Nature.com-এ আসার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি যে ব্রাউজারটি ব্যবহার করছেন, সেটিতে CSS সাপোর্ট সীমিত। সর্বোত্তম ফলাফলের জন্য, আমরা আপনাকে ব্রাউজারের একটি নতুন সংস্করণ ব্যবহার করার পরামর্শ দিচ্ছি (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে কম্প্যাটিবিলিটি মোড নিষ্ক্রিয় করুন)। আপাতত, নিরবচ্ছিন্ন সাপোর্ট নিশ্চিত করার জন্য, আমরা সাইটটি কোনো স্টাইলিং বা জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই প্রদর্শন করছি।
অটিজম স্পেকট্রাম ডিসঅর্ডারের মতো স্নায়ুবিকাশজনিত ব্যাধিতে মাইটোকন্ড্রিয়াল অকার্যকারিতার ভূমিকা অধ্যয়নের জন্য প্রোপিওনিক অ্যাসিড (PPA) ব্যবহৃত হয়। PPA মাইটোকন্ড্রিয়াল বায়োজেনেসিস, মেটাবলিজম এবং টার্নওভার ব্যাহত করে বলে জানা যায়। তবে, এই প্রক্রিয়াগুলোর জটিল কালিক প্রকৃতির কারণে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্স, ফিশন এবং ফিউশনের উপর PPA-এর প্রভাব এখনও সমস্যাযুক্ত। এখানে, আমরা নিউরন-সদৃশ SH-SY5Y কোষে PPA কীভাবে মাইটোকন্ড্রিয়াল আল্ট্রাস্ট্রাকচার, মরফোলজি এবং ডায়নামিক্সকে প্রভাবিত করে তা তদন্ত করতে পরিপূরক পরিমাণগত ইমেজিং কৌশল ব্যবহার করেছি। PPA (5 mM) মাইটোকন্ড্রিয়াল এরিয়া (p < 0.01), ফেরেট ডায়ামিটার ও সার্কামফারেন্স (p < 0.05), এবং এরিয়া 2 (p < 0.01)-এ উল্লেখযোগ্য হ্রাস ঘটিয়েছে। মাইটোকন্ড্রিয়াল ইভেন্ট লোকেটর বিশ্লেষণে ফিশন এবং ফিউশন ইভেন্টে একটি উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি (p < 0.05) দেখা গেছে, যার ফলে চাপের পরিস্থিতিতে মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কের অখণ্ডতা বজায় থাকে। এছাড়াও, cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) এবং OPA1 (p < 0.05)-এর mRNA এক্সপ্রেশন উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছিল। এটি চাপের পরিস্থিতিতে কার্যকারিতা বজায় রাখার জন্য মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজি, বায়োজেনেসিস এবং ডায়নামিক্সের পুনর্গঠনকে চিত্রিত করে। আমাদের ডেটা মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্সের উপর PPA-এর প্রভাব সম্পর্কে নতুন অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল স্ট্রেস প্রতিক্রিয়ার সাথে জড়িত জটিল নিয়ন্ত্রক প্রক্রিয়াগুলি অধ্যয়নের জন্য ইমেজিং কৌশলগুলির উপযোগিতা তুলে ধরে।
শক্তি উৎপাদন এবং জৈব সংশ্লেষণে তাদের সাধারণ ভূমিকার বাইরেও মাইটোকন্ড্রিয়া বিভিন্ন কোষীয় কার্যকলাপে অবিচ্ছেদ্যভাবে অংশগ্রহণ করে। মাইটোকন্ড্রিয়াল মেটাবলিজম ক্যালসিয়াম সিগন্যালিং, মেটাবলিক এবং রিডক্স হোমিওস্ট্যাসিস, প্রদাহজনক সিগন্যালিং, এপিজেনেটিক পরিবর্তন, কোষের বিস্তার, বিভেদন এবং প্রোগ্রামড সেল ডেথ¹-এর একটি মূল নিয়ন্ত্রক। বিশেষ করে, মাইটোকন্ড্রিয়াল মেটাবলিজম নিউরোনাল বিকাশ, বেঁচে থাকা এবং কার্যকারিতার জন্য অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ এবং এটি নিউরোপ্যাথলজির বিভিন্ন প্রকাশের সাথে ব্যাপকভাবে জড়িত²,³,⁴।
গত দশকে, বিপাকীয় অবস্থা নিউরোজেনেসিস, ডিফারেন্সিয়েশন, ম্যাচুরেশন এবং প্লাস্টিসিটির একটি কেন্দ্রীয় নিয়ন্ত্রক হিসেবে আবির্ভূত হয়েছে৫,৬। সম্প্রতি, মাইটোকন্ড্রিয়ার আকার ও গতিশীলতা মাইটোসিসের বিশেষভাবে গুরুত্বপূর্ণ উপাদান হয়ে উঠেছে; মাইটোসিস একটি গতিশীল প্রক্রিয়া যা কোষের মধ্যে সুস্থ মাইটোকন্ড্রিয়ার একটি পুল বজায় রাখে। মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিশীলতা মাইটোকন্ড্রিয়াল বায়োজেনেসিস এবং বায়োএনার্জেটিক্স থেকে শুরু করে মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিশন, ফিউশন, পরিবহন এবং ক্লিয়ারেন্স পর্যন্ত বিস্তৃত জটিল আন্তঃনির্ভরশীল পথ দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়৭,৮। এই সমন্বিত প্রক্রিয়াগুলির যেকোনো একটির ব্যাঘাত সুস্থ মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কের রক্ষণাবেক্ষণকে ব্যাহত করে এবং স্নায়ু বিকাশের উপর এর গভীর কার্যকরী পরিণতি রয়েছে৯,১০। প্রকৃতপক্ষে, মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিশীলতার নিয়ন্ত্রণহীনতা অটিজম স্পেকট্রাম ডিসঅর্ডার (ASD) সহ অনেক মানসিক, স্নায়ুক্ষয়ী এবং স্নায়ু বিকাশজনিত রোগে পরিলক্ষিত হয়১১,১২।
এএসডি হলো একটি ভিন্নধর্মী স্নায়ু-বিকাশজনিত ব্যাধি, যার একটি জটিল জিনগত এবং এপিজেনেটিক গঠন রয়েছে। এএসডি-র বংশগতি নিয়ে কোনো বিতর্ক নেই, কিন্তু এর অন্তর্নিহিত আণবিক কারণ সম্পর্কে এখনও ভালোভাবে জানা যায়নি। প্রি-ক্লিনিক্যাল মডেল, ক্লিনিক্যাল গবেষণা এবং মাল্টি-ওমিক্স আণবিক ডেটাসেট থেকে প্রাপ্ত ক্রমবর্ধমান তথ্য এএসডি-তে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার ক্রমবর্ধমান প্রমাণ দিচ্ছে¹³,¹⁴। আমরা পূর্বে এএসডি আক্রান্ত রোগীদের একটি দলে জিনোম-ব্যাপী ডিএনএ মিথাইলেশন স্ক্রিনিং করেছিলাম এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল বিপাকীয় পথ বরাবর গুচ্ছবদ্ধ ভিন্নভাবে মিথাইলেটেড জিন শনাক্ত করেছিলাম¹⁵। পরবর্তীতে আমরা মাইটোকন্ড্রিয়াল বায়োজেনেসিস এবং ডায়নামিক্সের কেন্দ্রীয় নিয়ন্ত্রকদের ভিন্ন মিথাইলেশনের কথা জানিয়েছিলাম, যা এএসডি-তে বর্ধিত mtDNA কপি সংখ্যা এবং পরিবর্তিত মূত্রীয় বিপাকীয় প্রোফাইলের সাথে সম্পর্কিত ছিল¹⁶। আমাদের তথ্য ক্রমবর্ধমান প্রমাণ দিচ্ছে যে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্স এবং হোমিওস্ট্যাসিস এএসডি-র প্যাথোফিজিওলজিতে একটি কেন্দ্রীয় ভূমিকা পালন করে। অতএব, মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্স, মরফোলজি এবং ফাংশনের মধ্যে সম্পর্কের কার্যকারণগত বোঝাপড়া উন্নত করা হলো সেকেন্ডারি মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা দ্বারা চিহ্নিত স্নায়বিক রোগ নিয়ে চলমান গবেষণার একটি প্রধান লক্ষ্য।
মাইটোকন্ড্রিয়াল স্ট্রেস প্রতিক্রিয়ায় নির্দিষ্ট জিনের ভূমিকা অধ্যয়নের জন্য প্রায়শই আণবিক কৌশল ব্যবহার করা হয়। তবে, মাইটোটিক নিয়ন্ত্রণ ব্যবস্থার বহুমুখী এবং সাময়িক প্রকৃতির কারণে এই পদ্ধতি সীমিত হতে পারে। অধিকন্তু, মাইটোকন্ড্রিয়াল জিনের ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন কার্যকরী পরিবর্তনের একটি পরোক্ষ সূচক, বিশেষ করে যেহেতু সাধারণত শুধুমাত্র সীমিত সংখ্যক জিন বিশ্লেষণ করা হয়। তাই, মাইটোকন্ড্রিয়াল ফাংশন এবং বায়োএনার্জেটিক্স অধ্যয়নের জন্য আরও সরাসরি পদ্ধতির প্রস্তাব করা হয়েছে¹⁷। মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজি মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্সের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত। শক্তি উৎপাদন এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ও কোষের বেঁচে থাকার জন্য মাইটোকন্ড্রিয়ার আকৃতি, সংযোগ এবং গঠন অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ⁵,¹⁸। অধিকন্তু, মাইটোসিসের বিভিন্ন উপাদান মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজির পরিবর্তনের উপর আলোকপাত করে, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিসফাংশনের কার্যকর শেষবিন্দু হিসেবে কাজ করতে পারে এবং পরবর্তী মেকানিজম-ভিত্তিক গবেষণার জন্য ভিত্তি প্রদান করতে পারে।
ট্রান্সমিশন ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপি (TEM) ব্যবহার করে মাইটোকন্ড্রিয়ার গঠন সরাসরি পর্যবেক্ষণ করা যায়, যা কোষের অতি-আণুবীক্ষণিক গঠন সম্পর্কে বিস্তারিত অধ্যয়নের সুযোগ করে দেয়। TEM শুধুমাত্র জিন ট্রান্সক্রিপশন, প্রোটিন এক্সপ্রেশন বা কোষের সমষ্টিতে মাইটোকন্ড্রিয়ার কার্যকারিতার প্যারামিটারের উপর নির্ভর না করে, প্রতিটি মাইটোকন্ড্রিয়ার রেজোলিউশনে মাইটোকন্ড্রিয়াল ক্রিস্টির গঠন, আকৃতি এবং কাঠামো সরাসরি দেখতে সাহায্য করে¹⁷,¹⁹,²⁰। এছাড়াও, TEM মাইটোকন্ড্রিয়া এবং অন্যান্য অঙ্গাণু, যেমন এন্ডোপ্লাজমিক রেটিকুলাম এবং অটোফ্যাগোসোমের মধ্যেকার মিথস্ক্রিয়া অধ্যয়নে সহায়তা করে, যা মাইটোকন্ড্রিয়ার কার্যকারিতা এবং হোমিওস্ট্যাসিসে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে²¹,²²। সুতরাং, নির্দিষ্ট পাথওয়ে বা জিনের উপর মনোযোগ দেওয়ার আগে মাইটোকন্ড্রিয়ার অকার্যকারিতা অধ্যয়নের জন্য TEM একটি ভালো সূচনা বিন্দু। যেহেতু নিউরোপ্যাথলজির ক্ষেত্রে মাইটোকন্ড্রিয়ার কার্যকারিতা ক্রমশ প্রাসঙ্গিক হয়ে উঠছে, তাই ইন ভিট্রো নিউরোনাল মডেলে মাইটোকন্ড্রিয়ার গঠন এবং গতিশীলতা সরাসরি ও পরিমাণগতভাবে অধ্যয়ন করার একটি সুস্পষ্ট প্রয়োজন রয়েছে।
এই প্রবন্ধে, আমরা অটিজম স্পেকট্রাম ডিসঅর্ডারে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার একটি নিউরোনাল মডেলে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্স পরীক্ষা করি। আমরা পূর্বে ASD-তে প্রোপিওনাইল-কোএ কার্বোক্সিলেজ বিটা (PCCB)-এর ডিফারেনশিয়াল মিথাইলেশন সম্পর্কে রিপোর্ট করেছিলাম¹⁵, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল প্রোপিওনাইল-কোএ কার্বোক্সিলেজ এনজাইম PCC-এর একটি সাবইউনিট। PCC-এর ডিসরেগুলেশন প্রোপিওনাইল ডেরিভেটিভের বিষাক্ত জমাট বাঁধার কারণ হিসেবে পরিচিত, যার মধ্যে প্রোপিওনিক অ্যাসিড (PPA)²³,²⁴,²⁵ অন্তর্ভুক্ত। PPA ইন ভিভোতে নিউরোনাল মেটাবলিজম ব্যাহত করে এবং আচরণ পরিবর্তন করে বলে দেখানো হয়েছে এবং এটি ASD-তে জড়িত নিউরোডেভেলপমেন্টাল প্রক্রিয়া অধ্যয়নের জন্য একটি প্রতিষ্ঠিত প্রাণী মডেল²⁶,²⁷,²⁸। উপরন্তু, PPA ইন ভিট্রোতে মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেন পটেনশিয়াল, বায়োজেনেসিস এবং রেসপিরেশন ব্যাহত করে বলে রিপোর্ট করা হয়েছে এবং নিউরনে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার মডেল তৈরিতে এটি ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়েছে²⁹,³⁰। তবে, PPA-প্ররোচিত মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজি এবং ডায়নামিক্সের উপর প্রভাব এখনও ভালোভাবে বোঝা যায়নি।
এই গবেষণায় SH-SY5Y কোষে মাইটোকন্ড্রিয়ার আকার, গতিশীলতা এবং কার্যকারিতার উপর PPA-এর প্রভাব পরিমাপ করার জন্য পরিপূরক ইমেজিং কৌশল ব্যবহার করা হয়েছে। প্রথমে, আমরা মাইটোকন্ড্রিয়ার আকার এবং অতি-কাঠামোর পরিবর্তন দেখার জন্য একটি TEM পদ্ধতি তৈরি করেছি¹⁷,³¹,³²। মাইটোকন্ড্রিয়ার গতিশীল প্রকৃতির কারণে³³, আমরা PPA চাপের অধীনে ফিশন এবং ফিউশন ঘটনার ভারসাম্য, মাইটোকন্ড্রিয়ার সংখ্যা এবং আয়তনের পরিবর্তন পরিমাপ করার জন্য মাইটোকন্ড্রিয়াল ইভেন্ট লোকালাইজার (MEL) বিশ্লেষণও ব্যবহার করেছি। পরিশেষে, আমরা পরীক্ষা করে দেখেছি যে মাইটোকন্ড্রিয়ার আকার এবং গতিশীলতা বায়োজেনেসিস, ফিশন এবং ফিউশনের সাথে জড়িত জিনের অভিব্যক্তির পরিবর্তনের সাথে সম্পর্কিত কিনা। সব মিলিয়ে, আমাদের তথ্য মাইটোকন্ড্রিয়ার গতিশীলতা নিয়ন্ত্রণকারী প্রক্রিয়াগুলির জটিলতা ব্যাখ্যা করার চ্যালেঞ্জ তুলে ধরে। আমরা SH-SY5Y কোষে মাইটোসিসের একটি পরিমাপযোগ্য অভিসারী শেষবিন্দু হিসাবে মাইটোকন্ড্রিয়ার আকার অধ্যয়নে TEM-এর উপযোগিতা তুলে ধরেছি। এছাড়াও, আমরা উল্লেখ করেছি যে TEM ডেটা সবচেয়ে সমৃদ্ধ তথ্য প্রদান করে যখন এটি এমন ইমেজিং কৌশলের সাথে মিলিত হয় যা বিপাকীয় চাপের প্রতিক্রিয়ায় গতিশীল ঘটনাগুলিও ধারণ করে। স্নায়ুকোষ বিভাজনকে সমর্থনকারী আণবিক নিয়ন্ত্রণমূলক প্রক্রিয়াগুলোর আরও বিশদ বিশ্লেষণ স্নায়ুতন্ত্র এবং স্নায়ুক্ষয়ী রোগসমূহের মাইটোকন্ড্রিয়াল উপাদান সম্পর্কে গুরুত্বপূর্ণ অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করতে পারে।
মাইটোকন্ড্রিয়াল স্ট্রেস প্ররোচিত করার জন্য, SH-SY5Y কোষগুলোকে ৩ mM এবং ৫ mM সোডিয়াম প্রোপিওনেট (NaP) ব্যবহার করে PPA দ্বারা ট্রিট করা হয়েছিল। TEM-এর আগে, নমুনাগুলোকে উচ্চ-চাপ হিমায়ন এবং সাধারণ হিমায়নের মাধ্যমে ক্রায়োজেনিক নমুনা প্রস্তুতির অধীনে আনা হয়েছিল (চিত্র ১ক)। আমরা তিনটি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেট জুড়ে মাইটোকন্ড্রিয়াল পপুলেশনের আটটি মরফোলজিক্যাল প্যারামিটার পরিমাপ করার জন্য একটি স্বয়ংক্রিয় মাইটোকন্ড্রিয়াল ইমেজ অ্যানালাইসিস পাইপলাইন তৈরি করেছি। আমরা দেখতে পেয়েছি যে PPA ট্রিটমেন্ট চারটি প্যারামিটারকে উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তন করেছে: এরিয়া ২, এরিয়া, পেরিমিটার এবং ফেরেট ডায়ামিটার (চিত্র ১খ–ঙ)। ৩ mM এবং ৫ mM উভয় PPA ট্রিটমেন্টেই এরিয়া ২ উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে (যথাক্রমে p = ০.০১৮৩ এবং p = ০.০০২) (চিত্র ১খ), যেখানে এরিয়া (p = ০.০০৩), পেরিমিটার (p = ০.০১০৬) এবং ফেরেট ডায়ামিটার সবগুলোই উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে। কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় ৫ mM ট্রিটমেন্ট গ্রুপে একটি উল্লেখযোগ্য হ্রাস (p = ০.০১৭২) পরিলক্ষিত হয়েছে (চিত্র ১গ–ঙ)। ক্ষেত্রফল এবং পরিধিতে উল্লেখযোগ্য হ্রাস থেকে দেখা যায় যে, ৫ mM PPA দ্বারা ট্রিট করা কোষগুলিতে মাইটোকন্ড্রিয়াগুলো ছোট ও বেশি গোলাকার ছিল এবং এই মাইটোকন্ড্রিয়াগুলো কন্ট্রোল কোষের মাইটোকন্ড্রিয়াগুলোর তুলনায় কম লম্বাটে ছিল। এটি ফেরেট ব্যাসের উল্লেখযোগ্য হ্রাসের সাথেও সামঞ্জস্যপূর্ণ, যা একটি স্বাধীন প্যারামিটার এবং কণার প্রান্তগুলোর মধ্যে বৃহত্তম দূরত্বের হ্রাস নির্দেশ করে। ক্রিস্টির আল্ট্রাস্ট্রাকচারে পরিবর্তন লক্ষ্য করা গেছে: PPA স্ট্রেসের প্রভাবে ক্রিস্টিগুলো কম সুস্পষ্ট হয়ে ওঠে (চিত্র ১ক, প্যানেল B)। তবে, সব ছবিতে ক্রিস্টির আল্ট্রাস্ট্রাকচার স্পষ্টভাবে প্রতিফলিত হয়নি, তাই এই পরিবর্তনগুলোর কোনো পরিমাণগত বিশ্লেষণ করা হয়নি। এই TEM ডেটা তিনটি সম্ভাব্য পরিস্থিতি প্রতিফলিত করতে পারে: (১) PPA ফিশন বাড়ায় বা ফিউশনকে বাধা দেয়, যার ফলে বিদ্যমান মাইটোকন্ড্রিয়া আকারে ছোট হয়ে যায়; (২) বর্ধিত বায়োজেনেসিস নতুন, ছোট মাইটোকন্ড্রিয়া তৈরি করে অথবা (৩) একই সাথে উভয় প্রক্রিয়াকে প্ররোচিত করে। যদিও এই অবস্থাগুলো TEM দ্বারা আলাদা করা যায় না, তবে উল্লেখযোগ্য আকারগত পরিবর্তনগুলো PPA স্ট্রেসের অধীনে মাইটোকন্ড্রিয়াল হোমিওস্ট্যাসিস এবং ডায়নামিক্সে পরিবর্তন নির্দেশ করে। পরবর্তীতে আমরা এই গতিশীলতা এবং এর অন্তর্নিহিত সম্ভাব্য প্রক্রিয়াগুলোকে আরও বিশদভাবে চিহ্নিত করার জন্য অতিরিক্ত পরামিতি অন্বেষণ করেছি।
প্রোপিওনিক অ্যাসিড (PPA) মাইটোকন্ড্রিয়ার আকার পরিবর্তন করে। (ক) প্রতিনিধিত্বমূলক ট্রান্সমিশন ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপি (TEM) চিত্র যা দেখাচ্ছে যে PPA-এর মাত্রা বৃদ্ধির সাথে সাথে মাইটোকন্ড্রিয়ার আকার হ্রাস পায় এবং মাইটোকন্ড্রিয়াগুলো আরও ছোট ও গোলাকার হয়ে ওঠে; যথাক্রমে ০ mM (চিকিৎসাবিহীন), ৩ mM এবং ৫ mM। লাল তীরচিহ্নগুলো মাইটোকন্ড্রিয়া নির্দেশ করে। (খ–ঙ) ২৪ ঘণ্টা ধরে PPA দ্বারা চিকিৎসাকৃত SH-SY5Y কোষগুলোকে TEM-এর জন্য প্রস্তুত করা হয়েছিল এবং ফলাফলগুলো Fiji/ImageJ ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। আটটি প্যারামিটারের মধ্যে চারটি কন্ট্রোল (চিকিৎসাবিহীন, ০ mM PPA) এবং চিকিৎসাকৃত (৩ mM এবং ৫ mM PPA) কোষগুলোর মধ্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখিয়েছে। (খ) অঞ্চল ২, (গ) ক্ষেত্রফল, (ঘ) পরিধি, (ঙ) ফেরেট ব্যাস। উল্লেখযোগ্য পার্থক্য (p < ০.০৫) নির্ধারণ করার জন্য একমুখী বৈশ্লেষিক ভেদ (কন্ট্রোল বনাম চিকিৎসা) এবং ডানেটের বহুবিধ তুলনা পরীক্ষা ব্যবহার করা হয়েছিল। ডেটা পয়েন্টগুলো প্রতিটি স্বতন্ত্র কোষের গড় মাইটোকন্ড্রিয়াল মানকে প্রতিনিধিত্ব করে এবং এরর বারগুলো গড় ± SEM নির্দেশ করে। প্রদর্শিত ডেটা n = 3 এর প্রতিনিধিত্ব করে, যেখানে প্রতিটি রেপ্লিকেটে কমপক্ষে ২৪টি কোষ ছিল; মোট ২৬৬টি চিত্র বিশ্লেষণ করা হয়েছে; * নির্দেশ করে p < 0.05, ** নির্দেশ করে p < 0.01।
PPA-এর প্রতি মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্স কীভাবে সাড়া দেয় তা আরও বিশদভাবে চিহ্নিত করার জন্য, আমরা টেট্রামিথাইলরোডামিন ইথাইল এস্টার (TMRE) দিয়ে মাইটোকন্ড্রিয়াকে রঞ্জিত করেছি এবং ৩ ও ৫ mM PPA-তে ২৪ ঘণ্টা পর মাইটোকন্ড্রিয়ার অবস্থান ও পরিমাণ নির্ণয়ের জন্য টাইম-ল্যাপস মাইক্রোস্কোপি এবং MEL বিশ্লেষণ ব্যবহার করেছি। ফিশন এবং ফিউশন ঘটনার ট্রিটমেন্ট। (চিত্র ২ক)। MEL বিশ্লেষণের পর, মাইটোকন্ড্রিয়াল কাঠামোর সংখ্যা এবং তাদের গড় আয়তনের পরিমাণ নির্ণয়ের জন্য মাইটোকন্ড্রিয়াকে আরও বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। আমরা লক্ষ্য করেছি যে ৩ mM [৪.৯ ± ০.৩ (p < ০.০৫)] এ ফিশন ঘটনার সংখ্যায় একটি ছোট কিন্তু তাৎপর্যপূর্ণ বৃদ্ধি ঘটেছে, যেখানে ৫ mM এ ফিশন [৫.৬ ± ০.৩ (p < ০.০৫))] এবং ফিউশন [৫.৪ ± ০.৫ (p < ০.০৫)] ও ফিউশন [৫.৪ ± ০.৫ (p < ০.০৫)] ঘটনাগুলো কন্ট্রোলের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র ৩খ)। ৩ [৩২.৬ ± ২.১ (p < ০.০৫)] এবং ৫ mM [৩৪.১ ± ২.২ (p < ০.০৫)] উভয় ক্ষেত্রেই মাইটোকন্ড্রিয়ার সংখ্যা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র ৩গ), যদিও প্রতিটি মাইটোকন্ড্রিয়াল কাঠামোর গড় আয়তন অপরিবর্তিত ছিল (চিত্র ৩ঘ)। সব মিলিয়ে, এটি ইঙ্গিত দেয় যে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্সের পুনর্গঠন একটি ক্ষতিপূরণমূলক প্রতিক্রিয়া হিসেবে কাজ করে যা সফলভাবে মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কের অখণ্ডতা বজায় রাখে। ৩ mM PPA-তে ফিশন ঘটনার সংখ্যা বৃদ্ধি ইঙ্গিত দেয় যে মাইটোকন্ড্রিয়ার সংখ্যা বৃদ্ধি আংশিকভাবে মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিশনের কারণে হয়েছে, কিন্তু যেহেতু গড় মাইটোকন্ড্রিয়াল আয়তন মূলত অপরিবর্তিত থাকে, তাই একটি অতিরিক্ত ক্ষতিপূরণমূলক প্রতিক্রিয়া হিসেবে বায়োজেনেসিসকে বাতিল করা যায় না। যাইহোক, এই তথ্যগুলো TEM দ্বারা পর্যবেক্ষণ করা ছোট, গোলাকার মাইটোকন্ড্রিয়াল কাঠামোর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ এবং PPA দ্বারা প্ররোচিত মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্সের উল্লেখযোগ্য পরিবর্তনও প্রদর্শন করে।
প্রোপিওনিক অ্যাসিড (PPA) নেটওয়ার্কের অখণ্ডতা বজায় রাখার জন্য গতিশীল মাইটোকন্ড্রিয়াল পুনর্গঠন ঘটায়। SH-SY5Y কোষগুলোকে কালচার করা হয়েছিল, ২৪ ঘণ্টার জন্য ৩ এবং ৫ mM PPA দিয়ে ট্রিটমেন্ট করা হয়েছিল এবং TMRE ও Hoechst 33342 দিয়ে স্টেইন করার পর MEL বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। (ক) প্রতিটি কন্ডিশনের জন্য সময় ২ (t2)-তে রঙিন এবং বাইনারিকৃত সর্বোচ্চ তীব্রতার প্রক্ষেপণ প্রদর্শনকারী প্রতিনিধিত্বমূলক টাইম-ল্যাপস মাইক্রোস্কোপি চিত্র। সময়ের সাথে সাথে গতিশীলতা চিত্রিত করার জন্য প্রতিটি বাইনারি চিত্রে নির্দেশিত নির্বাচিত অঞ্চলগুলোকে তিনটি ভিন্ন সময়সীমায় (t1-t3) উন্নত করে 3D-তে প্রদর্শন করা হয়েছে; ফিউশন ইভেন্টগুলো সবুজ রঙে হাইলাইট করা হয়েছে; ফিশন ইভেন্টগুলো সবুজ রঙে হাইলাইট করা হয়েছে। লাল রঙে প্রদর্শিত। (খ) প্রতিটি কন্ডিশনের জন্য গতিশীল ইভেন্টের গড় সংখ্যা। (গ) প্রতি কোষে মাইটোকন্ড্রিয়াল কাঠামোর গড় সংখ্যা। (ঘ) প্রতি কোষে প্রতিটি মাইটোকন্ড্রিয়াল কাঠামোর গড় আয়তন (µm³)। প্রদর্শিত ডেটা প্রতিটি ট্রিটমেন্ট গ্রুপের n = ১৫টি কোষের প্রতিনিধিত্বমূলক। প্রদর্শিত এরর বারগুলো গড় ± SEM নির্দেশ করে, স্কেল বার = ১০ μm, * p < ০.০৫।
প্রোপিওনিক অ্যাসিড (PPA) মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্সের সাথে সম্পর্কিত জিনগুলির ট্রান্সক্রিপশনাল সাপ্রেশন ঘটায়। SH-SY5Y কোষগুলিকে 24 ঘন্টার জন্য 3 এবং 5 mM PPA দিয়ে ট্রিট করা হয়েছিল। RT-qPCR ব্যবহার করে আপেক্ষিক জিন কোয়ান্টিফিকেশন করা হয়েছিল এবং B2M-এর সাথে নরমালাইজ করা হয়েছিল। মাইটোকন্ড্রিয়াল বায়োজেনেসিস জিন (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 এবং (d) NFE2L2। মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিউশন এবং ফিশন জিন (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 এবং (i) DRP1। ওয়ান-ওয়ে অ্যানোভা (কন্ট্রোল বনাম ট্রিটমেন্ট) এবং ডানেটের মাল্টিপল কম্প্যারিসন টেস্ট ব্যবহার করে তাৎপর্যপূর্ণ পার্থক্য (p < 0.05) পরীক্ষা করা হয়েছিল: * নির্দেশ করে p < 0.05, ** নির্দেশ করে p < 0.01, এবং **** নির্দেশ করে p < 0.0001। বারগুলি গড় এক্সপ্রেশন ± SEM উপস্থাপন করে। প্রদর্শিত ডেটা n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), এবং n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) সংখ্যক বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেটের প্রতিনিধিত্ব করে।
TEM এবং MEL বিশ্লেষণ থেকে প্রাপ্ত তথ্য একত্রে নির্দেশ করে যে PPA মাইটোকন্ড্রিয়ার গঠন এবং গতিশীলতা পরিবর্তন করে। তবে, এই ইমেজিং কৌশলগুলি এই প্রক্রিয়াগুলির চালিকাশক্তির অন্তর্নিহিত কার্যপ্রণালী সম্পর্কে কোনো ধারণা দেয় না। তাই আমরা PPA প্রয়োগের প্রতিক্রিয়ায় মাইটোকন্ড্রিয়ার গতিশীলতা, জৈবগঠন এবং মাইটোসিসের নয়টি প্রধান নিয়ন্ত্রকের mRNA এক্সপ্রেশন পরীক্ষা করেছি। আমরা 3 mM এবং 5 mM PPA দিয়ে 24 ঘন্টা প্রয়োগের পর সেল মাইলোমা অনকোজিন (cMYC), নিউক্লিয়ার রেসপিরেটরি ফ্যাক্টর (NRF1), মাইটোকন্ড্রিয়াল ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর 1 (TFAM), NFE2-লাইক ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর BZIP (NFE2L2), গ্যাস্ট্রিন-লাইক প্রোটিন 2 (STOML2), অপটিক নার্ভ অ্যাট্রোফি 1 (OPA1), মাইটোফিউসিন 1 (MFN1), মাইটোফিউসিন 2 (MFN2) এবং ডাইনামিন-রিলেটেড প্রোটিন 1 (DRP1) এর পরিমাণ নির্ণয় করেছি। আমরা ৩ mM (যথাক্রমে p = ০.০০৫৩, p = ০.০৪১৫ এবং p < ০.০০০১) এবং ৫ mM (p = ০.০০৩১, p = ০.০২৩৩, p < ০.০০০১) PPA প্রয়োগ পর্যবেক্ষণ করেছি। (চিত্র ৩ক–গ)। mRNA এক্সপ্রেশনের এই হ্রাস ডোজ-নির্ভর ছিল: ৩ mM-এ cMYC, NRF1 এবং TFAM-এর এক্সপ্রেশন যথাক্রমে ৫.৭, ২.৬ এবং ১.৯ গুণ এবং ৫ mM-এ ১১.২, ৩ এবং ২.২ গুণ হ্রাস পেয়েছে। এর বিপরীতে, কেন্দ্রীয় রিডক্স বায়োজেনেসিস জিন NFE2L2 PPA-এর কোনো ঘনত্বেই পরিবর্তিত হয়নি, যদিও এর এক্সপ্রেশন হ্রাসের একটি অনুরূপ ডোজ-নির্ভর প্রবণতা পরিলক্ষিত হয়েছে (চিত্র ৩ঘ)।
আমরা ফিশন এবং ফিউশনের নিয়ন্ত্রণে জড়িত ক্লাসিক্যাল জিনগুলির এক্সপ্রেশনও পরীক্ষা করেছি। STOML2 ফিউশন, মাইটোফ্যাজি এবং বায়োজেনেসিসে জড়িত বলে মনে করা হয়, এবং 3 mM (2.4-গুণ পরিবর্তন) এবং 5 mM (2.8-গুণ পরিবর্তন) PPA দ্বারা এর এক্সপ্রেশন উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে (p < 0.0001) (চিত্র 1.3d)। একইভাবে, 3 mM (1.6-গুণ পরিবর্তন) এবং 5 mM (1.9-গুণ পরিবর্তন) PPA-তে OPA1 ফিউশন জিনের এক্সপ্রেশন হ্রাস পেয়েছে (যথাক্রমে p = 0.006 এবং p = 0.0024) (চিত্র 3f)। তবে, 24-ঘণ্টার PPA স্ট্রেসের অধীনে আমরা ফিউশন জিন MFN1, MFN2 বা ফিশন জিন DRP1-এর এক্সপ্রেশনে উল্লেখযোগ্য কোনো পার্থক্য খুঁজে পাইনি (চিত্র 3g–i)। এছাড়াও, আমরা দেখতে পেয়েছি যে চারটি ফিউশন ও ফিশন প্রোটিনের (OPA1, MFN1, MFN2 এবং DRP1) মাত্রা একই পরিস্থিতিতে পরিবর্তিত হয়নি (চিত্র ৪ক–ঘ)। এটি উল্লেখ করা গুরুত্বপূর্ণ যে এই তথ্যগুলো একটি নির্দিষ্ট সময়ের প্রতিফলন এবং PPA স্ট্রেসের প্রাথমিক পর্যায়ে প্রোটিনের প্রকাশ বা সক্রিয়তার মাত্রার পরিবর্তনকে প্রতিফলিত নাও করতে পারে। তবে, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, এবং OPA1-এর প্রকাশের উল্লেখযোগ্য হ্রাস মাইটোকন্ড্রিয়াল মেটাবলিজম, বায়োজেনেসিস এবং ডায়নামিক্সের উল্লেখযোগ্য ট্রান্সক্রিপশনাল ডিসরেগুলেশন নির্দেশ করে। এছাড়াও, এই তথ্যগুলো মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকারিতার শেষ-অবস্থার পরিবর্তনগুলো সরাসরি অধ্যয়নের জন্য ইমেজিং কৌশলের উপযোগিতা তুলে ধরে।
প্রোপায়োনিক অ্যাসিড (PPA) প্রয়োগের পর ফিউশন এবং ফিশন ফ্যাক্টর প্রোটিনের মাত্রার কোনো পরিবর্তন হয়নি। SH-SY5Y কোষগুলোকে ৩ এবং ৫ mM PPA দিয়ে ২৪ ঘণ্টা ধরে ট্রিটমেন্ট করা হয়েছিল। ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণের মাধ্যমে প্রোটিনের মাত্রা পরিমাপ করা হয়েছিল এবং এক্সপ্রেশন লেভেলকে মোট প্রোটিনের সাপেক্ষে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। টার্গেট এবং মোট প্রোটিনের গড় প্রোটিন এক্সপ্রেশন এবং প্রতিনিধিত্বমূলক ওয়েস্টার্ন ব্লট দেখানো হয়েছে। a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1। বারগুলো গড় ± SEM নির্দেশ করে এবং প্রদর্শিত ডেটা n = ৩টি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেটের প্রতিনিধিত্বমূলক। ওয়ান-ওয়ে অ্যানালাইসিস অফ ভ্যারিয়েন্স এবং ডানেট'স টেস্ট ব্যবহার করে একাধিক তুলনা (p < ০.০৫) করা হয়েছিল। মূল জেল এবং ব্লট চিত্র S1-এ দেখানো হয়েছে।
মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা বিপাকীয়, কার্ডিওভাসকুলার এবং পেশী রোগ থেকে শুরু করে স্নায়বিক রোগ পর্যন্ত বহু-অঙ্গ-প্রত্যঙ্গের রোগের সাথে সম্পর্কিত¹,¹⁰। অনেক স্নায়ুক্ষয়ী এবং স্নায়ু-ক্ষয়কারী রোগ মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার সাথে সম্পর্কিত, যা মস্তিষ্কের জীবনকাল জুড়ে এই অঙ্গাণুগুলোর গুরুত্ব তুলে ধরে। এই রোগগুলোর মধ্যে রয়েছে পারকিনসন্স রোগ, আলঝেইমার রোগ এবং এএসডি³,⁴,¹⁸। তবে, এই রোগগুলো অধ্যয়নের জন্য মস্তিষ্কের টিস্যু পাওয়া কঠিন, বিশেষ করে কার্যপ্রণালীগত পর্যায়ে, যা কোষীয় মডেল সিস্টেমকে একটি প্রয়োজনীয় বিকল্প করে তুলেছে। এই গবেষণায়, আমরা PPA-চিকিৎসিত SH-SY5Y কোষ ব্যবহার করে একটি কোষীয় মডেল সিস্টেম ব্যবহার করেছি, যা স্নায়বিক রোগে, বিশেষ করে অটিজম স্পেকট্রাম ডিসঅর্ডারে, পরিলক্ষিত মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতাকে পুনরায় ফুটিয়ে তোলে। নিউরনে মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিশীলতা অধ্যয়নের জন্য এই PPA মডেলের ব্যবহার এএসডি-র কারণ সম্পর্কে অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করতে পারে।
আমরা মাইটোকন্ড্রিয়ার আকারগত পরিবর্তন দেখার জন্য TEM ব্যবহারের সম্ভাবনা অন্বেষণ করেছি। এটি মনে রাখা গুরুত্বপূর্ণ যে এর কার্যকারিতা সর্বাধিক করার জন্য TEM অবশ্যই সঠিকভাবে ব্যবহার করতে হবে। ক্রায়ো-নমুনা প্রস্তুতকরণ একই সাথে কোষীয় উপাদানগুলিকে স্থির করে এবং আর্টিফ্যাক্ট গঠন হ্রাস করে নিউরোনাল কাঠামোর আরও ভাল সংরক্ষণের সুযোগ করে দেয়³⁴। এর সাথে সামঞ্জস্য রেখে, আমরা পর্যবেক্ষণ করেছি যে নিউরন-সদৃশ SH-SY5Y কোষগুলিতে অক্ষত উপ-কোষীয় অঙ্গাণু এবং দীর্ঘায়িত মাইটোকন্ড্রিয়া ছিল (চিত্র ১ক)। এটি নিউরোনাল কোষ মডেলে মাইটোকন্ড্রিয়ার আকারবিদ্যা অধ্যয়নের জন্য ক্রায়োজেনিক প্রস্তুতি কৌশলের উপযোগিতা তুলে ধরে। যদিও TEM ডেটার বস্তুনিষ্ঠ বিশ্লেষণের জন্য পরিমাণগত পরিমাপ অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ, মাইটোকন্ড্রিয়ার আকারগত পরিবর্তন নিশ্চিত করার জন্য কোন নির্দিষ্ট পরামিতিগুলি পরিমাপ করা উচিত সে বিষয়ে এখনও কোনও ঐকমত্য নেই। মাইটোকন্ড্রিয়ার আকারবিদ্যা পরিমাণগতভাবে পরীক্ষা করেছে এমন বিপুল সংখ্যক গবেষণার¹⁷,³¹,³² উপর ভিত্তি করে, আমরা একটি স্বয়ংক্রিয় মাইটোকন্ড্রিয়াল চিত্র বিশ্লেষণ পাইপলাইন তৈরি করেছি যা আটটি আকারগত পরামিতি পরিমাপ করে, যথা: ক্ষেত্রফল, ক্ষেত্রফল², অ্যাসপেক্ট রেশিও, পরিধি, বৃত্তাকারতা, ডিগ্রি, ফেরেট ব্যাস এবং গোলাকারতা।
এদের মধ্যে, পিপিএ উল্লেখযোগ্যভাবে এরিয়া ২, ক্ষেত্রফল, পরিধি এবং ফেরেট ব্যাস হ্রাস করেছে (চিত্র ১বি–ই)। এতে দেখা যায় যে মাইটোকন্ড্রিয়াগুলো ছোট এবং আরও গোলাকার হয়ে গেছে, যা পূর্ববর্তী গবেষণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যেখানে পিপিএ৩০-প্ররোচিত মাইটোকন্ড্রিয়াল স্ট্রেসের ৭২ ঘন্টা পরে মাইটোকন্ড্রিয়ার ক্ষেত্রফল হ্রাস পেতে দেখা গেছে। এই রূপগত বৈশিষ্ট্যগুলো মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিশন নির্দেশ করতে পারে, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্ক থেকে ক্ষতিগ্রস্ত উপাদানগুলোকে আলাদা করে মাইটোফ্যাজির মাধ্যমে তাদের অবক্ষয়কে ত্বরান্বিত করার জন্য একটি প্রয়োজনীয় প্রক্রিয়া। অন্যদিকে, গড় মাইটোকন্ড্রিয়াল আকারের হ্রাস বর্ধিত বায়োজেনেসিসের সাথে সম্পর্কিত হতে পারে, যার ফলে ছোট নবজাত মাইটোকন্ড্রিয়া গঠিত হয়। বর্ধিত ফিশন বা বায়োজেনেসিস মাইটোকন্ড্রিয়াল স্ট্রেসের বিরুদ্ধে মাইটোসিস বজায় রাখার জন্য একটি ক্ষতিপূরণমূলক প্রতিক্রিয়া। তবে, মাইটোকন্ড্রিয়ার বৃদ্ধি হ্রাস, ফিউশন ব্যাহত হওয়া বা অন্যান্য পরিস্থিতিও বাদ দেওয়া যায় না।
যদিও TEM দ্বারা তৈরি উচ্চ-রেজোলিউশনের ছবিগুলো স্বতন্ত্র মাইটোকন্ড্রিয়ার স্তরে আকারগত বৈশিষ্ট্য নির্ধারণের সুযোগ দেয়, এই পদ্ধতিটি একটি নির্দিষ্ট সময়ে দ্বিমাত্রিক স্ন্যাপশট তৈরি করে। বিপাকীয় চাপের প্রতি গতিশীল প্রতিক্রিয়া অধ্যয়নের জন্য, আমরা TMRE দিয়ে মাইটোকন্ড্রিয়াকে রঞ্জিত করেছি এবং MEL বিশ্লেষণ সহ টাইম-ল্যাপস মাইক্রোস্কোপি ব্যবহার করেছি, যা সময়ের সাথে সাথে মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কের পরিবর্তনগুলোর উচ্চ-ক্ষমতাসম্পন্ন ত্রিমাত্রিক দৃশ্যায়নের সুযোগ দেয়³³,³⁸। আমরা PPA চাপের অধীনে মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যায় সূক্ষ্ম কিন্তু তাৎপর্যপূর্ণ পরিবর্তন পর্যবেক্ষণ করেছি (চিত্র ২)। ৩ mM ঘনত্বে, ফিশন ঘটনার সংখ্যা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে, যেখানে ফিউশন ঘটনা নিয়ন্ত্রণের মতোই ছিল। ৫ mM PPA-তে ফিশন এবং ফিউশন উভয় ঘটনার সংখ্যাতেই বৃদ্ধি লক্ষ্য করা গেছে, কিন্তু এই পরিবর্তনগুলো প্রায় সমানুপাতিক ছিল, যা ইঙ্গিত করে যে উচ্চতর ঘনত্বে ফিশন এবং ফিউশন গতিবিদ্যা ভারসাম্যে পৌঁছায় (চিত্র ২খ)। ৩ এবং ৫ mM PPA উভয় ঘনত্বেই গড় মাইটোকন্ড্রিয়াল আয়তন অপরিবর্তিত ছিল, যা নির্দেশ করে যে মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কের অখণ্ডতা সংরক্ষিত ছিল (চিত্র ২ঘ)। এটি গতিশীল মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কের সেই সক্ষমতাকে প্রতিফলিত করে, যার মাধ্যমে তারা নেটওয়ার্কের বিভাজন না ঘটিয়েই মৃদু বিপাকীয় চাপের প্রতি সাড়া দিয়ে কার্যকরভাবে হোমিওস্ট্যাসিস বজায় রাখতে পারে। ৩ mM PPA-তে, বিভাজনের বৃদ্ধি একটি নতুন ভারসাম্যে উত্তরণের জন্য যথেষ্ট, কিন্তু PPA-এর উচ্চতর ঘনত্বের কারণে সৃষ্ট চাপের প্রতিক্রিয়ায় আরও গভীর গতিবিদ্যাগত পুনর্গঠনের প্রয়োজন হয়।
উভয় PPA স্ট্রেস ঘনত্বেই মাইটোকন্ড্রিয়ার সংখ্যা বৃদ্ধি পেয়েছে, কিন্তু গড় মাইটোকন্ড্রিয়াল আয়তন উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হয়নি (চিত্র ২গ)। এটি বর্ধিত বায়োজেনেসিস বা বর্ধিত বিভাজনের কারণে হতে পারে; তবে, গড় মাইটোকন্ড্রিয়াল আয়তনে উল্লেখযোগ্য হ্রাস না থাকায়, জৈব সংশ্লেষণ বৃদ্ধি পাওয়ার সম্ভাবনাই বেশি। যাইহোক, চিত্র ২-এর তথ্য দুটি ক্ষতিপূরণমূলক প্রক্রিয়ার অস্তিত্বকে সমর্থন করে: ফিশন ঘটনার সংখ্যা বৃদ্ধি, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিশনের আপরেগুলেশনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, এবং ঘটনার সংখ্যা বৃদ্ধি, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল বায়োজেনেসিসের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। পরিশেষে, মৃদু স্ট্রেসের জন্য গতিশীল ক্ষতিপূরণ ফিশন, ফিউশন, বায়োজেনেসিস এবং মাইটোফ্যাজি জড়িত একযোগে চলমান প্রক্রিয়া নিয়ে গঠিত হতে পারে। যদিও পূর্ববর্তী লেখকরা দেখিয়েছেন যে PPA মাইটোসিস৩০,৩৯ এবং মাইটোফ্যাজি২৯ বৃদ্ধি করে, আমরা PPA-এর প্রতিক্রিয়ায় মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিশন এবং ফিউশন ডায়নামিক্সের পুনর্গঠনের প্রমাণ উপস্থাপন করছি। এই তথ্য TEM দ্বারা পর্যবেক্ষণ করা রূপগত পরিবর্তনগুলিকে নিশ্চিত করে এবং PPA-প্ররোচিত মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার সাথে সম্পর্কিত প্রক্রিয়াগুলিতে আরও অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে।
যেহেতু TEM বা MEL বিশ্লেষণ কোনোটিই পর্যবেক্ষণকৃত রূপগত পরিবর্তনের অন্তর্নিহিত জিন নিয়ন্ত্রক প্রক্রিয়াগুলির সরাসরি প্রমাণ দেয়নি, তাই আমরা মাইটোকন্ড্রিয়াল বিপাক, জৈবগঠন এবং গতিশীলতার সাথে জড়িত জিনগুলির RNA অভিব্যক্তি পরীক্ষা করেছি। cMYC প্রোটো-অনকোজিন হলো একটি ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর যা মাইটোকন্ড্রিয়া, গ্লাইকোলাইসিস, অ্যামিনো অ্যাসিড এবং ফ্যাটি অ্যাসিড বিপাকের নিয়ন্ত্রণে জড়িত। এছাড়াও, cMYC প্রায় ৬০০টি মাইটোকন্ড্রিয়াল জিনের অভিব্যক্তি নিয়ন্ত্রণ করে বলে জানা যায়, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল ট্রান্সক্রিপশন, ট্রান্সলেশন এবং জটিল সমাবেশের সাথে জড়িত, যার মধ্যে NRF1 এবং TFAM অন্তর্ভুক্ত। NRF1 এবং TFAM হলো মাইটোসিসের দুটি কেন্দ্রীয় নিয়ন্ত্রক, যা PGC-1α-এর ডাউনস্ট্রিমে কাজ করে mtDNA প্রতিলিপি সক্রিয় করে। এই পথটি cAMP এবং AMPK সিগন্যালিং দ্বারা সক্রিয় হয় এবং এটি শক্তি ব্যয় এবং বিপাকীয় চাপের প্রতি সংবেদনশীল। PPA-এর প্রভাব জারণ চাপের মাধ্যমে মধ্যস্থতা করা হয় কিনা তা নির্ধারণ করার জন্য আমরা মাইটোকন্ড্রিয়াল জৈবগঠনের একটি রিডক্স নিয়ন্ত্রক NFE2L2-ও পরীক্ষা করেছি।
যদিও NFE2L2-এর এক্সপ্রেশন অপরিবর্তিত ছিল, আমরা 3 mM এবং 5 mM PPA দিয়ে 24 ঘন্টা চিকিৎসার পর cMYC, NRF1 এবং TFAM-এর এক্সপ্রেশনে একটি সামঞ্জস্যপূর্ণ ডোজ-নির্ভর হ্রাস লক্ষ্য করেছি (চিত্র 3a–c)। cMYC এক্সপ্রেশনের ডাউনরেগুলেশন পূর্বে মাইটোকন্ড্রিয়াল স্ট্রেসের প্রতিক্রিয়া হিসাবে রিপোর্ট করা হয়েছে42, এবং বিপরীতভাবে, cMYC এক্সপ্রেশনের ডাউনরেগুলেশন মাইটোকন্ড্রিয়াল মেটাবলিজম, নেটওয়ার্ক কানেক্টিভিটি এবং মেমব্রেন পোলারাইজেশন পুনর্গঠনের মাধ্যমে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিসফাংশন ঘটাতে পারে43। মজার বিষয় হলো, cMYC মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিশন এবং ফিউশনের নিয়ন্ত্রণেও জড়িত42,43 এবং কোষ বিভাজনের সময় DRP1 ফসফোরাইলেশন এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল লোকালাইজেশন বৃদ্ধি করে বলে পরিচিত44, পাশাপাশি নিউরোনাল স্টেম কোষে মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজিক্যাল রিমডেলিংয়ে মধ্যস্থতা করে45। প্রকৃতপক্ষে, cMYC-বিহীন ফাইব্রোব্লাস্টগুলি হ্রাসপ্রাপ্ত মাইটোকন্ড্রিয়াল আকার প্রদর্শন করে, যা PPA43 স্ট্রেস দ্বারা প্ররোচিত পরিবর্তনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। এই ডেটা cMYC এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্সের মধ্যে একটি আকর্ষণীয় কিন্তু এখনও অস্পষ্ট সম্পর্ককে চিত্রিত করে, যা PPA স্ট্রেস-প্ররোচিত রিমডেলিংয়ের ভবিষ্যৎ গবেষণার জন্য একটি আকর্ষণীয় লক্ষ্য প্রদান করে।
NRF1 এবং TFAM-এর হ্রাস একটি গুরুত্বপূর্ণ ট্রান্সক্রিপশনাল অ্যাক্টিভেটর হিসেবে cMYC-এর ভূমিকার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। এই তথ্যগুলো মানুষের কোলন ক্যান্সার কোষের উপর করা পূর্ববর্তী গবেষণার সাথেও সামঞ্জস্যপূর্ণ, যেখানে দেখা গেছে যে PPA ২২ ঘণ্টায় NRF1 mRNA এক্সপ্রেশন হ্রাস করে, যা ATP-এর ঘাটতি এবং ROS46 বৃদ্ধির সাথে সম্পর্কিত ছিল। এই গবেষকরা আরও জানিয়েছেন যে TFAM এক্সপ্রেশন ৮.৫ ঘণ্টায় বৃদ্ধি পেলেও ২২ ঘণ্টায় তা বেসলাইন স্তরে ফিরে আসে। এর বিপরীতে, কিম এট আল. (২০১৯) দেখিয়েছেন যে SH-SY5Y কোষে PPA স্ট্রেসের ৪ ঘণ্টা পর TFAM mRNA এক্সপ্রেশন উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পায়; তবে, ৭২ ঘণ্টা পর TFAM প্রোটিন এক্সপ্রেশন এবং mtDNA কপি সংখ্যা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পায়। সুতরাং, ২৪ ঘণ্টা পর আমরা মাইটোকন্ড্রিয়াল বায়োজেনেসিস জিনের সংখ্যায় যে হ্রাস লক্ষ্য করেছি, তা এই সম্ভাবনাকে বাতিল করে না যে মাইটোকন্ড্রিয়ার সংখ্যা বৃদ্ধি পূর্ববর্তী সময়ে বায়োজেনেসিস সক্রিয়করণের সাথে সম্পর্কিত। পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে, PPA ৪ ঘন্টা ৩০ মিনিটে SH-SY5Y কোষে PGC-1α mRNA এবং প্রোটিনের মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে বাড়িয়ে দেয়, অন্যদিকে প্রোপায়োনিক অ্যাসিড ১২ ঘন্টা ৩৯ মিনিটে PGC-1α-এর মাধ্যমে বাছুরের হেপাটোসাইটে মাইটোকন্ড্রিয়াল বায়োজেনেসিস বৃদ্ধি করে। মজার বিষয় হলো, PGC-1α শুধুমাত্র NRF1 এবং TFAM-এর একটি সরাসরি ট্রান্সক্রিপশনাল নিয়ন্ত্রকই নয়, বরং এটি ফিশন এবং ফিউশন নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে MFN2 এবং DRP1-এর কার্যকলাপও নিয়ন্ত্রণ করে বলে দেখা গেছে। সব মিলিয়ে, এটি PPA দ্বারা প্ররোচিত মাইটোকন্ড্রিয়াল ক্ষতিপূরণমূলক প্রতিক্রিয়া নিয়ন্ত্রণকারী প্রক্রিয়াগুলির মধ্যে ঘনিষ্ঠ সংযোগকে তুলে ধরে। অধিকন্তু, আমাদের তথ্য PPA চাপের অধীনে বায়োজেনেসিস এবং মেটাবলিজমের ট্রান্সক্রিপশনাল নিয়ন্ত্রণের উল্লেখযোগ্য বিশৃঙ্খলা প্রতিফলিত করে।
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 এবং DRP1 জিনগুলো মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিশন, ফিউশন এবং ডায়নামিক্সের অন্যতম প্রধান নিয়ন্ত্রক। মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্সে আরও অনেক জিন জড়িত থাকলেও, STOML2, OPA1 এবং MFN2 জিনগুলোকে পূর্বে ASD কোহর্টদের মধ্যে ডিফারেনশিয়ালি মিথাইলেটেড হিসেবে পাওয়া গেছে এবং বেশ কয়েকটি স্বাধীন গবেষণায় মাইটোকন্ড্রিয়াল স্ট্রেসের প্রতিক্রিয়ায় এই ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টরগুলোর পরিবর্তন রিপোর্ট করা হয়েছে। ৩ mM এবং ৫ mM PPA ট্রিটমেন্টের ফলে OPA1 এবং STOML2 উভয়ের এক্সপ্রেশন উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছিল (চিত্র ৩e, f)। OPA1 হলো MFN1 এবং 2-এর সাথে সরাসরি মিথস্ক্রিয়ার মাধ্যমে মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিউশনের অন্যতম ক্লাসিক্যাল নিয়ন্ত্রক এবং এটি ক্রিস্টি রিমডেলিং ও মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজিতে ভূমিকা পালন করে। মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্সে STOML2-এর সঠিক ভূমিকা এখনও অস্পষ্ট, তবে প্রমাণ থেকে বোঝা যায় যে এটি মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিউশন, বায়োজেনেসিস এবং মাইটোফ্যাজিতে ভূমিকা পালন করে।
STOML2 মাইটোকন্ড্রিয়াল রেসপিরেটরি কাপলিং বজায় রাখা এবং রেসপিরেটরি চেইন কমপ্লেক্স গঠনে জড়িত⁵⁴,⁵⁵ এবং ক্যান্সার কোষের বিপাকীয় বৈশিষ্ট্যগুলিতে গভীর পরিবর্তন আনতে দেখা গেছে⁵⁶। গবেষণায় দেখা গেছে যে STOML2, BAN এবং কার্ডিওলিপিনের সাথে মিথস্ক্রিয়ার মাধ্যমে মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেন পটেনশিয়াল এবং বায়োজেনেসিসকে উৎসাহিত করে⁵⁵,⁵⁷,⁵⁸। এছাড়াও, স্বতন্ত্র গবেষণায় দেখা গেছে যে STOML2 এবং PINK1-এর মধ্যে মিথস্ক্রিয়া মাইটোফ্যাজিকে নিয়ন্ত্রণ করে⁵⁹,⁶⁰। উল্লেখযোগ্যভাবে, STOML2 সরাসরি MFN2-এর সাথে মিথস্ক্রিয়া করে এবং এটিকে স্থিতিশীল করে বলে জানা গেছে এবং এটি OPA1-এর অবক্ষয়ের জন্য দায়ী প্রোটিয়েজকে বাধা দিয়ে দীর্ঘ OPA1 আইসোফর্মগুলিকে স্থিতিশীল করতেও গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে⁵³,⁶¹,⁶²। PPA বিক্রিয়ায় STOML2 এক্সপ্রেশনের যে হ্রাস লক্ষ্য করা যায়, তা এই ফিউশন প্রোটিনগুলিকে ইউবিকুইটিন- এবং প্রোটিয়েসোম-নির্ভর পথের মাধ্যমে অবক্ষয়ের জন্য আরও সংবেদনশীল করে তুলতে পারে⁴⁸। যদিও PPA-এর গতিশীল প্রতিক্রিয়ায় STOML2 এবং OPA1-এর সুনির্দিষ্ট ভূমিকা অস্পষ্ট, এই ফিউশন জিনগুলির অভিব্যক্তি হ্রাস (চিত্র 3) ফিশন এবং ফিউশনের মধ্যে ভারসাম্য নষ্ট করতে পারে এবং মাইটোকন্ড্রিয়ার আকার হ্রাস করতে পারে (চিত্র 3)। 1)।
অন্যদিকে, ২৪ ঘন্টা পরেও OPA1 প্রোটিনের প্রকাশ অপরিবর্তিত ছিল, যেখানে PPA প্রয়োগের পর MFN1, MFN2 বা DRP1-এর mRNA এবং প্রোটিনের মাত্রায় উল্লেখযোগ্য কোনো পরিবর্তন হয়নি (চিত্র ৩জি-আই, চিত্র ৪)। এটি ইঙ্গিত দিতে পারে যে মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিউশন এবং ফিশনের সাথে জড়িত এই ফ্যাক্টরগুলির নিয়ন্ত্রণে কোনো পরিবর্তন হয় না। তবে, এটি লক্ষণীয় যে এই চারটি জিনের প্রত্যেকটি পোস্টট্রান্সক্রিপশনাল মডিফিকেশন (PTMs) দ্বারাও নিয়ন্ত্রিত হয় যা প্রোটিনের কার্যকলাপ নিয়ন্ত্রণ করে। OPA1-এর আটটি বিকল্প স্প্লাইস ভ্যারিয়েন্ট রয়েছে যা মাইটোকন্ড্রিয়াতে প্রোটিওলাইটিকভাবে বিভাজিত হয়ে দুটি স্বতন্ত্র আইসোফর্ম তৈরি করে 63। দীর্ঘ এবং সংক্ষিপ্ত আইসোফর্মের মধ্যে ভারসাম্যই শেষ পর্যন্ত মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিউশন এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্ক রক্ষণাবেক্ষণে OPA1-এর ভূমিকা নির্ধারণ করে64। DRP1-এর কার্যকলাপ ক্যালসিয়াম/ক্যালমডুলিন-নির্ভর প্রোটিন কাইনেজ II (CaMKII) ফসফোরাইলেশন দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়, যেখানে DRP1-এর অবক্ষয় ইউবিকুইটিনেশন এবং SUMOylation দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়65। অবশেষে, DRP1 এবং MFN1/2 উভয়ই GTPase, তাই মাইটোকন্ড্রিয়ায় GTP উৎপাদনের হার দ্বারা এদের কার্যকলাপ প্রভাবিত হতে পারে 66। অতএব, যদিও এই প্রোটিনগুলির এক্সপ্রেশন স্থির থাকে, এটি অপরিবর্তিত প্রোটিন কার্যকলাপ বা স্থানীয়করণকে প্রতিফলিত নাও করতে পারে67,68। প্রকৃতপক্ষে, বিদ্যমান PTM প্রোটিন ভাণ্ডার প্রায়শই তীব্র স্ট্রেস প্রতিক্রিয়া মধ্যস্থতার জন্য দায়ী প্রতিরক্ষার প্রথম লাইন হিসাবে কাজ করে। আমাদের মডেলে মাঝারি বিপাকীয় স্ট্রেসের উপস্থিতিতে, এটা সম্ভবত যে PTM, mRNA বা প্রোটিন স্তরে এই জিনগুলির অতিরিক্ত সক্রিয়করণের প্রয়োজন ছাড়াই মাইটোকন্ড্রিয়ার অখণ্ডতা পর্যাপ্তভাবে পুনরুদ্ধার করার জন্য ফিউশন এবং ফিশন প্রোটিনের বর্ধিত কার্যকলাপকে উৎসাহিত করে।
সামগ্রিকভাবে, উপরের তথ্যগুলো মাইটোকন্ড্রিয়ার গঠনবিন্যাসের জটিল ও সময়-নির্ভর নিয়ন্ত্রণ এবং এই প্রক্রিয়াগুলো উদ্ঘাটনের প্রতিবন্ধকতাগুলোকে তুলে ধরে। জিনের অভিব্যক্তি অধ্যয়নের জন্য, প্রথমে পাথওয়েতে নির্দিষ্ট টার্গেট জিন শনাক্ত করা প্রয়োজন। তবে, আমাদের তথ্য দেখায় যে একই পাথওয়ের জিনগুলো একই চাপের প্রতি একইভাবে সাড়া দেয় না। প্রকৃতপক্ষে, পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে একই পাথওয়ের বিভিন্ন জিন ভিন্ন ভিন্ন টেম্পোরাল রেসপন্স প্রোফাইল প্রদর্শন করতে পারে³⁰,⁴⁶। এছাড়াও, জটিল পোস্ট-ট্রান্সক্রিপশনাল প্রক্রিয়া রয়েছে যা ট্রান্সক্রিপশন এবং জিনের কার্যাবলীর মধ্যে সম্পর্ককে ব্যাহত করে। প্রোটিওমিক গবেষণা পোস্ট-ট্রান্সক্রিপশনাল মডিফিকেশন (PTM) এবং প্রোটিনের কার্যাবলীর প্রভাব সম্পর্কে ধারণা দিতে পারে, কিন্তু এগুলো কিছু প্রতিবন্ধকতাও তৈরি করে, যার মধ্যে রয়েছে লো-থ্রুপুট পদ্ধতি, উচ্চ সিগন্যাল-টু-নয়েজ অনুপাত এবং দুর্বল রেজোলিউশন।
এই প্রেক্ষাপটে, TEM এবং MEL ব্যবহার করে মাইটোকন্ড্রিয়ার গঠনবিন্যাস অধ্যয়ন করা মাইটোকন্ড্রিয়ার গতিশীলতা ও কার্যকারিতার মধ্যে সম্পর্ক এবং এটি কীভাবে রোগকে প্রভাবিত করে, সে সম্পর্কিত মৌলিক প্রশ্নগুলির সমাধানে ব্যাপক সম্ভাবনা রাখে। সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণভাবে, TEM মাইটোকন্ড্রিয়ার কর্মহীনতা এবং গতিশীলতার একটি অভিন্ন শেষবিন্দু হিসাবে মাইটোকন্ড্রিয়ার গঠনবিন্যাস পরিমাপের জন্য একটি সরাসরি পদ্ধতি প্রদান করে⁵¹। MEL-ও একটি ত্রিমাত্রিক কোষীয় পরিবেশে বিভাজন এবং সংযোজন ঘটনাগুলি দেখার জন্য একটি সরাসরি পদ্ধতি প্রদান করে, যা জিনের অভিব্যক্তিতে কোনো পরিবর্তন না থাকলেও গতিশীল মাইটোকন্ড্রিয়ার পুনর্গঠনের পরিমাণ নির্ধারণের সুযোগ দেয়³³। এখানে আমরা গৌণ মাইটোকন্ড্রিয়া রোগগুলিতে মাইটোকন্ড্রিয়া ইমেজিং কৌশলগুলির উপযোগিতা তুলে ধরছি। এই রোগগুলি সাধারণত তীব্র মাইটোকন্ড্রিয়ার ক্ষতির পরিবর্তে দীর্ঘস্থায়ী মৃদু বিপাকীয় চাপ দ্বারা চিহ্নিত হয়, যা মাইটোকন্ড্রিয়া নেটওয়ার্কের সূক্ষ্ম পুনর্গঠন দ্বারা বৈশিষ্ট্যযুক্ত। যাইহোক, দীর্ঘস্থায়ী চাপের অধীনে মাইটোসিস বজায় রাখার জন্য প্রয়োজনীয় মাইটোকন্ড্রিয়ার ক্ষতিপূরণের গভীর কার্যকরী পরিণতি রয়েছে। স্নায়ুবিজ্ঞানের প্রেক্ষাপটে, এই ক্ষতিপূরণমূলক প্রক্রিয়াগুলি সম্পর্কে আরও ভালভাবে বোঝা মাইটোকন্ড্রিয়ার কর্মহীনতার সাথে সম্পর্কিত বহুবিধ স্নায়ুরোগবিদ্যা সম্পর্কে গুরুত্বপূর্ণ তথ্য প্রদান করতে পারে।
পরিশেষে, আমাদের উপাত্ত জিন এক্সপ্রেশন, প্রোটিন মডিফিকেশন এবং প্রোটিন অ্যাক্টিভিটির মধ্যকার জটিল মিথস্ক্রিয়ার কার্যকরী পরিণতি বোঝার জন্য ইমেজিং কৌশলের উপযোগিতা তুলে ধরে, যা নিউরোনাল মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্সকে নিয়ন্ত্রণ করে। আমরা এএসডি-র মাইটোকন্ড্রিয়াল উপাদান সম্পর্কে অন্তর্দৃষ্টি লাভের জন্য একটি নিউরোনাল সেল মডেলে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিসফাংশনের মডেলিং করতে পিপিএ ব্যবহার করেছি। পিপিএ দ্বারা ট্রিট করা SH-SY5Y কোষগুলিতে মাইটোকন্ড্রিয়ার আকারগত পরিবর্তন দেখা গেছে: টিইএম (TEM) দ্বারা পর্যবেক্ষণে দেখা যায়, মাইটোকন্ড্রিয়া ছোট ও গোলাকার হয়ে গেছে এবং ক্রিস্টি অস্পষ্ট ছিল। এমইএল (MEL) বিশ্লেষণ দেখায় যে, মৃদু মেটাবলিক স্ট্রেসের প্রতিক্রিয়ায় মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্ক বজায় রাখার জন্য ফিশন এবং ফিউশন ঘটনার বৃদ্ধির সাথে সাথে এই পরিবর্তনগুলি যুগপৎ ঘটে। অধিকন্তু, পিপিএ মাইটোকন্ড্রিয়াল মেটাবলিজম এবং হোমিওস্ট্যাসিসের ট্রান্সক্রিপশনাল নিয়ন্ত্রণকে উল্লেখযোগ্যভাবে ব্যাহত করে। আমরা cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 এবং OPA1-কে পিপিএ স্ট্রেস দ্বারা ব্যাহত হওয়া প্রধান মাইটোকন্ড্রিয়াল নিয়ন্ত্রক হিসাবে চিহ্নিত করেছি এবং এগুলি পিপিএ-প্ররোচিত মাইটোকন্ড্রিয়াল আকার ও কার্যকারিতার পরিবর্তনে মধ্যস্থতা করার ক্ষেত্রে ভূমিকা রাখতে পারে। জিন এক্সপ্রেশন এবং প্রোটিন অ্যাক্টিভিটি, লোকলাইজেশন এবং পোস্ট-ট্রান্সলেশনাল মডিফিকেশনে পিপিএ-প্ররোচিত টেম্পোরাল পরিবর্তনগুলিকে আরও ভালোভাবে চিহ্নিত করার জন্য ভবিষ্যতে গবেষণার প্রয়োজন রয়েছে। আমাদের উপাত্ত মাইটোকন্ড্রিয়াল স্ট্রেস রেসপন্স নিয়ন্ত্রণকারী প্রক্রিয়াগুলোর জটিলতা ও আন্তঃনির্ভরশীলতাকে তুলে ধরে এবং আরও সুনির্দিষ্ট কার্যকারণমূলক গবেষণার জন্য টিইএম (TEM) ও অন্যান্য ইমেজিং কৌশলের উপযোগিতা প্রদর্শন করে।
SH-SY5Y সেল লাইন (ECACC, 94030304-1VL) সিগমা-অলড্রিচ থেকে কেনা হয়েছিল। SH-SY5Y কোষগুলিকে ডুলবেকো'স মডিফায়েড ঈগল'স মিডিয়াম/এফ-১২ পুষ্টি মিশ্রণ (DMEM/F-12) এবং এল-গ্লুটামিন (SC09411, সায়েন্সেল) যুক্ত ২৫ বর্গ সেমি ফ্লাস্কে ৩৭ °C তাপমাত্রা ও ৫% CO2 পরিবেশে প্রতিপালন করা হয়েছিল। এর সাথে ২০% ফিটাল বোভাইন সিরাম (FBS) (10493106, থার্মোফিশার সায়েন্টিফিক) এবং ১% পেনিসিলিন-স্ট্রেপ্টোমাইসিন (P4333-20ML, সিগমা-অলড্রিচ) যোগ করা হয়েছিল। কোষগুলোকে ০.০৫% ট্রিপসিন-ইডিটিএ (১৫৪০০০০৫৪, থার্মোফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে ৮০% কনফ্লুয়েন্স পর্যন্ত সাবকালচার করা হয়েছিল, ৩০০ গ্রাম-এ সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং প্রায় ৭ × ১০⁵ কোষ/মিলি ঘনত্বে প্লেট করা হয়েছিল। সমস্ত পরীক্ষা ১৯-২২ প্যাসেজের মধ্যে অবিচ্ছিন্ন SH-SY5Y কোষের উপর করা হয়েছিল। পিপিএ NaP হিসাবে প্রয়োগ করা হয়। NaP পাউডার (CAS নং ১৩৭-৪০-৬, রাসায়নিক সূত্র C₃H₅NaO₂, P5436-100G, সিগমা-অলড্রিচ) উষ্ণ মিলি-কিউ জলে ১ M ঘনত্বে দ্রবীভূত করুন এবং ৪ °C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করুন। চিকিৎসার দিনে, এই দ্রবণটিকে সিরাম-মুক্ত মাধ্যমে (L-গ্লুটামিন সহ DMEM/F-12) ১ M পিপিএ দিয়ে ৩ mM এবং ৫ mM পিপিএ-তে লঘু করুন। সকল পরীক্ষার জন্য ব্যবহৃত ট্রিটমেন্ট কনসেনট্রেশনগুলো ছিল পিপিএ-বিহীন (০ mM, কন্ট্রোল), ৩ mM এবং ৫ mM পিপিএ। পরীক্ষাগুলো কমপক্ষে তিনটি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেটে সম্পন্ন করা হয়েছিল।
SH-SY5Y কোষগুলোকে 25 cm⁵ ফ্লাস্কে 5.5 × 10⁵ কোষ/মিলি হারে বপন করা হয়েছিল এবং 24 ঘন্টা ধরে বৃদ্ধি করা হয়েছিল। 24 ঘন্টা ইনকিউবেশনের আগে ফ্লাস্কে PPA ট্রিটমেন্ট যোগ করা হয়েছিল। সাধারণ স্তন্যপায়ী টিস্যু সাবকালচার প্রোটোকল (উপরে বর্ণিত) অনুসরণ করে কোষের পেলেট সংগ্রহ করুন। কোষের পেলেটকে 100 µl 2.5% গ্লুটারালডিহাইড, 1× PBS-এ পুনরায় সাসপেন্ড করুন এবং প্রক্রিয়াকরণের আগ পর্যন্ত 4 °C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করুন। কোষগুলোকে পেলেট করার জন্য এবং 2.5% গ্লুটারালডিহাইড, 1× PBS দ্রবণটি অপসারণ করার জন্য SH-SY5Y কোষগুলোকে অল্প সময়ের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। পাতিত জলে প্রস্তুত 4% অ্যাগারোজ জেলে তলানিকে পুনরায় সাসপেন্ড করুন (অ্যাগারোজ এবং তলানির আয়তনের অনুপাত 1:1)। উচ্চ-চাপে হিমায়িত করার আগে অ্যাগারোজের টুকরোগুলোকে সমতল প্লেটের গ্রিডে রাখা হয়েছিল এবং 1-হেক্সাডেসিন দিয়ে প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল। নমুনাগুলোকে 100% শুষ্ক অ্যাসিটোনে -90°C তাপমাত্রায় 24 ঘন্টার জন্য হিমায়িত করা হয়েছিল। এরপর তাপমাত্রা বাড়িয়ে -৮০°C করা হয় এবং ১% অসমিয়াম টেট্রোক্সাইড ও ০.১% গ্লুটারালডিহাইডের একটি দ্রবণ যোগ করা হয়। নমুনাগুলো ২৪ ঘণ্টার জন্য -৮০°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল। এর পরে, কয়েক দিন ধরে তাপমাত্রা ধীরে ধীরে কক্ষ তাপমাত্রায় আনা হয়: প্রথমে –৮০°C থেকে –৫০°C পর্যন্ত ২৪ ঘণ্টা, তারপর –৩০°C পর্যন্ত ২৪ ঘণ্টা, তারপর –১০°C পর্যন্ত ২৪ ঘণ্টা এবং অবশেষে কক্ষ তাপমাত্রায়।
ক্রায়োজেনিক প্রস্তুতির পর, নমুনাগুলোকে রেজিন দিয়ে ইমপ্রেগনেট করা হয়েছিল এবং একটি লাইকা রাইকার্ট আল্ট্রাকাটএস আল্ট্রামাইক্রোটোম (লাইকা মাইক্রোসিস্টেমস) ব্যবহার করে অতি-পাতলা সেকশন (∼১০০ এনএম) তৈরি করা হয়েছিল। সেকশনগুলোকে ২% ইউরেনাইল অ্যাসিটেট এবং লেড সাইট্রেট দিয়ে স্টেইন করা হয়েছিল। নমুনাগুলো একটি এফইআই টেকনাই ২০ ট্রান্সমিশন ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপ (থার্মোফিশার (পূর্বতন এফইআই), আইন্দহোভেন, নেদারল্যান্ডস) ব্যবহার করে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল, যা ২০০ কেভি (ল্যাব৬ ট্রান্সমিটার) তে পরিচালিত হচ্ছিল এবং এর সাথে একটি ট্রাইডিয়েম এনার্জি ফিল্টারযুক্ত গ্যাটান সিসিডি ক্যামেরা (গ্যাটান, ইউকে) যুক্ত ছিল।
প্রতিটি টেকনিক্যাল রেপ্লিকেটে কমপক্ষে ২৪টি একক কোষের ছবি তোলা হয়েছিল, যার ফলে মোট ছবির সংখ্যা দাঁড়ায় ২৬৬টি। সমস্ত ছবি রিজিওন অফ ইন্টারেস্ট (ROI) ম্যাক্রো এবং মাইটোকন্ড্রিয়া ম্যাক্রো ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। মাইটোকন্ড্রিয়া ম্যাক্রোটি প্রকাশিত পদ্ধতি¹⁷,³¹,³²-এর উপর ভিত্তি করে তৈরি এবং এটি Fiji/ImageJ⁶⁹-এ TEM ছবির আধা-স্বয়ংক্রিয় ব্যাচ প্রসেসিং-এর সুযোগ দেয়। সংক্ষেপে বলতে গেলে: রোলিং বল ব্যাকগ্রাউন্ড সাবট্রাকশন (৬০ পিক্সেল ব্যাসার্ধ), একটি FFT ব্যান্ডপাস ফিল্টার (যথাক্রমে ৬০ এবং ৮ পিক্সেলের ঊর্ধ্ব ও নিম্ন সীমা ব্যবহার করে) এবং ৫% ওরিয়েন্টেশন টলারেন্স সহ ভার্টিক্যাল লাইন সাপ্রেশন ব্যবহার করে ছবিটিকে ইনভার্ট ও ইনভার্ট করা হয়। প্রসেস করা ছবিটি একটি ম্যাক্সিমাম এন্ট্রপি অ্যালগরিদম ব্যবহার করে স্বয়ংক্রিয়ভাবে থ্রেশহোল্ড করা হয় এবং একটি বাইনারি মাস্ক তৈরি করা হয়। কাঁচা TEM ছবিতে ম্যানুয়ালি নির্বাচিত ROI-এর সাথে সম্পর্কিত ছবির অঞ্চলগুলো নিষ্কাশন করা হয়েছিল, যা মাইটোকন্ড্রিয়ার বৈশিষ্ট্য তুলে ধরে এবং প্লাজমা মেমব্রেন ও অন্যান্য উচ্চ-কন্ট্রাস্ট অঞ্চলগুলোকে বাদ দেয়। প্রতিটি নিষ্কাশিত ROI-এর জন্য, ৬০০ পিক্সেলের চেয়ে বড় বাইনারি কণাগুলো বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং Fiji/ImageJ-এর অন্তর্নির্মিত পরিমাপ ফাংশন ব্যবহার করে কণার ক্ষেত্রফল, পরিধি, প্রধান ও গৌণ অক্ষ, ফেরেট ব্যাস, গোলাকারত্ব এবং বৃত্তাকারত্ব পরিমাপ করা হয়েছিল। Merrill, Flippo, এবং Strack (2017)-কে অনুসরণ করে, এই ডেটা থেকে ক্ষেত্রফল ২, কণার অ্যাসপেক্ট রেশিও (প্রধান থেকে গৌণ অক্ষের অনুপাত), এবং শেপ ফ্যাক্টর (FF) গণনা করা হয়েছিল, যেখানে FF = পরিধি ২/৪π x ক্ষেত্রফল। প্যারামেট্রিক সূত্রের সংজ্ঞা Merrill, Flippo, এবং Strack (2017)-এ পাওয়া যাবে। উল্লিখিত ম্যাক্রোগুলো GitHub-এ উপলব্ধ (ডেটা প্রাপ্যতা বিবৃতি দেখুন)। গড়ে, প্রতিটি PPA ট্রিটমেন্টের জন্য প্রায় ৫,৬০০টি কণা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল, যার মোট সংখ্যা ছিল প্রায় ১৭,০০০টি কণা (ডেটা দেখানো হয়নি)।
SH-SH5Y কোষগুলোকে সারারাত ধরে লেগে থাকার সুযোগ দেওয়ার জন্য ৮-চেম্বারের কালচার ডিশে (থার্মোফিশার, #155411) রাখা হয়েছিল এবং তারপর TMRE ১:১০০০ (থার্মোফিশার, #T669) ও Hoechst 33342 ১:২০০ (সিগমা-অলড্রিচ, H6024) দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। রঞ্জন। ৪০৫ nm এবং ৫৬১ nm লেজার ব্যবহার করে ১০ মিনিটের পরিবেশে ছবিগুলো তোলা হয়েছিল, এবং ১২টি ধারাবাহিক সময় বিন্দুতে ইমেজ ফ্রেমের মধ্যে ০.২ μm az স্টেপ সহ ১০টি ইমেজ মাইক্রোগ্রাফ ধারণকারী z-স্ট্যাক হিসাবে কাঁচা ছবিগুলো সংগ্রহ করা হয়েছিল। ছবিগুলো একটি LCI প্ল্যান অ্যাপোক্রোমেট ১০০x/১.৪ অয়েল DIC M27 লেন্স ব্যবহার করে একটি কার্ল জাইস LSM780 ELYRA PS.1 সুপার-রেজোলিউশন প্ল্যাটফর্ম (কার্ল জাইস, ওবারকোচেন, জার্মানি) দ্বারা সংগ্রহ করা হয়েছিল। পূর্বে বর্ণিত একটি পাইপলাইন এবং ImageJ প্লাগইন ব্যবহার করে ImageJ-তে ছবিগুলো বিশ্লেষণ করা হয়েছিল ফিউশন ও ফিশন ঘটনা, মাইটোকন্ড্রিয়াল কাঠামোর গড় সংখ্যা এবং প্রতি কোষে গড় মাইটোকন্ড্রিয়াল আয়তন পরিমাপ করার জন্য। MEL ম্যাক্রোগুলো গিটহাবে পাওয়া যায় (ডেটা প্রাপ্যতা বিবৃতি দেখুন)।
চিকিৎসার পূর্বে SH-SY5Y কোষগুলোকে ছয়-কূপ প্লেটে 0.3 × 10⁶ কোষ/মিলি ঘনত্বে ২৪ ঘন্টা ধরে কালচার করা হয়েছিল। কুইক-আরএনএ™ মিনিপ্রেপ প্রোটোকল (ZR R1055, জাইমো রিসার্চ) ব্যবহার করে আরএনএ নিষ্কাশন করা হয়েছিল, যেখানে সামান্য কিছু পরিবর্তন আনা হয়: নমুনা অপসারণের পূর্বে প্রতিটি কূপে ৩০০ μl আরএনএ লাইসিস বাফার যোগ করা হয় এবং চূড়ান্ত ধাপ হিসেবে ৩০ μl ডিএনএজ/আরএনএজ ইলিউশন-মুক্ত পানি দিয়ে প্রতিটি নমুনাকে লাইজ করা হয়। একটি ন্যানোড্রপ এনডি-১০০০ ইউভি-ভিস স্পেকট্রোফটোমিটার ব্যবহার করে সমস্ত নমুনার পরিমাণ ও গুণমান পরীক্ষা করা হয়েছিল। কোষ লাইসেট থেকে মোট প্রোটিন ২০০ μl আরআইপিএ লাইসিস বাফার ব্যবহার করে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং ব্র্যাডফোর্ড প্রোটিন অ্যাসে⁷⁰ ব্যবহার করে প্রোটিনের ঘনত্ব পরিমাপ করা হয়েছিল।
কিছু পরিবর্তন সহ প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুসারে Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) ব্যবহার করে cDNA সংশ্লেষণ করা হয়েছিল। 0.7 থেকে 1 μg মোট RNA ব্যবহার করে 20-μl বিক্রিয়ায় cDNA সংশ্লেষিত করা হয়েছিল। প্রাইমারগুলি পূর্বে প্রকাশিত গবেষণাপত্র 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (সারণী S1) থেকে নির্বাচন করা হয়েছিল এবং Integrated DNA Technologies-এর PrimerQuest টুল ব্যবহার করে আনুষঙ্গিক প্রোবগুলি ডিজাইন করা হয়েছিল। আগ্রহের সমস্ত জিনকে নিউক্লিয়ার B2M জিনের সাথে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC এবং OPA1 জিনের অভিব্যক্তি RT-qPCR দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল। মাস্টার মিক্সে অন্তর্ভুক্ত ছিল লুনা ট্যাক পলিমারেজ (M3003L, নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস), ১০ μM ফরোয়ার্ড ও রিভার্স প্রাইমার, সিডিএনএ, এবং পিসিআর-গ্রেড পানি, যা প্রতিটি বিক্রিয়ার জন্য চূড়ান্তভাবে ১০ μL আয়তন তৈরি করে। ট্যাকম্যান মাল্টিপ্লেক্স অ্যাসে ব্যবহার করে বিভাজন ও ফিশন জিনগুলোর (DRP1, MFN1/2) এক্সপ্রেশন পরিমাপ করা হয়েছিল। লুনা ইউনিভার্সাল প্রোব কিউপিআর মাস্টার মিক্স (M3004S, নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস) প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুযায়ী সামান্য পরিবর্তনসহ ব্যবহার করা হয়েছিল। মাল্টিপ্লেক্স আরটি-কিউপিআর মাস্টার মিক্সে অন্তর্ভুক্ত ছিল ১X লুনা ট্যাক পলিমারেজ, ১০ μM ফরোয়ার্ড ও রিভার্স প্রাইমার, ১০ μM প্রোব, সিডিএনএ, এবং পিসিআর-গ্রেড পানি, যার ফলে প্রতিটি বিক্রিয়ার জন্য চূড়ান্ত আয়তন হয় ২০ μL। রোটর-জিন কিউ ৬-প্লেক্স (কিয়াজেন আরজি—সিরিয়াল নম্বর: R0618110) ব্যবহার করে আরটি-কিউপিআর সম্পন্ন করা হয়েছিল। সাইক্লিং শর্তাবলী সারণী S1-এ দেখানো হয়েছে। সমস্ত cDNA নমুনা তিনবার করে বিবর্ধন করা হয়েছিল এবং দশগুণ লঘুকরণের একটি ধারাবাহিকতা ব্যবহার করে একটি স্ট্যান্ডার্ড কার্ভ তৈরি করা হয়েছিল। ডেটার পুনরুৎপাদনযোগ্যতা নিশ্চিত করার জন্য, তিনবারের নমুনাগুলিতে সাইকেল থ্রেশহোল্ড স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন (Ct) >0.5 সহ আউটলায়ারগুলিকে বিশ্লেষণ থেকে বাদ দেওয়া হয়েছিল। আপেক্ষিক জিন এক্সপ্রেশন 2-ΔΔCt পদ্ধতি ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল।
প্রোটিনের নমুনা (৬০ μg) ল্যামলি লোডিং বাফারের সাথে ২:১ অনুপাতে মেশানো হয়েছিল এবং একটি ১২% বর্ণহীন প্রোটিন জেলে (বায়ো-র‍্যাড #১৬১০১৮৪) রান করা হয়েছিল। ট্রান্স-ব্লট টার্বো সিস্টেম (#১৭০-৪১৫৫, বায়ো-র‍্যাড) ব্যবহার করে প্রোটিনগুলোকে একটি পিভিডিএফ (পলিভিনাইলিডিন ফ্লোরাইড) মেমব্রেনে (#১৭০-৮৪১৫৬, বায়ো-র‍্যাড) স্থানান্তর করা হয়েছিল। মেমব্রেনটিকে ব্লক করা হয়েছিল এবং উপযুক্ত প্রাইমারি অ্যান্টিবডি (OPA1, MFN1, MFN2, এবং DRP1) (১:১০০০ অনুপাতে লঘুকৃত) দিয়ে ৪৮ ঘণ্টা ইনকিউবেট করা হয়েছিল, এরপর সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (১:১০,০০০) দিয়ে ১ ঘণ্টা ইনকিউবেট করা হয়েছিল। এরপর ক্ল্যারিটি ওয়েস্টার্ন ইসিএল সাবস্ট্রেট (#১৭০-৫০৬১, বায়ো-র‍্যাড) ব্যবহার করে মেমব্রেনগুলোর ছবি তোলা হয়েছিল এবং একটি বায়ো-র‍্যাড কেমিডক এমপি সিস্টেম ব্যবহার করে তা রেকর্ড করা হয়েছিল। ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণের জন্য ইমেজল্যাব সংস্করণ ৬.১ ব্যবহার করা হয়েছিল। মূল জেল এবং ব্লট চিত্র S1-এ দেখানো হয়েছে। অ্যান্টিবডি সম্পর্কিত তথ্য সারণি S2-এ দেওয়া হয়েছে।
ডেটা সেটগুলো কমপক্ষে তিনটি স্বাধীন নমুনার গড় এবং গড়ের স্ট্যান্ডার্ড এরর (SEM) হিসেবে উপস্থাপন করা হয়েছে। একটি গাউসিয়ান ডিস্ট্রিবিউশন এবং সমান স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন ধরে নিয়ে বিশ্লেষণ শুরু করার আগে, ডেটা সেটগুলোর স্বাভাবিকতা শাপিরো-উইল্কস টেস্ট (অন্যথা উল্লেখ না থাকলে) ব্যবহার করে পরীক্ষা করা হয়েছিল। এছাড়াও, তাৎপর্য নির্ধারণের জন্য ফিশারের MEL LSD (p < 0.05), ওয়ান-ওয়ে অ্যানোভা (ট্রিটমেন্ট বনাম কন্ট্রোল গড়), এবং ডানেটের মাল্টিপল কম্প্যারিসন টেস্ট (p < 0.05) ব্যবহার করে ডেটা সেট বিশ্লেষণ করা হয়েছে। তাৎপর্যপূর্ণ p মানগুলো গ্রাফে *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 হিসেবে দেখানো হয়েছে। সমস্ত পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ এবং গ্রাফ GraphPad Prism 9.4.0 ব্যবহার করে তৈরি ও সম্পাদন করা হয়েছে।
TEM চিত্র বিশ্লেষণের জন্য Fiji/ImageJ ম্যাক্রোসমূহ গিটহাবে সর্বজনীনভাবে উপলব্ধ: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro। মাইটোকন্ড্রিয়াল ইভেন্ট লোকেটর (MEL) ম্যাক্রোটি গিটহাবে সর্বজনীনভাবে উপলব্ধ: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin।
মেইলিয়ানা এ., দেবী এনএম এবং বিজয়া এ. মাইটোকন্ড্রিয়া: বিপাক, হোমিওস্ট্যাসিস, পীড়ন, বার্ধক্য এবং এপিজেনেটিক্সের প্রধান নিয়ন্ত্রক। ইন্দোনেশিয়ান বায়োমেডিকেল সায়েন্স জার্নাল, ১৩, ২২১–২৪১ (২০২১)।
বেন-শাচার, ডি. সিজোফ্রেনিয়ায় বহুমুখী মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা, জটিল I একটি সম্ভাব্য রোগতাত্ত্বিক লক্ষ্য হিসাবে। সিজোফ্রেনিয়া রিসোর্স। ১৮৭, ৩–১০ (২০১৭)।
বোস, এ. এবং বিয়াল, এম. এফ. পারকিনসন রোগে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা। জে. নিউরোকেমিস্ট্রি। 139, 216–231 (2016)।
শর্মা ভিকে, সিং টিজি এবং মেহতা ভি। পীড়িত মাইটোকন্ড্রিয়া: আলঝেইমার রোগে আক্রমণের লক্ষ্যবস্তু। মাইটোকন্ড্রিয়া ৫৯, ৪৮–৫৭ (২০২১)।
বেলেঙ্গুয়ের পি., ডুয়ার্তে জেএমএন, শুক পিএফ এবং ফেরেইরা জিকে মাইটোকন্ড্রিয়া এবং মস্তিষ্ক: জৈবশক্তিবিজ্ঞান এবং আরও অনেক কিছু। নিউরোটক্সিনস রিসোর্স। ৩৬, ২১৯–২৩৮ (২০১৯)।
রঙ্গরাজু, ভি. প্রমুখ। প্লিওট্রপিক মাইটোকন্ড্রিয়া: স্নায়বিক বিকাশ এবং রোগে মাইটোকন্ড্রিয়ার প্রভাব। জে. নিউরোসায়েন্স। ৩৯, ৮২০০–৮২০৮ (২০১৯)।
কার্ডানো-রামোস, সি. এবং মোরাইস, ভি.এ. নিউরনে মাইটোকন্ড্রিয়াল জৈব-উৎপাদন: কীভাবে এবং কোথায়। আন্তর্জাতিকতা। জে. মোহর. দ্য সায়েন্স। ২২, ১৩০৫৯ (২০২১)।
ইউ, আর., লেন্ডাল, ইউ., নিস্টার, এম. এবং ঝাও, জে.। স্তন্যপায়ী মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্সের নিয়ন্ত্রণ: সুযোগ এবং প্রতিবন্ধকতা। ফ্রন্ট. এন্ডোক্রাইন. (লুজান) ১১, ৩৭৪ (২০২০)।
খাচো, এম. এবং স্ল্যাক, আর. এস. নিউরোজেনেসিস নিয়ন্ত্রণে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্স: বিকাশমান মস্তিষ্ক থেকে প্রাপ্তবয়স্ক মস্তিষ্ক পর্যন্ত। ডেভেলপমেন্ট. ডায়নামিক. ২৪৭, ৪৭–৫৩ (২০১৮)।