বর্তমান *বর্তমান ঠিকানা: কোলন ৫০৯৩১, জার্মানি, কোলন এক্সিলেন্স ক্লাস্টার রিসার্চ অন সেলুলার স্ট্রেস রেসপন্স ইন এজিং-সম্পর্কিত রোগ (CECAD)।
মাইটোকন্ড্রিয়াল রোগের নিউরোডিজেনারেশনকে অপরিবর্তনীয় বলে মনে করা হয় কারণ নিউরনের বিপাকীয় প্লাস্টিসিটি সীমিত, কিন্তু শরীরের নিউরোনাল বিপাকের কোষ স্বায়ত্তশাসনের উপর মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার প্রভাব খুব একটা বোঝা যায় না। এখানে, আমরা ব্যাহত মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিউশন গতিবিদ্যার কারণে প্রগতিশীল OXPHOS ঘাটতি সহ Purkinje নিউরনের কোষ-নির্দিষ্ট প্রোটিওম পরিচয় করিয়ে দিচ্ছি। আমরা দেখতে পেয়েছি যে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা প্রোটিওমিক্সের ক্ষেত্রে একটি গভীর পরিবর্তনের সূত্রপাত করেছে, যা শেষ পর্যন্ত কোষের মৃত্যুর আগে সুনির্দিষ্ট বিপাকীয় প্রোগ্রামগুলির ক্রমিক সক্রিয়করণের দিকে পরিচালিত করে। অপ্রত্যাশিতভাবে, আমরা পাইরুভেট কার্বক্সিলেস (PCx) এবং অন্যান্য অ্যান্টি-এজিং এনজাইমের স্পষ্ট আবেশন নির্ধারণ করেছি যা TCA চক্রের মধ্যবর্তী উপাদানগুলিকে পরিপূরক করে। PCx এর বাধা অক্সিডেটিভ স্ট্রেস এবং নিউরোডিজেনারেশনকে আরও বাড়িয়ে তোলে, যা ইঙ্গিত করে যে OXPHOS-এর অভাবযুক্ত নিউরনে এথেরোস্ক্লেরোসিসের একটি প্রতিরক্ষামূলক প্রভাব রয়েছে। চূড়ান্তভাবে অবক্ষয়প্রাপ্ত নিউরনে মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিউশন পুনরুদ্ধার এই বিপাকীয় বৈশিষ্ট্যগুলিকে সম্পূর্ণরূপে বিপরীত করে, যার ফলে কোষের মৃত্যু রোধ করা হয়। আমাদের অনুসন্ধানগুলি পূর্বে অজানা পথগুলি সনাক্ত করে যা মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার স্থিতিস্থাপকতা প্রদান করে এবং দেখায় যে রোগের শেষ পর্যায়েও নিউরোডিজেনারেশন বিপরীত হতে পারে।
মানুষের মাইটোকন্ড্রিয়াল রোগের সাথে সম্পর্কিত বিস্তৃত স্নায়বিক লক্ষণগুলি নিউরোনাল শক্তি বিপাক বজায় রাখার ক্ষেত্রে মাইটোকন্ড্রিয়ার কেন্দ্রীয় ভূমিকার উপর জোর দেয়। এই রোগগুলির বেশিরভাগই মাইটোকন্ড্রিয়াল জিনের প্রকাশ নিয়ন্ত্রণকারী জিন মিউটেশন (1, 2) বা মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যার সাথে সম্পর্কিত জিন ধ্বংসের কারণে ঘটে, যা পরোক্ষভাবে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ (mtDNA) এর স্থিতিশীলতাকে প্রভাবিত করে (3, 4)। প্রাণী মডেলগুলিতে কাজ করে দেখা গেছে যে পার্শ্ববর্তী টিস্যুতে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার প্রতিক্রিয়ায়, রক্ষণশীল বিপাকীয় পথ (5-7) সক্রিয় করা যেতে পারে, যা এই জটিল রোগগুলির প্যাথোজেনেসিসের গভীরভাবে বোঝার জন্য গুরুত্বপূর্ণ তথ্য সরবরাহ করে। সম্পূর্ণ বিপরীতে, মস্তিষ্কের মাইটোকন্ড্রিয়াল অ্যাডেনোসিন ট্রাইফসফেট (ATP) উৎপাদনের সাধারণ ব্যর্থতার কারণে সৃষ্ট নির্দিষ্ট কোষের ধরণের বিপাকীয় পরিবর্তন সম্পর্কে আমাদের বোধগম্যতা মৌলিক (8), রোগ প্রতিরোধ বা প্রতিরোধ করতে ব্যবহার করা যেতে পারে এমন থেরাপিউটিক লক্ষ্যগুলি সনাক্ত করার প্রয়োজনীয়তার উপর জোর দেয়। নিউরোডিজেনারেশন প্রতিরোধ করুন (9)। তথ্যের অভাব হল যে স্নায়ু কোষগুলিকে পার্শ্ববর্তী টিস্যুর ধরণের কোষের তুলনায় খুব সীমিত বিপাকীয় নমনীয়তা বলে মনে করা হয় (10)। যেহেতু এই কোষগুলি নিউরনে সিনাপটিক ট্রান্সমিশনকে উৎসাহিত করার জন্য এবং আঘাত এবং রোগের অবস্থার প্রতি সাড়া দেওয়ার জন্য বিপাকীয় পদার্থ সরবরাহের সমন্বয় সাধনে কেন্দ্রীয় ভূমিকা পালন করে, তাই মস্তিষ্কের টিস্যুর চ্যালেঞ্জিং অবস্থার সাথে কোষ বিপাককে খাপ খাইয়ে নেওয়ার ক্ষমতা প্রায় গ্লিয়াল কোষের মধ্যেই সীমাবদ্ধ (11-14)। এছাড়াও, মস্তিষ্কের টিস্যুর সহজাত কোষীয় বৈচিত্র্য নির্দিষ্ট নিউরোনাল উপগোষ্ঠীতে ঘটে যাওয়া বিপাকীয় পরিবর্তনগুলির অধ্যয়নকে মূলত বাধাগ্রস্ত করে। ফলস্বরূপ, নিউরনে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার সঠিক কোষীয় এবং বিপাকীয় পরিণতি সম্পর্কে খুব কমই জানা যায়।
মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার বিপাকীয় পরিণতি বোঝার জন্য, আমরা মাইটোকন্ড্রিয়াল বহিরাগত ঝিল্লি ফিউশন (Mfn2) ধ্বংসের ফলে সৃষ্ট নিউরোডিজেনারেশনের বিভিন্ন পর্যায়ে পুরকিনজে নিউরন (PNs) আলাদা করেছি। যদিও মানুষের মধ্যে Mfn2 মিউটেশনগুলি চারকোট-মেরি-টুথ টাইপ 2A (15) নামে পরিচিত বংশগত মোটর সংবেদনশীল নিউরোপ্যাথির সাথে যুক্ত, ইঁদুরের মধ্যে Mfn2 এর শর্তসাপেক্ষ ধ্বংস হল জারণ​​​​ফসফোরাইলেশন (OXPHOS) কর্মহীনতার একটি সুপরিচিত প্রবর্তন পদ্ধতি। বিভিন্ন নিউরোনাল সাবটাইপ (16-19) এবং ফলস্বরূপ নিউরোডিজেনারেটিভ ফেনোটাইপের সাথে প্রগতিশীল স্নায়বিক লক্ষণ থাকে, যেমন চলাচলের ব্যাধি (18, 19) বা সেরিবেলার অ্যাটাক্সিয়া (16)। লেবেল-মুক্ত পরিমাণগত (LFQ) প্রোটিওমিক্স, বিপাক, ইমেজিং এবং ভাইরোলজিক্যাল পদ্ধতির সংমিশ্রণ ব্যবহার করে, আমরা দেখাই যে প্রগতিশীল নিউরোডিজেনারেশন পাইরুভেট কার্বক্সিলেজ (PCx) এবং এনজাইমের প্রকাশের ক্ষেত্রে PN-এর ধমনী স্ক্লেরোসিসের সাথে জড়িত অন্যান্য কারণগুলিকে জোরালোভাবে প্ররোচিত করে। এই আবিষ্কারের প্রাসঙ্গিকতা যাচাই করার জন্য, আমরা বিশেষভাবে Mfn2-ঘাটতি PN-তে PCx-এর প্রকাশকে হ্রাস করেছি এবং দেখেছি যে এই অপারেশনটি অক্সিডেটিভ স্ট্রেসকে বাড়িয়ে তোলে এবং নিউরোডিজেনারেশনকে ত্বরান্বিত করে, এইভাবে প্রমাণ করে যে অ্যাজোস্পার্মিয়া কোষের মৃত্যুকে বিপাকীয় অভিযোজনযোগ্যতা প্রদান করে। MFN2-এর তীব্র প্রকাশ গুরুতর OXPHOS ঘাটতি, মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএর ব্যাপক ব্যবহার এবং দৃশ্যত ভাঙা মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্ক সহ টার্মিনাল ডিজেনারেশন PN-কে সম্পূর্ণরূপে উদ্ধার করতে পারে, যা আরও জোর দেয় যে এই ধরণের নিউরোডিজেনারেশন কোষের মৃত্যুর আগে রোগের উন্নত পর্যায়েও পুনরুদ্ধার করতে পারে।
Mfn2 নকআউট PN-তে মাইটোকন্ড্রিয়া কল্পনা করার জন্য, আমরা একটি মাউস স্ট্রেন ব্যবহার করেছি যা Cre-নির্ভর মাইটোকন্ড্রিয়াকে হলুদ ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন (YFP) (mtYFP) (20) Cre এক্সপ্রেশনকে লক্ষ্য করতে দেয় এবং ভিভোতে মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজি পরীক্ষা করে দেখেছি। আমরা দেখতে পেয়েছি যে PN-তে Mfn2 জিনের ধ্বংস মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কের ধীরে ধীরে বিভাজনের দিকে পরিচালিত করবে (চিত্র S1A), এবং প্রথম পরিবর্তনটি 3 সপ্তাহ বয়সে পাওয়া গেছে। বিপরীতে, ক্যালবিন্ডিন ইমিউনোস্টেইনিং হ্রাস দ্বারা প্রমাণিত PN কোষ স্তরের উল্লেখযোগ্য অবক্ষয় 12 সপ্তাহ বয়স পর্যন্ত শুরু হয়নি (চিত্র 1, A এবং B)। মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজিতে প্রাথমিক পরিবর্তন এবং নিউরোনাল মৃত্যুর দৃশ্যমান সূত্রপাতের মধ্যে সময়ের অমিল আমাদের কোষের মৃত্যুর আগে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার কারণে সৃষ্ট বিপাকীয় পরিবর্তনগুলি তদন্ত করতে প্ররোচিত করেছিল। আমরা YFP (YFP+)-প্রকাশকারী PN (চিত্র 1C) এবং নিয়ন্ত্রণ ইঁদুর (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) কে আলাদা করার জন্য একটি ফ্লুরোসেন্স-অ্যাক্টিভেটেড সেল সর্টিং (FACS)-ভিত্তিক কৌশল তৈরি করেছি, যা পরবর্তীতে CTRL (চিত্র S1B) হিসাবে উল্লেখ করা হয়েছে। YFP সংকেতের আপেক্ষিক তীব্রতার উপর ভিত্তি করে গেটিং কৌশলের অপ্টিমাইজেশন আমাদের PN-এর YFP+ বডি (YFPhigh) কে নন-PN (YFPneg) (চিত্র S1B) বা পুটেটিভ ফ্লুরোসেন্ট অ্যাক্সন/ডেনড্রাইটিক ফ্র্যাগমেন্ট (YFPlow; চিত্র S1D, বাম) থেকে বিশুদ্ধ করতে সাহায্য করে, যা কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ (চিত্র S1D, ডান) দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছে। শ্রেণীবদ্ধ জনসংখ্যার পরিচয় যাচাই করার জন্য, আমরা LFQ প্রোটিওমিক্স এবং তারপরে প্রধান উপাদান বিশ্লেষণ পরিচালনা করেছি এবং দেখেছি যে YFPhigh এবং YFPneg কোষের মধ্যে একটি স্পষ্ট বিচ্ছেদ রয়েছে (চিত্র S1C)। YFPhigh কোষগুলি পরিচিত PNs মার্কারগুলির (যেমন Calb1, Pcp2, Grid2 এবং Itpr3) নেট সমৃদ্ধি দেখিয়েছে (21, 22), কিন্তু নিউরন বা অন্যান্য কোষের ধরণের প্রোটিনের কোনও সমৃদ্ধি সাধারণত প্রকাশ করা হয়নি (চিত্র 1D)। স্বাধীন পরীক্ষায় সংগৃহীত শ্রেণীবদ্ধ YFPhigh কোষগুলির নমুনাগুলির মধ্যে তুলনা করলে একটি পারস্পরিক সম্পর্ক সহগ> 0.9 দেখা গেছে, যা জৈবিক প্রতিলিপিগুলির মধ্যে ভাল প্রজননযোগ্যতা প্রদর্শন করে (চিত্র S1E)। সংক্ষেপে, এই তথ্যগুলি সম্ভাব্য PN-এর তীব্র এবং নির্দিষ্ট বিচ্ছিন্নতার জন্য আমাদের পরিকল্পনাকে বৈধতা দিয়েছে। যেহেতু ব্যবহৃত L7-cre ড্রাইভার সিস্টেম প্রসবের পর প্রথম সপ্তাহে মোজাইক পুনর্মিলনকে প্ররোচিত করে (23), আমরা CTRL থেকে ইঁদুর সংগ্রহ শুরু করি এবং শর্তসাপেক্ষে (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) নিউরন সংগ্রহ করি। পুনর্মিলন সম্পন্ন হওয়ার পর, 4 সপ্তাহ বয়সে এটিকে Mfn2cKO বলা হয়। শেষ বিন্দু হিসেবে, আমরা ৮ সপ্তাহের বয়স বেছে নিয়েছি যখন স্পষ্ট মাইটোকন্ড্রিয়াল ফ্র্যাগমেন্টেশন সত্ত্বেও PN স্তরটি অক্ষত ছিল (চিত্র ১বি এবং চিত্র S1A)। মোট, আমরা মোট ৩০১৩টি প্রোটিনের পরিমাণ নির্ধারণ করেছি, যার মধ্যে প্রায় ২২% মাইটোকন্ড্রিয়াল প্রোটোম হিসাবে মাইটোকন্ড্রিয়াল (চিত্র ১ই) (চিত্র ১ই) (২৪) এর উপর ভিত্তি করে MitoCarta 2.0 টীকাগুলির উপর ভিত্তি করে তৈরি হয়েছিল। ৮ম সপ্তাহে সম্পাদিত ডিফারেনশিয়াল জিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে সমস্ত প্রোটিনের মাত্র ১০.৫% উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন ঘটেছে (চিত্র ১এফ এবং চিত্র S1F), যার মধ্যে ১৯৫টি প্রোটিন ডাউন-রেগুলেটেড ছিল এবং ১২০টি প্রোটিন আপ-রেগুলেটেড ছিল (চিত্র ১এফ)। এটি লক্ষণীয় যে এই ডেটা সেটের "উদ্ভাবনী পথ বিশ্লেষণ" দেখায় যে ডিফারেনশিয়ালি প্রকাশিত জিনগুলি মূলত নির্দিষ্ট বিপাকীয় পথের একটি সীমিত সেটের (চিত্র ১জি) অন্তর্গত। মজার বিষয় হল, যদিও OXPHOS এবং ক্যালসিয়াম সিগন্যালিং সম্পর্কিত পথের নিম্নচাপ ফিউশন-ঘাটতি PN-তে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার প্রবর্তন নিশ্চিত করে, অন্যান্য বিভাগগুলি যা মূলত অ্যামিনো অ্যাসিড বিপাক জড়িত তা উল্লেখযোগ্যভাবে আপরেগুলেটেড, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল PN-তে ঘটে যাওয়া বিপাকের সাথে সঙ্গতিপূর্ণ। পুনর্নির্মাণ সামঞ্জস্যপূর্ণ।
(A) CTRL এবং Mfn2cKO ইঁদুরের সেরিবেলার অংশের প্রতিনিধিত্বমূলক কনফোকাল ছবি যা PN-এর ক্রমবর্ধমান ক্ষতি (ক্যালবিন্ডিন, ধূসর) দেখায়; নিউক্লিয়াসকে DAPI দিয়ে পাল্টা দাগ দেওয়া হয়েছিল। (B) (A) এর পরিমাণ নির্ধারণ (প্রকরণের একমুখী বিশ্লেষণ, ***P<0.001; n = তিনটি ইঁদুর থেকে 4 থেকে 6 বৃত্ত)। (C) পরীক্ষামূলক কর্মপ্রবাহ। (D) পুরকিঞ্জে (শীর্ষ) এবং অন্যান্য কোষের ধরণের (মাঝারি) জন্য নির্দিষ্ট মার্কারগুলির তাপ মানচিত্র বিতরণ। (E) ভেন চিত্র যা শ্রেণীবদ্ধ PN-তে চিহ্নিত মাইটোকন্ড্রিয়াল প্রোটিনের সংখ্যা দেখায়। (F) 8 সপ্তাহে Mfn2cKO নিউরনে ডিফারেনশিয়ালি প্রকাশিত প্রোটিনের আগ্নেয়গিরির প্লট (তাৎপর্যপূর্ণ কাট-অফ মান 1.3)। (G) সৃজনশীলতা পথ বিশ্লেষণ Mfn2cKO PN-তে 8 সপ্তাহ হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ পাঁচটি সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ আপ-রেগুলেশন (লাল) এবং ডাউন-রেগুলেশন (নীল) পথ দেখায়। প্রতিটি সনাক্ত করা প্রোটিনের গড় প্রকাশ স্তর দেখানো হয়েছে। গ্রেস্কেল তাপ মানচিত্র: সামঞ্জস্যপূর্ণ P মান। ns, গুরুত্বপূর্ণ নয়।
প্রোটিওমিক্সের তথ্য থেকে দেখা গেছে যে কমপ্লেক্স I, III, এবং IV এর প্রোটিন এক্সপ্রেশন ধীরে ধীরে হ্রাস পেয়েছে। কমপ্লেক্স I, III, এবং IV এর মধ্যে অপরিহার্য mtDNA-এনকোডেড সাবইউনিট ছিল, যেখানে কমপ্লেক্স II, যা শুধুমাত্র নিউক্লিয়ার-কোডেড ছিল, মূলত অপ্রভাবিত ছিল (চিত্র 2A এবং চিত্র S2A)। । প্রোটিওমিক্সের ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, সেরিবেলার টিস্যু বিভাগের ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি দেখিয়েছে যে PN-তে কমপ্লেক্স IV এর MTCO1 (মাইটোকন্ড্রিয়াল সাইটোক্রোম C অক্সিডেস সাবইউনিট 1) সাবইউনিট স্তর ধীরে ধীরে হ্রাস পেয়েছে (চিত্র 2B)। mtDNA-এনকোডেড সাবইউনিট Mtatp8 উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে (চিত্র S2A), যেখানে নিউক্লিয়ার-এনকোডেড ATP সিন্থেস সাবইউনিটের স্থির-স্থিতি স্তর অপরিবর্তিত রয়েছে, যা mtDNA এক্সপ্রেশন স্থিতিশীল থাকাকালীন পরিচিত স্থিতিশীল ATP সিন্থেস সাবঅ্যাসেম্বলি F1 কমপ্লেক্সের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। গঠন সামঞ্জস্যপূর্ণ। বাধা (7)। রিয়েল-টাইম পলিমারেজ চেইন রিঅ্যাকশন (qPCR) দ্বারা সাজানো Mfn2cKO PN-তে mtDNA স্তরের মূল্যায়ন mtDNA কপি সংখ্যায় ধীরে ধীরে হ্রাস নিশ্চিত করেছে। নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর সাথে তুলনা করলে, 8 সপ্তাহ বয়সে, mtDNA স্তরের মাত্র 20% ধরে রাখা হয়েছিল (চিত্র 2C)। এই ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, Mfn2cKO PN-এর কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি স্টেইনিং ডিএনএ সনাক্ত করতে ব্যবহার করা হয়েছিল, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল নিউক্লিওটাইডের সময়-নির্ভর খরচ দেখায় (চিত্র 2D)। আমরা দেখতে পেয়েছি যে মাইটোকন্ড্রিয়াল প্রোটিন অবক্ষয় এবং স্ট্রেস প্রতিক্রিয়ার সাথে জড়িত কিছু প্রার্থীই আপ-নিয়ন্ত্রিত ছিল, যার মধ্যে রয়েছে Lonp1, Afg3l2 এবং Clpx, এবং OXPHOS জটিল সমাবেশ ফ্যাক্টর। অ্যাপোপটোসিসে জড়িত প্রোটিনের স্তরে কোনও উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন সনাক্ত করা হয়নি (চিত্র S2B)। একইভাবে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে ক্যালসিয়াম পরিবহনে জড়িত মাইটোকন্ড্রিয়া এবং এন্ডোপ্লাজমিক রেটিকুলাম চ্যানেলগুলিতে কেবল সামান্য পরিবর্তন হয়েছে (চিত্র S2C)। এছাড়াও, অটোফ্যাজি-সম্পর্কিত প্রোটিনের মূল্যায়নে কোনও উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন পাওয়া যায়নি, যা ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি এবং ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপি দ্বারা ভিভোতে পরিলক্ষিত অটোফ্যাগোসোমের দৃশ্যমান আবেশনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ (চিত্র S3)। তবে, PN-তে প্রগতিশীল OXPHOS কর্মহীনতার সাথে স্পষ্ট অতি-কাঠামোগত মাইটোকন্ড্রিয়াল পরিবর্তন দেখা যায়। 5 এবং 8 সপ্তাহ বয়সী Mfn2cKO PN-এর কোষ দেহ এবং ডেনড্রাইটিক গাছগুলিতে মাইটোকন্ড্রিয়াল ক্লাস্টার দেখা যায় এবং অভ্যন্তরীণ ঝিল্লির কাঠামোতে গভীর পরিবর্তন এসেছে (চিত্র S4, A এবং B)। এই অতি-কাঠামোগত পরিবর্তন এবং mtDNA-তে উল্লেখযোগ্য হ্রাসের সাথে সামঞ্জস্য রেখে, টেট্রামিথাইলরোডামাইন মিথাইল এস্টার (TMRM) দিয়ে তীব্র সেরিব্রাল সেরিবেলার স্লাইসের বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে Mfn2cKO PN-তে মাইটোকন্ড্রিয়াল ঝিল্লির সম্ভাবনা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে (চিত্র S4C)।
(ক) OXPHOS কমপ্লেক্সের এক্সপ্রেশন স্তরের টাইম কোর্স বিশ্লেষণ। ৮ সপ্তাহে শুধুমাত্র P<0.05 সহ প্রোটিন বিবেচনা করুন (দ্বি-মুখী ANOVA)। ডটেড লাইন: CTRL এর তুলনায় কোনও সমন্বয় নেই। (খ) বাম: অ্যান্টি-MTCO1 অ্যান্টিবডি (স্কেল বার, ২০ μm) দিয়ে লেবেল করা একটি সেরিবেলার অংশের উদাহরণ। পুরকিনজে কোষের দেহ দ্বারা দখল করা এলাকা হলুদ দ্বারা আচ্ছাদিত। ডান: MTCO1 স্তরের পরিমাণ নির্ধারণ (ভ্যারিয়েন্সের একমুখী বিশ্লেষণ; n = তিনটি ইঁদুর থেকে বিশ্লেষণ করা ৭ থেকে ২০ কোষ)। (গ) সাজানো PN-তে mtDNA কপি নম্বরের qPCR বিশ্লেষণ (ভ্যারিয়েন্সের একমুখী বিশ্লেষণ; n = ৩ থেকে ৭ ইঁদুর)। (ঘ) বাম: অ্যান্টি-DNA অ্যান্টিবডি (স্কেল বার, ২০ μm) দিয়ে লেবেল করা একটি সেরিবেলার স্লাইসের উদাহরণ। পুরকিনজে কোষের দেহ দ্বারা দখল করা এলাকা হলুদ দ্বারা আচ্ছাদিত। ডান: mtDNA ক্ষতের পরিমাণ নির্ধারণ (ভ্যারিয়েন্সের একমুখী বিশ্লেষণ; n = তিনটি ইঁদুর থেকে ৫ থেকে ৯ কোষ)। (E) একটি তীব্র সেরিবেলার অংশের উদাহরণ যেখানে একটি সম্পূর্ণ-কোষ প্যাচ ক্ল্যাম্প রেকর্ডিংয়ে mitoYFP + Purkinje কোষ (তীর) দেখানো হয়েছে। (F) IV বক্ররেখার পরিমাণ নির্ধারণ। (G) CTRL এবং Mfn2cKO Purkinje কোষে ডিপোলারাইজিং কারেন্ট ইনজেকশনের প্রতিনিধিত্বমূলক রেকর্ডিং। শীর্ষ ট্রেস: প্রথম পালস যা AP ট্রিগার করেছিল। নীচের ট্রেস: সর্বাধিক AP ফ্রিকোয়েন্সি। (H) পোস্টসিন্যাপটিক স্বতঃস্ফূর্ত ইনপুট (sPSPs) এর পরিমাণ নির্ধারণ। প্রতিনিধিত্বমূলক রেকর্ডিং ট্রেস এবং এর জুম অনুপাত (I) তে দেখানো হয়েছে। তিনটি ইঁদুর থেকে n = 5 থেকে 20 কোষ বিশ্লেষণ করে বৈচিত্র্যের একমুখী বিশ্লেষণ। ডেটা গড় ±SEM হিসাবে প্রকাশ করা হয়; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001। (J) ছিদ্রযুক্ত প্যাচ ক্ল্যাম্প মোড ব্যবহার করে রেকর্ড করা স্বতঃস্ফূর্ত AP এর প্রতিনিধিত্বমূলক ট্রেস। শীর্ষ ট্রেস: সর্বাধিক AP ফ্রিকোয়েন্সি। নীচের ট্রেস: একটি একক AP এর জুম। (K) (J) অনুসারে গড় এবং সর্বাধিক AP ফ্রিকোয়েন্সি পরিমাপ করুন। মান-হুইটনি পরীক্ষা; চারটি ইঁদুর থেকে n = 5 কোষ বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। তথ্য গড় ± SEM হিসাবে প্রকাশ করা হয়; গুরুত্বপূর্ণ নয়।
৮ সপ্তাহ বয়সী Mfn2cKO PN-তে স্পষ্ট OXPHOS ক্ষতি সনাক্ত করা হয়েছিল, যা ইঙ্গিত করে যে নিউরনের শারীরবৃত্তীয় কার্যকারিতা মারাত্মকভাবে অস্বাভাবিক। অতএব, আমরা ৪ থেকে ৫ সপ্তাহ এবং ৭ থেকে ৮ সপ্তাহে তীব্র সেরিবেলার স্লাইসে পুরো-কোষ প্যাচ ক্ল্যাম্প রেকর্ডিং করে OXPHOS-ঘাটতিযুক্ত নিউরনের নিষ্ক্রিয় বৈদ্যুতিক বৈশিষ্ট্য বিশ্লেষণ করেছি (চিত্র ২E)। অপ্রত্যাশিতভাবে, Mfn2cKO নিউরনের গড় বিশ্রামের ঝিল্লি সম্ভাবনা এবং ইনপুট প্রতিরোধ নিয়ন্ত্রণের অনুরূপ ছিল, যদিও কোষগুলির মধ্যে সূক্ষ্ম পার্থক্য ছিল (সারণী ১)। একইভাবে, ৪ থেকে ৫ সপ্তাহ বয়সে, বর্তমান-ভোল্টেজ সম্পর্কের (IV বক্ররেখা) কোনও উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন পাওয়া যায়নি (চিত্র ২F)। তবে, ৭ থেকে ৮ সপ্তাহ বয়সী কোনও Mfn2cKO নিউরন IV পদ্ধতিতে (হাইপারপোলারাইজেশন ধাপ) বেঁচে থাকতে পারেনি, যা ইঙ্গিত করে যে এই শেষ পর্যায়ে হাইপারপোলারাইজেশন সম্ভাবনার প্রতি স্পষ্ট সংবেদনশীলতা রয়েছে। বিপরীতে, Mfn2cKO নিউরনে, পুনরাবৃত্তিমূলক ক্রিয়া সম্ভাবনা (AP) নিঃসরণ ঘটায় এমন ডিপোলারাইজিং স্রোতগুলি ভালভাবে সহ্য করা হয়, যা নির্দেশ করে যে তাদের সামগ্রিক স্রাবের ধরণ 8-সপ্তাহ বয়সী নিয়ন্ত্রণ নিউরনের থেকে উল্লেখযোগ্যভাবে আলাদা নয় (সারণী 1 এবং চিত্র 2G)। একইভাবে, স্বতঃস্ফূর্ত পোস্টসিন্যাপটিক স্রোতের (sPSCs) ফ্রিকোয়েন্সি এবং প্রশস্ততা নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর ফ্রিকোয়েন্সিগুলির সাথে তুলনীয় ছিল এবং ঘটনাগুলির ফ্রিকোয়েন্সি 4 সপ্তাহ থেকে 5 সপ্তাহ থেকে 7 সপ্তাহ থেকে 8 সপ্তাহে একই বৃদ্ধির সাথে বৃদ্ধি পেয়েছিল (চিত্র 2, H এবং I)। PNs-এ সিনাপটিক পরিপক্কতার সময়কাল (25)। ছিদ্রযুক্ত PNs প্যাচগুলির পরে একই রকম ফলাফল পাওয়া গেছে। এই কনফিগারেশনটি সেলুলার ATP ত্রুটিগুলির সম্ভাব্য ক্ষতিপূরণকে বাধা দেয়, যেমনটি পুরো-কোষ প্যাচ ক্ল্যাম্প রেকর্ডিংয়ে ঘটতে পারে। বিশেষ করে, Mfn2cKO নিউরনের বিশ্রামের ঝিল্লি সম্ভাব্যতা এবং স্বতঃস্ফূর্ত ফায়ারিং ফ্রিকোয়েন্সি প্রভাবিত হয়নি (চিত্র 2, J এবং K)। সংক্ষেপে, এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে স্পষ্ট OXPHOS কর্মহীনতার সাথে PN গুলি উচ্চ-ফ্রিকোয়েন্সি স্রাবের ধরণগুলি ভালভাবে মোকাবেলা করতে পারে, যা ইঙ্গিত করে যে একটি ক্ষতিপূরণ ব্যবস্থা রয়েছে যা তাদের প্রায় স্বাভাবিক ইলেক্ট্রোফিজিওলজিক্যাল প্রতিক্রিয়া বজায় রাখতে সহায়তা করে।
তথ্যকে গড় ± SEM (পরিবর্তনের একমুখী বিশ্লেষণ, হোলম-সিডাকের বহুমুখী তুলনা পরীক্ষা; *P<0.05) হিসেবে প্রকাশ করা হয়। ইউনিট নম্বরটি বন্ধনী দ্বারা নির্দেশিত।
আমরা প্রোটিওমিক্স ডেটাসেটের (চিত্র 1G) কোনও বিভাগে এমন পথ রয়েছে কিনা তা তদন্ত করার জন্য বেরিয়েছি যা গুরুতর OXPHOS ঘাটতি মোকাবেলা করতে পারে, যার ফলে ব্যাখ্যা করা হয়েছে যে কেন প্রভাবিত PN প্রায় স্বাভাবিক ইলেক্ট্রোফিজিওলজি বজায় রাখতে পারে (চিত্র 2, E থেকে K)। প্রোটিওমিক্স বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে ব্রাঞ্চড চেইন অ্যামিনো অ্যাসিড (BCAA) এর ক্যাটাবোলিজমে জড়িত এনজাইমগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে আপ-নিয়ন্ত্রিত ছিল (চিত্র 3A এবং চিত্র S5A), এবং চূড়ান্ত পণ্য অ্যাসিটাইল-CoA (CoA) বা সাক্সিনাইল CoA ধমনী স্ক্লেরোসিস অ্যাসিড (TCA) চক্রে ট্রাইকারবক্সিলেটের পরিপূরক হতে পারে। আমরা দেখেছি যে BCAA ট্রান্সামিনেজ 1 (BCAT1) এবং BCAT2 উভয়েরই পরিমাণ বৃদ্ধি পেয়েছে। তারা α-ketoglutarate (26) থেকে গ্লুটামেট তৈরি করে BCAA ক্যাটাবোলিজমের প্রথম ধাপকে অনুঘটক করে। ব্রাঞ্চড চেইন কেটো অ্যাসিড ডিহাইড্রোজেনেস (BCKD) কমপ্লেক্স তৈরি করে এমন সমস্ত সাবইউনিট আপরেগুলেটেড (কমপ্লেক্সটি ফলস্বরূপ BCAA কার্বন কঙ্কালের পরবর্তী এবং অপরিবর্তনীয় ডিকারবক্সিলেশনকে অনুঘটক করে) (চিত্র 3A এবং চিত্র S5A)। তবে, বাছাই করা PN-তে BCAA-তে কোনও স্পষ্ট পরিবর্তন পাওয়া যায়নি, যা এই অপরিহার্য অ্যামিনো অ্যাসিডের বর্ধিত কোষীয় গ্রহণ বা TCA চক্রের পরিপূরক হিসাবে অন্যান্য উৎস (গ্লুকোজ বা ল্যাকটিক অ্যাসিড) ব্যবহারের কারণে হতে পারে (চিত্র S5B)। OXPHOS-এর অভাবযুক্ত PN-গুলিতে 8 সপ্তাহ বয়সে গ্লুটামিন পচন এবং ট্রান্সমিনেশন কার্যকলাপ বৃদ্ধি পেয়েছে, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল এনজাইম গ্লুটামিনেজ (GLS) এবং গ্লুটামিন পাইরুভেট ট্রান্সমিনেজ 2 (GPT2) (চিত্র 3, A এবং C) এর আপ-রেগুলেশন দ্বারা প্রতিফলিত হতে পারে। এটি লক্ষণীয় যে GLS-এর আপ-রেগুলেশন স্প্লিসড আইসোফর্ম গ্লুটামিনেজ C (GLS-GAC) এর মধ্যে সীমাবদ্ধ (Mfn2cKO/CTRL-এর পরিবর্তন প্রায় 4.5-গুণ, P = 0.05), এবং ক্যান্সার টিস্যুতে এর নির্দিষ্ট আপ-রেগুলেশন মাইটোকন্ড্রিয়াল জৈবশক্তিকে সমর্থন করতে পারে। (27)।
(A) তাপ মানচিত্রটি 8 সপ্তাহে নির্দিষ্ট রুটের জন্য প্রোটিন স্তরের ভাঁজ পরিবর্তন দেখায়। (B) অ্যান্টি-PCx অ্যান্টিবডি (স্কেল বার, 20 μm) দিয়ে লেবেল করা একটি সেরিবেলার স্লাইসের উদাহরণ। হলুদ তীরটি পুরকিনজে কোষের দেহের দিকে নির্দেশ করে। (C) এথেরোস্ক্লেরোসিসের জন্য একটি গুরুত্বপূর্ণ প্রার্থী হিসাবে চিহ্নিত টাইম কোর্স প্রোটিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ (মাল্টিপল টি-টেস্ট, *FDR <5%; n = 3-5 ইঁদুর)। (D) উপরে: [1-13C] পাইরুভেট ট্রেসারে থাকা লেবেলযুক্ত কার্বনে প্রবেশের বিভিন্ন উপায় দেখানো একটি পরিকল্পিত চিত্র (অর্থাৎ, PDH বা ট্রান্স-আর্টেরিয়াল রুটের মাধ্যমে)। নীচে: বেহালা চার্টটি [1-13C] পাইরুভেট (জোড়া টি-টেস্ট; ** P <0.01) দিয়ে তীব্র সেরিবেলার স্লাইস লেবেল করার পরে অ্যাসপার্টিক অ্যাসিড, সাইট্রিক অ্যাসিড এবং ম্যালিক অ্যাসিডে রূপান্তরিত একক-লেবেলযুক্ত কার্বন (M1) এর শতাংশ দেখায়। (E) নির্দেশিত পথের ব্যাপক সময় ইতিহাস বিশ্লেষণ। ৮ সপ্তাহে শুধুমাত্র P<0.05 সহ প্রোটিন বিবেচনা করুন। ড্যাশড লাইন: কোনও সমন্বয় মান নেই (প্রকরণের দ্বিমুখী বিশ্লেষণ; * P <0.05; *** P <0.001)। ডেটা গড়±SEM হিসাবে প্রকাশ করা হয়।
আমাদের বিশ্লেষণে, BCAA ক্যাটাবোলিজম একটি গুরুত্বপূর্ণ আপ-রেগুলেশন পথ হয়ে উঠেছে। এই তথ্যটি দৃঢ়ভাবে ইঙ্গিত দেয় যে TCA চক্রে প্রবেশকারী বায়ুচলাচল ভলিউম OXPHOS-এর অভাবযুক্ত PN-তে পরিবর্তিত হতে পারে। এটি নিউরোনাল বিপাকীয় পুনর্নির্মাণের একটি প্রধান রূপ হতে পারে, যা গুরুতর OXPHOS কর্মহীনতার রক্ষণাবেক্ষণের সময় নিউরোনাল ফিজিওলজি এবং বেঁচে থাকার উপর সরাসরি প্রভাব ফেলতে পারে। এই অনুমানের সাথে সামঞ্জস্য রেখে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে প্রধান অ্যান্টি-এথেরোস্ক্লেরোটিক এনজাইম PCx আপ-রেগুলেটেড (Mfn2cKO/CTRL প্রায় 1.5 বার পরিবর্তিত হয়; চিত্র 3A), যা পাইরুভেটের অক্সালোএসেটেটে রূপান্তরকে অনুঘটক করে (28), যা মস্তিষ্কের টিস্যুতে বলে মনে করা হয়। এক্সপ্রেশনটি অ্যাস্ট্রোসাইটগুলিতে সীমাবদ্ধ (29, 30)। প্রোটিওমিক্স ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি দেখিয়েছে যে OXPHOS-ঘাটতিযুক্ত PN-তে PCx এক্সপ্রেশন বিশেষভাবে এবং উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে, যেখানে PCx প্রতিক্রিয়া মূলত নিয়ন্ত্রণের সংলগ্ন বার্গম্যান গ্লিয়াল কোষগুলিতে সীমাবদ্ধ ছিল (চিত্র 3B)। PCx-এর পর্যবেক্ষণকৃত আপরেগুলেশন কার্যকরীভাবে পরীক্ষা করার জন্য, আমরা [1-13C] পাইরুভেট ট্রেসার দিয়ে তীব্র সেরিবেলার স্লাইসগুলির চিকিৎসা করেছি। যখন পাইরুভেটকে পাইরুভেট ডিহাইড্রোজেনেস (PDH) দ্বারা জারিত করা হয়েছিল, তখন এর আইসোটোপ লেবেল অদৃশ্য হয়ে গিয়েছিল, কিন্তু যখন পাইরুভেট ভাস্কুলার বিক্রিয়ার মাধ্যমে বিপাকিত হয় তখন এটি TCA চক্রের মধ্যবর্তী অংশে অন্তর্ভুক্ত হয় (চিত্র 3D)। আমাদের প্রোটিওমিক্স ডেটার সমর্থনে, আমরা Mfn2cKO স্লাইসের অ্যাসপার্টিক অ্যাসিডে এই ট্রেসার থেকে প্রচুর সংখ্যক মার্কার লক্ষ্য করেছি, যেখানে সাইট্রিক অ্যাসিড এবং ম্যালিক অ্যাসিডেরও একটি মাঝারি প্রবণতা ছিল, যদিও তা উল্লেখযোগ্য ছিল না (চিত্র 3D)।
মাইটোপার্ক ইঁদুরের ডোপামিন নিউরনে, যাদের মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিসফাংশন ছিল, বিশেষ করে মাইটোকন্ড্রিয়াল ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর A জিন (Tfam) ধ্বংস করার কারণে, PCx এক্সপ্রেশন উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছিল (31), যা ইঙ্গিত করে যে অ্যাসিটোন অ্যাসিড আর্টেরিওস্ক্লেরোসিস রোগের ঘটনা শরীরে নিউরোনাল OXPHOS এর কর্মহীনতার সময় নিয়ন্ত্রিত হয়। এটি লক্ষণীয় যে এটি পাওয়া গেছে যে অনন্য এনজাইম (32-34) যা আর্টেরিওস্ক্লেরোসিসের সাথে যুক্ত নিউরনে প্রকাশিত হতে পারে, OXPHOS এর অভাবযুক্ত PN-তে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছিল, যেমন প্রোপিওনিল-CoA কার্বক্সিলেজ (PCC-A), ম্যালোনিল-CoA প্রোপিওনিল-CoA কে সাক্সিনিল-CoA এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ম্যালিক এনজাইম 3 (ME3) তে রূপান্তরিত করে, যার প্রধান ভূমিকা ম্যালেট থেকে পাইরুভেট পুনরুদ্ধার করা (চিত্র 3, A এবং C) (33, 35)। এছাড়াও, আমরা Pdk3 এনজাইমে উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি পেয়েছি, যা ফসফোরিলেট করে এবং এইভাবে PDH নিষ্ক্রিয় করে (36), যেখানে Pdp1 এনজাইমে কোনও পরিবর্তন সনাক্ত করা যায়নি যা PDH বা PDH এনজাইম কমপ্লেক্সকে সক্রিয় করে (চিত্র 3A)। ধারাবাহিকভাবে, Mern2cKO PN-তে, Ser293 (PDH-এর এনজাইম কার্যকলাপকে বাধা দেওয়ার জন্য পরিচিত) PDH কমপ্লেক্সের পাইরুভেট ডিহাইড্রোজেনেস E1 উপাদানের α1 সাবইউনিট α (PDHE1α) সাবইউনিটের ফসফোরাইলেশন বৃদ্ধি করা হয়েছিল (চিত্র S6C) (চিত্র S6C)। পাইরুভেটের কোনও ভাস্কুলার অ্যাক্সেস নেই।
অবশেষে, আমরা দেখতে পেলাম যে, সক্রিয়করণ প্রক্রিয়া চলাকালীন, সেরিন এবং গ্লাইসিন জৈব সংশ্লেষণের সুপার পাথওয়ে, সম্পর্কিত মাইটোকন্ড্রিয়াল ফোলেট (1C) চক্র এবং প্রোলিন জৈব সংশ্লেষণ (চিত্র 1G এবং চিত্র S5C) উল্লেখযোগ্যভাবে আপ-নিয়ন্ত্রিত হয়। পার্শ্ববর্তী টিস্যুগুলি মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার সাথে সক্রিয় হয় (5-7)। এই প্রোটিওমিক্স ডেটা সমর্থনকারী কনফোকাল বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে OXPHOS অনুপস্থিত PN-তে, 8 সপ্তাহ বয়সী ইঁদুরের সেরিবেলার স্লাইসগুলি মাইটোকন্ড্রিয়াল ফোলেট চক্রের একটি মূল এনজাইম সেরিন হাইড্রোক্সিমিথাইলট্রান্সফেরেজ 2 (SHMT2) এর শিকার হয়েছিল। উল্লেখযোগ্য ইমিউন প্রতিক্রিয়া (চিত্র S5D)। 13টি CU-গ্লুকোজ-ইনকিউবেটেড অ্যাকিউট সেরিবেলার স্লাইসে, বিপাকীয় ট্রেসিং পরীক্ষাগুলি সেরিন এবং প্রোলিন জৈব সংশ্লেষণের আপ-নিয়ন্ত্রণকে আরও নিশ্চিত করেছে, যা নির্দেশ করে যে সেরিন এবং প্রোলিনে কার্বন আইসোফর্মের প্রবাহ বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র S5E)। যেহেতু GLS এবং GPT2 দ্বারা প্রচারিত বিক্রিয়াগুলি গ্লুটামিন থেকে গ্লুটামেটের সংশ্লেষণ এবং গ্লুটামেট এবং α-কেটোগ্লুটারেটের মধ্যে ট্রান্সঅ্যামিনেশনের জন্য দায়ী, তাই তাদের আপরেগুলেশন ইঙ্গিত দেয় যে OXPHOS-ঘাটতিযুক্ত নিউরনগুলিতে গ্লুটামেটের চাহিদা বৃদ্ধি পেয়েছে, এটি প্রোলিনের বর্ধিত জৈব সংশ্লেষণ বজায় রাখার লক্ষ্যে হতে পারে (চিত্র S5C)। এই পরিবর্তনগুলির বিপরীতে, PN-নির্দিষ্ট Mfn2cKO ইঁদুর থেকে সেরিবেলার অ্যাস্ট্রোসাইটের একটি প্রোটিওমিক বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে এই পথগুলি (সমস্ত অ্যান্টিপেরক্সিডেস সহ) প্রকাশে উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হয়নি, এইভাবে প্রমাণিত হয় যে এই বিপাকীয় পুনঃনির্দেশনা অবনমিত PN (চিত্র S6, D থেকে G) এর জন্য নির্বাচনী।
সংক্ষেপে, এই বিশ্লেষণগুলি PN-তে নির্দিষ্ট বিপাকীয় পথের টেম্পোরাল অ্যাক্টিভেশনের উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন ধরণ প্রকাশ করেছে। যদিও অস্বাভাবিক নিউরোনাল মাইটোকন্ড্রিয়াল ফাংশন প্রাথমিক এথেরোস্ক্লেরোসিস এবং 1C পুনর্নির্মাণের দিকে পরিচালিত করতে পারে (চিত্র 3E এবং চিত্র S5C), এবং এমনকি I এবং IV কমপ্লেক্সের প্রকাশে পূর্বাভাসযোগ্য পরিবর্তন, সেরিন ডি নভো সংশ্লেষণের পরিবর্তনগুলি কেবলমাত্র শেষ পর্যায়ে স্পষ্ট হয়ে ওঠে। OXPHOS কর্মহীনতা (চিত্র 3E এবং চিত্র S5C)। এই ফলাফলগুলি একটি ক্রমিক প্রক্রিয়া সংজ্ঞায়িত করে যেখানে স্ট্রেস-প্ররোচিত মাইটোকন্ড্রিয়াল (1C চক্র) এবং সাইটোপ্লাজমিক (সেরিন জৈব সংশ্লেষণ) নিউরোনাল বিপাককে পুনরায় আকার দেওয়ার জন্য TCA চক্রে এথেরোস্ক্লেরোসিসের বৃদ্ধির সাথে সমন্বয়মূলকভাবে প্রতিক্রিয়া দেখায়।
৮ সপ্তাহ বয়সী OXPHOS-ঘাটতিযুক্ত PN গুলি উচ্চ-ফ্রিকোয়েন্সি উত্তেজনা কার্যকলাপ বজায় রাখতে পারে এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার ক্ষতিপূরণ দেওয়ার জন্য উল্লেখযোগ্য বিপাকীয় পুনঃসংযোগের মধ্য দিয়ে যেতে পারে। এই আবিষ্কারটি একটি আকর্ষণীয় সম্ভাবনা তৈরি করে যে এই মুহূর্তেও, এই কোষগুলি নিউরোডিজেনারেশন বিলম্বিত বা প্রতিরোধ করার জন্য থেরাপিউটিক হস্তক্ষেপ গ্রহণ করতে পারে। দেরিতে। আমরা দুটি স্বাধীন হস্তক্ষেপের মাধ্যমে এই সম্ভাবনাটি সমাধান করেছি। প্রথম পদ্ধতিতে, আমরা একটি Cre-নির্ভর অ্যাডেনো-সম্পর্কিত ভাইরাস (AAV) ভেক্টর ডিজাইন করেছি যাতে MFN2 কে OXPHOS-ঘাটতিযুক্ত PN গুলিতে নির্বাচনীভাবে প্রকাশ করা যায় (চিত্র S7A)। AAV এনকোডিং MFN2 এবং ফ্লুরোসেন্ট রিপোর্টার জিন mCherry (Mfn2-AAV) প্রাথমিক নিউরন কালচার ইন ভিট্রোতে যাচাই করা হয়েছিল, যার ফলে MFN2 একটি Cre-নির্ভর পদ্ধতিতে প্রকাশ পেয়েছিল এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল রূপবিদ্যা উদ্ধার করা হয়েছিল, যার ফলে Mfn2cKO নিউরনে নিউরোমিউটেশন প্রতিরোধ করা হয়েছিল (চিত্র S7, B, D এবং E)। এরপর, আমরা ৮ সপ্তাহ বয়সী Mfn2-AAV কে Mfn2cKO এবং নিয়ন্ত্রণকারী ইঁদুরের সেরিবেলার কর্টেক্সে স্টিরিওট্যাকটিকভাবে সরবরাহ করার জন্য ইন ভিভো পরীক্ষা পরিচালনা করেছি এবং ১২ সপ্তাহ বয়সী ইঁদুর বিশ্লেষণ করেছি (চিত্র ৪A)। চিকিৎসা করা Mfn2cKO ইঁদুর মারা গেছে (চিত্র ১, A এবং B) (১৬)। ভিভোতে ভাইরাল ট্রান্সডাকশনের ফলে কিছু সেরিবেলার সার্কেলে PN-এর নির্বাচনী প্রকাশ দেখা গেছে (চিত্র S7, G এবং H)। শুধুমাত্র mCherry (Ctrl-AAV) প্রকাশকারী নিয়ন্ত্রণ AAV-এর ইনজেকশন Mfn2cKO প্রাণীদের নিউরোডিজেনারেশনের মাত্রার উপর কোনও উল্লেখযোগ্য প্রভাব ফেলেনি। বিপরীতে, Mfn2-AAV দিয়ে ট্রান্সডিউস করা Mfn2cKO-এর বিশ্লেষণ PN কোষ স্তরের একটি উল্লেখযোগ্য প্রতিরক্ষামূলক প্রভাব দেখিয়েছে (চিত্র ৪, B এবং C)। বিশেষ করে, নিয়ন্ত্রণ প্রাণীদের (চিত্র ৪, B এবং C, এবং চিত্র S7, H এবং I) থেকে নিউরনের ঘনত্ব প্রায় আলাদা করা যায় না বলে মনে হচ্ছে। MFN1 এর প্রকাশ কিন্তু MFN2 নয়, নিউরোনাল মৃত্যু বাঁচাতে সমানভাবে কার্যকর (চিত্র 4C এবং চিত্র S7, C এবং F), যা নির্দেশ করে যে একটোপিক MFN1 এর প্রকাশ কার্যকরভাবে MFN2 এর অভাব পূরণ করতে পারে। একক PN স্তরে আরও বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে Mfn2-AAV মূলত মাইটোকন্ড্রিয়ায় আল্ট্রাস্ট্রাকচার উদ্ধার করেছে, mtDNA স্তরকে স্বাভাবিক করেছে এবং অ্যান্টি-অ্যাঞ্জিওজেনেসিস মার্কার PCx এর উচ্চ প্রকাশকে বিপরীত করেছে (চিত্র 4, C থেকে E)। বিশ্রামরত অবস্থায় উদ্ধারকৃত Mfn2cKO ইঁদুরের চাক্ষুষ পরিদর্শনে দেখা গেছে যে তাদের ভঙ্গি এবং মোটর লক্ষণগুলি (S1 থেকে S3 পর্যন্ত চলাচল) উন্নত হয়েছে। উপসংহারে, এই পরীক্ষাগুলি দেখায় যে OXPHOS-এর গুরুতর ঘাটতিযুক্ত PN-তে MFN2 এর বিলম্বিত পুনঃপ্রবর্তন mtDNA খরচ বিপরীত করতে এবং এথেরোস্ক্লেরোসিসকে প্ররোচিত করতে যথেষ্ট, যার ফলে অ্যাক্সন অবক্ষয় এবং নিউরোনাল মৃত্যু প্রতিরোধ করা যায়।
(A) নির্দেশিত বিপাকীয় পথ সক্রিয় হলে AAV এনকোডিং MFN2 ইনজেকশনের জন্য পরীক্ষামূলক সময়সূচী দেখানো একটি স্কিম। (B) Mfn2cKO ইঁদুরের 8 সপ্তাহে ট্রান্সডুস করা 12 সপ্তাহ বয়সী সেরিবেলার স্লাইসের প্রতিনিধিত্বমূলক কনফোকাল চিত্র এবং অ্যান্টি-ক্যালবিন্ডিন অ্যান্টিবডি দিয়ে লেবেল করা। ডান: অ্যাক্সন ফাইবারের স্কেলিং। অ্যাক্সন জুমের স্কেল 450 এবং 75 μm। (C) বাম: AAV ট্রান্সডাকশন লুপে (AAV+) পুরকিনজে কোষের ঘনত্বের পরিমাণ নির্ধারণ (ভ্যারিয়েন্সের একমুখী বিশ্লেষণ; n = 3 ইঁদুর)। ডান: 12 সপ্তাহে ট্রান্সডুস করা PN-তে mtDNA ফোকাস বিশ্লেষণ (আনপেয়ারড টি-টেস্ট; তিনটি ইঁদুর থেকে n = 6 কোষ)। * P <0.05; ** P <0.01. (D) নির্দেশিত ভাইরাল ভেক্টর দিয়ে ট্রান্সডুস করা Mfn2cKO সেরিবেলার বিভাগের PN-এর প্রতিনিধিত্বমূলক ট্রান্সমিশন ইলেকট্রন মাইক্রোগ্রাফ। গোলাপী মুখোশটি ডেনড্রাইট দ্বারা দখলকৃত অঞ্চলটি চিত্রিত করে এবং হলুদ বিন্দুযুক্ত বর্গক্ষেত্রটি ডানদিকে প্রদত্ত জুমটি চিত্রিত করে; n নিউক্লিয়াসকে প্রতিনিধিত্ব করে। স্কেল বার, 1μm। (E) 12 সপ্তাহে ট্রান্সডিউস করা PN-তে PCx স্টেনিংয়ের একটি উদাহরণ দেখায়। স্কেল বার, 20μm। OE, ওভারএক্সপ্রেশন; FC, ভাঁজ পরিবর্তন।
অবশেষে, আমরা OXPHOS কর্মহীনতার অভিজ্ঞতা সম্পন্ন PN-দের মধ্যে পেরোক্সিডেস-প্ররোচিত কোষের বেঁচে থাকার গুরুত্ব অনুসন্ধান করেছি। আমরা বিশেষভাবে মাউস PCx mRNA (AAV-shPCx) লক্ষ্য করে mCherry এনকোডিং AAV-shRNA (ছোট চুলের পিন RNA) তৈরি করেছি এবং Mfn2cKO ইঁদুরের সেরিবেলামে ভাইরাস বা এর স্ক্র্যাম্বলড নিয়ন্ত্রণ (AAV-scr) ইনজেকশন দিয়েছি। বয়সের চতুর্থ সপ্তাহে (চিত্র 5A) ইনজেকশনটি করা হয়েছিল (যখন PCx এক্সপ্রেশন বৃদ্ধি পেয়েছিল (চিত্র 3C) এবং PN কোষ স্তর এখনও অক্ষত ছিল (চিত্র 1A) সেই সময়কালে কার্যকর PCx নকডাউন অর্জনের জন্য। এটি লক্ষণীয় যে PCx (চিত্র S8A) কে ছিটকে দেওয়ার ফলে PN মৃত্যুর উল্লেখযোগ্য ত্বরণ ঘটে, যা সংক্রামিত রিং (চিত্র 5, B এবং C) পর্যন্ত সীমাবদ্ধ। PCx আপ-রেগুলেশন দ্বারা সৃষ্ট বিপাকীয় প্রভাবের প্রক্রিয়া বোঝার জন্য, আমরা PCx নকডাউন এবং AAV-মধ্যস্থতাযুক্ত অপটিক্যাল বায়োসেন্সর Grx1-roGFP2 একযোগে প্রকাশের পরে PN-এর রেডক্স অবস্থা অধ্যয়ন করেছি (চিত্র S8, B থেকে D) পেপটাইড রেডক্স সম্ভাবনার আপেক্ষিক পরিবর্তন মূল্যায়ন করার জন্য। তারপর, আমরা FLIM অবস্থা যাচাই করার পরে সাইটোপ্লাজমিক রেডক্স অবস্থার সম্ভাব্য পরিবর্তন সনাক্ত করতে 7 সপ্তাহ বয়সী Mfn2cKO বা নিয়ন্ত্রণ লিটারমেটদের তীব্র মস্তিষ্কের টুকরোগুলিতে দ্বি-ফোটন ফ্লুরোসেন্স লাইফটাইম ইমেজিং মাইক্রোস্কোপি (FLIM) সম্পাদন করেছি (চিত্র S8, E থেকে G)। বিশ্লেষণে PCx এক্সপ্রেশনের অভাবযুক্ত একক Mfn2cKO PN-এর জারণ অবস্থার উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি দেখানো হয়েছে, যা নিয়ন্ত্রণ নিউরন বা Mfn2cKO PN-এর থেকে আলাদা যা শুধুমাত্র স্ক্র্যাম্বলড shRNA প্রকাশ করে (চিত্র 5, D এবং E)। যখন PCx এক্সপ্রেশন ডাউন-রেগুলেটেড করা হয়েছিল, তখন Mfn2cKO PN-এর শতাংশ অত্যন্ত জারিত অবস্থা প্রদর্শনকারী তিন গুণেরও বেশি বৃদ্ধি পেয়েছিল (চিত্র 5E), যা ইঙ্গিত করে যে PCx আপ-রেগুলেশন অবক্ষয়িত নিউরনের রেডক্স ক্ষমতা বজায় রেখেছিল।
(A) নির্দেশিত বিপাকীয় পথ সক্রিয় হলে AAV এনকোডিং shPCx ইনজেকশনের জন্য পরীক্ষামূলক সময়সূচী দেখানো একটি স্কিম। (B) Mfn2cKO ইঁদুরের 8 সপ্তাহ বয়সী সেরিবেলার অংশের প্রতিনিধি কনফোকাল ছবি 4 সপ্তাহে অ্যান্টি-ক্যালসিনুরিন অ্যান্টিবডি দিয়ে ট্রান্সডুস করা এবং লেবেল করা। স্কেল বার, 450μm। (C) AAV-ট্রান্সডুসড লুপে পুরকিনজে কোষের ঘনত্বের পরিমাণ নির্ধারণ (ভ্যারিয়েন্সের একমুখী বিশ্লেষণ; n = 3 থেকে 4 ইঁদুর)। ডেটা গড় ±SEM হিসাবে প্রকাশ করা হয়; ***P<0.001। (D) প্রতিনিধি FLIM ছবিটি নির্দিষ্ট পরীক্ষামূলক অবস্থার অধীনে 7 সপ্তাহ বয়সী PN প্রকাশকারী গ্লুটাথিয়ন রেডক্স সেন্সর Grx1-roGFP2 এর গড় আয়ু দেখায়। LUT (লুক-আপ টেবিল) অনুপাত: বেঁচে থাকার সময় ব্যবধান (পিকোসেকেন্ডে)। স্কেল বার, 25μm। (E) হিস্টোগ্রামটি (D) থেকে Grx1-roGFP2 লাইফটাইম মানের বন্টন দেখায় (n=158 থেকে 368 কোষ পর্যন্ত প্রতিটি অবস্থার অধীনে দুটি ইঁদুরে)। প্রতিটি হিস্টোগ্রামের উপরে পাই চার্ট: উল্লেখযোগ্যভাবে দীর্ঘ (লাল, জারিত) বা ছোট (নীল, হ্রাসপ্রাপ্ত) আয়ুষ্কাল মান সহ কোষের সংখ্যা দেখায়, যা CTRL-AAV-scr-এ গড় আয়ুষ্কাল মানের 1 SD অতিক্রম করে। (F) প্রস্তাবিত মডেলটি নিউরোনাল PCx-এর আপরেগুলেশনের প্রতিরক্ষামূলক প্রভাব দেখায়।
সামগ্রিকভাবে, আমরা এখানে যে তথ্য প্রদান করেছি তা দেখায় যে MFN2 এর পুনঃপ্রকাশ গুরুতর OXPHOS ঘাটতি, তীব্র mtDNA হ্রাস এবং অত্যন্ত অস্বাভাবিক ইস্টা-সদৃশ রূপবিদ্যা সহ উন্নত PN কে সম্পূর্ণরূপে উদ্ধার করতে পারে, যার ফলে উন্নত রোগেও ক্রমাগত অগ্রগতি নিশ্চিত হয়। নিউরোডিজেনারেশন কোষের মৃত্যুর পূর্ববর্তী পর্যায়ের বিপরীত প্রমাণ প্রদান করে। বিপাকীয় নমনীয়তার এই মাত্রাটি নিউরনের অ্যাথেরোস্ক্লেরোসিস (TCA চক্রের পুনর্নির্মাণ) প্ররোচিত করার ক্ষমতা দ্বারা আরও জোর দেওয়া হয়, যা OXPHOS ঘাটতিযুক্ত PN গুলিতে PCx প্রকাশকে বাধা দেয় এবং কোষের মৃত্যুকে বৃদ্ধি করে, যার ফলে একটি প্রতিরক্ষামূলক ভূমিকা পালন করে (চিত্র 5F)।
এই গবেষণায়, আমরা প্রমাণ প্রদান করেছি যে OXPHOS কর্মহীনতার প্রতি PN-এর প্রতিক্রিয়া বিপাকীয় প্রোগ্রাম দ্বারা সক্রিয় ডিফারেনশিয়াল অ্যাক্টিভেশন পথের মাধ্যমে ধীরে ধীরে TCA চক্র এথেরোস্ক্লেরোসিসে রূপান্তরিত হয়। আমরা অনেক পরিপূরক পদ্ধতির মাধ্যমে প্রোটিওমিক বিশ্লেষণ নিশ্চিত করেছি এবং প্রকাশ করেছি যে যখন গুরুতর মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার দ্বারা চ্যালেঞ্জ করা হয়, তখন নিউরনের বিপাকীয় স্থিতিস্থাপকতার একটি পূর্ব-অজানা রূপ থাকে। আমাদের অবাক করার বিষয় হল, পুরো পুনর্নির্মাণ প্রক্রিয়াটি অগত্যা নিউরোডিজেনারেশনের সাথে ধীরে ধীরে এবং অপরিবর্তনীয়ভাবে টার্মিনাল বিপাকীয় অবস্থা চিহ্নিত করে না, তবে আমাদের তথ্য থেকে জানা যায় যে এটি কোষের মৃত্যুর আগের পর্যায়েও কার্যকরী ক্ষতিপূরণ প্রক্রিয়ার ক্ষেত্রে একটি রক্ষণাবেক্ষণ নিউরন গঠন করতে পারে। এই আবিষ্কার ইঙ্গিত দেয় যে নিউরনের শরীরে বিপাকীয় প্লাস্টিকতার যথেষ্ট মাত্রা রয়েছে। এই তথ্য প্রমাণ করে যে MFN2-এর পরবর্তী পুনঃপ্রবর্তন মূল বিপাকীয় মার্কারগুলির প্রকাশকে বিপরীত করতে পারে এবং PN অবক্ষয় রোধ করতে পারে। বিপরীতে, এটি এথেরোস্ক্লেরোসিসকে বাধা দেয় এবং স্নায়ুকে ত্বরান্বিত করে। ট্রান্সসেক্সুয়াল।
আমাদের গবেষণায় সবচেয়ে আকর্ষণীয় আবিষ্কারগুলির মধ্যে একটি হল যে OXPHOS-এর অভাবযুক্ত PNগুলি বিশেষভাবে ধমনী স্ক্লেরোসিসকে উদ্দীপিত করে এমন এনজাইমগুলিকে আপ-রেগুলেট করে TCA চক্র বিপাক পরিবর্তন করতে পারে। বিপাকীয় পুনর্বিন্যাস ক্যান্সার কোষের একটি সাধারণ বৈশিষ্ট্য, যার মধ্যে কিছু TCA চক্র মধ্যস্থতাকারীদের পরিপূরক করার জন্য গ্লুটামিনের উপর নির্ভর করে হ্রাসকারী সমতুল্য তৈরি করে, যা শ্বাসযন্ত্রের শৃঙ্খলকে চালিত করে এবং লিপিড এবং নিউক্লিওটাইড জৈব সংশ্লেষণ পূর্বসূরীদের উৎপাদন বজায় রাখে (39, 40)। সাম্প্রতিক একটি গবেষণায় দেখা গেছে যে OXPHOS কর্মহীনতার সম্মুখীন পেরিফেরাল টিস্যুতে, গ্লুটামিন/গ্লুটামেট বিপাকের পুনঃসংযোগও একটি বিশিষ্ট বৈশিষ্ট্য (5, 41), যেখানে TCA চক্রে গ্লুটামিন প্রবেশের দিকটি OXPHOS আঘাতের তীব্রতার উপর নির্ভর করে (41)। যাইহোক, শরীরে নিউরোনাল বিপাকীয় প্লাস্টিসিটির কোনও মিল এবং রোগের প্রেক্ষাপটে এর সম্ভাব্য প্রাসঙ্গিকতার স্পষ্ট প্রমাণের অভাব রয়েছে। সাম্প্রতিক একটি ইন ভিট্রো গবেষণায়, প্রাথমিক কর্টিকাল নিউরনগুলি নিউরোট্রান্সমিশনের জন্য গ্লুটামেট পুলগুলিকে একত্রিত করতে দেখানো হয়েছে, যার ফলে বিপাকীয় চাপের পরিস্থিতিতে অক্সিডেটিভ বিপাক এবং এথেরোস্ক্লেরোসিসকে উৎসাহিত করে (42)। এটি লক্ষণীয় যে TCA চক্র এনজাইম সাক্সিনেট ডিহাইড্রোজেনেজের ফার্মাকোলজিকাল ইনহিবিশনের অধীনে, পাইরুভেট কার্বক্সিলেশন কালচারড সেরিবেলার গ্রানুল নিউরনে অক্সালোএসিটেটের সংশ্লেষণ বজায় রাখে বলে মনে করা হয় (34)। তবে, মস্তিষ্কের টিস্যুতে (যেখানে এথেরোস্ক্লেরোসিস মূলত অ্যাস্ট্রোসাইটের মধ্যে সীমাবদ্ধ বলে মনে করা হয়) এই প্রক্রিয়াগুলির শারীরবৃত্তীয় প্রাসঙ্গিকতার এখনও গুরুত্বপূর্ণ শারীরবৃত্তীয় তাৎপর্য রয়েছে (43)। এই ক্ষেত্রে, আমাদের তথ্য দেখায় যে শরীরে OXPHOS দ্বারা ক্ষতিগ্রস্ত PN গুলি BCAA অবক্ষয় এবং পাইরুভেট কার্বক্সিলেশনে স্যুইচ করা যেতে পারে, যা TCA পুল ইন্টারমিডিয়েটের পরিপূরকের দুটি প্রধান উৎস। যদিও নিউরোনাল শক্তি বিপাকে BCAA ক্যাটাবোলিজমের সম্ভাব্য অবদান প্রস্তাব করা হয়েছে, নিউরোট্রান্সমিশনের জন্য গ্লুটামেট এবং GABA এর ভূমিকা ছাড়াও (44), ভিভোতে এই প্রক্রিয়াগুলির জন্য এখনও কোনও প্রমাণ নেই। অতএব, এটি অনুমান করা সহজ যে অকার্যকর PN গুলি স্বয়ংক্রিয়ভাবে অ্যাথেরোস্ক্লেরোসিস বৃদ্ধি করে আত্তীকরণ প্রক্রিয়া দ্বারা চালিত TCA ইন্টারমিডিয়েটের ব্যবহারের জন্য ক্ষতিপূরণ দিতে পারে। বিশেষ করে, অ্যাসপার্টিক অ্যাসিডের বর্ধিত চাহিদা বজায় রাখার জন্য PCx-এর আপরেগুলেশনের প্রয়োজন হতে পারে, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার সাথে প্রজননকারী কোষগুলিতে প্রস্তাবিত হয় (45)। তবে, আমাদের বিপাক বিশ্লেষণ Mfn2cKO PN-তে অ্যাসপার্টিক অ্যাসিডের স্থির-অবস্থার স্তরে কোনও উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন প্রকাশ করেনি (চিত্র S6A), যা সম্ভবত প্রজননকারী কোষ এবং পোস্ট-মাইটোটিক নিউরনের মধ্যে অ্যাসপার্টিক অ্যাসিডের বিভিন্ন বিপাকীয় ব্যবহারকে প্রতিফলিত করে। যদিও ভিভোতে অকার্যকর নিউরনে PCx আপরেগুলেশনের সঠিক প্রক্রিয়াটি এখনও চিহ্নিত করা হয়নি, আমরা দেখিয়েছি যে এই অকাল প্রতিক্রিয়া নিউরনের রেডক্স অবস্থা বজায় রাখার ক্ষেত্রে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে, যা সেরিবেলার স্লাইসের উপর FLIM পরীক্ষায় প্রদর্শিত হয়েছিল। বিশেষ করে, PCx-কে আপ-রেগুলেশন থেকে PN-কে প্রতিরোধ করলে আরও জারিত অবস্থা হতে পারে এবং কোষের মৃত্যু ত্বরান্বিত হতে পারে। BCAA অবক্ষয়ের সক্রিয়করণ এবং পাইরুভেটের কার্বক্সিলেশন মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার পেরিফেরাল টিস্যুগুলিকে চিহ্নিত করার উপায় নয় (7)। অতএব, এগুলি OXPHOS-ঘাটতিযুক্ত নিউরনের একটি অগ্রাধিকার বৈশিষ্ট্য বলে মনে হয়, এমনকি একমাত্র বৈশিষ্ট্য না হলেও, যা নিউরোডিজেনারেশনের জন্য গুরুত্বপূর্ণ।
সেরিবেলার রোগ হল একটি ভিন্নধর্মী ধরণের নিউরোডিজেনারেটিভ রোগ যা সাধারণত অ্যাটাক্সিয়া হিসাবে প্রকাশ পায় এবং প্রায়শই পিএনগুলিকে ক্ষতিগ্রস্ত করে (46)। এই নিউরন জনসংখ্যা মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার জন্য বিশেষভাবে ঝুঁকিপূর্ণ কারণ ইঁদুরের মধ্যে তাদের নির্বাচনী অবক্ষয় মানুষের স্পিনোসেরেবেলার অ্যাটাক্সিয়াকে চিহ্নিত করে এমন অনেক মোটর লক্ষণ পুনরুত্পাদন করার জন্য যথেষ্ট (16, 47, 48)। প্রতিবেদন অনুসারে, একটি মিউট্যান্ট জিন সহ একটি ট্রান্সজেনিক মাউস মডেল মানুষের স্পিনোসেরেবেলার অ্যাটাক্সিয়ার সাথে যুক্ত এবং এতে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা রয়েছে (49, 50), যা PNPH-তে OXPHOS ঘাটতির পরিণতি অধ্যয়নের গুরুত্বের উপর জোর দেয়। অতএব, এই অনন্য নিউরন জনসংখ্যাকে কার্যকরভাবে বিচ্ছিন্ন করা এবং অধ্যয়ন করা বিশেষভাবে উপযুক্ত। যাইহোক, যেহেতু পিএনগুলি চাপের প্রতি অত্যন্ত সংবেদনশীল এবং সমগ্র সেরিবেলার কোষ জনসংখ্যার কম অনুপাতের জন্য দায়ী, তাই অনেক ওমিক্স-ভিত্তিক গবেষণার জন্য, সম্পূর্ণ কোষ হিসাবে তাদের নির্বাচনী পৃথকীকরণ এখনও একটি চ্যালেঞ্জিং দিক। যদিও অন্যান্য কোষের ধরণের (বিশেষ করে প্রাপ্তবয়স্ক টিস্যু) দূষণের সম্পূর্ণ অভাব অর্জন করা প্রায় অসম্ভব, তবুও আমরা FACS-এর সাথে একটি কার্যকর বিচ্ছিন্নতা পদক্ষেপ একত্রিত করে ডাউনস্ট্রিম প্রোটিওমিক্স বিশ্লেষণের জন্য পর্যাপ্ত সংখ্যক কার্যকর নিউরন অর্জন করেছি এবং সমগ্র সেরিবেলামের বিদ্যমান ডেটা সেটের তুলনায় আমাদের যথেষ্ট উচ্চ প্রোটিন কভারেজ (প্রায় 3000 প্রোটিন) রয়েছে (51)। সম্পূর্ণ কোষের কার্যকারিতা সংরক্ষণ করে, আমরা এখানে যে পদ্ধতিটি প্রদান করি তা আমাদের কেবল মাইটোকন্ড্রিয়ায় বিপাকীয় পথের পরিবর্তনগুলি পরীক্ষা করতে দেয় না, বরং এর সাইটোপ্লাজমিক প্রতিরূপের পরিবর্তনগুলিও পরীক্ষা করতে দেয়, যা কোষের ধরণকে সমৃদ্ধ করার জন্য মাইটোকন্ড্রিয়াল ঝিল্লি ট্যাগ ব্যবহারের পরিপূরক। জটিল টিস্যুতে মাইটোকন্ড্রিয়ার সংখ্যার জন্য নতুন পদ্ধতি (52, 53)। আমরা যে পদ্ধতিটি বর্ণনা করি তা কেবল পুরকিনজে কোষের অধ্যয়নের সাথে সম্পর্কিত নয়, তবে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার অন্যান্য মডেল সহ রোগাক্রান্ত মস্তিষ্কে বিপাকীয় পরিবর্তনগুলি মোকাবেলা করার জন্য যেকোনো ধরণের কোষে সহজেই প্রয়োগ করা যেতে পারে।
অবশেষে, আমরা এই বিপাকীয় পুনর্বিন্যাস প্রক্রিয়ার সময় একটি থেরাপিউটিক উইন্ডো সনাক্ত করেছি যা কোষীয় চাপের মূল লক্ষণগুলিকে সম্পূর্ণরূপে বিপরীত করতে পারে এবং নিউরোনাল অবক্ষয় রোধ করতে পারে। অতএব, এখানে বর্ণিত পুনর্নির্মাণের কার্যকরী প্রভাবগুলি বোঝা মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার সময় নিউরোনাল কার্যকারিতা বজায় রাখার সম্ভাব্য চিকিৎসা সম্পর্কে মৌলিক অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করতে পারে। অন্যান্য স্নায়বিক রোগের ক্ষেত্রে এই নীতির প্রযোজ্যতা সম্পূর্ণরূপে প্রকাশ করার জন্য অন্যান্য মস্তিষ্কের কোষের ধরণের শক্তি বিপাকের পরিবর্তনগুলি বিশ্লেষণ করার লক্ষ্যে ভবিষ্যতের গবেষণা প্রয়োজন।
MitoPark ইঁদুরের বর্ণনা আগেও দেওয়া হয়েছে (31)। LoxP-এর সাথে Mfn2 জিনের C57BL/6N ইঁদুরের বর্ণনা আগেও দেওয়া হয়েছে (18) এবং L7-Cre ইঁদুরের সাথে ক্রস করা হয়েছে (23)। ফলস্বরূপ দ্বিগুণ ভিন্নধর্মী বংশধরদেরকে Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) এর জন্য Purkinje-নির্দিষ্ট জিন নকআউট তৈরি করার জন্য হোমোজাইগাস Mfn2loxP/Mfn2loxP ইঁদুরের সাথে ক্রস করা হয়েছিল। মিলনের একটি উপসেটে, অতিরিক্ত ক্রসিংয়ের মাধ্যমে Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP অ্যালিল (stop-mtYFP) প্রবর্তন করা হয়েছিল (20)। সমস্ত প্রাণীর পদ্ধতি ইউরোপীয়, জাতীয় এবং প্রাতিষ্ঠানিক নির্দেশিকা অনুসারে সম্পাদিত হয়েছিল এবং জার্মানির নর্থ রাইন-ওয়েস্টফালিয়ার উমওয়েল্ট এবং ভার্ব্রুচারশুটজের ল্যান্ডেসামটফুরনাটুর দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল। প্রাণীর কাজ ইউরোপীয় ফেডারেশন অফ ল্যাবরেটরি অ্যানিমেল সায়েন্সেস অ্যাসোসিয়েশনের নির্দেশিকাও অনুসরণ করে।
গর্ভবতী মহিলার জরায়ুর স্থানচ্যুতিতে চেতনানাশক দ্রবণ দেওয়ার পর, ইঁদুরের ভ্রূণকে আলাদা করা হয় (E13)। কর্টেক্সটি হ্যাঙ্কসের ব্যালেন্সড সল্ট সলিউশন (HBSS) দিয়ে 10 mM হেপিস দিয়ে ছিন্ন করা হয়েছিল এবং ডালবেকোর মডিফাইড ঈগলস মিডিয়ামে প্যাপেইন (20 U/ml) এবং সিস্টাইন (1μg/ml) দিয়ে প্রেরণ করা হয়েছিল। টিস্যুটিকে DMEM-এ ইনকিউবেট করুন এবং এনজাইমেটিক হজমের মাধ্যমে এটিকে বিচ্ছিন্ন করুন। Ml) 37°C তাপমাত্রায় 20 মিনিটের জন্য, এবং তারপর 10% ভ্রূণ বোভাইন সিরাম দিয়ে পরিপূরক DMEM-এ যান্ত্রিকভাবে মিশ্রিত করা হয়েছিল। কোষগুলিকে পলিসাইন দিয়ে লেপা কাচের কভারস্লিপে প্রতি 6 সেমি কালচার ডিশে 2×106 ঘনত্বে বা ইমেজিং বিশ্লেষণের জন্য 0.5×105 কোষ/cm2 ঘনত্বে বীজ দেওয়া হয়েছিল। 4 ঘন্টা পরে, মাধ্যমটি 1% B27 সম্পূরক এবং 0.5 mM গ্লুটাম্যাক্স ধারণকারী নিউরোবাসাল সিরাম-মুক্ত মাধ্যমের সাথে প্রতিস্থাপিত করা হয়েছিল। এরপর পরীক্ষা জুড়ে নিউরনগুলিকে ৩৭°C এবং ৫% CO2 এ বজায় রাখা হয়েছিল এবং সপ্তাহে একবার খাওয়ানো হয়েছিল। ইন ভিট্রো পুনর্মিলন প্ররোচিত করার জন্য, ইন ভিট্রোর দ্বিতীয় দিনে নিম্নলিখিত AAV9 ভাইরাস ভেক্টরের 3μl (24-ওয়েল কালচার ডিশ) বা 0.5μl (24-ওয়েল প্লেট) ব্যবহার করা হয়েছিল: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, ক্যাটালগ নম্বর 105530-AAV9) এবং AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, ক্যাটালগ নম্বর 105545-AAV9)।
মাউস Mfn1 এবং Mfn2 পরিপূরক DNA (যথাক্রমে Addgene plasmid #23212 এবং #23213 থেকে প্রাপ্ত) C-টার্মিনাসে V5 সিকোয়েন্স (GKPIPNPLLGLDST) দিয়ে চিহ্নিত করা হয়েছে এবং T2A সিকোয়েন্সের মাধ্যমে ফ্রেমে mCherry এর সাথে মিশে গেছে। Grx1-roGFP2 হল হাইডেলবার্গ TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) এর একটি উপহার। প্রচলিত ক্লোনিং পদ্ধতি ব্যবহার করে tdTomato ক্যাসেট প্রতিস্থাপন করে, ক্যাসেটটিকে pAAV-CAG-FLEX-tdTomato ব্যাকবোনে (অ্যাডজিন রেফারেন্স নম্বর 28306) সাবক্লোন করা হয়েছিল যাতে pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 এবং pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 ভেক্টর তৈরি করা যায়। নিয়ন্ত্রণ ভেক্টর pAAV-CAG-FLEX-mCherry তৈরি করতে একই ধরণের কৌশল ব্যবহার করা হয়েছিল। AAV-shPCx গঠন তৈরি করার জন্য, একটি প্লাজমিড AAV ভেক্টর (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) প্রয়োজন, যাতে shRNA টার্গেটিং মাউস PCx (5′CTTTCGCTTAAGGTGCTAAACTCAGGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) এনকোডিং ডিএনএ সিকোয়েন্স থাকে। U6 প্রোমোটারের নিয়ন্ত্রণে, mCherry CMV প্রোমোটারের নিয়ন্ত্রণে ব্যবহৃত হয়। সহায়ক AAV ভেক্টরগুলির উৎপাদন প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী (সেল বায়োল্যাবস) অনুসারে করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, ক্যালসিয়াম ফসফেট পদ্ধতি ব্যবহার করে 293AAV কোষ-T2A-MFN1-V5), mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) অথবা Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) কোডিং জিনের ক্ষণস্থায়ী স্থানান্তর, সেইসাথে AAV1 ক্যাপসিড প্রোটিন এবং আনুষঙ্গিক প্রোটিন প্যাকেজিং প্লাজমিড প্লাজমিড কোডিং করে এমন একটি ট্রান্সফার প্লাজমিড ব্যবহার করুন। শুকনো বরফ/ইথানল স্নানে ফ্রিজ-থো চক্র এবং ফসফেট বাফার স্যালাইনে (PBS) কোষগুলিকে লিজ করে অপরিশোধিত ভাইরাস সুপারন্যাট্যান্ট পাওয়া যায়। AAV ভেক্টরটি বিচ্ছিন্ন আয়োডিক্সানল গ্রেডিয়েন্ট আল্ট্রাসেন্ট্রিফিউগেশন (32,000 rpm এবং 4°C তাপমাত্রায় 24 ঘন্টা) দ্বারা বিশুদ্ধ করা হয়েছিল এবং একটি Amicon ultra-15 সেন্ট্রিফিউগাল ফিল্টার ব্যবহার করে ঘনীভূত করা হয়েছিল। AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 জিনোম কপি (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX এর জিনোম টাইটার পূর্বে বর্ণিত (54) হিসাবে ছিল, রিয়েল-টাইম পরিমাণগত PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) এবং AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল।
প্রাথমিক নিউরনগুলিকে বরফ-ঠান্ডা 1x PBS-এ স্ক্র্যাপ করে, পেলেট করা হয়েছিল এবং তারপর 0.5% Triton X-100 / 0.5% সোডিয়াম ডিঅক্সিকোলেট/PBS লাইসিস বাফারে ফসফেটেজ এবং প্রোটিজ ইনহিবিটর (রোশে) ধারণকারী সমজাত করা হয়েছিল। প্রোটিনের পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল বাইসিনচোনিনিক অ্যাসিড অ্যাসে (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে। এরপর প্রোটিনগুলিকে SDS-পলিয়াক্রাইমাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল এবং তারপরে একটি পলিভিনাইলিডিন ফ্লোরাইড মেমব্রেনে (GE হেলথকেয়ার) ব্লট করা হয়েছিল। অ-নির্দিষ্ট স্থানগুলিকে ব্লক করুন এবং TBST (Tween সহ Tris-buffered স্যালাইন) 5% দুধে প্রাথমিক অ্যান্টিবডি (বিস্তারিত জানার জন্য টেবিল S1 দেখুন) দিয়ে ইনকিউবেট করুন, ওয়াশিং স্টেপ এবং TBST ইনকিউবেটে সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি। +4°C তাপমাত্রায় রাতারাতি প্রাথমিক অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউবেট করুন। ধোয়ার পরে, ঘরের তাপমাত্রায় 2 ঘন্টার জন্য সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি প্রয়োগ করুন। পরবর্তীকালে, একটি অ্যান্টি-β-অ্যাক্টিন অ্যান্টিবডি দিয়ে একই ব্লট ইনকিউবেট করে, একই লোডিং নিশ্চিত করা হয়েছিল। কেমিলুমিনেসেন্সে রূপান্তর করে এবং কেমিলুমিনেসেন্স বৃদ্ধি করে সনাক্তকরণ (জিই হেলথকেয়ার)।
কাচের কভারস্লিপে পূর্বে বীজযুক্ত নিউরনগুলিকে নির্দিষ্ট সময়ে 4% প্যারাফর্মালডিহাইড (PFA)/PBS দিয়ে ঘরের তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য স্থির করা হয়েছিল। কভারস্লিপগুলিকে প্রথমে 0.1% ট্রাইটন X-100/PBS দিয়ে ঘরের তাপমাত্রায় 5 মিনিটের জন্য প্রবেশ করানো হয়, এবং তারপর ব্লকিং বাফারে [3% বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন (BSA)/PBS] রাখা হয়। দ্বিতীয় দিনে, কভারস্লিপগুলিকে ব্লকিং বাফার দিয়ে ধুয়ে উপযুক্ত ফ্লুরোফোর-কনজুগেটেড সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দিয়ে ঘরের তাপমাত্রায় 2 ঘন্টা ইনকিউবেট করা হয়; অবশেষে, নমুনাগুলিকে 4′,6-ডায়ামিডিনো-2 দিয়ে PBS-এ পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে ধুয়ে -ফেনিলিনডোল (DAPI) কাউন্টারস্টেইন করা হয় এবং তারপর অ্যাকোয়া-পলি/মাউন্ট দিয়ে মাইক্রোস্কোপ স্লাইডে স্থির করা হয়।
পুরুষ এবং মহিলা ইঁদুরদের (পুরুষ) কেটামিন (১৩০ মিলিগ্রাম/কেজি) এবং জাইলাজিন (১০ মিলিগ্রাম/কেজি) ইন্ট্রাপেরিটোনিয়াল ইনজেকশন দিয়ে চেতনানাশক করা হয়েছিল এবং কারপ্রোফেন অ্যানালজেসিক (৫ মিলিগ্রাম/কেজি) দিয়ে ত্বকের নিচের দিকে দেওয়া হয়েছিল, এবং একটি উষ্ণ প্যাড দিয়ে সজ্জিত একটি স্টেরিওট্যাকটিক যন্ত্রে (কপফ) স্থাপন করা হয়েছিল। মাথার খুলিটি উন্মুক্ত করুন এবং একটি ডেন্টাল ড্রিল ব্যবহার করে মিস হাড়ের সাথে সম্পর্কিত সেরিবেলার কর্টেক্সের অংশটি পাতলা করুন (ল্যাম্বডা থেকে: লেজ ১.৮, পার্শ্বীয় ১, লোবিউল IV এবং V এর সাথে সম্পর্কিত)। নীচের ভাস্কুলেচার ব্যাহত না হওয়ার জন্য মাথার খুলিতে সাবধানে একটি ছোট গর্ত তৈরি করতে একটি বাঁকা সিরিঞ্জের সুই ব্যবহার করুন। তারপর পাতলা টানা কাচের কৈশিকটি ধীরে ধীরে মাইক্রো-হোলে প্রবেশ করানো হয় (ডুরা ম্যাটারের ভেন্ট্রাল পাশে -1.3 থেকে -1 পর্যন্ত), এবং 200 থেকে 300 nl AAV ম্যানুয়াল সিরিঞ্জ (Narishige) দিয়ে মাইক্রো-ইনজেক্টর (Narishige) এ কয়েকবার কম চাপে 10 থেকে 20 মিনিটের জানালায় ইনজেক্ট করা হয়। ইনফিউশনের পরে, ভাইরাসটি সম্পূর্ণরূপে ছড়িয়ে পড়ার জন্য আরও 10 মিনিটের জন্য কৈশিকটি রাখুন। কৈশিকগুলি সরিয়ে নেওয়ার পরে, ক্ষতের প্রদাহ কমাতে এবং প্রাণীটিকে পুনরুদ্ধার করতে ত্বক সাবধানে সেলাই করা হয়। অস্ত্রোপচারের পরে বেশ কয়েক দিন ধরে প্রাণীদের ব্যথানাশক (ক্যাসপোফেন) দিয়ে চিকিৎসা করা হয়েছিল, এই সময়ের মধ্যে তাদের শারীরিক অবস্থা সাবধানে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল এবং তারপরে নির্দিষ্ট সময়ে তাদের euthanized করা হয়েছিল। সমস্ত প্রক্রিয়া ইউরোপীয়, জাতীয় এবং প্রাতিষ্ঠানিক নির্দেশিকা অনুসারে পরিচালিত হয়েছিল এবং জার্মানির নর্থ রাইন-ওয়েস্টফালিয়ার উমওয়েল্ট এবং ভার্ব্রুচারশুটজের ল্যান্ডেসামটফুরনাটুর দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল।
প্রাণীদের কেটামিন (১০০ মিলিগ্রাম/কেজি) এবং জাইলাজিন (১০ মিলিগ্রাম/কেজি) দিয়ে চেতনানাশক দেওয়া হয়েছিল, এবং প্রথমে ০.১ এমবিএস এবং তারপর পিবিএস-এ ৪% পিএফএ দিয়ে হৃদপিণ্ডে পারফিউজ করা হয়েছিল। টিস্যুটি কেটে ৪° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ৪% পিএফএ/পিবিএসে রাতারাতি স্থির করা হয়েছিল। পিবিএস-এ স্থির মস্তিষ্ক থেকে স্যাজিটাল সেকশন (৫০ μm পুরু) প্রস্তুত করার জন্য একটি কম্পনকারী ছুরি (লাইকা মাইক্রোসিস্টেমস জিএমবিএইচ, ভিয়েনা, অস্ট্রিয়া) ব্যবহার করা হয়েছিল। অন্যথায় নির্দিষ্ট না করা হলে, উপরে বর্ণিত (১৩) অনুসারে ঘরের তাপমাত্রায় এবং নাড়াচাড়া করে মুক্ত-ভাসমান সেকশনগুলির দাগ দেওয়া হয়েছিল। সংক্ষেপে, প্রথমে, প্রাপ্ত স্লাইসগুলিকে ঘরের তাপমাত্রায় ১৫ মিনিটের জন্য ০.৫% ট্রাইটন এক্স-১০০/পিবিএস দিয়ে পারমিবিলাইজ করা হয়েছিল; কিছু এপিটোপের জন্য (পিসিএক্স এবং শ্মট২), ৮০° সেলসিয়াস (পিএইচ ৯) এ ট্রাইস-ইডিটিএ বাফারে স্লাইসগুলিকে ২৫ মিনিটের জন্য গরম করুন। এরপর, অংশগুলিকে ব্লকিং বাফারে (3% BSA/PBS) প্রাথমিক অ্যান্টিবডি (টেবিল S1 দেখুন) দিয়ে রাতারাতি 4°C তাপমাত্রায় নাড়াচাড়া করে ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল। পরের দিন, অংশগুলিকে ব্লকিং বাফার দিয়ে ধুয়ে উপযুক্ত ফ্লুরোফোর-কনজুগেটেড সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দিয়ে ঘরের তাপমাত্রায় 2 ঘন্টা ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল; অবশেষে, অংশগুলিকে PBS-এ পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে ধুয়ে, DAPI দিয়ে পাল্টা দাগ দেওয়া হয়েছিল, এবং তারপর একটি মাইক্রোস্কোপ স্লাইডে অ্যাকোয়াপলিমাউন্ট দিয়ে স্থির করা হয়েছিল।
নমুনা চিত্রিত করার জন্য একটি লেজার স্ক্যানিং কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ (TCS SP8-X অথবা TCS ডিজিটাল লাইট শিট, লাইকা মাইক্রোসিস্টেমস) ব্যবহার করা হয়েছিল যা একটি সাদা আলো লেজার এবং একটি 405 ডায়োড আল্ট্রাভায়োলেট লেজার দিয়ে সজ্জিত ছিল। ফ্লুরোফোরকে উত্তেজিত করে এবং হাইব্রিড ডিটেক্টর (HyDs) দিয়ে সংকেত সংগ্রহ করে, LAS-X সফ্টওয়্যারটি ক্রমিক মোডে Nyquist নমুনা অনুসারে স্ট্যাক করা চিত্র সংগ্রহ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল: অ-পরিমাণগত প্যানেলের জন্য, এটি অত্যন্ত গতিশীল সংকেত (উদাহরণস্বরূপ, সোম্যাটিক কোষ এবং ডেনড্রাইটে) mtYFP)। BrightR মোডে PN-এর সংখ্যা সনাক্ত করতে HyD ব্যবহার করুন। পটভূমি হ্রাস করার জন্য 0.3 থেকে 6 ns পর্যন্ত গেটিং প্রয়োগ করা হয়।
বাছাই করা কোষগুলির রিয়েল-টাইম ইমেজিং। ১% B27 সাপ্লিমেন্ট এবং ০.৫ mM GlutaMax ধারণকারী নিউরোব্যাসাল-এ মাধ্যমে বাছাই করার পর, কোষগুলিকে তাৎক্ষণিকভাবে পলি-এল-লাইসিন-কোটেড কাচের স্লাইডে (μ-Slide8 Well, Ibidi, ক্যাটালগ নম্বর 80826) বীজতলা করা হয়েছিল, এবং তারপর কোষগুলিকে স্থির করার জন্য এটিকে ৩৭°C এবং ৫% CO2 তাপমাত্রায় ১ ঘন্টার জন্য রাখা হয়েছিল। রিয়েল-টাইম ইমেজিং একটি সাদা লেজার, HyD, 63×[1.4 সংখ্যাসূচক অ্যাপারচার (NA)] তেল অবজেক্টিভ লেন্স এবং একটি হিটিং স্টেজ দিয়ে সজ্জিত একটি Leica SP8 লেজার স্ক্যানিং কনফোকাল মাইক্রোস্কোপে সঞ্চালিত হয়েছিল।
ইঁদুরটিকে দ্রুত কার্বন ডাই অক্সাইড দিয়ে চেতনানাশক ওষুধ দিয়ে শিরশ্ছেদ করা হয়, মস্তিষ্ক দ্রুত মাথার খুলি থেকে সরিয়ে ফেলা হয় এবং ২০০μm পুরু (১৩C লেবেলিং পরীক্ষার জন্য) অথবা ২৭৫μm পুরু (দুটি ফোটন পরীক্ষার জন্য) স্যাজিটাল অংশে কাটা হয়। আইসক্রিম (HM-650 V, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ওয়ালডর্ফ, জার্মানি) নিম্নলিখিত পদার্থ দিয়ে পূর্ণ: ১২৫ mM বরফ-ঠান্ডা, কার্বন-স্যাচুরেটেড (৯৫% O2 এবং ৫% CO2) কম Ca2 + কৃত্রিম সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (ACSF) NaCl, ২.৫ mM KCl, ১.২৫ mM সোডিয়াম ফসফেট বাফার, ২৫ mM NaHCO3, ২৫ mM গ্লুকোজ, ০.৫ mM CaCl2 এবং ৩.৫ mM MgCl2 (৩১০ থেকে ৩৩০ mmol এর অসমোটিক চাপ)। প্রাপ্ত মস্তিষ্কের টুকরোগুলিকে একটি প্রাক-ইনকিউবেশন চেম্বারে স্থানান্তর করুন যেখানে উচ্চতর Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM সোডিয়াম ফসফেট বাফার, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-গ্লুকোজ, 1.0 mM CaCl2 এবং 2.0 mM MgCl2 (মাঝারি) pH 7.4 এবং 310 থেকে 320 mmol) থাকে।
ইমেজিং প্রক্রিয়া চলাকালীন, স্লাইসগুলিকে একটি ডেডিকেটেড ইমেজিং রুমে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল এবং পরীক্ষাটি 32° থেকে 33°C তাপমাত্রায় অবিচ্ছিন্ন ACSF পারফিউশনের অধীনে সম্পাদিত হয়েছিল। স্লাইস ইমেজিংয়ের জন্য একটি মাল্টিফোটন লেজার স্ক্যানিং মাইক্রোস্কোপ (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) ব্যবহার করা হয়েছিল যা Leica 25x অবজেক্টিভ লেন্স (NA 0.95, জল), Ti: Sapphire লেজার (Chameleon Vision II, Coherent) দিয়ে সজ্জিত ছিল। FLIM মডিউল (PicoHarp300, PicoQuant)।
Grx1-roGFP2 এর FLIM। PN গুলির সাইটোপ্লাজমিক রেডক্স অবস্থার পরিবর্তনগুলি স্যাজিটাল ব্রেন স্লাইসে দুই-ফোটন FLIM দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল, যেখানে Grx1-roGFP2 বায়োসেন্সর PN গুলিকে লক্ষ্য করেছিল। PN স্তরে, একটি কার্যকর PN (অর্থাৎ, পুঁতির কাঠামোর অভাব বা ডেনড্রাইট বরাবর নিউরোনাল রূপগত পরিবর্তন) এবং ডাবল পজিটিভ roGFP2 সেন্সর এবং AAV এনকোডিং shRNA PCx বা এর নিয়ন্ত্রণ ক্রম (প্রতিটি সহ-প্রকাশকারী mCherry) নিশ্চিত করার জন্য স্লাইস পৃষ্ঠের প্রায় 50 থেকে 80 μm নীচে অধিগ্রহণ ক্ষেত্র নির্বাচন করা হয়। 2x ডিজিটাল জুম [উত্তেজনা তরঙ্গদৈর্ঘ্য: 890 nm; 512 nm 512 পিক্সেল] সহ একক-স্ট্যাক চিত্র সংগ্রহ করুন। সনাক্তকরণ: অভ্যন্তরীণ HyD, ফ্লুরোসেসিন আইসোথিওসায়ানেট (FITC) ফিল্টার গ্রুপ] এবং 2 থেকে 3 মিনিটের মধ্যে চিত্র গড় ব্যবহার করা হয় যাতে কার্ভ ফিটিংয়ের জন্য পর্যাপ্ত ফোটন সংগ্রহ করা হয় (মোট 1000 ফোটন)। Grx1-roGFP2 প্রোবের সংবেদনশীলতা এবং FLIM অবস্থার যাচাইকরণ roGFP2 এর জীবনকাল মান পর্যবেক্ষণ করে করা হয়েছিল যখন পারফিউশন ACSF-তে বহির্মুখী 10 mM H2O2 যোগ করা হয়েছিল (জারণ সর্বাধিক করার জন্য, যার ফলে আয়ুষ্কাল বৃদ্ধি পায়), এবং তারপর 2 mM ডাইথিওথ্রেইটল যোগ করা হয়েছিল (হ্রাসের মাত্রা কমিয়ে দেয়, যার ফলে আয়ুষ্কাল হ্রাস পায়) (চিত্র S8, D থেকে G)। অর্জিত ফলাফল বিশ্লেষণ করতে FLIMfit 5.1.1 সফ্টওয়্যার ব্যবহার করুন, সম্পূর্ণ চিত্রের একক সূচকীয় ক্ষয় বক্ররেখা পরিমাপ করা IRF (যন্ত্র প্রতিক্রিয়া ফাংশন) এর সাথে ফিট করুন এবং χ2 প্রায় 1। একটি একক PN এর জীবনকাল গণনা করতে, স্নায়ু শরীরের চারপাশের মুখোশটি ম্যানুয়ালি আঁকা হয়েছিল এবং প্রতিটি মুখোশের গড় জীবনকাল পরিমাপের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।
মাইটোকন্ড্রিয়াল বিভব বিশ্লেষণ। তীব্র অংশটি 100 nM TMRM সরাসরি পারফিউজড ACSF-তে 30 মিনিটের জন্য যোগ করার পর, PN-এর মাইটোকন্ড্রিয়াল বিভব পরিবর্তনগুলি একটি দুই-ফোটন মাইক্রোস্কোপ দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল। TMRM ইমেজিং 920 nm-এ প্রোবকে উত্তেজিত করে এবং অভ্যন্তরীণ HyD (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) ব্যবহার করে সংকেত সংগ্রহ করে; একই উত্তেজনা তরঙ্গদৈর্ঘ্য ব্যবহার করে কিন্তু mtYFP চিত্রিত করার জন্য একটি ভিন্ন অভ্যন্তরীণ HyD (FITC :525/50) ব্যবহার করে। একক কোষ স্তরে মাইটোকন্ড্রিয়াল বিভব মূল্যায়ন করতে ImageJ-এর ইমেজ ক্যালকুলেটর প্লাগ-ইন ব্যবহার করুন। সংক্ষেপে, প্লাগ-ইন সমীকরণ: সংকেত = ন্যূনতম (mtYFP, TMRM) মাইটোকন্ড্রিয়াল অঞ্চল সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয় যা সংশ্লিষ্ট চ্যানেলের একক-স্ট্যাক কনফোকাল ছবিতে Purkinje Somali-তে TMRM সংকেত দেখায়। তারপর ফলস্বরূপ মুখোশের পিক্সেল এলাকা পরিমাপ করা হয়, এবং তারপর mtYFP চ্যানেলের সংশ্লিষ্ট থ্রেশহোল্ড একক-স্ট্যাক ছবিতে স্বাভাবিক করা হয় যাতে মাইটোকন্ড্রিয়াল ভগ্নাংশ পাওয়া যায় যা মাইটোকন্ড্রিয়াল সম্ভাব্যতা প্রদর্শন করে।
ছবিটি Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) সফটওয়্যারের সাহায্যে ডিকনভোলিউট করা হয়েছে। টাইলসের স্ক্যান করা ছবির জন্য, LAS-X সফটওয়্যার দ্বারা প্রদত্ত স্বয়ংক্রিয় সেলাই অ্যালগরিদম ব্যবহার করে একটি একক টাইলের মন্টেজ তৈরি করা হয়। ছবির ক্যালিব্রেশনের পরে, ছবিটি আরও প্রক্রিয়াজাত করতে এবং উজ্জ্বলতা এবং বৈসাদৃশ্য সমানভাবে সামঞ্জস্য করতে ImageJ এবং Adobe Photoshop ব্যবহার করুন। গ্রাফিক প্রস্তুতির জন্য Adobe Illustrator ব্যবহার করুন।
mtDNA ফোকাস বিশ্লেষণ। কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে ডিএনএর বিরুদ্ধে অ্যান্টিবডি লেবেলযুক্ত সেরিবেলার অংশগুলিতে mtDNA ক্ষতের সংখ্যা পরিমাপ করা হয়েছিল। প্রতিটি লক্ষ্য এলাকা কোষের দেহ এবং প্রতিটি কোষের নিউক্লিয়াসের জন্য তৈরি করা হয়েছিল এবং মাল্টি মেজার প্লাগ-ইন (ImageJ সফ্টওয়্যার) ব্যবহার করে সংশ্লিষ্ট এলাকা গণনা করা হয়েছিল। সাইটোপ্লাজমিক এলাকা পেতে কোষের দেহ এলাকা থেকে নিউক্লিয়ার এলাকা বিয়োগ করুন। অবশেষে, থ্রেশহোল্ড ছবিতে mtDNA নির্দেশ করে সাইটোপ্লাজমিক DNA পয়েন্টগুলি স্বয়ংক্রিয়ভাবে পরিমাপ করার জন্য বিশ্লেষণ কণা প্লাগ-ইন (ImageJ সফ্টওয়্যার) ব্যবহার করা হয়েছিল এবং প্রাপ্ত ফলাফলগুলি CTRL ইঁদুরের PN গড়ের সাথে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি প্রতি কোষে নিউক্লিওসাইডের গড় সংখ্যা হিসাবে প্রকাশ করা হয়।
প্রোটিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ। একক কোষ স্তরে PN-তে প্রোটিন এক্সপ্রেশন মূল্যায়ন করতে ImageJ-এর ইমেজ ক্যালকুলেটর প্লাগ-ইন ব্যবহার করুন। সংক্ষেপে, সংশ্লিষ্ট চ্যানেলের একক-স্তর কনফোকাল ছবিতে, সমীকরণের মাধ্যমে: সংকেত = ন্যূনতম (mtYFP, অ্যান্টিবডি), পুরকিনায় একটি নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডির প্রতি ইমিউনোঅ্যাক্টিভিটি দেখানো মাইটোকন্ড্রিয়াল অঞ্চলটি চিহ্নিত করা হয়। তারপর ফলস্বরূপ মাস্কের পিক্সেল এলাকাটি পরিমাপ করা হয়, এবং তারপর প্রদর্শিত প্রোটিনের মাইটোকন্ড্রিয়াল ভগ্নাংশ পেতে mtYFP চ্যানেলের সংশ্লিষ্ট থ্রেশহোল্ড একক-স্ট্যাক ছবিতে স্বাভাবিক করা হয়।
পুরকিঞ্জে কোষের ঘনত্ব বিশ্লেষণ। ImageJ-এর সেল কাউন্টার প্লাগ-ইনটি পুরকিঞ্জে ঘনত্ব মূল্যায়নের জন্য গণনা করা কোষ দ্বারা দখল করা সেরিবেলার রিংয়ের দৈর্ঘ্য দিয়ে গণনা করা পুরকিঞ্জে কোষের সংখ্যা ভাগ করে ব্যবহার করা হয়েছিল।
নমুনা প্রস্তুতি এবং সংগ্রহ। নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠী এবং Mfn2cKO ইঁদুরের মস্তিষ্ক 0.1 M ফসফেট বাফার (PB) তে 2% PFA/2.5% গ্লুটারালডিহাইডে স্থির করা হয়েছিল, এবং তারপর সিলিয়েট ব্যবহার করে করোনাল বিভাগগুলি প্রস্তুত করা হয়েছিল (Leica Mikrosysteme GmbH, ভিয়েনা, অস্ট্রিয়া) (পুরুত্ব 50 থেকে 60 μm)। তারপর PB বাফারে 1% os টেট্রাঅক্সাইড এবং 1.5% পটাসিয়াম ফেরোসায়ানাইডে ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য স্থির করা হয়েছিল। বিভাগগুলি তিনবার পাতিত জল দিয়ে ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল, এবং তারপর 20 মিনিটের জন্য 1% ইউরেনাইল অ্যাসিটেটযুক্ত 70% ইথানল দিয়ে রঙ করা হয়েছিল। তারপর বিভাগগুলি গ্রেডেড অ্যালকোহলে ডিহাইড্রেট করা হয়েছিল এবং সিলিকন-প্রলিপ্ত কাচের স্লাইডগুলির মধ্যে Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, ক্যাটালগ নম্বর 14040) এ এমবেড করা হয়েছিল, এবং অবশেষে 60°C তাপমাত্রায় 48 ঘন্টার জন্য ওভেনে পলিমারাইজ করা হয়েছিল। সেরিবেলার কর্টেক্স এলাকা নির্বাচন করা হয়েছিল এবং লাইকা আল্ট্রাকাট (লাইকা মাইক্রোসিস্টেম জিএমবিএইচ, ভিয়েনা, অস্ট্রিয়া) থেকে ৫০ ন্যানোমিটার অতি-পাতলা অংশ কেটে পলিস্টাইরিন ফিল্ম দিয়ে লেপা ২×১ মিমি তামার স্লিট গ্রিডে তোলা হয়েছিল। অংশগুলিকে H2O তে ৪% ইউরেনিল অ্যাসিটেটের দ্রবণ দিয়ে ১০ মিনিটের জন্য রঙ করা হয়েছিল, H2O দিয়ে বেশ কয়েকবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল, তারপর H2O তে রেনল্ডস লিড সাইট্রেট দিয়ে ১০ মিনিটের জন্য ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং তারপর H2O দিয়ে বেশ কয়েকবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। একটি ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপ ফিলিপস CM100 (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ওয়ালথাম, এমএ, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) দিয়ে একটি TVIPS (Tietz ভিডিও এবং ইমেজ প্রসেসিং সিস্টেম) TemCam-F416 ডিজিটাল ক্যামেরা (TVIPS GmbH, Gauting, USA) ব্যবহার করে মাইক্রোগ্রাফ নেওয়া হয়েছিল। জার্মানি)।
AAV-তে আক্রান্ত ইঁদুরের ক্ষেত্রে, মস্তিষ্ক আলাদা করে 1 মিমি পুরু স্যাজিটাল অংশে কেটে ফেলা হয়েছিল এবং AAV-সংক্রামিত রিং (অর্থাৎ mCherry expressing) সনাক্ত করার জন্য একটি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে সেরিবেলাম পরীক্ষা করা হয়েছিল। শুধুমাত্র সেই পরীক্ষাগুলি ব্যবহার করা হয় যেখানে AAV ইনজেকশনের ফলে কমপক্ষে দুটি পরপর সেরিবেলার রিংয়ে Purkinje কোষ স্তরের (অর্থাৎ প্রায় পুরো স্তর) খুব উচ্চ ট্রান্সডাকশন দক্ষতা পাওয়া যায়। AAV-ট্রান্সডিউসড লুপটি রাতারাতি পোস্ট-ফিক্সেশনের জন্য মাইক্রোডিসেক্ট করা হয়েছিল (0.1 M কোকোয়েট বাফারে 4% PFA এবং 2.5% গ্লুটারালডিহাইড) এবং আরও প্রক্রিয়াজাত করা হয়েছিল। EPON এমবেডিংয়ের জন্য, স্থির টিস্যুটি 0.1 M সোডিয়াম কোকোয়েট বাফার (Applichem) দিয়ে ধুয়ে 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) 0.1 M সোডিয়াম কোকোয়েট বাফারে (Applichem) 4 ঘন্টা ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল, তারপর 2 ঘন্টা ধরে ধুয়ে ফেলুন। 0.1 M কোকামাইড বাফার দিয়ে 3 বার পুনরাবৃত্তি করুন। পরবর্তীতে, টিস্যু ডিহাইড্রেট করার জন্য প্রতিটি ইথানল দ্রবণকে 4°C তাপমাত্রায় 15 মিনিটের জন্য ইনকিউব করার জন্য ইথানলের ঊর্ধ্বমুখী সিরিজ ব্যবহার করা হয়েছিল। টিস্যুটিকে প্রোপিলিন অক্সাইডে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল এবং 4°C তাপমাত্রায় EPON (সিগমা-অ্যালড্রিচ) এ রাতারাতি ইনকিউব করা হয়েছিল। টিস্যুটিকে ঘরের তাপমাত্রায় তাজা EPON-এ 2 ঘন্টা রাখুন এবং তারপর 62°C তাপমাত্রায় 72 ঘন্টার জন্য এম্বেড করুন। 70 nm অতি পাতলা অংশ কাটার জন্য একটি আল্ট্রামাইক্রোটোম (Leica Microsystems, UC6) এবং একটি হীরার ছুরি (Diatome, Biel, সুইজারল্যান্ড) ব্যবহার করুন, এবং 37°C তাপমাত্রায় 15 মিনিটের জন্য 1.5% ইউরেনিল অ্যাসিটেট দিয়ে দাগ দিন এবং 4 মিনিটের জন্য সীসা সাইট্রেট দ্রবণ দিয়ে দাগ দিন। ক্যামেরা ওয়ানভিউ 4K 16-বিট (গ্যাটান) এবং ডিজিটালমাইক্রোগ্রাফ সফ্টওয়্যার (গ্যাটান) দিয়ে সজ্জিত JEM-2100 Plus ট্রান্সমিশন ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপ (JEOL) ব্যবহার করে ইলেকট্রন মাইক্রোগ্রাফগুলি নেওয়া হয়েছিল। বিশ্লেষণের জন্য, 5000× বা 10,000× ডিজিটাল জুম ব্যবহার করে ইলেকট্রন মাইক্রোগ্রাফ সংগ্রহ করা হয়েছিল।
মাইটোকন্ড্রিয়ার রূপতাত্ত্বিক বিশ্লেষণ। সকল বিশ্লেষণের জন্য, ImageJ সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে ডিজিটাল ছবিতে পৃথক মাইটোকন্ড্রিয়ার রূপরেখা ম্যানুয়ালি রূপরেখা করা হয়েছিল। বিভিন্ন রূপতাত্ত্বিক পরামিতি বিশ্লেষণ করা হয়। মাইটোকন্ড্রিয়াল ঘনত্বকে প্রতিটি কোষের মোট মাইটোকন্ড্রিয়াল এলাকাকে সাইটোপ্লাজম এলাকা (সাইটোপ্লাজম এলাকা = কোষ এলাকা-কোষ নিউক্লিয়াস এলাকা) × 100 দ্বারা ভাগ করে প্রাপ্ত শতাংশ হিসাবে প্রকাশ করা হয়। মাইটোকন্ড্রিয়ার গোলাকারতা সূত্র [4π∙(ক্ষেত্রফল/পরিধি 2)] ব্যবহার করে গণনা করা হয়। মাইটোকন্ড্রিয়ার ইস্টা রূপবিদ্যা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং তাদের প্রধান আকার অনুসারে দুটি বিভাগে ("নলাকার" এবং "ফোস্কা") বিভক্ত করা হয়েছিল।
অটোফ্যাগোসোম/লাইসোসোম সংখ্যা এবং ঘনত্ব বিশ্লেষণ। ডিজিটাল ছবিতে প্রতিটি অটোফ্যাগোসোম/লাইসোসোমের রূপরেখা ম্যানুয়ালি রূপরেখা করতে ImageJ সফ্টওয়্যার ব্যবহার করুন। অটোফ্যাগোসোম/লাইসোসোম এলাকাটি প্রতিটি কোষের মোট অটোফ্যাগোসোম/লাইসোসোম গঠন এলাকাকে সাইটোপ্লাজম এলাকা (সাইটোপ্লাজম এলাকা=কোষ এলাকা-নিউক্লিয়াস এলাকা)×100 দিয়ে ভাগ করে গণনা করা শতাংশ হিসাবে প্রকাশ করা হয়। অটোফ্যাগোসোম/লাইসোসোমের ঘনত্ব গণনা করা হয় মোট সংখ্যাকে প্রতি কোষে অটোফ্যাগোসোম/লাইসোসোম কাঠামোর সংখ্যা (সাইটোপ্লাজমিক এলাকার পরিপ্রেক্ষিতে) দিয়ে ভাগ করে (সাইটোপ্লাজমিক এলাকা=কোষ এলাকা-নিউক্লিয়ার এলাকা)।
তীব্র সেকশনিং এবং নমুনা প্রস্তুতির জন্য লেবেলিং। যেসব পরীক্ষায় গ্লুকোজ লেবেলিং প্রয়োজন, সেসব পরীক্ষার জন্য তীব্র মস্তিষ্কের টুকরোগুলিকে একটি প্রাক-ইনকিউবেশন চেম্বারে স্থানান্তর করুন, যেখানে স্যাচুরেটেড কার্বন (95% O2 এবং 5% CO2), উচ্চ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM সোডিয়াম ফসফেট বাফার, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-গ্লুকোজ, 1.0 mM CaCl2 এবং 2.0 mM MgCl2, pH 7.4 এবং 310 থেকে 320 mOsm-এ সামঞ্জস্য করা হয়েছে), যেখানে গ্লুকোজ 13 C 6- গ্লুকোজ প্রতিস্থাপন (Eurisotop, ক্যাটালগ নম্বর CLM-1396) থাকে। যেসব পরীক্ষায় পাইরুভেট লেবেলিং প্রয়োজন হয়, সেসব পরীক্ষায় অ্যাকিউট ব্রেন স্লাইসগুলিকে উচ্চতর Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM সোডিয়াম ফসফেট বাফার, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-গ্লুকোজ, 1.0 mM CaCl2) এ স্থানান্তর করুন এবং 2.0 mM MgCl2 যোগ করুন, pH 7.4 এবং 310 থেকে 320mOsm এর সাথে সামঞ্জস্য করুন, এবং 1 mM 1-[1-13C] পাইরুভেট (Eurisotop, ক্যাটালগ নম্বর CLM-1082) যোগ করুন। 37°C তাপমাত্রায় 90 মিনিটের জন্য সেকশনগুলিকে ইনকিউব করুন। পরীক্ষার শেষে, অংশগুলিকে দ্রুত ৭৫ মিলিমিটার অ্যামোনিয়াম কার্বনেট ধারণকারী জলীয় দ্রবণ (pH ৭.৪) দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল, এবং তারপর ৪০:৪০:২০ (v:v:v) অ্যাসিটোনিট্রাইল (ACN): মিথানল: জলে একজাত করা হয়েছিল। অংশগুলিকে ৩০ মিনিটের জন্য বরফে ইনকিউবেট করার পর, নমুনাগুলিকে ৪°C তাপমাত্রায় ১০ মিনিটের জন্য ২১,০০০ গ্রাম সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল, এবং স্বচ্ছ সুপারনাট্যান্টকে একটি স্পিডভ্যাক কনসেনট্রেটরে শুকানো হয়েছিল। ফলে শুকনো মেটাবোলাইট পেলেট বিশ্লেষণ না হওয়া পর্যন্ত -৮০°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল।
১৩টি সি-লেবেলযুক্ত অ্যামিনো অ্যাসিডের তরল ক্রোমাটোগ্রাফি-ভর স্পেকট্রোমেট্রি বিশ্লেষণ। তরল ক্রোমাটোগ্রাফি-ভর স্পেকট্রোমেট্রি (LC-MS) বিশ্লেষণের জন্য, মেটাবোলাইট পেলেটটি 75μl LC-MS গ্রেড জলে (হানিওয়েল) পুনঃস্থাপিত করা হয়েছিল। 4°C তাপমাত্রায় 5 মিনিটের জন্য 21,000 গ্রাম সেন্ট্রিফিউগেশনের পরে, অ্যামিনো অ্যাসিড ফ্লাক্স বিশ্লেষণের জন্য 20 μl স্পষ্ট সুপারনাট্যান্ট ব্যবহার করা হয়েছিল, যখন বাকি নির্যাসটি অবিলম্বে অ্যানিয়ন বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল (নীচে দেখুন)। পূর্বে বর্ণিত বেনজয়াইল ক্লোরাইড ডেরিভেটাইজেশন প্রোটোকল (55, 56) ব্যবহার করে অ্যামিনো অ্যাসিড বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। প্রথম ধাপে, 100 mM সোডিয়াম কার্বনেট (সিগমা-অ্যালড্রিচ) এর 10μl 20μl মেটাবোলাইট নির্যাসে যোগ করা হয়েছিল, এবং তারপরে 10μl 2% বেনজয়াইল ক্লোরাইড (সিগমা-অ্যালড্রিচ) LC গ্রেড ACN-তে যোগ করা হয়েছিল। নমুনাটি সংক্ষিপ্তভাবে ঘূর্ণিঝড়িত করা হয়েছিল এবং তারপর ২০°C তাপমাত্রায় ৫ মিনিটের জন্য ২১,০০০ গ্রাম তাপমাত্রায় সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। ক্লিয়ার করা সুপারনাট্যান্টকে একটি শঙ্কুযুক্ত কাচের সন্নিবেশ (২০০ μl আয়তন) সহ একটি ২ মিলি অটোস্যাম্পলার শিশিতে স্থানান্তর করুন। নমুনাগুলি Q-Exactive (QE)-HF (আল্ট্রা হাই ফিল্ড অরবিট্র্যাপ) উচ্চ-রেজোলিউশন নির্ভুলতা ভর স্পেকট্রোমিটার (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) এর সাথে সংযুক্ত Acquity iClass অতি-উচ্চ কর্মক্ষমতা LC সিস্টেম (ওয়াটারস) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। বিশ্লেষণের জন্য, ডেরিভেটাইজড নমুনার 2μl 1.8μm কণা ধারণকারী 100×1.0 মিমি উচ্চ-শক্তি সিলিকা T3 কলামে (ওয়াটারস) ইনজেক্ট করা হয়েছিল। প্রবাহ হার 100μl/মিনিট, এবং বাফার সিস্টেমে বাফার A (10 mM অ্যামোনিয়াম ফর্মেট এবং জলে 0.15% ফর্মিক অ্যাসিড) এবং বাফার B (ACN) থাকে। গ্রেডিয়েন্ট নিম্নরূপ: 0 মিনিটে 0%B; 0%B। ০ থেকে ০.১ মিনিটে ০ থেকে ১৫% B; ০.১ থেকে ০.৫ মিনিটে ১৫ থেকে ১৭% B; ০.৫ থেকে ১৪ মিনিটে ১৭ থেকে ৫৫% B; ১৪ থেকে ১৪.৫ মিনিটে ৫৫ থেকে ৭০% B; ১৮ মিনিটে ১৪.৫ থেকে ৭০ থেকে ১০০% B; ১৮ থেকে ১৯ মিনিটে ১০০% B; ১৯ থেকে ১৯.১ মিনিটে ১০০ থেকে ০% B; ১৯.১ থেকে ২৮ মিনিটে ০% B (৫৫, ৫৬)। QE-HF ভর স্পেকট্রোমিটারটি ধনাত্মক আয়নীকরণ মোডে কাজ করে যার ভর পরিসীমা m/z (ভর/চার্জ অনুপাত) 50 থেকে 750। প্রয়োগকৃত রেজোলিউশন হল 60,000, এবং প্রাপ্ত লাভ নিয়ন্ত্রণ (AGC) আয়ন লক্ষ্য হল 3×106, এবং সর্বাধিক আয়ন সময় হল 100 মিলিসেকেন্ড। উত্তপ্ত ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়নীকরণ (ESI) উৎসটি 3.5 kV স্প্রে ভোল্টেজ, 250°C কৈশিক তাপমাত্রা, 60 AU (স্বেচ্ছাসেবী একক) এর একটি শিথ বায়ুপ্রবাহ এবং 20 AU. 250°C এর একটি সহায়ক বায়ুপ্রবাহে কাজ করে। S লেন্সটি 60 AU তে সেট করা আছে।
১৩সি লেবেলযুক্ত জৈব অ্যাসিডের অ্যানিয়ন ক্রোমাটোগ্রাফি-এমএস বিশ্লেষণ। অবশিষ্ট মেটাবোলাইট অবক্ষেপণ (৫৫μl) একটি QE-HF ভর স্পেকট্রোমিটার (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) এর সাথে সংযুক্ত একটি ডায়োনেক্স আয়ন ক্রোমাটোগ্রাফি সিস্টেম (ICS 5000+, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, ৫μl মেটাবোলাইট নির্যাস HPLC (২ মিমি × ২৫০ মিমি, কণার আকার ৪μm, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) দিয়ে সজ্জিত একটি ডায়োনেক্স আয়নপ্যাক AS11-HC কলামে পুশ-ইন আংশিক লুপ মোডে ইনজেক্ট করা হয়েছিল যার ফিলিং অনুপাত ১। ) ডায়োনেক্স আয়নপ্যাক AG11-HC গার্ড কলাম (২ মিমি x ৫০ মিমি, ৪μm, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক)। কলামের তাপমাত্রা ৩০°C এ বজায় রাখা হয় এবং অটোস্যাম্পলার ৬°C এ সেট করা হয়। ইলুয়েন্ট জেনারেটরের মাধ্যমে পটাসিয়াম হাইড্রোক্সাইড গ্রেডিয়েন্ট তৈরি করতে ডিওনাইজড জল দিয়ে সরবরাহ করা একটি পটাসিয়াম হাইড্রোক্সাইড কার্তুজ ব্যবহার করুন। ৩৮০μl/মিনিট প্রবাহ হারে বিপাকীয় পদার্থের পৃথকীকরণ, নিম্নলিখিত গ্রেডিয়েন্ট প্রয়োগ করে: ০ থেকে ৩ মিনিট, ১০ মিমি KOH; ৩ থেকে ১২ মিনিট, ১০ থেকে ৫০ মিমি KOH; ১২ থেকে ১৯ মিনিট, ৫০ থেকে ১০০ মিমি KOH; ১৯ থেকে ২১ মিনিট, ১০০ মিমি KOH; ২১ থেকে ২১.৫ মিনিট, ১০০ থেকে ১০ মিমি KOH। কলামটি ৮.৫ মিনিটের জন্য ১০ মিমি KOH এর অধীনে পুনরায় ভারসাম্যপূর্ণ করা হয়েছিল।
কলামের পরে এলিউটেড মেটাবোলাইটগুলিকে 150μl/মিনিট আইসোপ্রোপ্যানল সাপ্লিমেন্ট স্ট্রিমের সাথে একত্রিত করা হয় এবং তারপর ঋণাত্মক আয়নীকরণ মোডে কাজ করে এমন একটি উচ্চ-রেজোলিউশন ভর স্পেকট্রোমিটারে পরিচালিত করা হয়। MS 60,000 রেজোলিউশন সহ m/z 50 থেকে 750 পর্যন্ত ভর পরিসীমা পর্যবেক্ষণ করছে। AGC 1×106 এ সেট করা হয়েছে এবং সর্বোচ্চ আয়ন সময় 100 ms এ রাখা হয়েছে। উত্তপ্ত ESI উৎসটি 3.5 kV এর স্প্রে ভোল্টেজে পরিচালিত হয়েছিল। আয়ন উৎসের অন্যান্য সেটিংস নিম্নরূপ: কৈশিক তাপমাত্রা 275°C; খাপ গ্যাস প্রবাহ, 60 AU; সহায়ক গ্যাস প্রবাহ, 300°C এ 20 AU, এবং S লেন্স 60 AU তে সেট করা হয়েছে।
১৩সি লেবেলযুক্ত বিপাকীয় পদার্থের তথ্য বিশ্লেষণ। আইসোটোপ অনুপাতের তথ্য বিশ্লেষণের জন্য ট্রেসফাইন্ডার সফ্টওয়্যার (সংস্করণ ৪.২, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করুন। প্রতিটি যৌগের পরিচয় একটি নির্ভরযোগ্য রেফারেন্স যৌগ দ্বারা যাচাই করা হয়েছিল এবং স্বাধীনভাবে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। আইসোটোপ সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণ সম্পাদনের জন্য, প্রতিটি ১৩সি আইসোটোপের (Mn) নিষ্কাশিত আয়ন ক্রোমাটোগ্রাম (XIC) এর ক্ষেত্রফল [M + H] + থেকে বের করা হয়েছিল, যেখানে n হল লক্ষ্য যৌগের কার্বন সংখ্যা, যা অ্যামিনো অ্যাসিড বিশ্লেষণ করতে ব্যবহৃত হয় অথবা [MH] + অ্যানিয়ন বিশ্লেষণ করতে ব্যবহৃত হয়। XIC এর ভর নির্ভুলতা প্রতি মিলিয়নে পাঁচ অংশের কম এবং RT এর নির্ভুলতা 0.05 মিনিট। প্রতিটি সনাক্ত করা আইসোটোপের অনুপাত সংশ্লিষ্ট যৌগের সমস্ত আইসোটোপের যোগফলের সাথে গণনা করে সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণ করা হয়। এই অনুপাতগুলি প্রতিটি আইসোটোপের জন্য শতাংশের মান হিসাবে দেওয়া হয় এবং ফলাফলগুলি মোলার শতাংশ সমৃদ্ধকরণ (MPE) হিসাবে প্রকাশ করা হয়, যেমনটি পূর্বে বর্ণিত হয়েছে (42)।
হিমায়িত নিউরন পেলেটটি বরফ-ঠান্ডা ৮০% মিথানল (v/v) এ একজাত করা হয়েছিল, ঘূর্ণি করা হয়েছিল এবং -২০°C তাপমাত্রায় ৩০ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। নমুনাটি আবার ঘুরিয়ে +৪°C তাপমাত্রায় ৩০ মিনিটের জন্য নাড়ুন। নমুনাটি ২১,০০০ গ্রাম তাপমাত্রায় ৪°C তাপমাত্রায় ৫ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল, এবং তারপরে ফলস্বরূপ সুপারনাট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং পরবর্তী বিশ্লেষণের জন্য ২৫°C তাপমাত্রায় একটি স্পিডভ্যাক কনসেনট্রেটর ব্যবহার করে শুকানো হয়েছিল। উপরে বর্ণিত হিসাবে, বাছাই করা কোষগুলির অ্যামিনো অ্যাসিডের উপর LC-MS বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। TraceFinder (সংস্করণ ৪.২, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে, প্রতিটি যৌগের মনোআইসোটোপিক ভর ব্যবহার করে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। প্রিপ্রসেসকোর সফ্টওয়্যার প্যাকেজ (57) ব্যবহার করে বিপাকীয় ডেটার পরিমাণগত স্বাভাবিকীকরণ করা হয়েছিল।
স্লাইস প্রস্তুতি। ইঁদুরটিকে দ্রুত কার্বন ডাই অক্সাইড দিয়ে চেতনানাশক করে শিরশ্ছেদ করা হয়েছিল, মাথার খুলি থেকে মস্তিষ্ক দ্রুত সরিয়ে ফেলা হয়েছিল, এবং বরফভর্তি কম্পনকারী ছুরি (HM-650 V, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ওয়ালডর্ফ, জার্মানি) ব্যবহার করে এটিকে 300 থেকে 375 μm স্যাজিটাল অংশে কাটা হয়েছিল। ঠান্ডা কার্বন গ্যাসীকরণ (95% O2 এবং 5% CO2) নিম্ন Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM সোডিয়াম ফসফেট বাফার, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-গ্লুকোজ, 1.0 mM CaCl2 এবং 6.0 mM MgCl2 pH 7.4 এবং 310 থেকে 330 mOsm এ সামঞ্জস্য করুন)। প্রাপ্ত মস্তিষ্কের টুকরোগুলিকে উচ্চতর Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM সোডিয়াম ফসফেট বাফার, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-গ্লুকোজ, 4.0 mM CaCl2 এবং mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 এবং 310 থেকে 320 mOsm ধারণকারী একটি চেম্বারে স্থানান্তর করুন। টুকরোগুলিকে 20 থেকে 30 মিনিটের জন্য সংরক্ষণ করুন যাতে রেকর্ড করার আগে সেগুলি পুনরুদ্ধার করা যায়।
রেকর্ডিং। সমস্ত রেকর্ডিংয়ের জন্য একটি স্থির রেকর্ডিং চেম্বার এবং একটি 20x জল নিমজ্জন অবজেক্টিভ লেন্স (Scientifica) দিয়ে সজ্জিত একটি মাইক্রোস্কোপ স্টেজ ব্যবহার করা হয়েছিল। পুটেটিভ পুরকিনজে কোষগুলি (i) শরীরের আকার, (ii) সেরিবেলামের শারীরবৃত্তীয় অবস্থান এবং (iii) ফ্লুরোসেন্ট mtYFP রিপোর্টার জিনের প্রকাশ দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল। 5 থেকে 11 মেগোহমের টিপ প্রতিরোধের প্যাচ পিপেটটি একটি বোরোসিলিকেট গ্লাস কৈশিক (GB150-10, 0.86 মিমি × 1.5 মিমি × 100 মিমি, সায়েন্স প্রোডাক্টস, হফহেইম, জার্মানি) এবং একটি অনুভূমিক পিপেট ইন্সট্রুমেন্টস (P-1000, সাটার), নোভাটো, ক্যালিফোর্নিয়া) দ্বারা টেনে বের করা হয়। সমস্ত রেকর্ডিং ELC-03XS npi প্যাচ ক্ল্যাম্প অ্যামপ্লিফায়ার (npi ইলেকট্রনিক GmbH, Tam, জার্মানি) দ্বারা সম্পাদিত হয়েছিল, যা সফ্টওয়্যার সিগন্যাল (সংস্করণ 6.0, কেমব্রিজ ইলেকট্রনিক, কেমব্রিজ, যুক্তরাজ্য) দ্বারা নিয়ন্ত্রিত ছিল। পরীক্ষাটি 12.5 kHz এর নমুনা হারে রেকর্ড করা হয়েছিল। সিগন্যালটি দুটি শর্ট-পাস বেসেল ফিল্টার দিয়ে ফিল্টার করা হয় যার কাটঅফ ফ্রিকোয়েন্সি যথাক্রমে ১.৩ এবং ১০ kHz। মেমব্রেন এবং পাইপেটের ক্যাপাসিট্যান্স এমপ্লিফায়ার ব্যবহার করে কম্পেনসেশন সার্কিট দ্বারা ক্ষতিপূরণ করা হয়। সমস্ত পরীক্ষা-নিরীক্ষা একটি Orca-Flash 4.0 ক্যামেরা (হামামাতসু, গার্ডেন, জার্মানি) এর নিয়ন্ত্রণে সম্পাদিত হয়েছিল, যা হোকাও সফ্টওয়্যার (সংস্করণ ২.৮, হামামাতসু, গার্ডেন, জার্মানি) দ্বারা নিয়ন্ত্রিত ছিল।
নিয়মিত পুরো কোষের কনফিগারেশন এবং বিশ্লেষণ। রেকর্ডিংয়ের ঠিক আগে, নিম্নলিখিত পদার্থগুলি ধারণকারী অভ্যন্তরীণ দ্রবণ দিয়ে পাইপেটটি পূরণ করুন: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM পটাসিয়াম গ্লুকোনেট, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM গুয়ানোসিন ট্রাইফসফেট (GTP) (Na) এবং 10.0 mM ক্রিয়েটিনিন ফসফেট pH 7.25 এ সামঞ্জস্য করা হয়েছিল এবং অসমোটিক চাপ ছিল 290 mOsm (সুক্রোজ)। ঝিল্লিটি ভেঙে ফেলার জন্য 0 pA বল প্রয়োগ করার পরপরই, বিশ্রামরত ঝিল্লি বিভব পরিমাপ করা হয়েছিল। -40, -30, -20, এবং -10 pA এর হাইপারপোলারাইজড স্রোত প্রয়োগ করে ইনপুট প্রতিরোধ পরিমাপ করা হয়। ভোল্টেজ প্রতিক্রিয়ার মাত্রা পরিমাপ করুন এবং ইনপুট প্রতিরোধ গণনা করতে ওহমের সূত্র ব্যবহার করুন। একটি ভোল্টেজ ক্ল্যাম্পে ৫ মিনিটের জন্য স্বতঃস্ফূর্ত কার্যকলাপ রেকর্ড করা হয়েছিল এবং sPSC সনাক্ত করা হয়েছিল এবং Igor Pro (সংস্করণ 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) তে একটি আধা-স্বয়ংক্রিয় স্বীকৃতি স্ক্রিপ্ট ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল। IV বক্ররেখা এবং স্থির-অবস্থার কারেন্ট পরিমাপ করা হয় বিভিন্ন বিভব (-110 mV থেকে শুরু করে) এ ব্যাটারি ক্ল্যাম্প করে এবং 5 mV ধাপে ভোল্টেজ বৃদ্ধি করে। AP এর উৎপাদন পরীক্ষা করা হয়েছিল একটি ডিপোলারাইজিং কারেন্ট প্রয়োগ করে। ডিপোলারাইজিং কারেন্ট পালস প্রয়োগ করার সময় -70 mV এ সেল ক্ল্যাম্প করুন। প্রতিটি রেকর্ডিং ইউনিটের ধাপের আকার আলাদাভাবে সামঞ্জস্য করুন (10 থেকে 60 pA)। সর্বোচ্চ AP ফ্রিকোয়েন্সি সৃষ্টিকারী পালস স্পাইকগুলি ম্যানুয়ালি গণনা করে সর্বাধিক AP ফ্রিকোয়েন্সি গণনা করুন। AP থ্রেশহোল্ড বিশ্লেষণ করা হয় ডিপোলারাইজেশন পালসের দ্বিতীয় ডেরিভেটিভ ব্যবহার করে যা প্রথমে এক বা একাধিক AP ট্রিগার করে।
ছিদ্রযুক্ত প্যাচ কনফিগারেশন এবং বিশ্লেষণ। স্ট্যান্ডার্ড প্রোটোকল ব্যবহার করে ছিদ্রযুক্ত প্যাচ রেকর্ডিং করুন। একটি ATP- এবং GTP-মুক্ত পাইপেট ব্যবহার করুন যাতে নিম্নলিখিত উপাদানগুলি থাকে না: 128 mM গ্লুকোনেট K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA এবং 2 mM MgCl2, এবং pH 7.2 (KOH ব্যবহার করে) এর সাথে সামঞ্জস্য করুন। কোষের ঝিল্লির অনিয়ন্ত্রিত ব্যাপ্তিযোগ্যতা রোধ করার জন্য ATP এবং GTP অন্তঃকোষীয় দ্রবণ থেকে বাদ দেওয়া হয়। প্যাচ পাইপেটটি একটি অ্যামফোটেরিসিনযুক্ত অভ্যন্তরীণ দ্রবণ (প্রায় 200 থেকে 250μg/ml; G4888, সিগমা-অ্যালড্রিচ) দিয়ে পূর্ণ করা হয় যাতে একটি পাঞ্চ করা প্যাচ রেকর্ড পাওয়া যায়। অ্যামফোটেরিসিন ডাইমিথাইল সালফক্সাইডে দ্রবীভূত করা হয়েছিল (চূড়ান্ত ঘনত্ব: 0.1 থেকে 0.3%; DMSO; D8418, সিগমা-অ্যালড্রিচ)। ব্যবহৃত DMSO এর ঘনত্ব অধ্যয়ন করা নিউরনের উপর কোনও উল্লেখযোগ্য প্রভাব ফেলেনি। পাঞ্চিং প্রক্রিয়া চলাকালীন, চ্যানেল রেজিস্ট্যান্স (Ra) ক্রমাগত পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল, এবং Ra এবং AP এর প্রশস্ততা স্থিতিশীল হওয়ার পরে (20-40 মিনিট) পরীক্ষা শুরু করা হয়েছিল। স্বতঃস্ফূর্ত কার্যকলাপ 2 থেকে 5 মিনিটের জন্য একটি ভোল্টেজ এবং/অথবা কারেন্ট ক্ল্যাম্পে পরিমাপ করা হয়। Igor Pro (সংস্করণ 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (সংস্করণ 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) এবং GraphPad Prism (সংস্করণ 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) ব্যবহার করে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। স্বতঃস্ফূর্ত AP সনাক্ত করার জন্য, IgorPro এর NeuroMatic v3.0c প্লাগ-ইন ব্যবহার করা হয়। একটি নির্দিষ্ট থ্রেশহোল্ড ব্যবহার করে স্বয়ংক্রিয়ভাবে AP সনাক্ত করুন, যা প্রতিটি রেকর্ডের জন্য পৃথকভাবে সামঞ্জস্য করা হয়। স্পাইক ব্যবধান ব্যবহার করে, সর্বাধিক তাৎক্ষণিক স্পাইক ফ্রিকোয়েন্সি এবং গড় স্পাইক ফ্রিকোয়েন্সি সহ স্পাইক ফ্রিকোয়েন্সি নির্ধারণ করুন।
PN বিচ্ছিন্নতা। পূর্বে প্রকাশিত প্রোটোকলের সাথে খাপ খাইয়ে, একটি নির্দিষ্ট পর্যায়ে মাউসের সেরিবেলাম থেকে PN গুলি বিশুদ্ধ করা হয়েছিল (58)। সংক্ষেপে, সেরিবেলামটি বরফ-ঠান্ডা বিচ্ছিন্নকরণ মাধ্যমে [HBSS Ca2+ এবং Mg2+ ছাড়া, 20 mM গ্লুকোজ, পেনিসিলিন (50 U/ml) এবং স্ট্রেপ্টোমাইসিন (0.05 mg/ml) দিয়ে পরিপূরক] কেটে কেটে ফেলা হয়েছিল, এবং তারপর মাধ্যমটিকে papain [HBSS, 1-cysteine·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) এবং deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml) দিয়ে পরিপূরক] দিয়ে হজম করা হয়েছিল। 30°C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য চিকিত্সা করুন। প্রথমে কোষগুলিকে ঘরের তাপমাত্রায় ডিমের শ্লেষ্মা (১০ মিলিগ্রাম/মিলি), বিএসএ (১০ মিলিগ্রাম/মিলি) এবং ডিনেস (০.১ মিলিগ্রাম/মিলি) ধারণকারী এইচবিএসএস মাধ্যমের সাথে ধুয়ে এনজাইমেটিক হজম প্রতিরোধ করুন। তারপর ২০ মিলিমিটার গ্লুকোজ ধারণকারী এইচবিএসএস মাধ্যমের সাথে আলতো করে পিষে পেনিসিলিন (৫০ ইউ/মিলি), স্ট্রেপ্টোমাইসিন (০.০৫ মিলিগ্রাম/মিলি) এবং ডিনেস (০.১ মিলিগ্রাম/মিলি) একক কোষ নির্গত করুন। ফলস্বরূপ কোষ সাসপেনশনটি ৭০μm কোষ ছাঁকনির মাধ্যমে ফিল্টার করা হয়েছিল, তারপর কোষগুলিকে সেন্ট্রিফিউগেশন (১১১০ আরপিএম, ৫ মিনিট, ৪°সে) দ্বারা পেললেট করা হয়েছিল এবং বাছাই মাধ্যমের সাথে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল [এইচবিএসএস, ২০ মিলিমিটার গ্লুকোজ, ২০% ভ্রূণের গবাদি পশুর সাথে পরিপূরক) সিরাম, পেনিসিলিন (৫০ ইউ/মিলি) এবং স্ট্রেপ্টোমাইসিন (০.০৫ মিলিগ্রাম/মিলি)]; প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড দিয়ে কোষের কার্যকারিতা মূল্যায়ন করুন এবং কোষের ঘনত্ব ১×১০৬ থেকে ২×১০৬ কোষ/মিলি এ সামঞ্জস্য করুন। ফ্লো সাইটোমেট্রির আগে, সাসপেনশনটি 50 μm সেল স্ট্রেনারের মাধ্যমে ফিল্টার করা হয়েছিল।
ফ্লো সাইটোমিটার। FACSAria III মেশিন (BD Biosciences) এবং FACSDiva সফটওয়্যার (BD Biosciences, সংস্করণ 8.0.1) ব্যবহার করে 4°C তাপমাত্রায় কোষ বাছাই করা হয়েছিল। কোষ সাসপেনশনটি 100 μm নজল ব্যবহার করে 20 psi চাপে ~2800 ইভেন্ট/সেকেন্ড হারে সাজানো হয়েছিল। যেহেতু ঐতিহ্যবাহী গেটিং মানদণ্ড (কোষের আকার, দ্বি-মোডাল বৈষম্য এবং বিক্ষিপ্তকরণ বৈশিষ্ট্য) অন্যান্য কোষের ধরণ থেকে PN-এর সঠিক বিচ্ছিন্নতা নিশ্চিত করতে পারে না, তাই গেটিং কৌশলটি mitoYFP+ ​​এবং নিয়ন্ত্রণ mitoYFP − ইঁদুরের YFP তীব্রতা এবং অটোফ্লুরোসেন্সের সরাসরি তুলনার উপর ভিত্তি করে সেট করা হয়। YFP একটি 488 nm লেজার লাইন দিয়ে নমুনা বিকিরণ করে উত্তেজিত হয় এবং 530/30 nm ব্যান্ড পাস ফিল্টার ব্যবহার করে সংকেত সনাক্ত করা হয়। mitoYFP+ ​​ইঁদুরে, Rosa26-mitoYFP রিপোর্টার জিনের আপেক্ষিক শক্তিও নিউরোনাল বডি এবং অ্যাক্সন খণ্ডগুলিকে আলাদা করতে ব্যবহৃত হয়। ৭-এএডি ৫৬১ এনএম হলুদ লেজার দিয়ে উত্তেজিত হয় এবং মৃত কোষ বাদ দেওয়ার জন্য ৬৭৫/২০ এনএম ব্যান্ডপাস ফিল্টার দিয়ে সনাক্ত করা হয়। একই সময়ে অ্যাস্ট্রোসাইট আলাদা করার জন্য, কোষের সাসপেনশনটি ACSA-2-APC দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল, তারপর নমুনাটি ৬৪০ এনএম লেজার লাইন দিয়ে বিকিরণ করা হয়েছিল এবং সংকেত সনাক্ত করার জন্য ৬৬০/২০ এনএম ব্যান্ডপাস ফিল্টার ব্যবহার করা হয়েছিল।
সংগৃহীত কোষগুলিকে সেন্ট্রিফিউগেশন (১১১০ আরপিএম, ৫ মিনিট, ৪°সে) দ্বারা পেলেট করা হয়েছিল এবং ব্যবহার না করা পর্যন্ত -৮০°সে তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল। পদ্ধতিগত পরিবর্তনশীলতা কমাতে Mfn2cKO ইঁদুর এবং তাদের লিটার কুকুরছানাগুলিকে একই দিনে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়। FACS ডেটা উপস্থাপনা এবং বিশ্লেষণ FlowJo সফ্টওয়্যার (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) ব্যবহার করে সম্পাদিত হয়েছিল।
উপরে উল্লিখিত (59), পরবর্তী mtDNA পরিমাণ নির্ধারণের জন্য সাজানো নিউরন থেকে DNA বিচ্ছিন্ন করার জন্য রিয়েল-টাইম PCR ব্যবহার করা হয়। প্রাথমিকভাবে বিভিন্ন সংখ্যক কোষের উপর qPCR চালিয়ে রৈখিকতা এবং প্রান্তিক সংবেদনশীলতা পরীক্ষা করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 এবং প্রোটিনেজ K (200 ng/ml) সমন্বিত একটি লাইসিস বাফারে 300 PN সংগ্রহ করুন এবং 55°C 120 মিনিটে ইনকিউবেট করুন। প্রোটিনেজ K সম্পূর্ণ নিষ্ক্রিয় করার জন্য কোষগুলিকে 10 মিনিটের জন্য 95°C তাপমাত্রায় আরও ইনকিউবেট করা হয়েছিল। mt-Nd1-এর জন্য নির্দিষ্ট একটি TaqMan প্রোব (থার্মো ফিশার) ব্যবহার করে, 7900HT রিয়েল-টাইম PCR সিস্টেমে (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) আধা-পরিমাণগত PCR দ্বারা mtDNA পরিমাপ করা হয়েছিল (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক)। বিজ্ঞান, ক্যাটালগ নম্বর Mm04225274_s1), mt-Nd6 (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ক্যাটালগ নম্বর AIVI3E8) এবং 18S (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ক্যাটালগ নম্বর Hs99999901_s1) জিন।
প্রোটিওম নমুনা প্রস্তুতি। দ্রবণটিকে ৯৫°C তাপমাত্রায় ১০ মিনিটের জন্য গরম করে এবং সোনিকেশনের মাধ্যমে, লিসিস বাফারে [৬ M গুয়ানিডিন ক্লোরাইড, ১০ mM ট্রিস(২-কারবক্সিইথাইল) ফসফিন হাইড্রোক্লোরাইড, ১০ mM ক্লোরোএসিটামাইড এবং ১০০ mM ট্রিস- HCl-তে লিস হিমায়িত নিউরন পেলেট]। বায়োরাপ্টর (ডায়াজেনড) -এ ১০ মিনিটের জন্য (৩০ সেকেন্ড পালস / ৩০ সেকেন্ড বিরতি সময়কাল)। নমুনাটি ২০ mM ট্রিস-এইচসিএল (pH 8.0) -এ ১:১০ মিশ্রিত করা হয়েছিল, ৩০০ এনজি ট্রিপসিন সোনা (প্রোমেগা) দিয়ে মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং সম্পূর্ণ হজম অর্জনের জন্য ৩৭°C তাপমাত্রায় রাতারাতি ইনকিউবেট করা হয়েছিল। দ্বিতীয় দিনে, নমুনাটি ২০,০০০ গ্রাম তাপমাত্রায় ২০ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। সুপারন্যাট্যান্টটি ০.১% ফর্মিক অ্যাসিড দিয়ে মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং দ্রবণটি স্ব-তৈরি স্টেজটিপস দিয়ে ডিসল্ট করা হয়েছিল। নমুনাটি একটি স্পিডভ্যাক যন্ত্রে (এপেনডর্ফ কনসেনট্রেটর প্লাস ৫৩০৫) ৪৫° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় শুকানো হয়েছিল, এবং তারপর পেপটাইডটি ০.১% ফর্মিক অ্যাসিডে সাসপেন্ড করা হয়েছিল। সমস্ত নমুনা একই ব্যক্তি একই সাথে প্রস্তুত করেছিলেন। অ্যাস্ট্রোসাইট নমুনা বিশ্লেষণ করার জন্য, ৪ μg ডিসল্টেড পেপটাইডগুলিকে একটি ট্যান্ডেম ভর ট্যাগ (TMT10plex, ক্যাটালগ নম্বর 90110, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) দিয়ে লেবেল করা হয়েছিল যার পেপটাইড থেকে TMT রিএজেন্ট অনুপাত ১:২০ ছিল। TMT লেবেলিংয়ের জন্য, ৭০ μl অ্যানহাইড্রাস ACN-তে ০.৮ মিলিগ্রাম TMT রিএজেন্ট পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল, এবং শুকনো পেপটাইডটি ০.১ M TEAB (ট্রাইথাইলামোনিয়াম বাইকার্বোনেট) এর ৯ μl-এ পুনর্গঠিত করা হয়েছিল, যার সাথে ACN-তে ৭ μl TMT রিএজেন্ট যোগ করা হয়েছিল। ঘনত্ব ছিল ৪৩.৭৫%। ৬০ মিনিট ইনকিউবেশনের পর, ৫% হাইড্রোক্সিলামাইনের ২ μl দিয়ে বিক্রিয়াটি নিভিয়ে ফেলা হয়েছিল। লেবেলযুক্ত পেপটাইডগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল, শুকানো হয়েছিল, 0.1% ফর্মিক অ্যাসিড (FA) এর 200μl-এ পুনঃসাসপেন্ড করা হয়েছিল, দুটি ভাগে বিভক্ত করা হয়েছিল এবং তারপর স্ব-নির্মিত স্টেজটিপস ব্যবহার করে ডিসল্ট করা হয়েছিল। UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph) ব্যবহার করে, দুটি অর্ধেকের একটি 130Å1.7μm C18 কণা দিয়ে ভরা 1mm x 150mm Acquity chromatographic কলামে ভগ্নাংশ করা হয়েছিল (ওয়াটারস, ক্যাটালগ নং SKU: 186006935)। থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক)। 30μl/মিনিট প্রবাহ হারে পেপটাইডগুলি পৃথক করুন, 1% থেকে 50% বাফার B থেকে 85 মিনিটের জন্য 96 মিনিটের ধাপে ধাপে গ্রেডিয়েন্ট সহ পৃথক করুন, 50% থেকে 95% বাফার B থেকে 3 মিনিটের জন্য, তারপর 95% বাফার B এর জন্য 8 মিনিট; বাফার A হল 5% ACN এবং 10 mM অ্যামোনিয়াম বাইকার্বোনেট (ABC), এবং বাফার B হল 80% ACN এবং 10 mM ABC। প্রতি 3 মিনিট অন্তর ভগ্নাংশ সংগ্রহ করুন এবং তাদের দুটি গ্রুপে (1 + 17, 2 + 18, ইত্যাদি) একত্রিত করুন এবং একটি ভ্যাকুয়াম সেন্ট্রিফিউজে শুকিয়ে নিন।
LC-MS/MS বিশ্লেষণ। ভর বর্ণালীমিতির জন্য, পেপটাইডগুলি (নম্বর r119.aq) 25 সেমি, 75 μm অভ্যন্তরীণ ব্যাসের PicoFrit বিশ্লেষণাত্মক কলামে (নতুন অবজেক্টিভ লেন্স, অংশ নম্বর PF7508250) আলাদা করা হয়েছিল যা 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ মাধ্যমের (ডঃ মাইশ, ম্যাট), Use EASY-nLC 1200 (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, জার্মানি) সজ্জিত ছিল। কলামটি 50°C তাপমাত্রায় বজায় রাখা হয়েছিল। বাফার A এবং B হল যথাক্রমে পানিতে 0.1% ফর্মিক অ্যাসিড এবং 80% ACN-এ 0.1% ফর্মিক অ্যাসিড। পেপটাইডগুলিকে 65 মিনিটের জন্য 6% থেকে 31% বাফার B থেকে এবং 31% থেকে 50% বাফার B থেকে 5 মিনিটের জন্য 200 nl/মিনিট গ্রেডিয়েন্ট সহ পৃথক করা হয়েছিল। অরবিট্র্যাপ ফিউশন ভর স্পেকট্রোমিটার (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে এলিউটেড পেপটাইডগুলি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। পেপটাইড প্রিকার্সার m/z পরিমাপ 350 থেকে 1500 m/z এর মধ্যে 120,000 রেজোলিউশনের সাথে সঞ্চালিত হয়। 27% স্বাভাবিক সংঘর্ষ শক্তি ব্যবহার করে, 2 থেকে 6 চার্জ অবস্থা সহ সবচেয়ে শক্তিশালী প্রিকার্সার উচ্চ শক্তি C ট্র্যাপ ডিসোসিয়েশন (HCD) ক্লিভেজের জন্য নির্বাচন করা হয়। চক্র সময় 1 সেকেন্ডে সেট করা হয়। পেপটাইড ফ্র্যাগমেন্টের m/z মান আয়ন ট্র্যাপে 5×104 এর ক্ষুদ্রতম AGC লক্ষ্য এবং সর্বোচ্চ 86 ms ইনজেকশন সময় ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল। ফ্র্যাগমেন্টেশনের পরে, প্রিকার্সারটিকে 45 সেকেন্ডের জন্য গতিশীল বর্জন তালিকায় রাখা হয়েছিল। TMT-লেবেলযুক্ত পেপটাইডগুলিকে 50 সেমি, 75 μm অ্যাক্লেইম পেপম্যাপ কলামে (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ক্যাটালগ নম্বর 164942) আলাদা করা হয়েছিল, এবং মাইগ্রেশন স্পেকট্রাটি একটি অরবিট্র্যাপ লুমোস ট্রাইব্রিড ভর স্পেকট্রোমিটার (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল যা উচ্চ-ক্ষেত্রের অসমমিতিক তরঙ্গরূপ আয়ন (FAIMS) সরঞ্জাম (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) দিয়ে সজ্জিত ছিল -50 এবং -70 V এর দুটি ক্ষতিপূরণ ভোল্টেজে। সিঙ্ক্রোনাইজেশন পূর্বসূরীর উপর ভিত্তি করে নির্বাচিত MS3 টিএমটি রিপোর্ট আয়ন সংকেত পরিমাপের জন্য ব্যবহৃত হয়। পেপটাইড বিচ্ছেদটি EASY-nLC 1200-এ 90% রৈখিক গ্রেডিয়েন্ট এলিউশন ব্যবহার করে করা হয়েছিল, যার বাফার ঘনত্ব 6% থেকে 31% ছিল; বাফার A ছিল 0.1% FA, এবং বাফার B ছিল 0.1% FA এবং 80% ACN। বিশ্লেষণাত্মক কলামটি 50°C তাপমাত্রায় পরিচালিত হয়। FAIMS ক্ষতিপূরণ ভোল্টেজ অনুসারে মূল ফাইলটি বিভক্ত করতে ফ্রিস্টাইল (সংস্করণ 1.6, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করুন।
প্রোটিন শনাক্তকরণ এবং পরিমাণ নির্ধারণ। ইন্টিগ্রেটেড অ্যান্ড্রোমিডা সার্চ ইঞ্জিন ব্যবহার করে, MaxQuant সংস্করণ 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) ব্যবহার করে মূল তথ্য বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। Aequorea victoria থেকে প্রাপ্ত Cre recombinase এবং YFP সিকোয়েন্স ছাড়াও, মাউস রেফারেন্স প্রোটিওমের ক্যানোনিকাল সিকোয়েন্স এবং আইসোফর্ম সিকোয়েন্সের জন্য পেপটাইড ফ্র্যাগমেন্ট স্পেকট্রা অনুসন্ধান করা হয়েছিল (প্রোটিওম আইডি UP000000589, মে 2017 সালে UniProt থেকে ডাউনলোড করা হয়েছিল)। মেথিওনিন জারণ এবং প্রোটিন N-টার্মিনাল অ্যাসিটাইলেশন পরিবর্তনশীল পরিবর্তন হিসাবে সেট করা হয়েছিল; সিস্টাইন কার্বামোয়েল মিথাইলেশন স্থির পরিবর্তন হিসাবে সেট করা হয়েছিল। হজমের পরামিতিগুলি "স্পেসিফিসিটি" এবং "ট্রিপসিন/P" এ সেট করা হয়েছে। প্রোটিন সনাক্তকরণের জন্য ব্যবহৃত পেপটাইড এবং রেজার পেপটাইডের সর্বনিম্ন সংখ্যা 1; অনন্য পেপটাইডের সর্বনিম্ন সংখ্যা 0। পেপটাইড মানচিত্র মিলের শর্তে, প্রোটিন সনাক্তকরণ হার ছিল 0.01। "দ্বিতীয় পেপটাইড" বিকল্পটি সক্রিয় করা হয়েছে। বিভিন্ন মূল ফাইলের মধ্যে সফল সনাক্তকরণ স্থানান্তর করতে "রনের মধ্যে মিল" বিকল্পটি ব্যবহার করুন। লেবেল-মুক্ত পরিমাণ নির্ধারণের জন্য LFQ ন্যূনতম অনুপাত গণনা 1 ব্যবহার করুন (LFQ) (60)। প্রতিটি সময় বিন্দুতে কমপক্ষে একটি জিনোটাইপ গ্রুপে কমপক্ষে দুটি বৈধ মানের জন্য LFQ তীব্রতা ফিল্টার করা হয় এবং 0.3 প্রস্থ সহ একটি স্বাভাবিক বিতরণ থেকে এক্সট্রাপোলেট করা হয় এবং 1.8 নীচে সরানো হয়। LFQ ফলাফল বিশ্লেষণ করতে Perseus কম্পিউটিং প্ল্যাটফর্ম (https://maxquant.net/perseus/) এবং R (https://r-project.org/) ব্যবহার করুন। ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণের জন্য limma সফ্টওয়্যার প্যাকেজ থেকে একটি দ্বি-মুখী মাঝারি t পরীক্ষা ব্যবহার করা হয়েছিল (61)। ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally এবং phetmap ব্যবহার করে অনুসন্ধানমূলক ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়। TMT-ভিত্তিক প্রোটিওমিক্স ডেটা MaxQuant সংস্করণ 1.6.10.43 ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। UniProt-এর মানব প্রোটিওমিক্স ডাটাবেস থেকে কাঁচা প্রোটিওমিক্স ডেটা অনুসন্ধান করুন, যা সেপ্টেম্বর ২০১৮ সালে ডাউনলোড করা হয়েছিল। বিশ্লেষণে প্রস্তুতকারকের দ্বারা সরবরাহিত আইসোটোপ বিশুদ্ধতা সংশোধন ফ্যাক্টর অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণের জন্য R-তে limma ব্যবহার করুন। মূল ডেটা, ডাটাবেস অনুসন্ধান ফলাফল এবং ডেটা বিশ্লেষণ কর্মপ্রবাহ এবং ফলাফলগুলি PRIDE অংশীদার সংগ্রহস্থলের মাধ্যমে ডেটা সেট শনাক্তকারী PXD019690 সহ ProteomeXchange জোটে সংরক্ষণ করা হয়।
কার্যকরী টীকা বিশ্লেষণকে সমৃদ্ধ করে। ৮ সপ্তাহে ডেটা সেটের কার্যকরী টীকা পদের সমৃদ্ধতা নির্ধারণের জন্য ইনজেনুইটি পাথওয়ে অ্যানালাইসিস (QIAGEN) টুল ব্যবহার করা হয়েছিল (চিত্র ১)। সংক্ষেপে, LC-MS/MS (ট্যান্ডেম ভর স্পেকট্রোমেট্রি) ডেটা বিশ্লেষণ থেকে প্রাপ্ত পরিমাণগত প্রোটিন তালিকা নিম্নলিখিত ফিল্টার মানদণ্ডের সাথে ব্যবহার করা হয়: Mus musculus প্রজাতি এবং পটভূমি হিসাবে নির্বাচিত হয়, এবং বিভাগটি দেখায় যে Benjamini দ্বারা 0.05 বা তার কম সমৃদ্ধকরণের জন্য সামঞ্জস্য করা P মান উল্লেখযোগ্য বলে বিবেচিত হয়। এই গ্রাফের জন্য, সামঞ্জস্যপূর্ণ P মানের উপর ভিত্তি করে প্রতিটি ক্লাস্টারে শীর্ষ পাঁচটি অতিরিক্ত বিভাগ দেখানো হয়েছে। একাধিক t-পরীক্ষা ব্যবহার করে, Benjamini, Krieger এবং Yekutieli (Q = 5%) এর দুই-পর্যায়ের রৈখিক বুস্ট প্রোগ্রাম ব্যবহার করে, প্রতিটি বিভাগে চিহ্নিত গুরুত্বপূর্ণ প্রার্থীদের উপর সময়-কোর্স প্রোটিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ করা হয় এবং প্রতিটি সারি আলাদাভাবে বিশ্লেষণ করা হয়। একটি সামঞ্জস্যপূর্ণ SD গ্রহণ করার প্রয়োজন নেই।
এই গবেষণার ফলাফল প্রকাশিত ডাটাবেসের সাথে তুলনা করার জন্য এবং চিত্র ১-এ একটি ভেন ডায়াগ্রাম তৈরি করার জন্য, আমরা পরিমাণগত প্রোটিন তালিকাটি মিটোকার্টা ২.০ টীকা (২৪) এর সাথে একত্রিত করেছি। ডায়াগ্রামটি তৈরি করতে অনলাইন টুল ড্র ভেন ডায়াগ্রাম (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) ব্যবহার করুন।
প্রোটিওমিক্স বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহৃত পরিসংখ্যানগত পদ্ধতি সম্পর্কে বিস্তারিত তথ্যের জন্য, অনুগ্রহ করে উপকরণ এবং পদ্ধতির সংশ্লিষ্ট বিভাগটি দেখুন। অন্যান্য সমস্ত পরীক্ষার জন্য, সংশ্লিষ্ট কিংবদন্তিতে বিস্তারিত তথ্য পাওয়া যাবে। অন্যথায় নির্দিষ্ট না করা হলে, সমস্ত তথ্য গড় ± SEM হিসাবে প্রকাশ করা হয় এবং সমস্ত পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ গ্রাফপ্যাড প্রিজম 8.1.2 সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে সম্পাদিত হয়েছিল।
এই প্রবন্ধের জন্য সম্পূরক উপকরণের জন্য, অনুগ্রহ করে http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 দেখুন।
এটি একটি উন্মুক্ত প্রবেশাধিকার নিবন্ধ যা ক্রিয়েটিভ কমন্স অ্যাট্রিবিউশন-নন-কমার্শিয়াল লাইসেন্সের শর্তাবলীর অধীনে বিতরণ করা হয়েছে, যা যেকোনো মাধ্যমে ব্যবহার, বিতরণ এবং পুনরুৎপাদনের অনুমতি দেয়, যতক্ষণ না চূড়ান্ত ব্যবহার বাণিজ্যিক লাভের জন্য না হয় এবং মূল কাজটি সঠিক বলে মনে করা হয়। তথ্যসূত্র।
দ্রষ্টব্য: আমরা আপনাকে কেবল আপনার ইমেল ঠিকানাটি সরবরাহ করতে বলব যাতে আপনি পৃষ্ঠাটিতে যাকে সুপারিশ করবেন তিনি জানেন যে আপনি চান যে তারা ইমেলটি দেখুক এবং এটি স্প্যাম নয়। আমরা কোনও ইমেল ঠিকানা ক্যাপচার করব না।
এই প্রশ্নটি আপনি একজন ভিজিটর কিনা তা পরীক্ষা করতে এবং স্বয়ংক্রিয় স্প্যাম জমা প্রতিরোধ করতে ব্যবহৃত হয়।
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. লারসন
অকার্যকর নিউরনের প্রোটিওমিক্স বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে বিপাকীয় প্রোগ্রামগুলি নিউরোডিজেনারেশন প্রতিরোধের জন্য সক্রিয় হয়।
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. লারসন
অকার্যকর নিউরনের প্রোটিওমিক্স বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে বিপাকীয় প্রোগ্রামগুলি নিউরোডিজেনারেশন প্রতিরোধের জন্য সক্রিয় হয়।
©2020 আমেরিকান অ্যাসোসিয়েশন ফর দ্য অ্যাডভান্সমেন্ট অফ সায়েন্স। সমস্ত অধিকার সংরক্ষিত AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef এবং COUNTER এর অংশীদার। Science Advances ISSN 2375-2548.