ল্যাম্বডা থেকে: লেজ ১.৮, পার্শ্বীয় ১, যা লোবিউল IV এবং V-এর সাথে সঙ্গতিপূর্ণ)। নিচের রক্তনালীর ক্ষতি এড়াতে একটি বাঁকানো সিরিঞ্জের সুচ ব্যবহার করে সাবধানে মাথার খুলিতে একটি ছোট ছিদ্র তৈরি করা হয়। এরপর পাতলা টানা কাঁচের কৈশিক নলটি ধীরে ধীরে মাইক্রো-হোলের (ডুরা ম্যাটারের ভেন্ট্রাল দিকে -১.৩ থেকে -১ পর্যন্ত) মধ্যে প্রবেশ করানো হয় এবং ম্যানুয়াল সিরিঞ্জ (নারিশিগে) দিয়ে মাইক্রো-ইনজেক্টরে (নারিশিগে) ১০ থেকে ২০ মিনিটের মধ্যে কম চাপে বেশ কয়েকবার ২০০ থেকে ৩০০ ন্যানোলিটার AAV ইনজেক্ট করা হয়। ইনফিউশনের পর, ভাইরাসটিকে সম্পূর্ণরূপে ছড়িয়ে পড়ার সুযোগ দেওয়ার জন্য কৈশিক নলটি আরও ১০ মিনিটের জন্য রেখে দেওয়া হয়। কৈশিক নলগুলো বের করে নেওয়ার পর, ক্ষতের প্রদাহ কমাতে এবং প্রাণীটিকে সুস্থ হতে দেওয়ার জন্য চামড়াটি সাবধানে সেলাই করে দেওয়া হয়। অপারেশনের পর বেশ কয়েকদিন ধরে প্রাণীগুলোকে ব্যথানাশক (ক্যাসপোফেন) দিয়ে চিকিৎসা করা হয়েছিল, এই সময়ে তাদের শারীরিক অবস্থা সাবধানে পর্যবেক্ষণ করা হয় এবং তারপর নির্দিষ্ট সময়ে তাদের安乐死 (安乐死) করা হয়। সমস্ত কার্যপ্রণালী ইউরোপীয়, জাতীয় এবং প্রাতিষ্ঠানিক নির্দেশিকা অনুসারে পরিচালিত হয়েছিল এবং জার্মানির নর্থ রাইন-ওয়েস্টফালিয়ার ল্যান্ডেসামটফুরন্যাচার অফ উমওয়েল্ট অ্যান্ড ভেরব্রাউচারশুটজ কর্তৃক অনুমোদিত হয়েছিল।
প্রাণীগুলোকে কেটামিন (100 মিলিগ্রাম/কেজি) এবং জাইলাজিন (10 মিলিগ্রাম/কেজি) দিয়ে অবেদন দেওয়া হয়েছিল, এবং হৃৎপিণ্ডকে প্রথমে 0.1 M PBS দিয়ে এবং তারপর PBS-এ 4% PFA দিয়ে পারফিউজ করা হয়েছিল। টিস্যুটি বিচ্ছিন্ন করে 4°C তাপমাত্রায় সারারাত 4% PFA/PBS-এ স্থির করা হয়েছিল। PBS-এ স্থির করা মস্তিষ্ক থেকে স্যাজিটাল সেকশন (50 μm পুরু) প্রস্তুত করার জন্য একটি ভাইব্রেটিং নাইফ (Leica Microsystems GmbH, ভিয়েনা, অস্ট্রিয়া) ব্যবহার করা হয়েছিল। অন্যথায় নির্দিষ্ট না করা থাকলে, ফ্রি-ফ্লোটিং সেকশনের স্টেইনিং উপরে বর্ণিত (13) পদ্ধতি অনুসারে ঘরের তাপমাত্রায় এবং নাড়াচাড়া করে করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, প্রথমে, প্রাপ্ত স্লাইসগুলিকে ঘরের তাপমাত্রায় 15 মিনিটের জন্য 0.5% Triton X-100/PBS দিয়ে পারমিয়েবিলাইজ করা হয়েছিল; কিছু এপিটোপের (Pcx এবং Shmt2) জন্য, এই ধাপের পরিবর্তে 80°C (PH 9) তাপমাত্রায় ট্রিস-ইডিটিএ বাফারে স্লাইসগুলিকে 25 মিনিটের জন্য গরম করা হয়েছিল। এরপর, সেকশনগুলোকে ব্লকিং বাফারে (৩% BSA/PBS) প্রাইমারি অ্যান্টিবডি (টেবিল S1 দেখুন) সহ ৪°C তাপমাত্রায় সারারাত ধরে নাড়াচাড়া করে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। পরের দিন, সেকশনগুলোকে ব্লকিং বাফার দিয়ে ধুয়ে উপযুক্ত ফ্লুরোফোর-সংযুক্ত সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি সহ ঘরের তাপমাত্রায় ২ ঘন্টা ইনকিউবেট করা হয়েছিল; অবশেষে, সেকশনগুলোকে PBS দিয়ে ভালোভাবে ধুয়ে, DAPI দিয়ে কাউন্টার-স্টেইন করা হয়েছিল এবং তারপর একটি মাইক্রোস্কোপ স্লাইডে অ্যাকোয়াপলিমাউন্ট দিয়ে ফিক্স করা হয়েছিল।
নমুনাটির ছবি তোলার জন্য একটি সাদা আলোর লেজার এবং একটি ৪০৫ ডায়োড অতিবেগুনি লেজারযুক্ত একটি লেজার স্ক্যানিং কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ (টিসিএস এসপি৮-এক্স বা টিসিএস ডিজিটাল লাইট শীট, লাইকা মাইক্রোসিস্টেমস) ব্যবহার করা হয়েছিল। ফ্লুরোফোরকে উত্তেজিত করে এবং হাইব্রিড ডিটেক্টর (হাইডি) দিয়ে সংকেত সংগ্রহ করে, সিকোয়েনশিয়াল মোডে নাইকুইস্ট স্যাম্পলিং অনুসারে স্ট্যাক করা ছবি সংগ্রহ করার জন্য LAS-X সফটওয়্যার ব্যবহার করা হয়েছিল: অ-পরিমাণগত প্যানেলের জন্য, এটি অত্যন্ত গতিশীল সংকেত (উদাহরণস্বরূপ, সোমাটিক কোষ এবং ডেনড্রাইটে) mtYFP) ব্রাইটআর মোডে পিএন-এর সংখ্যা সনাক্ত করতে HyD ব্যবহার করে। ব্যাকগ্রাউন্ড কমাতে ০.৩ থেকে ৬ ন্যানোসেকেন্ড পর্যন্ত গেটিং প্রয়োগ করা হয়।
বাছাই করা কোষের রিয়েল-টাইম ইমেজিং। ১% B27 সাপ্লিমেন্ট এবং ০.৫ mM গ্লুটাম্যাক্স যুক্ত নিউরোবেসাল-এ মিডিয়ামে বাছাই করার পর, কোষগুলোকে অবিলম্বে পলি-এল-লাইসিন-লেপযুক্ত গ্লাস স্লাইডে (μ-Slide8 Well, Ibidi, ক্যাটালগ নম্বর ৮০৮২৬) স্থাপন করা হয় এবং তারপর কোষগুলোকে থিতিয়ে পড়ার সুযোগ দেওয়ার জন্য এটিকে ১ ঘন্টার জন্য ৩৭°C এবং ৫% CO2 তাপমাত্রায় রাখা হয়। একটি সাদা লেজার, HyD, ৬৩× [১.৪ নিউমেরিক্যাল অ্যাপারচার (NA)] অয়েল অবজেক্টিভ লেন্স এবং একটি হিটিং স্টেজ দ্বারা সজ্জিত একটি লাইকা SP8 লেজার স্ক্যানিং কনফোকাল মাইক্রোস্কোপে রিয়েল-টাইম ইমেজিং করা হয়েছিল।
ইঁদুরটিকে দ্রুত কার্বন ডাই অক্সাইড দিয়ে অচেতন করে শিরশ্ছেদ করা হয়, খুলি থেকে মস্তিষ্কটি দ্রুত বের করে আনা হয় এবং 200μm পুরু (13C লেবেলিং পরীক্ষার জন্য) বা 275μm পুরু (টু-ফোটন পরীক্ষার জন্য) স্যাজিটাল সেকশনে কাটা হয়, যা নিম্নলিখিত পদার্থ দিয়ে পূর্ণ থাকে: আইসক্রিম (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) নিম্নলিখিত পদার্থ দিয়ে পূর্ণ থাকে: 125 mM বরফ-ঠান্ডা, কার্বন-সম্পৃক্ত (95% O2 এবং 5% CO2) কম Ca2+ কৃত্রিম সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM সোডিয়াম ফসফেট বাফার, 25 mM NaHCO3, 25 mM গ্লুকোজ, 0.5 mM CaCl2 এবং 3.5 mM MgCl2 (অসমোটিক চাপ 310 থেকে 330 mmol)। প্রাপ্ত মস্তিষ্কের স্লাইসগুলিকে একটি প্রি-ইনকিউবেশন চেম্বারে স্থানান্তর করুন, যেখানে উচ্চ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM সোডিয়াম ফসফেট বাফার, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-গ্লুকোজ, 1.0 mM CaCl2 এবং 2.0 mM MgCl2 মিডিয়াম) pH 7.4 এবং 310 থেকে 320 mmol) রয়েছে।
ইমেজিং প্রক্রিয়া চলাকালীন, স্লাইসগুলোকে একটি নির্দিষ্ট ইমেজিং কক্ষে নিয়ে যাওয়া হয়েছিল এবং ৩২° থেকে ৩৩° সেলসিয়াস স্থির তাপমাত্রায় অবিচ্ছিন্ন ACSF পারফিউশনের অধীনে পরীক্ষাটি সম্পন্ন করা হয়েছিল। স্লাইস ইমেজিংয়ের জন্য একটি লাইকা ২৫x অবজেক্টিভ লেন্স (NA ০.৯৫, ওয়াটার), Ti: স্যাফায়ার লেজার (ক্যামেলিয়ন ভিশন II, কোহেরেন্ট) এবং FLIM মডিউল (পিকোহার্প৩০০, পিকোকোয়ান্ট) সহ সজ্জিত একটি মাল্টিফোটন লেজার স্ক্যানিং মাইক্রোস্কোপ (টিসিএস এসপি৮ এমপি-ওপিও, লাইকা মাইক্রোসিস্টেমস) ব্যবহার করা হয়েছিল।
Grx1-roGFP2-এর FLIM। স্যাজিটাল ব্রেইন স্লাইসে টু-ফোটন FLIM ব্যবহার করে PN-এর সাইটোপ্লাজমিক রিডক্স অবস্থার পরিবর্তন পরিমাপ করা হয়েছিল, যেখানে Grx1-roGFP2 বায়োসেন্সরটি PN-কে টার্গেট করে। PN স্তরে, স্লাইসের পৃষ্ঠ থেকে প্রায় ৫০ থেকে ৮০ μm নিচে অ্যাকুইজিশন ফিল্ড নির্বাচন করা হয়, যাতে একটি কার্যকর PN (অর্থাৎ, ডেনড্রাইট বরাবর পুঁতির মতো গঠন বা নিউরোনাল আকারগত পরিবর্তনের অভাব) এবং ডাবল পজিটিভ roGFP2 সেন্সর ও shRNA PCx বা এর কন্ট্রোল সিকোয়েন্স এনকোডিংকারী AAV (প্রত্যেকটি mCherry সহ-প্রকাশ করে) নিশ্চিত করা যায়। কার্ভ ফিটিং-এর জন্য পর্যাপ্ত ফোটন (মোট ১০০০ ফোটন) সংগ্রহ করা হয়েছে তা নিশ্চিত করতে ২x ডিজিটাল জুম [এক্সাইটেশন তরঙ্গদৈর্ঘ্য: ৮৯০ nm; ৫১২ nm × ৫১২ পিক্সেল] সহ সিঙ্গেল-স্ট্যাক ছবি সংগ্রহ করা হয় এবং ২ থেকে ৩ মিনিটের মধ্যে ছবির অ্যাভারেজিং করা হয়। ডিটেকশন: ইন্টারনাল HyD, ফ্লুরেসিন আইসোথায়োসায়ানেট (FITC) ফিল্টার গ্রুপ। Grx1-roGFP2 প্রোবের সংবেদনশীলতা এবং FLIM শর্তাবলীর যাচাইকরণ করা হয়েছিল পারফিউশন ACSF-এ বাহ্যিক 10 mM H2O2 যোগ করে (জারণকে সর্বোচ্চ করার জন্য, যার ফলে আয়ুষ্কাল বৃদ্ধি পায়) এবং তারপর 2 mM ডাইথিওথ্রিটল যোগ করে (বিজারণের মাত্রা কমিয়ে আনার জন্য, যার ফলে আয়ুষ্কাল হ্রাস পায়) roGFP2-এর আয়ুষ্কালের মান পর্যবেক্ষণের মাধ্যমে (চিত্র S8, D থেকে G)। প্রাপ্ত ফলাফল বিশ্লেষণ করার জন্য FLIMfit 5.1.1 সফটওয়্যার ব্যবহার করা হয়, সম্পূর্ণ চিত্রের একক এক্সপোনেনশিয়াল ক্ষয় বক্ররেখাকে পরিমাপকৃত IRF (ইনস্ট্রুমেন্ট রেসপন্স ফাংশন)-এর সাথে ফিট করা হয়, এবং χ2-এর মান প্রায় 1 পাওয়া যায়। একটি একক PN-এর আয়ুষ্কাল গণনা করার জন্য, স্নায়ুদেহের চারপাশে মাস্কটি হাতে আঁকা হয়েছিল, এবং পরিমাণ নির্ধারণের জন্য প্রতিটি মাস্কের গড় আয়ুষ্কাল ব্যবহার করা হয়েছিল।
মাইটোকন্ড্রিয়াল পটেনশিয়াল বিশ্লেষণ। পারফিউজড ACSF-এ সরাসরি যোগ করা ১০০ nM TMRM দিয়ে একিউট সেকশনটিকে ৩০ মিনিট ইনকিউবেট করার পর, একটি টু-ফোটন মাইক্রোস্কোপের সাহায্যে PN-গুলোর মাইটোকন্ড্রিয়াল পটেনশিয়ালের পরিবর্তন পরিমাপ করা হয়েছিল। TMRM ইমেজিং করা হয়েছিল ৯২০ nm-এ প্রোবটিকে এক্সাইট করে এবং সিগন্যাল সংগ্রহের জন্য ইন্টারনাল HyD (টেট্রামিথাইলরোডামিন আইসোথায়োসায়ানেট: ৫৮৫/৪০ nm) ব্যবহার করে; একই এক্সাইটেশন ওয়েভলেংথ ব্যবহার করে কিন্তু mtYFP-এর ইমেজিংয়ের জন্য একটি ভিন্ন ইন্টারনাল HyD (FITC: ৫২৫/৫০) ব্যবহার করা হয়েছিল। একক কোষ পর্যায়ে মাইটোকন্ড্রিয়াল পটেনশিয়াল মূল্যায়ন করার জন্য ImageJ-এর ইমেজ ক্যালকুলেটর প্লাগ-ইন ব্যবহার করুন। সংক্ষেপে, প্লাগ-ইন সমীকরণ: signal = min (mtYFP, TMRM) সংশ্লিষ্ট চ্যানেলের সিঙ্গেল-স্ট্যাক কনফোকাল ইমেজে TMRM সিগন্যাল প্রদর্শনকারী মাইটোকন্ড্রিয়াল অঞ্চলটি শনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়। এরপর প্রাপ্ত মাস্কের পিক্সেল এলাকা পরিমাপ করা হয় এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল পটেনশিয়াল প্রদর্শনকারী মাইটোকন্ড্রিয়াল ভগ্নাংশটি পাওয়ার জন্য mtYFP চ্যানেলের সংশ্লিষ্ট থ্রেশহোল্ড সিঙ্গেল-স্ট্যাক ইমেজের সাপেক্ষে সেটিকে স্বাভাবিকীকরণ করা হয়।
Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) সফটওয়্যার দিয়ে ছবিটি ডিকনভল্যুটেড করা হয়েছিল। টাইলসের স্ক্যান করা ছবিগুলোর ক্ষেত্রে, LAS-X সফটওয়্যারের অটোমেটিক স্টিচিং অ্যালগরিদম ব্যবহার করে একটিমাত্র টাইলের মন্টেজ তৈরি করা হয়। ইমেজ ক্যালিব্রেশনের পর, ছবিটিকে আরও প্রসেস করতে এবং এর ব্রাইটনেস ও কনট্রাস্ট একরূপভাবে অ্যাডজাস্ট করতে ImageJ এবং Adobe Photoshop ব্যবহার করুন। গ্রাফিক প্রস্তুতির জন্য Adobe Illustrator ব্যবহার করুন।
mtDNA ফোকাস বিশ্লেষণ। কনফোকাল মাইক্রোস্কোপের সাহায্যে ডিএনএ-এর বিরুদ্ধে অ্যান্টিবডি দ্বারা লেবেল করা সেরিবেলার সেকশনগুলিতে mtDNA ক্ষতের সংখ্যা পরিমাপ করা হয়েছিল। প্রতিটি কোষের কোষদেহ এবং নিউক্লিয়াসের জন্য আলাদা আলাদা টার্গেট এলাকা তৈরি করা হয়েছিল এবং মাল্টি মেজার প্লাগ-ইন (ইমেজজে সফটওয়্যার) ব্যবহার করে সংশ্লিষ্ট এলাকা গণনা করা হয়েছিল। সাইটোপ্লাজমিক এলাকা পাওয়ার জন্য কোষদেহের এলাকা থেকে নিউক্লিয়াসের এলাকা বিয়োগ করা হয়েছিল। সবশেষে, থ্রেশহোল্ড ইমেজে mtDNA নির্দেশকারী সাইটোপ্লাজমিক ডিএনএ পয়েন্টগুলো স্বয়ংক্রিয়ভাবে পরিমাপ করার জন্য অ্যানালাইজ পার্টিকলস প্লাগ-ইন (ইমেজজে সফটওয়্যার) ব্যবহার করা হয়েছিল এবং প্রাপ্ত ফলাফলগুলোকে কন্ট্রোল ইঁদুরের পিএন গড়ের সাথে স্বাভাবিকীকরণ করা হয়েছিল। ফলাফলগুলো প্রতি কোষে নিউক্লিওসাইডের গড় সংখ্যা হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছে।
প্রোটিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ। একক কোষ পর্যায়ে PN-এ প্রোটিন এক্সপ্রেশন মূল্যায়ন করতে ImageJ-এর ইমেজ ক্যালকুলেটর প্লাগ-ইন ব্যবহার করুন। সংক্ষেপে, সংশ্লিষ্ট চ্যানেলের একক-স্তর কনফোকাল ইমেজে, signal = min (mtYFP, antibody) সমীকরণের মাধ্যমে, Purkina-তে একটি নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডির প্রতি ইমিউনোরিঅ্যাক্টিভিটি প্রদর্শনকারী মাইটোকন্ড্রিয়াল অঞ্চলটি শনাক্ত করা হয়। তারপর প্রাপ্ত মাস্কের পিক্সেল এলাকা পরিমাপ করা হয় এবং প্রদর্শিত প্রোটিনের মাইটোকন্ড্রিয়াল ভগ্নাংশ পাওয়ার জন্য mtYFP চ্যানেলের সংশ্লিষ্ট থ্রেশহোল্ড একক-স্ট্যাক ইমেজের উপর নর্মালাইজ করা হয়।
পারকিনজে কোষের ঘনত্ব বিশ্লেষণ। গণনা করা পারকিনজে কোষের সংখ্যাকে গণনাকৃত কোষগুলো দ্বারা অধিকৃত সেরিবেলার রিং-এর দৈর্ঘ্য দিয়ে ভাগ করে পারকিনজে ঘনত্ব নির্ণয় করার জন্য ImageJ-এর Cell Counter প্লাগ-ইনটি ব্যবহার করা হয়েছিল।
নমুনা প্রস্তুতি ও সংগ্রহ। কন্ট্রোল গ্রুপ এবং Mfn2cKO ইঁদুরের মস্তিষ্ক 0.1 M ফসফেট বাফার (PB)-এ 2% PFA/2.5% গ্লুটারালডিহাইড দিয়ে ফিক্স করা হয়েছিল, এবং তারপর সিলিয়েটস (Leica Mikrosysteme GmbH, ভিয়েনা, অস্ট্রিয়া) ব্যবহার করে করোনাল সেকশন (পুরুত্ব 50 থেকে 60 μm) প্রস্তুত করা হয়েছিল। এরপর সেগুলোকে PB বাফারে 1% অস টেট্রাঅক্সাইড এবং 1.5% পটাশিয়াম ফেরোসায়ানাইড দিয়ে ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য ফিক্স করা হয়েছিল। সেকশনগুলোকে পাতিত জল দিয়ে তিনবার ধোয়া হয়েছিল, এবং তারপর 1% ইউরেনাইল অ্যাসিটেটযুক্ত 70% ইথানল দিয়ে 20 মিনিটের জন্য স্টেইন করা হয়েছিল। এরপর সেকশনগুলোকে গ্রেডেড অ্যালকোহলে ডিহাইড্রেট করা হয়েছিল এবং সিলিকন-কোটেড গ্লাস স্লাইডের মধ্যে ডার্কুপান ACM (অ্যারালডাইট কাস্টিং রেজিন M) ইপোক্সি রেজিন (ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপি সায়েন্সেস, ক্যাটালগ নম্বর 14040) দিয়ে এমবেড করা হয়েছিল, এবং সবশেষে 60°C তাপমাত্রায় ওভেনে 48 ঘন্টার জন্য পলিমারাইজ করা হয়েছিল। সেরেবেলার কর্টেক্স এলাকাটি নির্বাচন করা হয়েছিল এবং লাইকা আল্ট্রাকাট (লাইকা মাইক্রোসিস্টেম জিএমবিএইচ, ভিয়েনা, অস্ট্রিয়া) ব্যবহার করে ৫০ ন্যানোমিটার অতি-পাতলা সেকশন কাটা হয়েছিল এবং পলিস্টাইরিন ফিল্ম দিয়ে আবৃত একটি ২×১ মিমি তামার স্লিট গ্রিডে রাখা হয়েছিল। সেকশনগুলিকে ১০ মিনিটের জন্য জলে ৪% ইউরেনাইল অ্যাসিটেটের দ্রবণে রঞ্জিত করা হয়েছিল, কয়েকবার জল দিয়ে ধোয়া হয়েছিল, তারপর ১০ মিনিটের জন্য জলে রেনল্ডস লেড সাইট্রেট দিয়ে রঞ্জিত করা হয়েছিল এবং তারপরে কয়েকবার জল দিয়ে ধোয়া হয়েছিল। একটি টিভিপস (টিয়েটজ ভিডিও অ্যান্ড ইমেজ প্রসেসিং সিস্টেম) টেমক্যাম-এফ৪১৬ ডিজিটাল ক্যামেরা (টিভিপস জিএমবিএইচ, গাউটিং, ইউএসএ, জার্মানি) ব্যবহার করে একটি ট্রান্সমিশন ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপ ফিলিপস সিএম১০০ (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ওয়ালথাম, এমএ, ইউএসএ) দিয়ে মাইক্রোগ্রাফগুলি তোলা হয়েছিল।
AAV দ্বারা সংক্রমিত ইঁদুরের মস্তিষ্ককে আলাদা করে ১ মিমি পুরু স্যাজিটাল সেকশনে কাটা হয় এবং AAV-সংক্রমিত রিং (অর্থাৎ, mCherry প্রকাশকারী) শনাক্ত করার জন্য ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে সেরিবেলাম পরীক্ষা করা হয়। শুধুমাত্র সেই পরীক্ষাগুলোই ব্যবহার করা হয়েছে যেখানে AAV ইনজেকশনের ফলে অন্তত দুটি পরপর সেরিবেলার রিং-এর পারকিনজি কোষ স্তরে (অর্থাৎ প্রায় পুরো স্তর জুড়ে) খুব উচ্চ ট্রান্সডাকশন দক্ষতা দেখা গেছে। AAV-ট্রান্সডিউসড লুপটিকে সারারাত ধরে পোস্ট-ফিক্সেশনের (০.১ M কোকোয়েট বাফারে ৪% PFA এবং ২.৫% গ্লুটারালডিহাইড) জন্য মাইক্রোডিসেট করা হয় এবং এরপর আরও প্রক্রিয়াজাত করা হয়। EPON এমবেডিং-এর জন্য, ফিক্সড টিস্যুটি ০.১ M সোডিয়াম কোকোয়েট বাফার (অ্যাপ্লিকেম) দিয়ে ধোয়া হয় এবং ০.১ M সোডিয়াম কোকোয়েট বাফারে (অ্যাপ্লিকেম) ২% OsO4 (os, সায়েন্স সার্ভিসেস; Caco) দিয়ে ৪ ঘন্টা ইনকিউবেট করা হয়, তারপর ২ ঘন্টা ধরে ধোয়া হয়। ০.১ M কোকামাইড বাফার দিয়ে এই প্রক্রিয়াটি ৩ বার পুনরাবৃত্তি করা হয়। পরবর্তীতে, টিস্যুটিকে ডিহাইড্রেট করার জন্য ক্রমবর্ধমান ইথানল দ্রবণ ব্যবহার করে প্রতিটি ইথানল দ্রবণকে ৪°C তাপমাত্রায় ১৫ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়। টিস্যুটিকে প্রোপিলিন অক্সাইডে স্থানান্তর করে ৪°C তাপমাত্রায় EPON (সিগমা-অলড্রিচ)-এ সারারাত ইনকিউবেট করা হয়। টিস্যুটিকে ঘরের তাপমাত্রায় ২ ঘণ্টার জন্য নতুন EPON-এ রাখা হয় এবং তারপর এটিকে ৬২°C তাপমাত্রায় ৭২ ঘণ্টার জন্য এমবেড করা হয়। একটি আল্ট্রামাইক্রোটোম (লাইকা মাইক্রোসিস্টেমস, UC6) এবং একটি ডায়মন্ড নাইফ (ডায়াটোম, বিয়েল, সুইজারল্যান্ড) ব্যবহার করে ৭০ ন্যানোমিটারের অতি-পাতলা সেকশন কাটা হয় এবং ৩৭°C তাপমাত্রায় ১৫ মিনিটের জন্য ১.৫% ইউরেনাইল অ্যাসিটেট দিয়ে স্টেইন করা হয়, এবং এরপর ৪ মিনিটের জন্য লেড সাইট্রেট দ্রবণ দিয়ে স্টেইন করা হয়। ইলেকট্রন মাইক্রোগ্রাফগুলো ক্যামেরা ওয়ানভিউ ৪কে ১৬-বিট (গ্যাটান) এবং ডিজিটালমাইক্রোগ্রাফ সফটওয়্যার (গ্যাটান) দ্বারা সজ্জিত একটি JEM-2100 প্লাস ট্রান্সমিশন ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপ (JEOL) ব্যবহার করে তোলা হয়। বিশ্লেষণের জন্য, ৫০০০× বা ১০,০০০× ডিজিটাল জুম ব্যবহার করে ইলেকট্রন মাইক্রোগ্রাফ সংগ্রহ করা হয়েছিল।
মাইটোকন্ড্রিয়ার আকারতাত্ত্বিক বিশ্লেষণ। সমস্ত বিশ্লেষণের জন্য, ImageJ সফটওয়্যার ব্যবহার করে ডিজিটাল ছবিতে প্রতিটি মাইটোকন্ড্রিয়ার রূপরেখা হাতে এঁকে নেওয়া হয়েছিল। বিভিন্ন আকারতাত্ত্বিক পরামিতি বিশ্লেষণ করা হয়। মাইটোকন্ড্রিয়ার ঘনত্বকে শতাংশ হিসাবে প্রকাশ করা হয়, যা প্রতিটি কোষের মোট মাইটোকন্ড্রিয়াল ক্ষেত্রফলকে সাইটোপ্লাজমের ক্ষেত্রফল (সাইটোপ্লাজমের ক্ষেত্রফল = কোষের ক্ষেত্রফল - কোষের নিউক্লিয়াসের ক্ষেত্রফল) × ১০০ দ্বারা ভাগ করে পাওয়া যায়। মাইটোকন্ড্রিয়ার গোলাকৃতি [4π∙(ক্ষেত্রফল/পরিধি²)] সূত্র দিয়ে গণনা করা হয়। মাইটোকন্ড্রিয়ার আকারতত্ত্ব বিশ্লেষণ করে তাদের প্রধান আকৃতি অনুসারে দুটি শ্রেণীতে (“নলাকার” এবং “ফোস্কা”) ভাগ করা হয়েছিল।
অটোফ্যাগোসোম/লাইসোসোমের সংখ্যা এবং ঘনত্ব বিশ্লেষণ। ডিজিটাল ছবিতে প্রতিটি অটোফ্যাগোসোম/লাইসোসোমের রূপরেখা হাতে এঁকে নিতে ImageJ সফটওয়্যার ব্যবহার করুন। অটোফ্যাগোসোম/লাইসোসোমের ক্ষেত্রফলকে শতাংশ হিসাবে প্রকাশ করা হয়, যা প্রতিটি কোষের মোট অটোফ্যাগোসোম/লাইসোসোম কাঠামোর ক্ষেত্রফলকে সাইটোপ্লাজমের ক্ষেত্রফল (সাইটোপ্লাজমের ক্ষেত্রফল = কোষের ক্ষেত্রফল - নিউক্লিয়াসের ক্ষেত্রফল) দ্বারা ভাগ করে ১০০ দিয়ে গুণ করে গণনা করা হয়। অটোফ্যাগোসোম/লাইসোসোমের ঘনত্ব গণনা করা হয় মোট সংখ্যাকে প্রতি কোষে অটোফ্যাগোসোম/লাইসোসোম কাঠামোর সংখ্যা (সাইটোপ্লাজমের ক্ষেত্রফলের ভিত্তিতে) (সাইটোপ্লাজমের ক্ষেত্রফল = কোষের ক্ষেত্রফল - নিউক্লিয়াসের ক্ষেত্রফল) দ্বারা ভাগ করে।
অ্যাকিউট সেকশনিং এবং নমুনা প্রস্তুতির জন্য লেবেলিং। যে পরীক্ষাগুলিতে গ্লুকোজ লেবেলিং প্রয়োজন, সেগুলির জন্য অ্যাকিউট ব্রেইন স্লাইসগুলিকে একটি প্রি-ইনকিউবেশন চেম্বারে স্থানান্তর করুন, যেটিতে স্যাচুরেটেড কার্বন (৯৫% O2 এবং ৫% CO2), উচ্চ Ca2 + ACSF (১২৫.০ mM NaCl, ২.৫ mM KCl, ১.২৫ mM সোডিয়াম ফসফেট বাফার, ২৫.০ mM NaHCO3, ২৫.০ mM d-গ্লুকোজ, ১.০ mM CaCl2 এবং ২.০ mM MgCl2, যা pH ৭.৪ এবং ৩১০ থেকে ৩২০ mOsm-এ সামঞ্জস্য করা) থাকে, যেখানে গ্লুকোজ হলো 13 C 6- গ্লুকোজ সাবস্টিটিউশন (ইউরিসোটোপ, ক্যাটালগ নম্বর CLM-1396)। যেসব পরীক্ষায় পাইরুভেট লেবেলিং প্রয়োজন, সেগুলোর জন্য অ্যাক্যুট ব্রেইন স্লাইসগুলোকে উচ্চ Ca2 + যুক্ত ACSF (১২৫.০ mM NaCl, ২.৫ mM KCl, ১.২৫ mM সোডিয়াম ফসফেট বাফার, ২৫.০ mM NaHCO3, ২৫.০ mM d-গ্লুকোজ, ১.০ mM CaCl2 এবং ২.০ mM MgCl2 যোগ করে pH ৭.৪ এবং ৩১০ থেকে ৩২০ mOsm-এ সামঞ্জস্য করুন)-এ স্থানান্তর করুন এবং ১ mM 1-[1-13C]পাইরুভেট (ইউরিসোটোপ, ক্যাটালগ নম্বর CLM-1082) যোগ করুন। সেকশনগুলোকে ৩৭°C তাপমাত্রায় ৯০ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করুন। পরীক্ষার শেষে, সেকশনগুলোকে ৭৫ mM অ্যামোনিয়াম কার্বনেটযুক্ত একটি জলীয় দ্রবণ (pH ৭.৪) দিয়ে দ্রুত ধুয়ে ফেলা হয় এবং তারপর ৪০:৪০:২০ (v:v:v) অ্যাসিটোনাইট্রাইল (ACN): মিথানল: জলে হোমোজেনাইজ করা হয়। সেকশনগুলিকে ৩০ মিনিট ধরে বরফের উপর ইনকিউবেট করার পর, নমুনাগুলিকে ৪°C তাপমাত্রায় ১০ মিনিটের জন্য ২১,০০০ g-তে সেন্ট্রিফিউজ করা হয় এবং স্বচ্ছ সুপারন্যাট্যান্টকে একটি স্পিডভ্যাক কনসেনট্রেটরে শুকানো হয়। ফলস্বরূপ প্রাপ্ত শুকনো মেটাবোলাইট পেলিটটি বিশ্লেষণের আগ পর্যন্ত -৮০°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়।
13C-লেবেলযুক্ত অ্যামিনো অ্যাসিডের লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি-মাস স্পেকট্রোমেট্রি বিশ্লেষণ। লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি-মাস স্পেকট্রোমেট্রি (LC-MS) বিশ্লেষণের জন্য, মেটাবোলাইট পেলিটকে ৭৫μl LC-MS গ্রেড জলে (হানিওয়েল) পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল। ৪°C তাপমাত্রায় ৫ মিনিটের জন্য ২১,০০০ g-তে সেন্ট্রিফিউগেশনের পর, ২০ μl পরিশোধিত সুপারন্যাট্যান্ট অ্যামিনো অ্যাসিড ফ্লাক্স বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং বাকি নির্যাসটি অবিলম্বে অ্যানায়ন বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল (নীচে দেখুন)। পূর্বে বর্ণিত বেনজয়ল ক্লোরাইড ডেরিভেটাইজেশন প্রোটোকল (৫৫, ৫৬) ব্যবহার করে অ্যামিনো অ্যাসিড বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। প্রথম ধাপে, ২০μl মেটাবোলাইট নির্যাসে ১০μl ১০০ mM সোডিয়াম কার্বনেট (সিগমা-অলড্রিচ) যোগ করা হয়েছিল, এবং তারপর LC গ্রেড ACN-এ ১০μl ২% বেনজয়ল ক্লোরাইড (সিগমা-অলড্রিচ) যোগ করা হয়েছিল। নমুনাটিকে অল্প সময়ের জন্য ভর্টেক্স করা হয়েছিল এবং তারপর ২০°C তাপমাত্রায় ২১,০০০ g-তে ৫ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। পরিষ্কার সুপারন্যাট্যান্টকে একটি শঙ্কু আকৃতির কাঁচের ইনসার্টসহ (২০০ μl আয়তন) একটি ২ মিলি অটোস্যাম্পলার ভায়ালে স্থানান্তর করুন। নমুনাগুলো থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিকের Q-Exactive (QE)-HF (আল্ট্রা হাই ফিল্ড অরবিটরাপ) উচ্চ-রেজোলিউশন প্রিসিশন মাস স্পেকট্রোমিটারের সাথে সংযুক্ত অ্যাকুইটি আইক্লাস আল্ট্রা-হাই পারফরম্যান্স এলসি সিস্টেম (ওয়াটার্স) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। বিশ্লেষণের জন্য, ডেরিভেটাইজড নমুনার ২μl পরিমাণ ১.৮μm কণাযুক্ত একটি ১০০×১.০ মিমি উচ্চ-শক্তিসম্পন্ন সিলিকা T3 কলামে (ওয়াটার্স) ইনজেক্ট করা হয়েছিল। প্রবাহের হার ছিল ১০০μl/মিনিট, এবং বাফার সিস্টেমটি বাফার A (জলে ১০ mM অ্যামোনিয়াম ফরমেট এবং ০.১৫% ফরমিক অ্যাসিড) এবং বাফার B (ACN) দ্বারা গঠিত ছিল। গ্রেডিয়েন্টটি নিম্নরূপ: ০ মিনিটে ০%B; ০ থেকে ০.১ মিনিটে ০%B, ০ থেকে ১৫%B; ০.১ থেকে ০.৫ মিনিটে ১৫ থেকে ১৭%B; ০.৫ থেকে ১৪ মিনিটে ১৭ থেকে ৫৫%B; ১৪ থেকে ১৪.৫ মিনিটে ৫৫ থেকে ৭০%B; ১৮ মিনিটে ১৪.৫ থেকে ৭০ থেকে ১০০%B; ১৮ থেকে ১৯ মিনিটে ১০০%B; ১৯ থেকে ১৯.১ মিনিটে ১০০ থেকে ০%B; ১৯.১ থেকে ২৮ মিনিটে ০%B (৫৫, ৫৬)। QE-HF ভর স্পেকট্রোমিটারটি পজিটিভ আয়োনাইজেশন মোডে কাজ করে, যার ভর পরিসীমা m/z (ভর/চার্জ অনুপাত) ৫০ থেকে ৭৫০। এর প্রয়োগকৃত রেজোলিউশন ৬০,০০০, গেইন কন্ট্রোল (AGC) পদ্ধতিতে প্রাপ্ত আয়ন টার্গেট ৩×১০⁶ এবং সর্বোচ্চ আয়ন সময় ১০০ মিলিসেকেন্ড। হিটেড ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়োনাইজেশন (ESI) সোর্সটি ৩.৫ kV স্প্রে ভোল্টেজ, ২৫০°C ক্যাপিলারি তাপমাত্রা, ৬০ AU (স্বেচ্ছাধীন একক) শিথ এয়ারফ্লো এবং ২০ AU অক্সিলিয়ারি এয়ারফ্লোতে কাজ করে। S লেন্সটি ৬০ AU-তে সেট করা থাকে।
13C লেবেলযুক্ত জৈব অ্যাসিডের অ্যানায়ন ক্রোমাটোগ্রাফি-এমএস বিশ্লেষণ। অবশিষ্ট মেটাবোলাইট অধঃক্ষেপ (৫৫μl) একটি ডায়োনেক্স আয়ন ক্রোমাটোগ্রাফি সিস্টেম (ICS 5000+, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল, যা একটি QE-HF ভর স্পেকট্রোমিটারের (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) সাথে সংযুক্ত ছিল। সংক্ষেপে, ৫μl মেটাবোলাইট নির্যাস একটি ডায়োনেক্স আয়নপ্যাক AS11-HC কলামে (২ মিমি×২৫০ মিমি, কণার আকার ৪μm, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) পুশ-ইন পার্শিয়াল লুপ মোডে ১ ফিলিং রেশিওতে ইনজেক্ট করা হয়েছিল। ডায়োনেক্স আয়নপ্যাক AG11-HC গার্ড কলাম (২ মিমি x ৫০ মিমি, ৪μm, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক)। কলামের তাপমাত্রা ৩০°C-তে বজায় রাখা হয় এবং অটোস্যাম্পলারটি ৬°C-তে সেট করা হয়। এলুয়েন্ট জেনারেটরের মাধ্যমে একটি পটাশিয়াম হাইড্রোক্সাইড গ্রেডিয়েন্ট তৈরি করতে ডিআয়োনাইজড জলসহ একটি পটাশিয়াম হাইড্রোক্সাইড কার্টিজ ব্যবহার করুন। ৩৮০ μl/min প্রবাহ হারে নিম্নলিখিত গ্রেডিয়েন্ট প্রয়োগ করে মেটাবোলাইটসমূহের পৃথকীকরণ করা হয়: ০ থেকে ৩ মিনিট, ১০ mM KOH; ৩ থেকে ১২ মিনিট, ১০ থেকে ৫০ mM KOH; ১২ থেকে ১৯ মিনিট, ৫০ থেকে ১০০ mM KOH; ১৯ থেকে ২১ মিনিট, ১০০ mM KOH; ২১ থেকে ২১.৫ মিনিট, ১০০ থেকে ১০ mM KOH। কলামটিকে ৮.৫ মিনিটের জন্য ১০ mM KOH-এর অধীনে পুনরায় সাম্যাবস্থায় আনা হয়।
কলামের পরে এলুটেড মেটাবোলাইটগুলোকে একটি ১৫০μl/min আইসোপ্রোপানল সাপ্লিমেন্ট স্ট্রিমের সাথে মিশ্রিত করা হয় এবং তারপর নেগেটিভ আয়োনাইজেশন মোডে পরিচালিত একটি উচ্চ-রেজোলিউশন মাস স্পেকট্রোমিটারে পাঠানো হয়। MS ৬০,০০০ রেজোলিউশনে m/z ৫০ থেকে ৭৫০ পর্যন্ত ভর পরিসীমা পর্যবেক্ষণ করে। AGC ১×১০⁶-এ সেট করা হয় এবং সর্বোচ্চ আয়ন সময় ১০০ ms-এ রাখা হয়। উত্তপ্ত ESI সোর্সটি ৩.৫ kV স্প্রে ভোল্টেজে পরিচালিত হয়েছিল। আয়ন সোর্সের অন্যান্য সেটিংগুলো নিম্নরূপ: ক্যাপিলারি তাপমাত্রা ২৭৫°C; শিথ গ্যাস প্রবাহ, ৬০ AU; সহায়ক গ্যাস প্রবাহ, ৩০০°C তাপমাত্রায় ২০ AU, এবং S লেন্স সেটিং ৬০ AU।
13C লেবেলযুক্ত মেটাবোলাইটের ডেটা বিশ্লেষণ। আইসোটোপ অনুপাতের ডেটা বিশ্লেষণের জন্য TraceFinder সফটওয়্যার (সংস্করণ 4.2, Thermo Fisher Scientific) ব্যবহার করুন। প্রতিটি যৌগের পরিচয় একটি নির্ভরযোগ্য রেফারেন্স যৌগ দ্বারা যাচাই করা হয়েছিল এবং স্বাধীনভাবে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। আইসোটোপ এনরিচমেন্ট বিশ্লেষণ করার জন্য, প্রতিটি 13C আইসোটোপের (Mn) এক্সট্র্যাক্টেড আয়ন ক্রোমাটোগ্রামের (XIC) ক্ষেত্রফল [M + H]+ থেকে নিষ্কাশন করা হয়েছিল, যেখানে n হল লক্ষ্য যৌগের কার্বন সংখ্যা, যা অ্যামিনো অ্যাসিড বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহৃত হয় অথবা [MH]+ অ্যানায়ন বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহৃত হয়। XIC-এর ভরের নির্ভুলতা প্রতি মিলিয়নে পাঁচ অংশের চেয়ে কম, এবং RT-এর নির্ভুলতা 0.05 মিনিট। এনরিচমেন্ট বিশ্লেষণটি প্রতিটি সনাক্তকৃত আইসোটোপের সাথে সংশ্লিষ্ট যৌগের সমস্ত আইসোটোপের যোগফলের অনুপাত গণনা করে করা হয়। এই অনুপাতগুলি প্রতিটি আইসোটোপের জন্য শতাংশ মান হিসাবে দেওয়া হয়, এবং ফলাফলগুলি মোলার শতাংশ এনরিচমেন্ট (MPE) হিসাবে প্রকাশ করা হয়, যেমনটি পূর্বে বর্ণিত হয়েছে (42)।
হিমায়িত নিউরন পেলেটকে বরফ-ঠান্ডা ৮০% মিথানল (v/v)-এ সমজাতীয় করা হয়েছিল, ভর্টেক্স করা হয়েছিল এবং -২০°C তাপমাত্রায় ৩০ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। নমুনাটিকে আবার ভর্টেক্স করুন এবং +৪°C তাপমাত্রায় ৩০ মিনিটের জন্য নাড়াচাড়া করুন। নমুনাটিকে ৪°C তাপমাত্রায় ২১,০০০ g-তে ৫ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল, এবং তারপর প্রাপ্ত সুপারন্যাট্যান্ট সংগ্রহ করে পরবর্তী বিশ্লেষণের জন্য ২৫°C তাপমাত্রায় একটি স্পিডভ্যাক কনসেনট্রেটর ব্যবহার করে শুকানো হয়েছিল। উপরে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে, বাছাই করা কোষের অ্যামিনো অ্যাসিডগুলির উপর LC-MS বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ট্রেসফাইন্ডার (সংস্করণ ৪.২, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে, প্রতিটি যৌগের মনোআইসোটোপিক ভর ব্যবহার করে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। মেটাবোলাইট ডেটার কোয়ান্টাইল নর্মালাইজেশন প্রিপ্রসেসকোর সফটওয়্যার প্যাকেজ (৫৭) ব্যবহার করে করা হয়েছিল।
স্লাইস প্রস্তুতকরণ। ইঁদুরটিকে দ্রুত কার্বন ডাই অক্সাইড দিয়ে অবেদন দেওয়া হয় এবং শিরশ্ছেদ করা হয়, খুলি থেকে দ্রুত মস্তিষ্কটি বের করে আনা হয়, এবং বরফ ভর্তি কম্পনশীল ছুরি (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) ব্যবহার করে এটিকে ৩০০ থেকে ৩৭৫ μm স্যাজিটাল সেকশনে কাটা হয়। কোল্ড কার্বন গ্যাসফিকেশন (৯৫% O2 এবং ৫% CO2) লো Ca2 + ACSF (১২৫.০ mM NaCl, ২.৫ mM KCl, ১.২৫ mM সোডিয়াম ফসফেট বাফার, ২৫.০ mM NaHCO3, ২৫.০ mM d-গ্লুকোজ, ১.০ mM CaCl2 এবং ৬.০ mM MgCl2, pH ৭.৪ এবং ৩১০ থেকে ৩৩০ mOsm-এ সামঞ্জস্য করা হয়)। প্রাপ্ত মস্তিষ্কের স্লাইসগুলিকে উচ্চ Ca2 + যুক্ত ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM সোডিয়াম ফসফেট বাফার, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-গ্লুকোজ, 4.0 mM CaCl2 এবং 3.5 mM MgCl2) (pH 7.4 এবং 310 থেকে 320 mOsm) যুক্ত একটি চেম্বারে স্থানান্তর করুন। স্লাইসগুলিকে 20 থেকে 30 মিনিটের জন্য সংরক্ষণ করুন যাতে রেকর্ডিংয়ের আগে সেগুলি পুনরুদ্ধার করা যায়।
রেকর্ডিং। সমস্ত রেকর্ডিংয়ের জন্য একটি স্থির রেকর্ডিং চেম্বার এবং একটি ২০x ওয়াটার ইমারশন অবজেক্টিভ লেন্স (সায়েন্টিফিকা) সহ একটি মাইক্রোস্কোপ স্টেজ ব্যবহার করা হয়েছিল। সম্ভাব্য পারকিনজে কোষগুলিকে (i) দেহের আকার, (ii) সেরিবেলামের শারীরবৃত্তীয় অবস্থান, এবং (iii) ফ্লুরোসেন্ট mtYFP রিপোর্টার জিনের এক্সপ্রেশন দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল। ৫ থেকে ১১ মেগাওহম টিপ রেজিস্ট্যান্সের প্যাচ পাইপেটটি একটি বোরোসিলিকেট গ্লাস ক্যাপিলারি (GB150-10, ০.৮৬ মিমি × ১.৫ মিমি × ১০০ মিমি, সায়েন্স প্রোডাক্টস, হফহাইম, জার্মানি) এবং একটি হরাইজন্টাল পাইপেট ইনস্ট্রুমেন্টস (P-1000, সাটার, নোভাটো, সিএ) দ্বারা টেনে বের করা হয়। সমস্ত রেকর্ডিং ELC-03XS npi প্যাচ ক্ল্যাম্প অ্যামপ্লিফায়ার (npi electronic GmbH, ট্যাম, জার্মানি) দ্বারা সম্পাদিত হয়েছিল, যা সিগন্যাল (সংস্করণ ৬.০, কেমব্রিজ ইলেকট্রনিক, কেমব্রিজ, ইউকে) সফটওয়্যার দ্বারা নিয়ন্ত্রিত ছিল। পরীক্ষাটি ১২.৫ কিলোহার্জ স্যাম্পলিং রেটে রেকর্ড করা হয়েছিল। সিগন্যালটিকে যথাক্রমে ১.৩ এবং ১০ কিলোহার্জ কাটঅফ ফ্রিকোয়েন্সির দুটি শর্ট-পাস বেসেল ফিল্টার দিয়ে ফিল্টার করা হয়। অ্যামপ্লিফায়ার ব্যবহার করে কম্পেনসেশন সার্কিটের মাধ্যমে মেমব্রেন এবং পিপেটের ক্যাপাসিট্যান্সের ক্ষতিপূরণ করা হয়। সমস্ত পরীক্ষা-নিরীক্ষা একটি ওরকা-ফ্ল্যাশ ৪.০ ক্যামেরা (হামামাৎসু, গারডেন, জার্মানি)-এর নিয়ন্ত্রণে সম্পন্ন করা হয়েছিল, যা হোকাবো সফটওয়্যার (ভার্সন ২.৮, হামামাৎসু, গারডেন, জার্মানি) দ্বারা নিয়ন্ত্রিত ছিল।
রুটিন হোল-সেল কনফিগারেশন এবং বিশ্লেষণ। রেকর্ডিং শুরু করার ঠিক আগে, পিপেটটি নিম্নলিখিত পদার্থযুক্ত অভ্যন্তরীণ দ্রবণ দিয়ে পূর্ণ করুন: ৪.০ mM KCl, ২.০ mM NaCl, ০.২ mM EGTA, ১৩৫.০ mM পটাশিয়াম গ্লুকোনেট, ১০.০ mM Hepes, ৪.০ mM ATP (Mg), ০.৫ mM গুয়ানোসিন ট্রাইফসফেট (GTP) (Na) এবং ১০.০ mM ক্রিয়েটিনিন ফসফেট। দ্রবণটির pH ৭.২৫-এ সামঞ্জস্য করা হয়েছিল এবং অভিস্রবণ চাপ ছিল ২৯০ mOsm (সুক্রোজ)। ঝিল্লি ফাটানোর জন্য ০ pA বল প্রয়োগ করার ঠিক পরেই, রেস্টিং মেমব্রেন পটেনশিয়াল পরিমাপ করা হয়েছিল। -৪০, -৩০, -২০, এবং -১০ pA-এর হাইপারপোলারাইজড কারেন্ট প্রয়োগ করে ইনপুট রেজিস্ট্যান্স পরিমাপ করা হয়। ভোল্টেজ প্রতিক্রিয়ার মাত্রা পরিমাপ করুন এবং ওহমের সূত্র ব্যবহার করে ইনপুট রেজিস্ট্যান্স গণনা করুন। স্বতঃস্ফূর্ত কার্যকলাপ ৫ মিনিটের জন্য একটি ভোল্টেজ ক্ল্যাম্পে রেকর্ড করা হয়েছিল, এবং একটি আধা-স্বয়ংক্রিয় শনাক্তকরণ স্ক্রিপ্ট ব্যবহার করে ইগর প্রো (সংস্করণ ৩২ ৭.০১, ওয়েভমেট্রিক্স, লেক ওসওয়েগো, ওরেগন, ইউএসএ)-তে এসপিএসসি শনাক্ত ও পরিমাপ করা হয়েছিল। ব্যাটারিকে বিভিন্ন পটেনশিয়ালে (-১১০ mV থেকে শুরু করে) ক্ল্যাম্প করে এবং ৫ mV ধাপে ভোল্টেজ বাড়িয়ে IV কার্ভ এবং স্টেডি-স্টেট কারেন্ট পরিমাপ করা হয়। একটি ডিপোলারাইজিং কারেন্ট প্রয়োগ করে এপি উৎপাদন পরীক্ষা করা হয়েছিল। একটি ডিপোলারাইজিং কারেন্ট পালস প্রয়োগ করার সময় সেলটিকে -৭০ mV-তে ক্ল্যাম্প করুন। প্রতিটি রেকর্ডিং ইউনিটের ধাপের আকার আলাদাভাবে (১০ থেকে ৬০ pA) সামঞ্জস্য করুন। সর্বোচ্চ এপি ফ্রিকোয়েন্সি সৃষ্টিকারী পালস স্পাইকগুলো হাতে গণনা করে সর্বোচ্চ এপি ফ্রিকোয়েন্সি গণনা করুন। যে ডিপোলারাইজেশন পালসটি প্রথম এক বা একাধিক এপি ট্রিগার করে, তার দ্বিতীয় ডেরিভেটিভ ব্যবহার করে এপি থ্রেশহোল্ড বিশ্লেষণ করা হয়।
পারফোরেটেড প্যাচ কনফিগারেশন এবং বিশ্লেষণ। স্ট্যান্ডার্ড প্রোটোকল ব্যবহার করে পারফোরেটেড প্যাচ রেকর্ডিং সম্পাদন করুন। একটি ATP- এবং GTP-মুক্ত পিপেট ব্যবহার করুন যাতে নিম্নলিখিত উপাদানগুলি না থাকে: 128 mM গ্লুকোনেট K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA এবং 2 mM MgCl2, এবং KOH ব্যবহার করে pH 7.2-এ সামঞ্জস্য করুন। কোষ পর্দার অনিয়ন্ত্রিত ভেদ্যতা রোধ করার জন্য ইন্ট্রাসেলুলার দ্রবণ থেকে ATP এবং GTP বাদ দেওয়া হয়। একটি পাঞ্চড প্যাচ রেকর্ড পাওয়ার জন্য প্যাচ পিপেটটি একটি অ্যাম্ফোটেরিসিন-যুক্ত অভ্যন্তরীণ দ্রবণ (প্রায় 200 থেকে 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) দিয়ে পূর্ণ করা হয়। অ্যাম্ফোটেরিসিন ডাইমিথাইল সালফোক্সাইডে (চূড়ান্ত ঘনত্ব: 0.1 থেকে 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich) দ্রবীভূত করা হয়েছিল। ব্যবহৃত DMSO-এর ঘনত্ব পরীক্ষিত নিউরনগুলির উপর কোনও উল্লেখযোগ্য প্রভাব ফেলেনি। পাঞ্চিং প্রক্রিয়া চলাকালীন, চ্যানেল রেজিস্ট্যান্স (Ra) ক্রমাগত পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল, এবং Ra ও AP-এর বিস্তার স্থিতিশীল হওয়ার পর (২০-৪০ মিনিট) পরীক্ষাটি শুরু করা হয়েছিল। স্বতঃস্ফূর্ত কার্যকলাপ ২ থেকে ৫ মিনিটের জন্য একটি ভোল্টেজ এবং/অথবা কারেন্ট ক্ল্যাম্পে পরিমাপ করা হয়। ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল ইগর প্রো (সংস্করণ ৭.০৫.২, ওয়েভমেট্রিক্স, ইউএসএ), এক্সেল (সংস্করণ ২০১০, মাইক্রোসফট কর্পোরেশন, রেডমন্ড, ইউএসএ) এবং গ্রাফপ্যাড প্রিজম (সংস্করণ ৮.১.২, গ্রাফপ্যাড সফটওয়্যার ইনকর্পোরেটেড, লা জোলা, সিএ, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) ব্যবহার করে। স্বতঃস্ফূর্ত AP শনাক্ত করার জন্য, ইগরপ্রো-এর নিউরোম্যাটিক ভি৩.০সি প্লাগ-ইন ব্যবহার করা হয়। এটি একটি নির্দিষ্ট থ্রেশহোল্ড ব্যবহার করে স্বয়ংক্রিয়ভাবে AP শনাক্ত করে, যা প্রতিটি রেকর্ডের জন্য আলাদাভাবে সামঞ্জস্য করা হয়। স্পাইক ইন্টারভ্যাল ব্যবহার করে, সর্বোচ্চ তাৎক্ষণিক স্পাইক ফ্রিকোয়েন্সি এবং গড় স্পাইক ফ্রিকোয়েন্সির মাধ্যমে স্পাইক ফ্রিকোয়েন্সি নির্ধারণ করা হয়।
PN পৃথকীকরণ। পূর্বে প্রকাশিত প্রোটোকল অবলম্বন করে, একটি নির্দিষ্ট পর্যায়ে (58) ইঁদুরের সেরিবেলাম থেকে PN বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, সেরিবেলামটি বিচ্ছিন্ন করে বরফ-ঠান্ডা ডিসোসিয়েশন মিডিয়ামে [HBSS Ca2+ এবং Mg2+ ছাড়া, 20 mM গ্লুকোজ, পেনিসিলিন (50 U/ml) এবং স্ট্রেপ্টোমাইসিন (0.05 mg/ml) সহ] কুচি কুচি করা হয়েছিল, এবং তারপর প্যাপেইন [HBSS, 1-সিস্টেইন·HCl (1 mg/ml), প্যাপেইন (16 U/ml) এবং ডিঅক্সিরাইবোনিউক্লিয়েজ I (DNase I; 0.1 mg/ml) সহ] মিডিয়ামটি 30°C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য ডাইজেস্ট করা হয়েছিল। প্রথমে এনজাইমেটিক হজম রোধ করার জন্য টিস্যুগুলোকে ঘরের তাপমাত্রায় ডিমের মিউকাস (১০ মিগ্রা/মিলি), বিএসএ (১০ মিগ্রা/মিলি) এবং ডিএনএজ (০.১ মিগ্রা/মিলি) যুক্ত এইচবিএসএস (HBSS) মাধ্যমে ধুয়ে নিন, এবং তারপর ২০ mM গ্লুকোজ যুক্ত এইচবিএসএস মাধ্যমে আলতোভাবে পিষে পেনিসিলিন (৫০ ইউনিট/মিলি), স্ট্রেপ্টোমাইসিন (০.০৫ মিগ্রা/মিলি) এবং ডিএনএজ (০.১ মিগ্রা/মিলি) যোগ করে একক কোষগুলোকে মুক্ত করুন। প্রাপ্ত কোষ সাসপেনশনটি একটি ৭০μm সেল স্ট্রেইনারের মাধ্যমে ছেঁকে নেওয়া হয়, তারপর সেন্ট্রিফিউগেশন (১১১০ আরপিএম, ৫ মিনিট, ৪°সে) দ্বারা কোষগুলোকে জমাটবদ্ধ করা হয় এবং সর্টিং মাধ্যমে [এইচবিএসএস, যাতে ২০ mM গ্লুকোজ, ২০% ফিটাল বোভাইন সিরাম, পেনিসিলিন (৫০ ইউনিট/মিলি) এবং স্ট্রেপ্টোমাইসিন (০.০৫ মিগ্রা/মিলি) যোগ করা হয়েছে] পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়। প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড দিয়ে কোষের কার্যক্ষমতা মূল্যায়ন করুন এবং কোষের ঘনত্ব 1×10⁶ থেকে 2×10⁶ কোষ/মিলি-তে সামঞ্জস্য করুন। ফ্লো সাইটোমেট্রির আগে, সাসপেনশনটি একটি 50 μm সেল স্ট্রেইনারের মাধ্যমে ছেঁকে নেওয়া হয়েছিল।
ফ্লো সাইটোমিটার। FACSAria III মেশিন (BD Biosciences) এবং FACSDiva সফটওয়্যার (BD Biosciences, সংস্করণ 8.0.1) ব্যবহার করে ৪°C তাপমাত্রায় কোষ বাছাই করা হয়েছিল। কোষ সাসপেনশনটি একটি ১০০ μm নজল ব্যবহার করে ২০ psi চাপে এবং প্রতি সেকেন্ডে প্রায় ২৮০০ ইভেন্টের হারে বাছাই করা হয়েছিল। যেহেতু প্রচলিত গেটিং মানদণ্ড (কোষের আকার, দ্বিমুখী পার্থক্যকরণ এবং বিক্ষেপণ বৈশিষ্ট্য) অন্যান্য কোষের প্রকার থেকে PN-এর সঠিক পৃথকীকরণ নিশ্চিত করতে পারে না, তাই mitoYFP+ ​​এবং নিয়ন্ত্রক mitoYFP− ইঁদুরের মধ্যে YFP-এর তীব্রতা এবং অটোফ্লুরোসেন্সের সরাসরি তুলনার উপর ভিত্তি করে গেটিং কৌশলটি নির্ধারণ করা হয়। একটি ৪৮৮ nm লেজার লাইন দিয়ে নমুনাকে বিকিরণ করে YFP-কে উত্তেজিত করা হয় এবং একটি ৫৩০/৩০ nm ব্যান্ড পাস ফিল্টার ব্যবহার করে সংকেতটি শনাক্ত করা হয়। mitoYFP+ ​​ইঁদুরের ক্ষেত্রে, নিউরোনাল বডি এবং অ্যাক্সন খণ্ডাংশকে আলাদা করার জন্য Rosa26-mitoYFP রিপোর্টার জিনের আপেক্ষিক শক্তিও ব্যবহার করা হয়। 7-AAD-কে একটি 561 nm হলুদ লেজার দিয়ে উত্তেজিত করা হয় এবং মৃত কোষ বাদ দেওয়ার জন্য একটি 675/20 nm ব্যান্ডপাস ফিল্টার দিয়ে শনাক্ত করা হয়। একই সাথে অ্যাস্ট্রোসাইটগুলিকে আলাদা করার জন্য, কোষ সাসপেনশনটিকে ACSA-2-APC দিয়ে স্টেইন করা হয়েছিল, তারপর নমুনাটিকে একটি 640 nm লেজার লাইন দিয়ে বিকিরণ করা হয়েছিল এবং সংকেত শনাক্ত করার জন্য একটি 660/20 nm ব্যান্ডপাস ফিল্টার ব্যবহার করা হয়েছিল।
সংগৃহীত কোষগুলোকে সেন্ট্রিফিউগেশন (১১১০ আরপিএম, ৫ মিনিট, ৪°সে.) দ্বারা জমাটবদ্ধ করা হয় এবং ব্যবহারের আগ পর্যন্ত -৮০°সে. তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়। পদ্ধতিগত ভিন্নতা কমানোর জন্য Mfn2cKO ইঁদুর এবং তাদের শাবকদের একই দিনে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়। FACS ডেটা উপস্থাপন এবং বিশ্লেষণ FlowJo সফটওয়্যার (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) ব্যবহার করে সম্পন্ন করা হয়েছিল।
উপরে উল্লিখিত (59) অনুযায়ী, পরবর্তীকালে mtDNA পরিমাণ নির্ধারণের জন্য বাছাই করা নিউরন থেকে DNA আলাদা করতে রিয়েল-টাইম PCR ব্যবহার করা হয়। বিভিন্ন সংখ্যক কোষে qPCR চালিয়ে প্রাথমিকভাবে রৈখিকতা এবং থ্রেশহোল্ড সংবেদনশীলতা পরীক্ষা করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, 50 mM ট্রিস-এইচসিএল (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% টুইন 20 এবং প্রোটিয়িনেজ K (200 ng/ml) সমন্বিত একটি লাইসিস বাফারে 300 PN সংগ্রহ করুন এবং 55°C তাপমাত্রায় 120 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করুন। প্রোটিয়িনেজ K-এর সম্পূর্ণ নিষ্ক্রিয়তা নিশ্চিত করার জন্য কোষগুলিকে আরও 10 মিনিটের জন্য 95°C তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করা হয়েছিল। mt-Nd1-এর জন্য নির্দিষ্ট একটি TaqMan প্রোব (থার্মো ফিশার) ব্যবহার করে, 7900HT রিয়েল-টাইম PCR সিস্টেমে (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) সেমি-কোয়ান্টিটেটিভ PCR দ্বারা mtDNA পরিমাপ করা হয়েছিল। থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক (ক্যাটালগ নম্বর Mm04225274_s1), mt-Nd6 (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ক্যাটালগ নম্বর AIVI3E8) এবং 18S (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ক্যাটালগ নম্বর Hs99999901_s1) জিনসমূহ।
প্রোটিওম নমুনা প্রস্তুতি। লাইসিস বাফারে [৬ M গুয়ানিডিন ক্লোরাইড, ১০ mM ট্রিস(২-কার্বক্সিইথাইল) ফসফিন হাইড্রোক্লোরাইড, ১০ mM ক্লোরোঅ্যাসিটামাইড এবং ১০০ mM ট্রিস-HCl] হিমায়িত নিউরন পেলেট লাইজ করে, দ্রবণটিকে ৯৫°C তাপমাত্রায় ১০ মিনিট ধরে উত্তপ্ত করা হয় এবং সনিকেট করা হয়। এরপর বায়োর‍্যাপ্টর (ডায়াজিনোড)-এ ১০ মিনিটের জন্য (৩০ সেকেন্ড পালস / ৩০ সেকেন্ড বিরতি) সনিকেট করা হয়। নমুনাটিকে ২০ mM ট্রিস-HCl (pH ৮.০)-এ ১:১০ অনুপাতে লঘু করে, ৩০০ ng ট্রিপসিন গোল্ড (প্রোমেগা)-এর সাথে মেশানো হয় এবং সম্পূর্ণ পরিপাক নিশ্চিত করার জন্য ৩৭°C তাপমাত্রায় সারারাত ইনকিউবেট করা হয়। দ্বিতীয় দিনে, নমুনাটিকে ২০,০০০ g-তে ২০ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়। সুপারন্যাট্যান্টকে ০.১% ফরমিক অ্যাসিড দিয়ে লঘু করা হয় এবং দ্রবণটিকে স্ব-নির্মিত স্টেজটিপস দিয়ে লবণমুক্ত করা হয়। নমুনাটি একটি স্পিডভ্যাক যন্ত্রে (এপেনডর্ফ কনসেনট্রেটর প্লাস ৫৩০৫) ৪৫° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় শুকানো হয়েছিল, এবং তারপর পেপটাইডটিকে ০.১% ফরমিক অ্যাসিডে সাসপেন্ড করা হয়েছিল। সমস্ত নমুনা একই ব্যক্তি দ্বারা একই সাথে প্রস্তুত করা হয়েছিল। অ্যাস্ট্রোসাইট নমুনা বিশ্লেষণ করার জন্য, ৪ মাইক্রোগ্রাম লবণমুক্ত পেপটাইডকে একটি ট্যান্ডেম মাস ট্যাগ (TMT10plex, ক্যাটালগ নম্বর ৯০১১০, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) দিয়ে লেবেল করা হয়েছিল, যেখানে পেপটাইড ও TMT রিএজেন্টের অনুপাত ছিল ১:২০। TMT লেবেলিং-এর জন্য, ০.৮ মিলিগ্রাম TMT রিএজেন্ট ৭০ মাইক্রোলিটার অ্যানহাইড্রাস ACN-এ পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল, এবং শুকনো পেপটাইডটিকে ৯ মাইক্রোলিটার ০.১ মোলার TEAB (ট্রাইইথাইলঅ্যামোনিয়াম বাইকার্বনেট)-এ পুনর্গঠন করা হয়েছিল, যার সাথে ACN-এ দ্রবীভূত ৭ মাইক্রোলিটার TMT রিএজেন্ট যোগ করা হয়েছিল। এর ঘনত্ব ছিল ৪৩.৭৫%। ৬০ মিনিট ইনকিউবেশনের পর, ২ μl ৫% হাইড্রোক্সিলামাইন দিয়ে বিক্রিয়াটি প্রশমিত করা হয়। লেবেলযুক্ত পেপটাইডগুলো সংগ্রহ করে, শুকিয়ে, ২০০μl ০.১% ফরমিক অ্যাসিড (FA)-এ পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়, দুটি ভাগে ভাগ করা হয় এবং তারপরে স্ব-নির্মিত স্টেজটিপস ব্যবহার করে ডিসল্ট করা হয়। আল্টিমেট ৩০০০ আল্ট্রা হাই পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফ (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph) ব্যবহার করে, দুটি অর্ধাংশের একটিকে ১ মিমি x ১৫০ মিমি অ্যাকুইটি ক্রোমাটোগ্রাফিক কলামে ফ্র্যাকশনেট করা হয়, যা ১৩০Å১.৭μm C18 কণা (ওয়াটার্স, ক্যাটালগ নং SKU: 186006935), থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক দ্বারা পূর্ণ ছিল। ৩০μl/min প্রবাহ হারে পেপটাইডগুলিকে পৃথক করুন, ৯৬ মিনিটের একটি ধাপে ধাপে গ্রেডিয়েন্টের মাধ্যমে ৮৫ মিনিট ধরে ১% থেকে ৫০% বাফার B, ৩ মিনিট ধরে ৫০% থেকে ৯৫% বাফার B, এবং তারপর ৮ মিনিট ধরে ৯৫% বাফার B দ্বারা পৃথক করুন; বাফার A হলো ৫% ACN এবং ১০ mM অ্যামোনিয়াম বাইকার্বোনেট (ABC), এবং বাফার B হলো ৮০% ACN এবং ১০ mM ABC। প্রতি ৩ মিনিট অন্তর ফ্র্যাকশনগুলি সংগ্রহ করুন এবং সেগুলিকে দুটি গ্রুপে (১ + ১৭, ২ + ১৮, ইত্যাদি) একত্রিত করে একটি ভ্যাকুয়াম সেন্ট্রিফিউজে শুকিয়ে নিন।
LC-MS/MS বিশ্লেষণ। ভর বর্ণালিবীক্ষণের জন্য, পেপটাইডগুলোকে (নম্বর r119.aq) একটি ২৫ সেমি, ৭৫ মাইক্রোমিটার অভ্যন্তরীণ ব্যাসের পিকোফ্রিট অ্যানালিটিক্যাল কলামে (নতুন অবজেক্টিভ লেন্স, পার্ট নম্বর PF7508250) পৃথক করা হয়েছিল। এই কলামটি ১.৯ মাইক্রোমিটার রিপ্রোসিল-পুর ১২০ সি১৮-একিউ মিডিয়াম (ড. মাইশ, ম্যাট) দ্বারা সজ্জিত ছিল এবং এর জন্য ইজি-এনএলসি ১২০০ (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, জার্মানি) ব্যবহার করা হয়। কলামটিকে ৫০° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় রাখা হয়েছিল। বাফার এ এবং বি হলো যথাক্রমে জলে ০.১% ফরমিক অ্যাসিড এবং ৮০% এসিএন-এ ০.১% ফরমিক অ্যাসিড। পেপটাইডগুলোকে ৬% থেকে ৩১% বাফার বি-তে ৬৫ মিনিট ধরে এবং ৩১% থেকে ৫০% বাফার বি-তে ৫ মিনিট ধরে ২০০ ন্যানোলিটার/মিনিট গ্রেডিয়েন্টে পৃথক করা হয়েছিল। এলুটেড পেপটাইডগুলো একটি অরবিটরাপ ফিউশন মাস স্পেকট্রোমিটার (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। পেপটাইড প্রিকার্সরের m/z পরিমাপ ৩৫০ থেকে ১৫০০ m/z পরিসরে ১২০,০০০ রেজোলিউশনে করা হয়। ২৭% নর্মালাইজড কলিশন এনার্জি ব্যবহার করে, হাই এনার্জি সি ট্র্যাপ ডিসোসিয়েশন (HCD) ক্লিভেজের জন্য ২ থেকে ৬ চার্জ স্টেটের সবচেয়ে শক্তিশালী প্রিকার্সরটি নির্বাচন করা হয়। সাইকেল টাইম ১ সেকেন্ডে সেট করা হয়। আয়ন ট্র্যাপে পেপটাইড ফ্র্যাগমেন্টের m/z মান ৫×১০⁴-এর ক্ষুদ্রতম AGC টার্গেট এবং ৮৬ মিলিসেকেন্ডের সর্বোচ্চ ইনজেকশন টাইম ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল। ফ্র্যাগমেন্টেশনের পর, প্রিকার্সরটিকে ৪৫ সেকেন্ডের জন্য ডাইনামিক এক্সক্লুশন লিস্টে রাখা হয়েছিল। TMT-লেবেলযুক্ত পেপটাইডগুলোকে একটি ৫০ সেমি, ৭৫ μm Acclaim PepMap কলামে (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ক্যাটালগ নম্বর ১৬৪৯৪২) পৃথক করা হয়েছিল, এবং মাইগ্রেশন স্পেকট্রাগুলো একটি Orbitrap Lumos Tribrid ভর স্পেকট্রোমিটারে (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। এই স্পেকট্রোমিটারটি হাই-ফিল্ড অ্যাসিমেট্রিক ওয়েভফর্ম আয়ন (FAIMS) সরঞ্জাম (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) দ্বারা সজ্জিত ছিল, যা −৫০ এবং −৭০ V-এর দুটি কমপেনসেশন ভোল্টেজে পরিচালিত হয়। TMT রিপোর্ট আয়ন সিগন্যাল পরিমাপের জন্য সিনক্রোনাইজেশন প্রিকার্সরের উপর ভিত্তি করে নির্বাচিত MS3 ব্যবহার করা হয়। পেপটাইড পৃথকীকরণ EASY-nLC 1200-এ ৯০% লিনিয়ার গ্রেডিয়েন্ট এলুশন ব্যবহার করে সম্পন্ন করা হয়েছিল, যেখানে বাফারের ঘনত্ব ছিল ৬% থেকে ৩১%; বাফার A ছিল ০.১% FA, এবং বাফার B ছিল ০.১% FA ও ৮০% ACN। অ্যানালিটিক্যাল কলামটি ৫০°C তাপমাত্রায় পরিচালিত হয়। FAIMS ক্ষতিপূরণ ভোল্টেজ অনুযায়ী মূল ফাইলটিকে বিভক্ত করতে FreeStyle (সংস্করণ 1.6, Thermo Fisher Scientific) ব্যবহার করুন।
প্রোটিন শনাক্তকরণ এবং পরিমাণ নির্ধারণ। সমন্বিত অ্যান্ড্রোমিডা সার্চ ইঞ্জিন ব্যবহার করে, ম্যাক্সকোয়ান্ট সংস্করণ ১.৫.২.৮ (https://maxquant.org/) দিয়ে মূল ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। অ্যাকোরিয়া ভিক্টোরিয়া থেকে প্রাপ্ত ক্রে রিকম্বিনেজ এবং ওয়াইএফপি সিকোয়েন্স ছাড়াও, মাউস রেফারেন্স প্রোটিওমের (প্রোটিওম আইডি UP000000589, মে ২০১৭-তে ইউনিপ্রোট থেকে ডাউনলোড করা) ক্যানোনিকাল সিকোয়েন্স এবং আইসোফর্ম সিকোয়েন্সের জন্য পেপটাইড ফ্র্যাগমেন্ট স্পেকট্রা অনুসন্ধান করা হয়েছিল। মিথিওনিন অক্সিডেশন এবং প্রোটিন এন-টার্মিনাল অ্যাসিটাইলেশনকে পরিবর্তনশীল মডিফিকেশন হিসেবে নির্ধারণ করা হয়েছিল; সিস্টেইন কার্বাময়ল মিথাইলেশনকে স্থির মডিফিকেশন হিসেবে নির্ধারণ করা হয়েছিল। ডাইজেশন প্যারামিটারগুলো “স্পেসিফিসিটি” এবং “ট্রিপসিন/পি”-তে সেট করা হয়েছে। প্রোটিন শনাক্তকরণের জন্য ব্যবহৃত পেপটাইড এবং রেজর পেপটাইডের সর্বনিম্ন সংখ্যা হলো ১; অনন্য পেপটাইডের সর্বনিম্ন সংখ্যা হলো ০। পেপটাইড ম্যাপ ম্যাচিংয়ের শর্তে, প্রোটিন শনাক্তকরণের হার ছিল ০.০১। “সেকেন্ড পেপটাইড” অপশনটি সক্রিয় করা হয়েছে। বিভিন্ন মূল ফাইলের মধ্যে সফল শনাক্তকরণ স্থানান্তর করতে “ম্যাচ বিটুইন রানস” অপশনটি ব্যবহার করুন। লেবেল-ফ্রি কোয়ান্টিফিকেশন (LFQ) (60)-এর জন্য LFQ ন্যূনতম অনুপাত গণনা 1 ব্যবহার করুন। প্রতিটি টাইম পয়েন্টে অন্তত একটি জিনোটাইপ গ্রুপে অন্তত দুটি বৈধ মানের জন্য LFQ ইনটেনসিটি ফিল্টার করা হয়, এবং .0.3 প্রস্থ এবং 1.8 ডাউন মুভ সহ একটি নরমাল ডিস্ট্রিবিউশন থেকে এক্সট্রাপোলেট করা হয়। LFQ ফলাফল বিশ্লেষণ করতে পার্সিয়াস কম্পিউটিং প্ল্যাটফর্ম (https://maxquant.net/perseus/) এবং R (https://r-project.org/) ব্যবহার করুন। ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণের জন্য লিম্মা সফটওয়্যার প্যাকেজ থেকে একটি টু-ওয়ে মডারেট টি টেস্ট ব্যবহার করা হয়েছিল (61)। এক্সপ্লোরেটরি ডেটা বিশ্লেষণ ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally এবং pheatmap ব্যবহার করে করা হয়। TMT-ভিত্তিক প্রোটিওমিক্স ডেটা MaxQuant সংস্করণ 1.6.10.43 ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ইউনিপ্রোট-এর হিউম্যান প্রোটিওমিক্স ডেটাবেস থেকে কাঁচা প্রোটিওমিক্স ডেটা অনুসন্ধান করুন, যা সেপ্টেম্বর ২০১৮-তে ডাউনলোড করা হয়েছিল। এই বিশ্লেষণে প্রস্তুতকারকের সরবরাহ করা আইসোটোপ বিশুদ্ধতা সংশোধন ফ্যাক্টর অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণের জন্য R-এ limma ব্যবহার করুন। মূল ডেটা, ডেটাবেস অনুসন্ধানের ফলাফল, এবং ডেটা বিশ্লেষণ কর্মপ্রবাহ ও ফলাফল—এই সবকিছুই PRIDE পার্টনার রিপোজিটরির মাধ্যমে ProteomeXchange অ্যালায়েন্সে PXD019690 ডেটা সেট আইডেন্টিফায়ারসহ সংরক্ষিত আছে।
কার্যকরী টীকা বিশ্লেষণকে সমৃদ্ধ করে। ৮ সপ্তাহের ডেটা সেটের কার্যকরী টীকা পদগুলির প্রাচুর্য নির্ধারণ করতে ইনজেনুইটি পাথওয়ে অ্যানালাইসিস (QIAGEN) টুলটি ব্যবহার করা হয়েছিল (চিত্র ১)। সংক্ষেপে, LC-MS/MS (ট্যান্ডেম মাস স্পেকট্রোমেট্রি) ডেটা বিশ্লেষণ থেকে প্রাপ্ত পরিমাণগত প্রোটিন তালিকাটি নিম্নলিখিত ফিল্টার মানদণ্ড সহ ব্যবহার করা হয়: প্রজাতি এবং পটভূমি হিসাবে Mus musculus নির্বাচন করা হয়, এবং বিভাগটি দেখায় যে সমৃদ্ধির জন্য বেনজামিনি দ্বারা সামঞ্জস্যকৃত P মান ০.০৫ বা তার কম হলে তা তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়। এই গ্রাফের জন্য, সামঞ্জস্যকৃত P মানের উপর ভিত্তি করে প্রতিটি ক্লাস্টারের শীর্ষ পাঁচটি অতিরিক্ত বিভাগ দেখানো হয়েছে। বেনজামিনি, ক্রিগার এবং ইয়েকুটিয়েলির দ্বি-পর্যায়ের লিনিয়ার বুস্ট প্রোগ্রাম (Q = ৫%) ব্যবহার করে একাধিক টি-টেস্টের মাধ্যমে, প্রতিটি বিভাগে চিহ্নিত গুরুত্বপূর্ণ ক্যান্ডিডেটদের উপর সময়-ভিত্তিক প্রোটিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ করা হয় এবং প্রতিটি সারি আলাদাভাবে বিশ্লেষণ করা হয়। একটি সামঞ্জস্যপূর্ণ SD গ্রহণ করার প্রয়োজন নেই।
এই গবেষণার ফলাফল প্রকাশিত ডাটাবেসের সাথে তুলনা করতে এবং চিত্র ১-এ একটি ভেন ডায়াগ্রাম তৈরি করতে, আমরা পরিমাণগত প্রোটিন তালিকাটিকে MitoCarta 2.0 টীকা (24) এর সাথে একত্রিত করেছি। ডায়াগ্রামটি তৈরি করতে Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) অনলাইন টুলটি ব্যবহার করুন।
প্রোটিওমিক্স বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহৃত পরিসংখ্যানগত পদ্ধতি সম্পর্কে বিস্তারিত তথ্যের জন্য, অনুগ্রহ করে উপকরণ ও পদ্ধতি-এর সংশ্লিষ্ট বিভাগটি দেখুন। অন্য সকল পরীক্ষার জন্য, বিস্তারিত তথ্য সংশ্লিষ্ট লেজেন্ডে পাওয়া যাবে। অন্যথায় নির্দিষ্ট করা না থাকলে, সমস্ত ডেটা গড় ± SEM হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছে, এবং সমস্ত পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ GraphPad Prism 8.1.2 সফটওয়্যার ব্যবহার করে করা হয়েছে।
এই প্রবন্ধের সম্পূরক উপকরণের জন্য, অনুগ্রহ করে http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 দেখুন।
এটি ক্রিয়েটিভ কমন্স অ্যাট্রিবিউশন-নন-কমার্শিয়াল লাইসেন্সের শর্তাবলীর অধীনে বিতরণ করা একটি উন্মুক্ত প্রবেশাধিকার নিবন্ধ, যা যেকোনো মাধ্যমে এর ব্যবহার, বিতরণ এবং পুনরুৎপাদনের অনুমতি দেয়, যতক্ষণ পর্যন্ত চূড়ান্ত ব্যবহারটি বাণিজ্যিক লাভের জন্য না হয় এবং মূল কাজটি সঠিক থাকার শর্ত থাকে। তথ্যসূত্র।
দ্রষ্টব্য: আমরা শুধুমাত্র আপনার ইমেল ঠিকানাটি এই কারণে প্রদান করতে অনুরোধ করছি, যাতে আপনি যাকে এই পেজটি সুপারিশ করছেন, তিনি যেন জানতে পারেন যে আপনি চান তিনি ইমেলটি দেখুন এবং এটি কোনো স্প্যাম নয়। আমরা কোনো ইমেল ঠিকানা সংগ্রহ করব না।
আপনি একজন পরিদর্শক কিনা তা যাচাই করতে এবং স্বয়ংক্রিয় স্প্যাম জমা হওয়া রোধ করতে এই প্রশ্নটি ব্যবহার করা হয়।
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. লারসন
অকার্যকর নিউরনের প্রোটিওমিক্স বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে, স্নায়ুক্ষয় প্রতিরোধ করার জন্য বিপাকীয় কার্যক্রম সক্রিয় হয়।
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. লারসন
অকার্যকর নিউরনের প্রোটিওমিক্স বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে, স্নায়ুক্ষয় প্রতিরোধ করার জন্য বিপাকীয় কার্যক্রম সক্রিয় হয়।
©2020 আমেরিকান অ্যাসোসিয়েশন ফর দ্য অ্যাডভান্সমেন্ট অফ সায়েন্স। সমস্ত অধিকার সংরক্ষিত AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef এবং COUNTER এর অংশীদার। Science Advances ISSN 2375-2548.