Nature.com দেখার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি যে ব্রাউজারটি ব্যবহার করছেন তার সংস্করণে সীমিত CSS সাপোর্ট রয়েছে। সেরা ফলাফলের জন্য, আমরা আপনাকে আপনার ব্রাউজারের একটি নতুন সংস্করণ ব্যবহার করার পরামর্শ দিচ্ছি (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্যতা মোড অক্ষম করুন)। ইতিমধ্যে, চলমান সহায়তা নিশ্চিত করার জন্য, আমরা স্টাইলিং বা জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই সাইটটি দেখাচ্ছি।
অটিজম স্পেকট্রাম ডিসঅর্ডারের মতো নিউরোডেভেলপমেন্টাল ডিসঅর্ডারে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিসফাংশনের ভূমিকা অধ্যয়নের জন্য প্রোপিওনিক অ্যাসিড (PPA) ব্যবহার করা হয়। PPA মাইটোকন্ড্রিয়াল জৈবজেনেসিস, বিপাক এবং টার্নওভার ব্যাহত করার জন্য পরিচিত। তবে, এই প্রক্রিয়াগুলির জটিল টেম্পোরাল প্রকৃতির কারণে মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যা, বিদারণ এবং ফিউশনের উপর PPA এর প্রভাব সমস্যাযুক্ত রয়ে গেছে। এখানে, আমরা নিউরনের মতো SH-SY5Y কোষগুলিতে মাইটোকন্ড্রিয়াল আল্ট্রাস্ট্রাকচার, রূপবিদ্যা এবং গতিবিদ্যাকে PPA কীভাবে প্রভাবিত করে তা তদন্ত করার জন্য পরিপূরক পরিমাণগত ইমেজিং কৌশল ব্যবহার করি। PPA (5 mM) মাইটোকন্ড্রিয়াল এলাকা (p < 0.01), ফেরেট ব্যাস এবং পরিধি (p < 0.05), এবং এলাকা 2 (p < 0.01) উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করেছে। মাইটোকন্ড্রিয়াল ইভেন্ট লোকেটার বিশ্লেষণে ফিশন এবং ফিউশন ইভেন্টগুলিতে উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি (p < 0.05) দেখানো হয়েছে, যার ফলে চাপের পরিস্থিতিতে মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কের অখণ্ডতা বজায় রাখা হয়েছে। এছাড়াও, cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) এবং OPA1 (p < 0.05) এর mRNA এক্সপ্রেশন উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে। 01)। এটি চাপের পরিস্থিতিতে কার্যকারিতা বজায় রাখার জন্য মাইটোকন্ড্রিয়াল রূপবিদ্যা, জৈবজন্ম এবং গতিবিদ্যার পুনর্গঠনকে চিত্রিত করে। আমাদের তথ্য মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যার উপর PPA এর প্রভাব সম্পর্কে নতুন অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল স্ট্রেস প্রতিক্রিয়ার সাথে জড়িত জটিল নিয়ন্ত্রক প্রক্রিয়াগুলি অধ্যয়নের জন্য ইমেজিং কৌশলগুলির উপযোগিতা তুলে ধরে।
মাইটোকন্ড্রিয়া শক্তি উৎপাদন এবং জৈব সংশ্লেষণের ক্ষেত্রে তাদের সাধারণ ভূমিকার বাইরেও বিভিন্ন কোষীয় কার্যক্রমে অবিচ্ছেদ্য অংশগ্রহণকারী। মাইটোকন্ড্রিয়া বিপাক ক্যালসিয়াম সংকেত, বিপাকীয় এবং রেডক্স হোমিওস্ট্যাসিস, প্রদাহজনক সংকেত, এপিজেনেটিক পরিবর্তন, কোষের বিস্তার, পার্থক্য এবং প্রোগ্রাম করা কোষের মৃত্যুর একটি মূল নিয়ন্ত্রক। বিশেষ করে, মাইটোকন্ড্রিয়াল বিপাক নিউরোনাল বিকাশ, বেঁচে থাকা এবং কার্যকারিতার জন্য অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ এবং নিউরোপ্যাথোলজির বিভিন্ন প্রকাশে ব্যাপকভাবে জড়িত।
গত দশক ধরে, বিপাকীয় অবস্থা নিউরোজেনেসিস, ডিফারেনটিভেশন, পরিপক্কতা এবং প্লাস্টিসিটির কেন্দ্রীয় নিয়ন্ত্রক হিসেবে আবির্ভূত হয়েছে5,6। সম্প্রতি, মাইটোকন্ড্রিয়াল রূপবিদ্যা এবং গতিবিদ্যা মাইটোসিসের বিশেষ গুরুত্বপূর্ণ উপাদান হয়ে উঠেছে, একটি গতিশীল প্রক্রিয়া যা কোষের মধ্যে সুস্থ মাইটোকন্ড্রিয়ার একটি পুল বজায় রাখে। মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যা মাইটোকন্ড্রিয়াল জৈবজেনেসিস এবং জৈবশক্তি থেকে শুরু করে মাইটোকন্ড্রিয়াল বিদারণ, ফিউশন, পরিবহন এবং ক্লিয়ারেন্স পর্যন্ত জটিল আন্তঃনির্ভরশীল পথ দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়7,8। এই সমন্বিত প্রক্রিয়াগুলির যেকোনো একটির ব্যাঘাত সুস্থ মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কগুলির রক্ষণাবেক্ষণকে ব্যাহত করে এবং নিউরোডেভেলপমেন্টের জন্য গভীর কার্যকরী পরিণতি ঘটায়9,10। প্রকৃতপক্ষে, অটিজম স্পেকট্রাম ডিসঅর্ডার (ASD)11,12 সহ অনেক মানসিক, নিউরোডিজেনারেটিভ এবং নিউরোডেভেলপমেন্টাল ব্যাধিতে মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যার অনিয়ন্ত্রণ পরিলক্ষিত হয়।
ASD হল একটি ভিন্নধর্মী নিউরোডেভেলপমেন্টাল ডিসঅর্ডার যার একটি জটিল জেনেটিক এবং এপিজেনেটিক স্থাপত্য রয়েছে। ASD-এর বংশগতি নিঃসন্দেহে বিতর্কিত, কিন্তু অন্তর্নিহিত আণবিক এটিওলজি এখনও খারাপভাবে বোঝা যাচ্ছে। প্রি-ক্লিনিক্যাল মডেল, ক্লিনিকাল স্টাডি এবং মাল্টি-ওমিক্স আণবিক ডেটাসেট থেকে প্রাপ্ত তথ্য ASD-তে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার ক্রমবর্ধমান প্রমাণ প্রদান করে13,14। আমরা পূর্বে ASD আক্রান্ত রোগীদের একটি দলে একটি জিনোম-ওয়াইড DNA মিথাইলেশন স্ক্রিন পরিচালনা করেছি এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল বিপাকীয় পথ বরাবর ক্লাস্টার করা ডিফারেনশিয়ালি মিথাইলেটেড জিন সনাক্ত করেছি15। আমরা পরবর্তীতে মাইটোকন্ড্রিয়াল জৈবজেনেসিস এবং গতিবিদ্যার কেন্দ্রীয় নিয়ন্ত্রকদের ডিফারেনশিয়াল মিথাইলেশন রিপোর্ট করেছি, যা ASD16-তে বর্ধিত mtDNA কপি সংখ্যা এবং পরিবর্তিত মূত্রনালীর বিপাকীয় প্রোফাইলের সাথে যুক্ত ছিল। আমাদের তথ্য ক্রমবর্ধমান প্রমাণ প্রদান করে যে মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যা এবং হোমিওস্ট্যাসিস ASD-এর প্যাথোফিজিওলজিতে একটি কেন্দ্রীয় ভূমিকা পালন করে। অতএব, মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যা, রূপবিদ্যা এবং কার্যকারিতার মধ্যে সম্পর্কের যান্ত্রিক বোঝাপড়া উন্নত করা সেকেন্ডারি মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা দ্বারা চিহ্নিত স্নায়বিক রোগগুলির উপর চলমান গবেষণার একটি মূল লক্ষ্য।
মাইটোকন্ড্রিয়াল স্ট্রেস প্রতিক্রিয়ায় নির্দিষ্ট জিনের ভূমিকা অধ্যয়নের জন্য প্রায়শই আণবিক কৌশল ব্যবহার করা হয়। তবে, মাইটোটিক নিয়ন্ত্রণ ব্যবস্থার বহুমুখী এবং সময়গত প্রকৃতির কারণে এই পদ্ধতি সীমিত হতে পারে। অধিকন্তু, মাইটোকন্ড্রিয়াল জিনের ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন কার্যকরী পরিবর্তনের একটি পরোক্ষ সূচক, বিশেষ করে যেহেতু শুধুমাত্র সীমিত সংখ্যক জিন সাধারণত বিশ্লেষণ করা হয়। অতএব, মাইটোকন্ড্রিয়াল ফাংশন এবং জৈবশক্তি অধ্যয়নের জন্য আরও সরাসরি পদ্ধতি প্রস্তাব করা হয়েছে17। মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজি মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যার সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত। মাইটোকন্ড্রিয়াল আকৃতি, সংযোগ এবং গঠন শক্তি উৎপাদন এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল এবং কোষের বেঁচে থাকার জন্য অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ5,18। অধিকন্তু, মাইটোসিসের বিভিন্ন উপাদান মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজির পরিবর্তনের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করে, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার কার্যকর শেষ বিন্দু হিসেবে কাজ করতে পারে এবং পরবর্তী যান্ত্রিক গবেষণার জন্য একটি ভিত্তি প্রদান করতে পারে।
ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি (TEM) ব্যবহার করে মাইটোকন্ড্রিয়াল মর্ফোলজি সরাসরি পর্যবেক্ষণ করা যেতে পারে, যা কোষীয় আল্ট্রাস্ট্রাকচারের বিশদ অধ্যয়নের অনুমতি দেয়। TEM কোষ জনসংখ্যার জিন ট্রান্সক্রিপশন, প্রোটিন এক্সপ্রেশন বা মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকরী পরামিতিগুলির উপর নির্ভর না করে, পৃথক মাইটোকন্ড্রিয়ার রেজোলিউশনে মাইটোকন্ড্রিয়াল ক্রিস্টের মর্ফোলজি, আকৃতি এবং গঠন সরাসরি কল্পনা করে। এছাড়াও, TEM মাইটোকন্ড্রিয়া এবং অন্যান্য অর্গানেল, যেমন এন্ডোপ্লাজমিক রেটিকুলাম এবং অটোফ্যাগোসোমগুলির মধ্যে মিথস্ক্রিয়া অধ্যয়নের সুবিধা প্রদান করে, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল ফাংশন এবং হোমিওস্ট্যাসিসে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে21,22। সুতরাং, এটি নির্দিষ্ট পথ বা জিনের উপর মনোযোগ দেওয়ার আগে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা অধ্যয়নের জন্য TEM কে একটি ভাল সূচনা বিন্দু করে তোলে। মাইটোকন্ড্রিয়াল ফাংশন নিউরোপ্যাথোলজির সাথে ক্রমবর্ধমানভাবে প্রাসঙ্গিক হয়ে উঠার সাথে সাথে, ইন ভিট্রো নিউরোনাল মডেলগুলিতে মাইটোকন্ড্রিয়াল মর্ফোলজি এবং গতিবিদ্যা সরাসরি এবং পরিমাণগতভাবে অধ্যয়ন করতে সক্ষম হওয়ার স্পষ্ট প্রয়োজন।
এই প্রবন্ধে, আমরা অটিজম স্পেকট্রাম ডিসঅর্ডারে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিসফাংশনের একটি নিউরোনাল মডেলে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডাইনামিক্স পরীক্ষা করব। আমরা পূর্বে ASD15-তে প্রোপিওনিল-CoA কার্বক্সিলেজ বিটা (PCCB) এর ডিফারেনশিয়াল মিথাইলেশন রিপোর্ট করেছি, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল প্রোপিওনিল-CoA কার্বক্সিলেজ এনজাইম PCC-এর একটি সাবইউনিট। PCC-এর অনিয়ন্ত্রণ প্রোপিওনিল ডেরিভেটিভস, যার মধ্যে প্রোপিওনিল অ্যাসিড (PPA)23,24,25 রয়েছে, বিষাক্ত জমার কারণ হিসাবে পরিচিত। PPA নিউরোনাল বিপাক ব্যাহত করে এবং ভিভোতে আচরণ পরিবর্তন করে এবং ASD26,27,28-এর সাথে জড়িত নিউরোডেভেলপমেন্টাল প্রক্রিয়া অধ্যয়নের জন্য একটি প্রতিষ্ঠিত প্রাণী মডেল হিসাবে দেখা গেছে। অতিরিক্তভাবে, PPA মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেন পটেনশিয়াল, জৈবজেনেসিস এবং শ্বসনকে ইন ভিট্রোতে ব্যাহত করে বলে জানা গেছে এবং নিউরনে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিসফাংশনের মডেল তৈরি করতে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়েছে29,30। তবে, মাইটোকন্ড্রিয়াল রূপবিদ্যা এবং গতিবিদ্যার উপর PPA-প্ররোচিত মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিসফাংশনের প্রভাব এখনও খারাপভাবে বোঝা যাচ্ছে।
এই গবেষণায় SH-SY5Y কোষে মাইটোকন্ড্রিয়াল রূপবিদ্যা, গতিবিদ্যা এবং কার্যকারিতার উপর PPA এর প্রভাব পরিমাপ করার জন্য পরিপূরক ইমেজিং কৌশল ব্যবহার করা হয়েছে। প্রথমত, আমরা মাইটোকন্ড্রিয়াল রূপবিদ্যা এবং আল্ট্রাস্ট্রাকচারের পরিবর্তনগুলি কল্পনা করার জন্য একটি TEM পদ্ধতি তৈরি করেছি17,31,32। মাইটোকন্ড্রিয়ার গতিশীল প্রকৃতির কারণে33, আমরা PPA চাপের অধীনে ফিশন এবং ফিউশন ইভেন্ট, মাইটোকন্ড্রিয়াল সংখ্যা এবং আয়তনের মধ্যে ভারসাম্যের পরিবর্তন পরিমাপ করার জন্য মাইটোকন্ড্রিয়াল ইভেন্ট লোকালাইজার (MEL) বিশ্লেষণও ব্যবহার করেছি। অবশেষে, আমরা পরীক্ষা করেছি যে মাইটোকন্ড্রিয়াল রূপবিদ্যা এবং গতিবিদ্যা জৈবজেনেসিস, ফিশন এবং ফিউশনে জড়িত জিনের প্রকাশের পরিবর্তনের সাথে সম্পর্কিত কিনা। একসাথে নেওয়া হলে, আমাদের ডেটা মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যা নিয়ন্ত্রণকারী প্রক্রিয়াগুলির জটিলতা ব্যাখ্যা করার চ্যালেঞ্জকে চিত্রিত করে। আমরা SH-SY5Y কোষে মাইটোসিসের একটি পরিমাপযোগ্য অভিসারী শেষ বিন্দু হিসাবে মাইটোকন্ড্রিয়াল রূপবিদ্যা অধ্যয়নে TEM এর উপযোগিতা তুলে ধরেছি। অতিরিক্তভাবে, আমরা হাইলাইট করি যে TEM ডেটা ইমেজিং কৌশলগুলির সাথে মিলিত হলে সবচেয়ে সমৃদ্ধ তথ্য সরবরাহ করে যা বিপাকীয় চাপের প্রতিক্রিয়ায় গতিশীল ঘটনাগুলিও ক্যাপচার করে। নিউরোনাল কোষ মাইটোসিসকে সমর্থন করে এমন আণবিক নিয়ন্ত্রক প্রক্রিয়াগুলির আরও বৈশিষ্ট্য স্নায়ুতন্ত্রের মাইটোকন্ড্রিয়াল উপাদান এবং নিউরোডিজেনারেটিভ রোগ সম্পর্কে গুরুত্বপূর্ণ অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করতে পারে।
মাইটোকন্ড্রিয়াল স্ট্রেস তৈরির জন্য, SH-SY5Y কোষগুলিকে 3 mM এবং 5 mM সোডিয়াম প্রোপিওনেট (NaP) ব্যবহার করে PPA দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। TEM-এর আগে, নমুনাগুলিকে উচ্চ-চাপ হিমায়িত এবং হিমায়িত ব্যবহার করে ক্রায়োজেনিক নমুনা প্রস্তুতির শিকার করা হত (চিত্র 1a)। আমরা তিনটি জৈবিক প্রতিলিপি জুড়ে মাইটোকন্ড্রিয়াল জনসংখ্যার আটটি রূপগত পরামিতি পরিমাপ করার জন্য একটি স্বয়ংক্রিয় মাইটোকন্ড্রিয়াল চিত্র বিশ্লেষণ পাইপলাইন তৈরি করেছি। আমরা দেখতে পেয়েছি যে PPA চিকিত্সা উল্লেখযোগ্যভাবে চারটি পরামিতি পরিবর্তন করেছে: এলাকা 2, এলাকা, পরিধি এবং ফেরেট ব্যাস (চিত্র 1b–e)। 3 mM এবং 5 mM PPA চিকিত্সা (যথাক্রমে p = 0.0183 এবং p = 0.002) (চিত্র 1b) উভয়ের সাথে ক্ষেত্র 2 উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে, যেখানে ক্ষেত্রফল (p = 0.003), পরিধি (p = 0.0106) এবং ফেরেট ব্যাস সবই উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে। নিয়ন্ত্রণ গ্রুপের (চিত্র 1c–e) তুলনায় 5 mM চিকিত্সা গ্রুপে একটি উল্লেখযোগ্য হ্রাস (p = 0.0172) ছিল। ক্ষেত্রফল এবং পরিধির উল্লেখযোগ্য হ্রাস দেখিয়েছে যে 5 mM PPA দিয়ে চিকিত্সা করা কোষগুলিতে ছোট, আরও গোলাকার মাইটোকন্ড্রিয়া ছিল এবং এই মাইটোকন্ড্রিয়া নিয়ন্ত্রণ কোষের তুলনায় কম দীর্ঘায়িত ছিল। এটি ফেরেট ব্যাসের উল্লেখযোগ্য হ্রাসের সাথেও সামঞ্জস্যপূর্ণ, যা একটি স্বাধীন প্যারামিটার যা কণার প্রান্তগুলির মধ্যে সর্বাধিক দূরত্ব হ্রাস নির্দেশ করে। ক্রিস্টির আল্ট্রাস্ট্রাকচারে পরিবর্তন লক্ষ্য করা গেছে: PPA স্ট্রেসের প্রভাবে ক্রিস্টি কম স্পষ্ট হয়ে ওঠে (চিত্র 1a, প্যানেল B)। যাইহোক, সমস্ত চিত্র স্পষ্টভাবে ক্রিস্টির আল্ট্রাস্ট্রাকচার প্রতিফলিত করেনি, তাই এই পরিবর্তনগুলির একটি পরিমাণগত বিশ্লেষণ করা হয়নি। এই TEM ডেটা তিনটি সম্ভাব্য পরিস্থিতি প্রতিফলিত করতে পারে: (1) PPA বিদারণ বৃদ্ধি করে বা ফিউশনকে বাধা দেয়, যার ফলে বিদ্যমান মাইটোকন্ড্রিয়া আকারে সঙ্কুচিত হয়; (2) বর্ধিত জৈবজেনেসিস নতুন, ছোট মাইটোকন্ড্রিয়া তৈরি করে বা (3) উভয় প্রক্রিয়াকে একই সাথে প্ররোচিত করে। যদিও এই অবস্থাগুলিকে TEM দ্বারা আলাদা করা যায় না, উল্লেখযোগ্য রূপগত পরিবর্তনগুলি PPA স্ট্রেসের অধীনে মাইটোকন্ড্রিয়া হোমিওস্ট্যাসিস এবং গতিবিদ্যার পরিবর্তন নির্দেশ করে। পরবর্তীতে আমরা এই গতিবিদ্যা এবং তাদের অন্তর্নিহিত সম্ভাব্য প্রক্রিয়াগুলিকে আরও চিহ্নিত করার জন্য অতিরিক্ত পরামিতিগুলি অন্বেষণ করেছি।
প্রোপিওনিক অ্যাসিড (PPA) মাইটোকন্ড্রিয়াল রূপবিদ্যা পুনর্গঠন করে। (a) প্রতিনিধিত্বমূলক ট্রান্সমিশন ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপি (TEM) চিত্রগুলি দেখায় যে মাইটোকন্ড্রিয়াল আকার হ্রাস পায় এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল PPA চিকিত্সা বৃদ্ধির সাথে ছোট এবং আরও গোলাকার হয়ে যায়; যথাক্রমে 0 mM (চিকিৎসাবিহীন), 3 mM এবং 5 mM। লাল তীরগুলি মাইটোকন্ড্রিয়া নির্দেশ করে। (b–e) 24 ঘন্টা ধরে PPA দিয়ে চিকিত্সা করা SH-SY5Y কোষগুলি TEM-এর জন্য প্রস্তুত করা হয়েছিল এবং ফলাফলগুলি Fiji/ImageJ ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। আটটি প্যারামিটারের মধ্যে চারটি নিয়ন্ত্রণ (চিকিৎসাবিহীন, 0 mM PPA) এবং চিকিত্সা করা (3 mM এবং 5 mM PPA) কোষের মধ্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখিয়েছে। (b) অঞ্চল 2, (c) এলাকা, (d) পরিধি, (e) ফেরেট ব্যাস। উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্ধারণের জন্য বৈচিত্র্যের একমুখী বিশ্লেষণ (নিয়ন্ত্রণ বনাম চিকিত্সা) এবং ডানেটের একাধিক তুলনা পরীক্ষা ব্যবহার করা হয়েছিল (p < 0.05)। ডেটা পয়েন্টগুলি প্রতিটি পৃথক কোষের জন্য গড় মাইটোকন্ড্রিয়াল মান উপস্থাপন করে এবং ত্রুটি বারগুলি গড় ± SEM উপস্থাপন করে। দেখানো তথ্য n = 3 প্রতিনিধিত্ব করে, প্রতি প্রতিলিপিতে কমপক্ষে 24টি কোষ; মোট 266টি চিত্র বিশ্লেষণ করা হয়েছিল; * p < 0.05 নির্দেশ করে, ** p < 0.01 নির্দেশ করে।
মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যা PPA-তে কীভাবে প্রতিক্রিয়া দেখায় তা আরও স্পষ্ট করার জন্য, আমরা টেট্রামিথাইলরোডামাইন ইথাইল এস্টার (TMRE) দিয়ে মাইটোকন্ড্রিয়াকে স্টেইন করেছি এবং 3 এবং 5 mM PPA-তে 24 ঘন্টা পরে মাইটোকন্ড্রিয়াকে স্থানীয়করণ এবং পরিমাণ নির্ধারণের জন্য টাইম-ল্যাপস মাইক্রোস্কোপি এবং MEL বিশ্লেষণ ব্যবহার করেছি। ফিশন এবং ফিউশন ইভেন্টের চিকিৎসা। (চিত্র 2a)। MEL বিশ্লেষণের পরে, মাইটোকন্ড্রিয়া গঠনের সংখ্যা এবং তাদের গড় আয়তন পরিমাপ করার জন্য মাইটোকন্ড্রিয়া আরও বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। আমরা 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] এ সংঘটিত বিদারণ ইভেন্টের সংখ্যায় একটি ছোট কিন্তু উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি লক্ষ্য করেছি [5.6 ± 0.3 (p < 0.05) )] এবং ফিউশন [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] নিয়ন্ত্রণের তুলনায় 5 mM এ উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছিল (চিত্র 3b)। মাইটোকন্ড্রিয়ার সংখ্যা উল্লেখযোগ্যভাবে 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] এবং 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (চিত্র 3c) উভয় ক্ষেত্রেই বৃদ্ধি পেয়েছে, যেখানে প্রতিটি মাইটোকন্ড্রিয়াল কাঠামোর গড় আয়তন অপরিবর্তিত রয়েছে (চিত্র 3c)। 3d)। একসাথে নেওয়া হলে, এটি ইঙ্গিত দেয় যে মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যার পুনর্নির্মাণ একটি ক্ষতিপূরণমূলক প্রতিক্রিয়া হিসাবে কাজ করে যা সফলভাবে মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কের অখণ্ডতা বজায় রাখে। 3 mM PPA-তে বিদারণ ঘটনার সংখ্যা বৃদ্ধি ইঙ্গিত দেয় যে মাইটোকন্ড্রিয়াল সংখ্যার বৃদ্ধি আংশিকভাবে মাইটোকন্ড্রিয়াল বিদারণের কারণে, তবে গড় মাইটোকন্ড্রিয়াল আয়তন মূলত অপরিবর্তিত থাকায়, জৈবজন্মকে অতিরিক্ত ক্ষতিপূরণমূলক প্রতিক্রিয়া হিসাবে উড়িয়ে দেওয়া যায় না। যাইহোক, এই তথ্যগুলি TEM দ্বারা পর্যবেক্ষণ করা ছোট, গোলাকার মাইটোকন্ড্রিয়াল কাঠামোর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ এবং PPA দ্বারা প্ররোচিত মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যায় উল্লেখযোগ্য পরিবর্তনগুলিও প্রদর্শন করে।
প্রোপিওনিক অ্যাসিড (PPA) নেটওয়ার্ক অখণ্ডতা বজায় রাখার জন্য গতিশীল মাইটোকন্ড্রিয়াল পুনর্নির্মাণকে প্ররোচিত করে। SH-SY5Y কোষগুলিকে কালচার করা হয়েছিল, 3 এবং 5 mM PPA দিয়ে 24 ঘন্টা ধরে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং TMRE এবং Hoechst 33342 দিয়ে রঙ করা হয়েছিল এবং তারপরে MEL বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। (a) প্রতিটি অবস্থার জন্য সময় 2 (t2) এ রঙ এবং বাইনারিাইজড সর্বাধিক তীব্রতা প্রক্ষেপণ চিত্রিত করে প্রতিনিধিত্বমূলক টাইম-ল্যাপস মাইক্রোস্কোপি চিত্র। প্রতিটি বাইনারি ছবিতে নির্দেশিত নির্বাচিত অঞ্চলগুলিকে উন্নত করা হয় এবং সময়ের সাথে সাথে গতিশীলতা চিত্রিত করার জন্য তিনটি ভিন্ন সময় ফ্রেমে (t1-t3) 3D তে প্রদর্শিত হয়; ফিউশন ইভেন্টগুলি সবুজ রঙে হাইলাইট করা হয়; বিদারণ ইভেন্টগুলি সবুজ রঙে হাইলাইট করা হয়। লাল রঙে প্রদর্শিত হয়। (b) প্রতি অবস্থাতে গতিশীল ইভেন্টের গড় সংখ্যা। (c) প্রতি কোষে মাইটোকন্ড্রিয়াল কাঠামোর গড় সংখ্যা। (d) প্রতি কোষে প্রতিটি মাইটোকন্ড্রিয়াল কাঠামোর গড় আয়তন (µm3)। প্রদর্শিত ডেটা প্রতি চিকিত্সা গ্রুপে n = 15 কোষের প্রতিনিধিত্ব করে। প্রদর্শিত ত্রুটি বারগুলি গড় ± SEM, স্কেল বার = 10 μm, * p < 0.05 প্রতিনিধিত্ব করে।
প্রোপায়োনিক অ্যাসিড (PPA) মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যার সাথে সম্পর্কিত জিনের ট্রান্সক্রিপশনাল দমন ঘটায়। SH-SY5Y কোষগুলিকে 24 ঘন্টা ধরে 3 এবং 5 mM PPA দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। RT-qPCR ব্যবহার করে আপেক্ষিক জিনের পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল এবং B2M-এ স্বাভাবিক করা হয়েছিল। মাইটোকন্ড্রিয়াল জৈবজেনেসিস জিন (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 এবং (d) NFE2L2। মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিউশন এবং ফিশন জিন (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 এবং (i) DRP1। একমুখী ANOVA (নিয়ন্ত্রণ বনাম চিকিত্সা) এবং ডানেটের একাধিক তুলনামূলক পরীক্ষা ব্যবহার করে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য (p < 0.05) পরীক্ষা করা হয়েছিল: * p < 0.05 নির্দেশ করে, ** p < 0.01 নির্দেশ করে, এবং **** p < 0.0001 নির্দেশ করে। বারগুলি গড় প্রকাশ ± SEM প্রতিনিধিত্ব করে। প্রদর্শিত তথ্য n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), এবং n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) জৈবিক প্রতিলিপি উপস্থাপন করে।
TEM এবং MEL বিশ্লেষণের একত্রে প্রাপ্ত তথ্য ইঙ্গিত দেয় যে PPA মাইটোকন্ড্রিয়াল রূপবিদ্যা এবং গতিবিদ্যা পরিবর্তন করে। তবে, এই ইমেজিং কৌশলগুলি এই প্রক্রিয়াগুলিকে পরিচালিত করার অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়াগুলির অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে না। তাই আমরা PPA চিকিৎসার প্রতিক্রিয়ায় মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যা, জৈবজেনেসিস এবং মাইটোসিসের নয়টি মূল নিয়ন্ত্রকের mRNA অভিব্যক্তি পরীক্ষা করেছি। আমরা 3 mM এবং 5 mM PPA দিয়ে 24 ঘন্টা চিকিত্সার পরে কোষ মাইলোমা অনকোজিন (cMYC), নিউক্লিয়ার রেসপিরেটরি ফ্যাক্টর (NRF1), মাইটোকন্ড্রিয়াল ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর 1 (TFAM), NFE2-এর মতো ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর BZIP (NFE2L2), গ্যাস্ট্রিন-এর মতো প্রোটিন 2 (STOML2), অপটিক নার্ভ অ্যাট্রোফি 1 (OPA1), মাইটোফুসিন 1 (MFN1), মাইটোফুসিন 2 (MFN2) এবং ডাইনামিন-সম্পর্কিত প্রোটিন 1 (DRP1) পরিমাপ করেছি। আমরা 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 এবং p < 0.0001, যথাক্রমে) এবং 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) PPA চিকিৎসা পর্যবেক্ষণ করেছি। (চিত্র 3a–c)। mRNA প্রকাশের হ্রাস ডোজ-নির্ভর ছিল: cMYC, NRF1 এবং TFAM এর প্রকাশ 3 mM এ যথাক্রমে 5.7, 2.6 এবং 1.9 বার হ্রাস পেয়েছে, এবং 5 mM এ 11.2, 3 এবং 2.2 বার হ্রাস পেয়েছে। বিপরীতে, কেন্দ্রীয় রেডক্স জৈবজেনেসিস জিন NFE2L2 PPA এর কোনও ঘনত্বে পরিবর্তিত হয়নি, যদিও হ্রাসের একই রকম ডোজ-নির্ভর প্রবণতা লক্ষ্য করা গেছে (চিত্র 3d)।
আমরা ফিশন এবং ফিউশন নিয়ন্ত্রণে জড়িত ধ্রুপদী জিনের প্রকাশও পরীক্ষা করেছি। STOML2 ফিউশন, মাইটোফ্যাজি এবং জৈবজননে জড়িত বলে মনে করা হয় এবং এর প্রকাশ উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে (p < 0.0001) 3 mM (2.4-গুণ পরিবর্তন) এবং 5 mM (2.8-গুণ পরিবর্তন) PPA (চিত্র 1) দ্বারা। 3d)। একইভাবে, OPA1 ফিউশন জিনের প্রকাশ 3 mM (1.6-গুণ পরিবর্তন) এবং 5 mM (1.9-গুণ পরিবর্তন) PPA (p = 0.006 এবং p = 0.0024, যথাক্রমে) (চিত্র 3f) এ হ্রাস পেয়েছে। তবে, আমরা 24-ঘন্টা PPA চাপের অধীনে ফিউশন জিন MFN1, MFN2 বা ফিশন জিন DRP1 এর প্রকাশে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য খুঁজে পাইনি (চিত্র 3g–i)। এছাড়াও, আমরা দেখতে পেয়েছি যে চারটি ফিউশন এবং ফিশন প্রোটিনের (OPA1, MFN1, MFN2 এবং DRP1) মাত্রা একই অবস্থার অধীনে পরিবর্তিত হয়নি (চিত্র 4a–d)। এটি মনে রাখা গুরুত্বপূর্ণ যে এই তথ্যগুলি সময়ের একটি একক বিন্দু প্রতিফলিত করে এবং PPA স্ট্রেসের প্রাথমিক পর্যায়ে প্রোটিন প্রকাশ বা কার্যকলাপের স্তরের পরিবর্তনগুলি প্রতিফলিত নাও করতে পারে। তবে, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, এবং OPA1 এর প্রকাশে উল্লেখযোগ্য হ্রাস মাইটোকন্ড্রিয়াল বিপাক, জৈবজেনেসিস এবং গতিবিদ্যার উল্লেখযোগ্য ট্রান্সক্রিপশনাল ডিসরেগুলেশন নির্দেশ করে। এছাড়াও, এই তথ্যগুলি মাইটোকন্ড্রিয়াল ফাংশনে এন্ড-স্টেট পরিবর্তনগুলি সরাসরি অধ্যয়ন করার জন্য ইমেজিং কৌশলগুলির উপযোগিতা তুলে ধরে।
প্রোপিওনিক অ্যাসিড (PPA) চিকিৎসার পরেও ফিউশন এবং ফিশন ফ্যাক্টর প্রোটিনের মাত্রা পরিবর্তিত হয়নি। SH-SY5Y কোষগুলিকে 3 এবং 5 mM PPA দিয়ে 24 ঘন্টা ধরে চিকিৎসা করা হয়েছিল। ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণের মাধ্যমে প্রোটিনের মাত্রা পরিমাপ করা হয়েছিল এবং এক্সপ্রেশনের মাত্রা মোট প্রোটিনে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। গড় প্রোটিন এক্সপ্রেশন এবং লক্ষ্য এবং মোট প্রোটিনের প্রতিনিধিত্বকারী ওয়েস্টার্ন ব্লট দেখানো হয়েছে। a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1। বারগুলি গড় ± SEM প্রতিনিধিত্ব করে এবং দেখানো ডেটা n = 3 জৈবিক প্রতিলিপির প্রতিনিধিত্ব করে। ভ্যারিয়েন্সের একমুখী বিশ্লেষণ এবং ডানেটের পরীক্ষা ব্যবহার করে একাধিক তুলনা (p < 0.05) করা হয়েছিল। মূল জেল এবং ব্লট চিত্র S1 এ দেখানো হয়েছে।
মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা বহু-সিস্টেম রোগের সাথে যুক্ত, যার মধ্যে রয়েছে বিপাকীয়, কার্ডিওভাসকুলার এবং পেশীবহুল রোগ থেকে শুরু করে স্নায়বিক রোগ1,10। অনেক নিউরোডিজেনারেটিভ এবং নিউরোডিজেনারেটিভ রোগ মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার সাথে যুক্ত, যা মস্তিষ্কের জীবদ্দশায় এই অর্গানেলগুলির গুরুত্ব তুলে ধরে। এই রোগগুলির মধ্যে রয়েছে পার্কিনসন রোগ, আলঝাইমার রোগ এবং ASD3,4,18। তবে, এই রোগগুলি অধ্যয়নের জন্য মস্তিষ্কের টিস্যুতে অ্যাক্সেস কঠিন, বিশেষ করে যান্ত্রিক স্তরে, যা সেলুলার মডেল সিস্টেমগুলিকে একটি প্রয়োজনীয় বিকল্প করে তোলে। এই গবেষণায়, আমরা নিউরোনাল রোগে, বিশেষ করে অটিজম স্পেকট্রাম ডিসঅর্ডারে পরিলক্ষিত মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার পুনরাবৃত্তি করার জন্য PPA-চিকিত্সা করা SH-SY5Y কোষ ব্যবহার করে একটি সেলুলার মডেল সিস্টেম ব্যবহার করি। নিউরনে মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যা অধ্যয়ন করার জন্য এই PPA মডেল ব্যবহার করলে ASD এর কারণ সম্পর্কে অন্তর্দৃষ্টি পাওয়া যেতে পারে।
আমরা মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজির পরিবর্তনগুলি দেখার জন্য TEM ব্যবহারের সম্ভাবনা অন্বেষণ করেছি। এটি মনে রাখা গুরুত্বপূর্ণ যে TEM এর কার্যকারিতা সর্বাধিক করার জন্য সঠিকভাবে ব্যবহার করা উচিত। ক্রায়ো-নমুনা প্রস্তুত করার ফলে একই সাথে কোষীয় উপাদানগুলি ঠিক করে এবং শিল্পকর্মের গঠন হ্রাস করে নিউরোনাল কাঠামোর আরও ভাল সংরক্ষণ করা সম্ভব হয়34। এর সাথে সামঞ্জস্য রেখে, আমরা লক্ষ্য করেছি যে নিউরনের মতো SH-SY5Y কোষগুলিতে অক্ষত উপকোষীয় অর্গানেল এবং দীর্ঘায়িত মাইটোকন্ড্রিয়া ছিল (চিত্র 1a)। এটি নিউরোনাল কোষ মডেলগুলিতে মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজি অধ্যয়নের জন্য ক্রায়োজেনিক প্রস্তুতি কৌশলগুলির উপযোগিতা তুলে ধরে। যদিও TEM ডেটার বস্তুনিষ্ঠ বিশ্লেষণের জন্য পরিমাণগত পরিমাপ অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ, তবুও মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজিকাল পরিবর্তনগুলি নিশ্চিত করার জন্য কোন নির্দিষ্ট পরামিতিগুলি পরিমাপ করা উচিত সে সম্পর্কে এখনও কোনও ঐক্যমত্য নেই। মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজি17,31,32 পরিমাণগতভাবে পরীক্ষা করা বিপুল সংখ্যক গবেষণার উপর ভিত্তি করে, আমরা একটি স্বয়ংক্রিয় মাইটোকন্ড্রিয়াল চিত্র বিশ্লেষণ পাইপলাইন তৈরি করেছি যা আটটি রূপগত পরামিতি পরিমাপ করে, যথা: ক্ষেত্রফল, ক্ষেত্রফল2, দিক অনুপাত, পরিধি, বৃত্তাকারতা, ডিগ্রি, ফেরেট ব্যাস। এবং বৃত্তাকারতা।
এর মধ্যে, PPA উল্লেখযোগ্যভাবে ক্ষেত্রফল 2, ক্ষেত্রফল, পরিধি এবং ফেরেট ব্যাস হ্রাস করেছে (চিত্র 1b–e)। এটি দেখায় যে মাইটোকন্ড্রিয়া ছোট এবং আরও গোলাকার হয়ে উঠেছে, যা পূর্ববর্তী গবেষণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যা PPA30-প্ররোচিত মাইটোকন্ড্রিয়াল চাপের 72 ঘন্টা পরে মাইটোকন্ড্রিয়াল ক্ষেত্রের হ্রাস দেখায়। এই রূপগত বৈশিষ্ট্যগুলি মাইটোকন্ড্রিয়াল বিদারণ নির্দেশ করতে পারে, মাইটোফ্যাজির মাধ্যমে মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্ক থেকে ক্ষতিগ্রস্ত উপাদানগুলিকে আলাদা করার জন্য একটি প্রয়োজনীয় প্রক্রিয়া 35,36,37। অন্যদিকে, গড় মাইটোকন্ড্রিয়াল আকার হ্রাস বৃদ্ধি জৈবজেনেসিসের সাথে যুক্ত হতে পারে, যার ফলে ছোট নবজাতক মাইটোকন্ড্রিয়া তৈরি হয়। বর্ধিত বিদারণ বা জৈবজেনেসিস মাইটোকন্ড্রিয়াল চাপের বিরুদ্ধে মাইটোসিস বজায় রাখার জন্য একটি ক্ষতিপূরণমূলক প্রতিক্রিয়া প্রতিনিধিত্ব করে। তবে, মাইটোকন্ড্রিয়াল বৃদ্ধি হ্রাস, প্রতিবন্ধী ফিউশন বা অন্যান্য অবস্থা বাদ দেওয়া যায় না।
যদিও TEM দ্বারা তৈরি উচ্চ-রেজোলিউশনের ছবিগুলি পৃথক মাইটোকন্ড্রিয়ার স্তরে রূপগত বৈশিষ্ট্য নির্ধারণের অনুমতি দেয়, এই পদ্ধতিটি একই সময়ে দ্বি-মাত্রিক স্ন্যাপশট তৈরি করে। বিপাকীয় চাপের গতিশীল প্রতিক্রিয়া অধ্যয়ন করার জন্য, আমরা TMRE দিয়ে মাইটোকন্ড্রিয়াকে স্টেইন করেছি এবং MEL বিশ্লেষণের সাথে টাইম-ল্যাপস মাইক্রোস্কোপি ব্যবহার করেছি, যা সময়ের সাথে সাথে মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কে পরিবর্তনের উচ্চ-থ্রুপুট 3D ভিজ্যুয়ালাইজেশনের অনুমতি দেয়33,38। আমরা PPA স্ট্রেসের অধীনে মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যায় সূক্ষ্ম কিন্তু উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন লক্ষ্য করেছি (চিত্র 2)। 3 mM এ, ফিশন ইভেন্টের সংখ্যা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে, যখন ফিউশন ইভেন্টগুলি নিয়ন্ত্রণের মতোই রয়ে গেছে। 5 mM PPA এ ফিশন এবং ফিউশন ইভেন্ট উভয়ের সংখ্যা বৃদ্ধি লক্ষ্য করা গেছে, তবে এই পরিবর্তনগুলি প্রায় সমানুপাতিক ছিল, যা নির্দেশ করে যে ফিশন এবং ফিউশন গতিবিদ্যা উচ্চ ঘনত্বে ভারসাম্যে পৌঁছায় (চিত্র 2b)। গড় মাইটোকন্ড্রিয়াল আয়তন 3 এবং 5 mM PPA উভয় ক্ষেত্রেই অপরিবর্তিত ছিল, যা নির্দেশ করে যে মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কের অখণ্ডতা সংরক্ষিত ছিল (চিত্র 2d)। এটি গতিশীল মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কগুলির হালকা বিপাকীয় চাপের প্রতি সাড়া দেওয়ার এবং নেটওয়ার্ক ফ্র্যাগমেন্টেশন না করে কার্যকরভাবে হোমিওস্ট্যাসিস বজায় রাখার ক্ষমতা প্রতিফলিত করে। 3 mM PPA-তে, ফিশনের বৃদ্ধি একটি নতুন ভারসাম্যে রূপান্তরকে উৎসাহিত করার জন্য যথেষ্ট, তবে PPA-এর উচ্চ ঘনত্বের কারণে সৃষ্ট চাপের প্রতিক্রিয়ায় আরও গভীর গতিগত পুনর্নির্মাণ প্রয়োজন।
উভয় PPA স্ট্রেস ঘনত্বেই মাইটোকন্ড্রিয়ার সংখ্যা বৃদ্ধি পেয়েছে, কিন্তু গড় মাইটোকন্ড্রিয়াল আয়তন উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হয়নি (চিত্র 2c)। এটি জৈব উৎপত্তি বৃদ্ধি বা বিভাজন বৃদ্ধির কারণে হতে পারে; তবে, গড় মাইটোকন্ড্রিয়াল আয়তনে উল্লেখযোগ্য হ্রাস না থাকলে, জৈব সংশ্লেষণ বৃদ্ধির সম্ভাবনা বেশি। যাইহোক, চিত্র 2-এর তথ্য দুটি ক্ষতিপূরণমূলক প্রক্রিয়ার অস্তিত্বকে সমর্থন করে: মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিশনের আপরেগুলেশনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ বিদারণ ঘটনার সংখ্যা বৃদ্ধি এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল জৈব উৎপত্তির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ ঘটনার সংখ্যা বৃদ্ধি। পরিশেষে, হালকা চাপের জন্য গতিশীল ক্ষতিপূরণে ফিশন, ফিউশন, জৈব উৎপত্তি এবং মাইটোফ্যাজি জড়িত একযোগে প্রক্রিয়া থাকতে পারে। যদিও পূর্ববর্তী লেখকরা দেখিয়েছেন যে PPA মাইটোসিস30,39 এবং মাইটোফ্যাজি29 বৃদ্ধি করে, আমরা PPA-এর প্রতিক্রিয়ায় মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিশন এবং ফিউশন গতিবিদ্যার পুনর্নির্মাণের প্রমাণ প্রদান করি। এই তথ্যগুলি TEM দ্বারা পর্যবেক্ষণ করা রূপগত পরিবর্তনগুলি নিশ্চিত করে এবং PPA-প্ররোচিত মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার সাথে সম্পর্কিত প্রক্রিয়াগুলির আরও অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে।
যেহেতু TEM বা MEL বিশ্লেষণ উভয়ই পর্যবেক্ষণকৃত রূপগত পরিবর্তনের অন্তর্নিহিত জিন নিয়ন্ত্রক প্রক্রিয়ার সরাসরি প্রমাণ প্রদান করেনি, তাই আমরা মাইটোকন্ড্রিয়াল বিপাক, জৈব উৎপত্তি এবং গতিবিদ্যায় জড়িত জিনের RNA প্রকাশ পরীক্ষা করেছি। cMYC প্রোটো-অনকোজিন হল মাইটোকন্ড্রিয়া, গ্লাইকোলাইসিস, অ্যামিনো অ্যাসিড এবং ফ্যাটি অ্যাসিড বিপাক নিয়ন্ত্রণে জড়িত একটি ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর। এছাড়াও, cMYC মাইটোকন্ড্রিয়াল ট্রান্সক্রিপশন, অনুবাদ এবং জটিল সমাবেশে জড়িত প্রায় 600 মাইটোকন্ড্রিয়াল জিনের প্রকাশ নিয়ন্ত্রণ করতে পরিচিত, যার মধ্যে NRF1 এবং TFAM41 অন্তর্ভুক্ত। NRF1 এবং TFAM হল মাইটোসিসের দুটি কেন্দ্রীয় নিয়ন্ত্রক, যা mtDNA প্রতিলিপি সক্রিয় করার জন্য PGC-1α এর নিম্ন প্রবাহে কাজ করে। এই পথটি cAMP এবং AMPK সংকেত দ্বারা সক্রিয় এবং শক্তি ব্যয় এবং বিপাকীয় চাপের প্রতি সংবেদনশীল। আমরা মাইটোকন্ড্রিয়াল জৈব উৎপত্তির একটি রেডক্স নিয়ন্ত্রক NFE2L2ও পরীক্ষা করেছি, যাতে নির্ধারণ করা যায় যে PPA এর প্রভাব অক্সিডেটিভ স্ট্রেস দ্বারা মধ্যস্থতা করা যেতে পারে কিনা।
যদিও NFE2L2 এক্সপ্রেশন অপরিবর্তিত ছিল, তবুও 3 mM এবং 5 mM PPA (চিত্র 3a–c) দিয়ে 24 ঘন্টা চিকিৎসার পরে আমরা cMYC, NRF1 এবং TFAM এর এক্সপ্রেশনে একটি ধারাবাহিক ডোজ-নির্ভর হ্রাস পেয়েছি। cMYC এক্সপ্রেশনের ডাউনরেগুলেশন পূর্বে মাইটোকন্ড্রিয়াল স্ট্রেস42 এর প্রতিক্রিয়া হিসাবে রিপোর্ট করা হয়েছে, এবং বিপরীতভাবে, cMYC এক্সপ্রেশনের ডাউনরেগুলেশন মাইটোকন্ড্রিয়াল বিপাক, নেটওয়ার্ক সংযোগ এবং ঝিল্লি মেরুকরণ পুনর্নির্মাণের মাধ্যমে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার কারণ হতে পারে43। মজার বিষয় হল, cMYC মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিশন এবং ফিউশন নিয়ন্ত্রণেও জড়িত এবং কোষ বিভাজনের সময় DRP1 ফসফোরাইলেশন এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল স্থানীয়করণ বৃদ্ধি করে44, সেইসাথে নিউরোনাল স্টেম কোষে মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজিকাল পুনর্নির্মাণের মধ্যস্থতা করে45। প্রকৃতপক্ষে, cMYC-ঘাটতিযুক্ত ফাইব্রোব্লাস্টগুলি PPA43 স্ট্রেস দ্বারা সৃষ্ট পরিবর্তনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ মাইটোকন্ড্রিয়াল আকার হ্রাস করে। এই তথ্যগুলি cMYC এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যার মধ্যে একটি আকর্ষণীয় কিন্তু এখনও অস্পষ্ট সম্পর্ক চিত্রিত করে, যা PPA স্ট্রেস-প্ররোচিত পুনর্নির্মাণের ভবিষ্যতের গবেষণার জন্য একটি আকর্ষণীয় লক্ষ্য প্রদান করে।
NRF1 এবং TFAM-এর হ্রাস একটি গুরুত্বপূর্ণ ট্রান্সক্রিপশনাল অ্যাক্টিভেটর হিসেবে cMYC-এর ভূমিকার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। এই তথ্যগুলি মানব কোলন ক্যান্সার কোষের পূর্ববর্তী গবেষণার সাথেও সামঞ্জস্যপূর্ণ যা দেখায় যে PPA 22 ঘন্টায় NRF1 mRNA এক্সপ্রেশন হ্রাস করে, যা ATP হ্রাসের সাথে সম্পর্কিত ছিল এবং ROS46 বৃদ্ধি করে। এই লেখকরা আরও রিপোর্ট করেছেন যে TFAM এক্সপ্রেশন 8.5 ঘন্টায় বৃদ্ধি পেয়েছে কিন্তু 22 ঘন্টায় বেসলাইন স্তরে ফিরে এসেছে। বিপরীতে, Kim et al. (2019) দেখিয়েছেন যে SH-SY5Y কোষে 4 ঘন্টা PPA স্ট্রেসের পরে TFAM mRNA এক্সপ্রেশন উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে; তবে, 72 ঘন্টা পরে, TFAM প্রোটিন এক্সপ্রেশন উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে এবং mtDNA কপি নম্বর উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে। সুতরাং, 24 ঘন্টা পরে আমরা যে মাইটোকন্ড্রিয়াল বায়োজেনেসিস জিন পর্যবেক্ষণ করেছি তা মাইটোকন্ড্রিয়ার সংখ্যা বৃদ্ধির সম্ভাবনা বাদ দেয় না যে পূর্ববর্তী সময়ে জৈবজেনেসিস সক্রিয়করণের সাথে মাইটোকন্ড্রিয়ার সংখ্যা বৃদ্ধির সম্পর্ক রয়েছে। পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে PPA 4 ঘন্টা 30 মিনিটে SH-SY5Y কোষে PGC-1α mRNA এবং প্রোটিনকে উল্লেখযোগ্যভাবে আপগ্রেড করে, যেখানে প্রোপায়োনিক অ্যাসিড 12 ঘন্টা 39 মিনিটে PGC-1α এর মাধ্যমে বাছুরের হেপাটোসাইটগুলিতে মাইটোকন্ড্রিয়াল জৈবজেনেসিসকে উন্নত করে। মজার বিষয় হল, PGC-1α কেবল NRF1 এবং TFAM এর একটি সরাসরি ট্রান্সক্রিপশনাল নিয়ন্ত্রক নয়, বরং ফিশন এবং ফিউশন নিয়ন্ত্রণ করে MFN2 এবং DRP1 এর কার্যকলাপ নিয়ন্ত্রণ করতেও দেখা গেছে। একসাথে নেওয়া হলে, এটি PPA দ্বারা প্ররোচিত মাইটোকন্ড্রিয়াল ক্ষতিপূরণমূলক প্রতিক্রিয়া নিয়ন্ত্রণকারী প্রক্রিয়াগুলির ঘনিষ্ঠ সংযোগকে হাইলাইট করে। অধিকন্তু, আমাদের তথ্য PPA চাপের অধীনে জৈবজেনেসিস এবং বিপাকের ট্রান্সক্রিপশনাল নিয়ন্ত্রণের উল্লেখযোগ্য অব্যবস্থাপনা প্রতিফলিত করে।
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 এবং DRP1 জিনগুলি মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিশন, ফিউশন এবং ডাইনামিক্সের কেন্দ্রীয় নিয়ন্ত্রকদের মধ্যে রয়েছে37,48,49। মাইটোকন্ড্রিয়াল ডাইনামিক্সের সাথে জড়িত আরও অনেক জিন রয়েছে, তবে, STOML2, OPA1 এবং MFN2 পূর্বে ASD কোহর্টগুলিতে ডিফারেনশিয়ালি মিথাইলেটেড পাওয়া গেছে,16 এবং বেশ কয়েকটি স্বাধীন গবেষণায় মাইটোকন্ড্রিয়াল স্ট্রেস50,51 এর প্রতিক্রিয়ায় এই ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টরগুলিতে পরিবর্তনের কথা জানানো হয়েছে। 52. OPA1 এবং STOML2 উভয়েরই অভিব্যক্তি 3 mM এবং 5 mM PPA চিকিত্সা দ্বারা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে (চিত্র 3e, f)। OPA1 হল MFN1 এবং 2 এর সাথে সরাসরি মিথস্ক্রিয়ার মাধ্যমে মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিউশনের একটি ধ্রুপদী নিয়ন্ত্রক এবং ক্রিস্টি পুনর্নির্মাণ এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজিতে ভূমিকা পালন করে53। মাইটোকন্ড্রিয়াল ডাইনামিক্সে STOML2 এর সুনির্দিষ্ট ভূমিকা অস্পষ্ট রয়ে গেছে, তবে প্রমাণ থেকে জানা যায় যে এটি মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিউশন, জৈবজেনেসিস এবং মাইটোফ্যাজিতে ভূমিকা পালন করে।
STOML2 মাইটোকন্ড্রিয়াল রেসপিরেটরি কাপলিং এবং রেসপিরেটরি চেইন কমপ্লেক্স গঠনে জড়িত 54,55 এবং ক্যান্সার কোষের বিপাকীয় বৈশিষ্ট্যগুলিকে গভীরভাবে পরিবর্তন করতে দেখা গেছে 56। গবেষণায় দেখা গেছে যে STOML2 BAN এবং কার্ডিওলিপিনের সাথে মিথস্ক্রিয়ার মাধ্যমে মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেন পটেনশিয়াল এবং জৈবজেনেসিসকে উৎসাহিত করে 55, 57, 58। উপরন্তু, স্বাধীন গবেষণায় দেখা গেছে যে STOML2 এবং PINK1 এর মধ্যে মিথস্ক্রিয়া মাইটোফ্যাজি নিয়ন্ত্রণ করে59,60। উল্লেখযোগ্যভাবে, STOML2 সরাসরি MFN2 এর সাথে মিথস্ক্রিয়া করে এবং স্থিতিশীল করে বলে জানা গেছে এবং OPA1 অবক্ষয়ের জন্য দায়ী প্রোটিজকে বাধা দিয়ে দীর্ঘ OPA1 আইসোফর্মগুলিকে স্থিতিশীল করতেও গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে53, 61, 62। PPA বিক্রিয়ায় পরিলক্ষিত STOML2 এক্সপ্রেশন হ্রাস এই ফিউশন প্রোটিনগুলিকে ubiquitin- এবং প্রোটিজোম-নির্ভর পথের মাধ্যমে অবক্ষয়ের জন্য আরও সংবেদনশীল করে তুলতে পারে48। যদিও PPA-র গতিশীল প্রতিক্রিয়ায় STOML2 এবং OPA1-এর সুনির্দিষ্ট ভূমিকা অস্পষ্ট, এই ফিউশন জিনগুলির (চিত্র 3) হ্রাসপ্রাপ্ত প্রকাশ বিদারণ এবং ফিউশনের মধ্যে ভারসাম্য ব্যাহত করতে পারে এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল আকার হ্রাস করতে পারে (চিত্র 3)। 1)।
অন্যদিকে, ২৪ ঘন্টা পরেও OPA1 প্রোটিন এক্সপ্রেশন অপরিবর্তিত ছিল, যেখানে PPA চিকিৎসার পরে MFN1, MFN2 বা DRP1 এর mRNA এবং প্রোটিনের মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হয়নি (চিত্র 3g-i, চিত্র 4)। এটি ইঙ্গিত দিতে পারে যে মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিউশন এবং ফিশনের সাথে জড়িত এই কারণগুলির নিয়ন্ত্রণে কোনও পরিবর্তন হয়নি। তবে, এটি লক্ষণীয় যে এই চারটি জিনের প্রতিটি প্রোটিন কার্যকলাপ নিয়ন্ত্রণকারী পোস্টট্রান্সক্রিপশনাল মডিফিকেশন (PTM) দ্বারাও নিয়ন্ত্রিত হয়। OPA1 এর আটটি বিকল্প স্প্লাইস রূপ রয়েছে যা দুটি স্বতন্ত্র আইসোফর্ম তৈরি করার জন্য মাইটোকন্ড্রিয়ায় প্রোটিওলাইটিকভাবে বিচ্ছিন্ন হয় 63। দীর্ঘ এবং সংক্ষিপ্ত আইসোফর্মের মধ্যে ভারসাম্য শেষ পর্যন্ত মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিউশন এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কের রক্ষণাবেক্ষণে OPA1 এর ভূমিকা নির্ধারণ করে64। DRP1 কার্যকলাপ ক্যালসিয়াম/ক্যালমোডুলিন-নির্ভর প্রোটিন কাইনেজ II (CaMKII) ফসফোরাইলেশন দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়, যেখানে DRP1 অবক্ষয় ubiquitination এবং SUMOylation65 দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়। পরিশেষে, DRP1 এবং MFN1/2 উভয়ই GTPases, তাই কার্যকলাপ মাইটোকন্ড্রিয়া 66-তে GTP উৎপাদনের হার দ্বারা প্রভাবিত হতে পারে। অতএব, যদিও এই প্রোটিনগুলির প্রকাশ স্থির থাকে, এটি অপরিবর্তিত প্রোটিন কার্যকলাপ বা স্থানীয়করণ প্রতিফলিত নাও হতে পারে67,68। প্রকৃতপক্ষে, বিদ্যমান PTM প্রোটিন সংগ্রহগুলি প্রায়শই তীব্র চাপ প্রতিক্রিয়ার মধ্যস্থতার জন্য দায়ী প্রতিরক্ষার প্রথম লাইন হিসাবে কাজ করে। আমাদের মডেলে মাঝারি বিপাকীয় চাপের উপস্থিতিতে, সম্ভবত PTM mRNA বা প্রোটিন স্তরে এই জিনগুলির অতিরিক্ত সক্রিয়করণের প্রয়োজন ছাড়াই মাইটোকন্ড্রিয়াল অখণ্ডতা পর্যাপ্তভাবে পুনরুদ্ধার করার জন্য ফিউশন এবং ফিশন প্রোটিনের বর্ধিত কার্যকলাপকে উৎসাহিত করে।
একসাথে বিবেচনা করলে, উপরের তথ্যগুলি মাইটোকন্ড্রিয়াল রূপবিদ্যার জটিল এবং সময়-নির্ভর নিয়ন্ত্রণ এবং এই প্রক্রিয়াগুলি ব্যাখ্যা করার চ্যালেঞ্জগুলি তুলে ধরে। জিনের প্রকাশ অধ্যয়ন করার জন্য, প্রথমে পথের নির্দিষ্ট লক্ষ্য জিনগুলি সনাক্ত করা প্রয়োজন। তবে, আমাদের তথ্য দেখায় যে একই পথের জিনগুলি একই চাপের প্রতি একইভাবে প্রতিক্রিয়া দেখায় না। প্রকৃতপক্ষে, পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে একই পথের বিভিন্ন জিন বিভিন্ন টেম্পোরাল প্রতিক্রিয়া প্রোফাইল প্রদর্শন করতে পারে30,46। এছাড়াও, ট্রান্সক্রিপশন এবং জিন ফাংশনের মধ্যে সম্পর্ককে ব্যাহত করে এমন জটিল পোস্ট-ট্রান্সক্রিপশনাল প্রক্রিয়া রয়েছে। প্রোটিওমিক গবেষণাগুলি PTM এবং প্রোটিন ফাংশনের প্রভাব সম্পর্কে অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করতে পারে, তবে তারা কম-থ্রুপুট পদ্ধতি, উচ্চ সংকেত-থেকে-শব্দ অনুপাত এবং দুর্বল রেজোলিউশন সহ চ্যালেঞ্জও তৈরি করে।
এই প্রেক্ষাপটে, TEM এবং MEL ব্যবহার করে মাইটোকন্ড্রিয়াল রূপবিদ্যা অধ্যয়ন করলে মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যা এবং কার্যকারিতার মধ্যে সম্পর্ক এবং এটি কীভাবে রোগকে প্রভাবিত করে সে সম্পর্কে মৌলিক প্রশ্নগুলির সমাধান করার প্রচুর সম্ভাবনা রয়েছে। সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ বিষয় হল, TEM মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা এবং গতিবিদ্যার একটি অভিসারী শেষবিন্দু হিসাবে মাইটোকন্ড্রিয়াল রূপবিদ্যা পরিমাপের জন্য একটি সরাসরি পদ্ধতি প্রদান করে51। MEL ত্রিমাত্রিক কোষীয় পরিবেশে বিদারণ এবং ফিউশন ঘটনাগুলিকে কল্পনা করার জন্য একটি সরাসরি পদ্ধতিও প্রদান করে, যা জিনের প্রকাশের পরিবর্তনের অনুপস্থিতিতেও গতিশীল মাইটোকন্ড্রিয়াল পুনর্নির্মাণের পরিমাণ নির্ধারণের অনুমতি দেয়33। এখানে আমরা সেকেন্ডারি মাইটোকন্ড্রিয়াল রোগে মাইটোকন্ড্রিয়াল ইমেজিং কৌশলের উপযোগিতা তুলে ধরছি। এই রোগগুলি সাধারণত তীব্র মাইটোকন্ড্রিয়াল ক্ষতির পরিবর্তে মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কগুলির সূক্ষ্ম পুনর্নির্মাণ দ্বারা চিহ্নিত দীর্ঘস্থায়ী হালকা বিপাকীয় চাপ দ্বারা চিহ্নিত করা হয়। যাইহোক, দীর্ঘস্থায়ী চাপের অধীনে মাইটোসিস বজায় রাখার জন্য প্রয়োজনীয় মাইটোকন্ড্রিয়াল ক্ষতিপূরণের গভীর কার্যকরী পরিণতি রয়েছে। স্নায়ুবিজ্ঞানের প্রেক্ষাপটে, এই ক্ষতিপূরণমূলক প্রক্রিয়াগুলির আরও ভাল বোঝা মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার সাথে সম্পর্কিত প্লিওট্রপিক নিউরোপ্যাথোলজি সম্পর্কে গুরুত্বপূর্ণ তথ্য প্রদান করতে পারে।
পরিশেষে, আমাদের তথ্য জিনের প্রকাশ, প্রোটিন পরিবর্তন এবং নিউরোনাল মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যা নিয়ন্ত্রণকারী প্রোটিন কার্যকলাপের মধ্যে জটিল মিথস্ক্রিয়ার কার্যকরী পরিণতি বোঝার জন্য ইমেজিং কৌশলের উপযোগিতা তুলে ধরে। ASD-এর মাইটোকন্ড্রিয়াল উপাদান সম্পর্কে অন্তর্দৃষ্টি অর্জনের জন্য আমরা একটি নিউরোনাল কোষ মডেলে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার মডেল করার জন্য PPA ব্যবহার করেছি। PPA দিয়ে চিকিত্সা করা SH-SY5Y কোষগুলি মাইটোকন্ড্রিয়াল রূপবিদ্যায় পরিবর্তন দেখিয়েছে: মাইটোকন্ড্রিয়া ছোট এবং গোলাকার হয়ে গেছে, এবং TEM দ্বারা পর্যবেক্ষণ করা হলে ক্রিস্টা খারাপভাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল। MEL বিশ্লেষণ দেখায় যে হালকা বিপাকীয় চাপের প্রতিক্রিয়ায় মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্ক বজায় রাখার জন্য ফিশন এবং ফিউশন ইভেন্টগুলির বৃদ্ধির সাথে এই পরিবর্তনগুলি একই সাথে ঘটে। অধিকন্তু, PPA মাইটোকন্ড্রিয়াল বিপাক এবং হোমিওস্ট্যাসিসের ট্রান্সক্রিপশনাল নিয়ন্ত্রণকে উল্লেখযোগ্যভাবে ব্যাহত করে। আমরা cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, এবং OPA1 কে PPA চাপ দ্বারা ব্যাহত মূল মাইটোকন্ড্রিয়াল নিয়ন্ত্রক হিসাবে চিহ্নিত করেছি এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল রূপবিদ্যা এবং কার্যকারিতায় PPA-প্ররোচিত পরিবর্তনগুলির মধ্যস্থতায় ভূমিকা পালন করতে পারে। জিনের প্রকাশ এবং প্রোটিন কার্যকলাপ, স্থানীয়করণ এবং অনুবাদ-পরবর্তী পরিবর্তনগুলিতে PPA-প্ররোচিত টেম্পোরাল পরিবর্তনগুলিকে আরও ভালভাবে চিহ্নিত করার জন্য ভবিষ্যতের গবেষণা প্রয়োজন। আমাদের তথ্য মাইটোকন্ড্রিয়াল স্ট্রেস প্রতিক্রিয়ার মধ্যস্থতাকারী নিয়ন্ত্রক প্রক্রিয়াগুলির জটিলতা এবং আন্তঃনির্ভরতা তুলে ধরে এবং আরও লক্ষ্যযুক্ত যান্ত্রিক গবেষণার জন্য TEM এবং অন্যান্য ইমেজিং কৌশলগুলির উপযোগিতা প্রদর্শন করে।
SH-SY5Y সেল লাইন (ECACC, 94030304-1VL) সিগমা-অ্যালড্রিচ থেকে কেনা হয়েছিল। SH-SY5Y কোষগুলি ডালবেকোর পরিবর্তিত ঈগলের মাঝারি/F-12 পুষ্টির মিশ্রণ (DMEM/F-12) এবং L-গ্লুটামিন (SC09411, ScienCell) 25 cm2 ফ্লাস্কে 20% ভ্রূণ গবাদি পশুর সিরাম (FBS) (10493106, থার্মোফিশার সায়েন্টিফিক) এবং 1% পেনিসিলিন-স্ট্রেপ্টোমাইসিন (P4333-20ML, সিগমা-অ্যালড্রিচ) 37 °C, 5% CO2 তাপমাত্রায় জন্মানো হয়েছিল। কোষগুলিকে 0.05% ট্রিপসিন-EDTA (15400054, থার্মোফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে 80% সঙ্গমে সাবকালচার করা হয়েছিল, 300 গ্রাম সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং প্রায় 7 × 105 কোষ/মিলি ঘনত্বে প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল। সমস্ত পরীক্ষা-নিরীক্ষা 19-22 প্যাসেজের মধ্যে অভেদ্য SH-SY5Y কোষের উপর করা হয়েছিল। PPA NaP হিসাবে দেওয়া হয়। NaP পাউডার (CAS No. 137-40-6, রাসায়নিক সূত্র C3H5NaO2, P5436-100G, সিগমা-অ্যালড্রিচ) উষ্ণ MilliQ জলে 1 M ঘনত্বে দ্রবীভূত করুন এবং 4 °C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করুন। চিকিৎসার দিন, এই দ্রবণটি 1 M PPA থেকে 3 mM এবং 5 mM PPA দিয়ে সিরাম-মুক্ত মাধ্যমে (DMEM/F-12 L-গ্লুটামিন সহ) পাতলা করুন। সমস্ত পরীক্ষায় চিকিৎসার ঘনত্ব ছিল কোন PPA (0 mM, নিয়ন্ত্রণ), 3 mM, এবং 5 mM PPA। পরীক্ষাগুলি কমপক্ষে তিনটি জৈবিক প্রতিলিপিতে করা হয়েছিল।
SH-SY5Y কোষগুলিকে 5.5 × 105 কোষ/মিলি হারে 25 cm5 ফ্লাস্কে বীজতলা করা হয়েছিল এবং 24 ঘন্টা ধরে বৃদ্ধি করা হয়েছিল। ইনকিউবেশনের 24 ঘন্টা আগে ফ্লাস্কে PPA চিকিত্সা যোগ করা হয়েছিল। স্বাভাবিক স্তন্যপায়ী টিস্যু সাবকালচার প্রোটোকল (উপরে বর্ণিত) অনুসরণ করে কোষের পেলেট সংগ্রহ করুন। কোষের পেলেটটিকে 100 µl 2.5% গ্লুটারালডিহাইড, 1× PBS-এ পুনরায় সাসপেন্ড করুন এবং প্রক্রিয়াজাতকরণ না হওয়া পর্যন্ত 4 °C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করুন। SH-SY5Y কোষগুলিকে সংক্ষিপ্তভাবে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল যাতে কোষগুলি পেলেট করা হয় এবং 2.5% গ্লুটারালডিহাইড, 1× PBS দ্রবণ অপসারণ করা হয়। পাতিত জলে প্রস্তুত 4% অ্যাগারোজ জেলে পলিটি পুনঃসাসপেন্ড করুন (অ্যাগারোজ এবং পলির আয়তনের অনুপাত 1:1)। অ্যাগারোজের টুকরোগুলিকে সমতল প্লেটের গ্রিডে স্থাপন করা হয়েছিল এবং উচ্চ-চাপ জমা করার আগে 1-হেক্সাডেসিন দিয়ে প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল। নমুনাগুলিকে -90°C তাপমাত্রায় 100% শুকনো অ্যাসিটোনে 24 ঘন্টার জন্য হিমায়িত করা হয়েছিল। এরপর তাপমাত্রা -৮০°C তে বাড়ানো হয় এবং ১% অসমিয়াম টেট্রোক্সাইড এবং ০.১% গ্লুটারালডিহাইডের দ্রবণ যোগ করা হয়। নমুনাগুলি -৮০°C তাপমাত্রায় ২৪ ঘন্টার জন্য সংরক্ষণ করা হয়। এর পরে, কয়েক দিন ধরে তাপমাত্রা ধীরে ধীরে ঘরের তাপমাত্রায় বৃদ্ধি করা হয়: –৮০°C থেকে –৫০°C পর্যন্ত ২৪ ঘন্টার জন্য, –৩০°C পর্যন্ত ২৪ ঘন্টার জন্য, –১০°C পর্যন্ত ২৪ ঘন্টার জন্য এবং অবশেষে ঘরের তাপমাত্রায়।
ক্রায়োজেনিক প্রস্তুতির পর, নমুনাগুলিতে রজন লাগানো হয়েছিল এবং অতি পাতলা অংশ (~১০০ ন্যানোমিটার) তৈরি করা হয়েছিল একটি Leica Reichert UltracutS ultramicrotome (Leica Microsystems) ব্যবহার করে। অংশগুলিতে ২% ইউরেনিল অ্যাসিটেট এবং সীসা সাইট্রেট দিয়ে রঙ করা হয়েছিল। নমুনাগুলি FEI Tecnai 20 ট্রান্সমিশন ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপ (থার্মোফিশার (পূর্বে FEI), আইন্ডহোভেন, নেদারল্যান্ডস) ব্যবহার করে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল যা ২০০ kV (Lab6 ট্রান্সমিটার) এ কাজ করে এবং একটি Gatan CCD ক্যামেরা (Gatan, UK) যা Tridiem শক্তি ফিল্টার দিয়ে সজ্জিত।
প্রতিটি টেকনিক্যাল রেপ্লিকেশনে, কমপক্ষে ২৪টি একক কোষের ছবি সংগ্রহ করা হয়েছিল, যার ফলে মোট ২৬৬টি ছবি তৈরি করা হয়েছিল। সমস্ত ছবি রিজিওন অফ ইন্টারেস্ট (ROI) ম্যাক্রো এবং মাইটোকন্ড্রিয়া ম্যাক্রো ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। মাইটোকন্ড্রিয়াল ম্যাক্রো প্রকাশিত পদ্ধতি 17,31,32 এর উপর ভিত্তি করে তৈরি এবং ফিজি/ইমেজজে69-তে TEM ছবির আধা-স্বয়ংক্রিয় ব্যাচ প্রক্রিয়াকরণের অনুমতি দেয়। সংক্ষেপে: ছবিটি রোলিং বল ব্যাকগ্রাউন্ড বিয়োগ (60 পিক্সেল ব্যাসার্ধ) এবং একটি FFT ব্যান্ডপাস ফিল্টার (যথাক্রমে 60 এবং 8 পিক্সেল উপরের এবং নিম্ন সীমা ব্যবহার করে) এবং 5% ওরিয়েন্টেশন সহনশীলতা সহ উল্লম্ব রেখা দমন ব্যবহার করে উল্টানো এবং উল্টানো হয়। প্রক্রিয়াকৃত ছবিটি সর্বোচ্চ এনট্রপি অ্যালগরিদম ব্যবহার করে স্বয়ংক্রিয়ভাবে থ্রেশহোল্ড করা হয় এবং একটি বাইনারি মাস্ক তৈরি করা হয়। কাঁচা TEM ছবিতে ম্যানুয়ালি নির্বাচিত ROI-এর সাথে যুক্ত চিত্র অঞ্চলগুলি বের করা হয়েছিল, যা মাইটোকন্ড্রিয়াকে চিহ্নিত করে এবং প্লাজমা মেমব্রেন এবং অন্যান্য উচ্চ-বৈপরীত্য অঞ্চলগুলিকে বাদ দেয়। প্রতিটি নিষ্কাশিত ROI-এর জন্য, 600 পিক্সেলের চেয়ে বড় বাইনারি কণা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং Fiji/ImageJ-এর অন্তর্নির্মিত পরিমাপ ফাংশন ব্যবহার করে কণার ক্ষেত্রফল, পরিধি, প্রধান এবং ক্ষুদ্র অক্ষ, ফেরেট ব্যাস, বৃত্তাকারতা এবং বৃত্তাকারতা পরিমাপ করা হয়েছিল। Merrill, Flippo, এবং Strack (2017) এর পরে, এলাকা 2, কণার আকৃতির অনুপাত (প্রধান থেকে ক্ষুদ্র অক্ষ অনুপাত), এবং আকৃতি ফ্যাক্টর (FF) এই ডেটা থেকে গণনা করা হয়েছিল, যেখানে FF = পরিধি 2/4pi x ক্ষেত্রফল। প্যারামেট্রিক সূত্রের সংজ্ঞা Merrill, Flippo, এবং Strack (2017) এ পাওয়া যাবে। উল্লিখিত ম্যাক্রোগুলি GitHub-এ উপলব্ধ (ডেটা অ্যাভেইলেবিলিটি স্টেটমেন্ট দেখুন)। গড়ে, প্রতি PPA ট্রিটমেন্টে প্রায় 5,600টি কণা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল, মোট প্রায় 17,000টি কণার জন্য (ডেটা দেখানো হয়নি)।
SH-SH5Y কোষগুলিকে 8-চেম্বার কালচার ডিশে (থার্মোফিশার, #155411) স্থাপন করা হয়েছিল যাতে রাতারাতি আঠালো হতে পারে এবং তারপর TMRE 1:1000 (থার্মোফিশার, #T669) এবং Hoechst 33342 1:200 (সিগমা-অ্যালড্রিচ, H6024) দিয়ে ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল। রঞ্জনবিদ্যা। 10 মিনিটের পরিবেশে 405 nm এবং 561 nm লেজার ব্যবহার করে ছবিগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল, এবং 12 পরবর্তী সময় বিন্দুতে ছবির ফ্রেমের মধ্যে 0.2 μm az ধাপ সহ 10টি ইমেজ মাইক্রোগ্রাফ ধারণকারী z-স্ট্যাক হিসাবে কাঁচা ছবিগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল। একটি LCI প্ল্যান অ্যাপোক্রোমেট 100x/1.4 অয়েল DIC M27 লেন্স ব্যবহার করে কার্ল জেইস LSM780 ELYRA PS.1 সুপার-রেজোলিউশন প্ল্যাটফর্ম (কার্ল জেইস, ওবারকোচেন, জার্মানি) ব্যবহার করে ছবিগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল। ImageJ-তে পূর্বে বর্ণিত পাইপলাইন এবং ImageJ প্লাগইন ব্যবহার করে চিত্রগুলি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল যাতে ফিউশন এবং ফিশন ইভেন্ট, মাইটোকন্ড্রিয়াল কাঠামোর গড় সংখ্যা এবং প্রতি কোষে গড় মাইটোকন্ড্রিয়াল আয়তন পরিমাপ করা যায়। MEL ম্যাক্রোগুলি GitHub-এ উপলব্ধ (ডেটা অ্যাভেইলেবিলিটি স্টেটমেন্ট দেখুন)।
SH-SY5Y কোষগুলি চিকিৎসার আগে 24 ঘন্টা ধরে 0.3 × 106 কোষ/mL ঘনত্বে ছয়টি ওয়েল প্লেটে জন্মানো হয়েছিল। সামান্য পরিবর্তন সহ Quick-RNA™ Miniprep প্রোটোকল (ZR R1055, Zymo Research) ব্যবহার করে RNA বের করা হয়েছিল: অপসারণের আগে প্রতিটি ওয়েলে 300 μl RNA লাইসিস বাফার যোগ করুন এবং চূড়ান্ত ধাপ হিসেবে 30 μl DNase/RNase নির্গমন দিয়ে প্রতিটি নমুনা পরীক্ষা করুন। -মুক্ত জল। সমস্ত নমুনা একটি NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer ব্যবহার করে পরিমাণ এবং গুণমান পরীক্ষা করা হয়েছিল। কোষ লাইসেট থেকে মোট প্রোটিন 200 μl RIPA লাইসিস বাফার ব্যবহার করে প্রাপ্ত করা হয়েছিল এবং ব্র্যাডফোর্ড প্রোটিন অ্যাস70 ব্যবহার করে প্রোটিনের ঘনত্ব পরিমাপ করা হয়েছিল।
প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে কিছু পরিবর্তন সহ Tetro™ cDNA সিন্থেসিস কিট (BIO-65043, Meridian Bioscience) ব্যবহার করে cDNA সংশ্লেষণ করা হয়েছিল। মোট RNA-এর 0.7 থেকে 1 μg ব্যবহার করে 20-μl বিক্রিয়ায় cDNA সংশ্লেষিত করা হয়েছিল। পূর্বে প্রকাশিত গবেষণাপত্র 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (টেবিল S1) থেকে প্রাইমার নির্বাচন করা হয়েছিল এবং ইন্টিগ্রেটেড DNA টেকনোলজিস থেকে PrimerQuest টুল ব্যবহার করে সহগামী প্রোবগুলি ডিজাইন করা হয়েছিল। আগ্রহের সমস্ত জিনকে নিউক্লিয়ার B2M জিনে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC এবং OPA1 এর জিন এক্সপ্রেশন RT-qPCR দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল। মাস্টার মিক্সটিতে LUNA Taq পলিমারেজ (M3003L, নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস), 10 μM ফরোয়ার্ড এবং রিভার্স প্রাইমার, cDNA এবং PCR-গ্রেড জল অন্তর্ভুক্ত ছিল যাতে প্রতিটি বিক্রিয়ার জন্য চূড়ান্ত আয়তন 10 μL হয়। TaqMan মাল্টিপ্লেক্স অ্যাসে ব্যবহার করে বিভাজন এবং বিদারণ জিনের প্রকাশ (DRP1, MFN1/2) পরিমাপ করা হয়েছিল। Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস) প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে সামান্য পরিবর্তন সহ ব্যবহার করা হয়েছিল। মাল্টিপ্লেক্স RT-qPCR মাস্টার মিক্সে 1X LUNA Taq পলিমারেজ, 10 μM ফরোয়ার্ড এবং রিভার্স প্রাইমার, 10 μM প্রোব, cDNA এবং PCR-গ্রেড জল অন্তর্ভুক্ত রয়েছে, যার ফলে প্রতিটি বিক্রিয়ার জন্য চূড়ান্ত আয়তন 20 μL হয়। RT-qPCR রোটার-জিন Q 6-প্লেক্স (QIAGEN RG—সিরিয়াল নম্বর: R0618110) ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল। সাইক্লিং অবস্থা টেবিল S1 এ দেখানো হয়েছে। সমস্ত cDNA নমুনা ত্রি-প্রতিলিপিতে প্রশস্ত করা হয়েছিল এবং দশগুণ তরলীকরণের একটি সিরিজ ব্যবহার করে একটি আদর্শ বক্ররেখা তৈরি করা হয়েছিল। তথ্য পুনরুৎপাদনযোগ্যতা নিশ্চিত করার জন্য চক্র থ্রেশহোল্ড স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন (Ct) >0.5 সহ ত্রি-প্রতিলিপি নমুনার বহিরাগতগুলি বিশ্লেষণ থেকে সরানো হয়েছিল30,72। আপেক্ষিক জিন এক্সপ্রেশন 2-ΔΔCt79 পদ্ধতি ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল।
প্রোটিন নমুনা (60 μg) 2:1 অনুপাতে Laemmli লোডিং বাফারের সাথে মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং 12% বর্ণহীন প্রোটিন জেল (Bio-Rad #1610184) এর উপর চালানো হয়েছিল। ট্রান্স-ব্লট টার্বো সিস্টেম (#170-4155, Bio-Rad) ব্যবহার করে প্রোটিনগুলিকে একটি PVDF (পলিভিনাইলিডিন ফ্লোরাইড) ঝিল্লিতে (#170-84156, Bio-Rad) স্থানান্তরিত করা হয়েছিল। ঝিল্লিটি ব্লক করা হয়েছিল এবং উপযুক্ত প্রাথমিক অ্যান্টিবডি (OPA1, MFN1, MFN2, এবং DRP1) (1:1000 মিশ্রিত) দিয়ে 48 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল, তারপরে 1 ঘন্টার জন্য সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (1:10,000) দিয়ে ইনকিউবেশন করা হয়েছিল। এরপর ক্ল্যারিটি ওয়েস্টার্ন ECL সাবস্ট্রেট (#170-5061, Bio-Rad) ব্যবহার করে ঝিল্লির চিত্র তোলা হয়েছিল এবং একটি Bio-Rad ChemiDoc MP সিস্টেম ব্যবহার করে রেকর্ড করা হয়েছিল। ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণের জন্য ইমেজল্যাব সংস্করণ 6.1 ব্যবহার করা হয়েছিল। মূল জেল এবং ব্লট চিত্র S1 এ দেখানো হয়েছে। অ্যান্টিবডি তথ্য সারণি S2 এ দেওয়া হয়েছে।
ডেটা সেটগুলিকে কমপক্ষে তিনটি স্বাধীন নমুনার গড় (SEM) এর গড় এবং মান ত্রুটি হিসাবে উপস্থাপন করা হয়। গাউসিয়ান বিতরণ এবং সমান মান বিচ্যুতি ধরে নেওয়ার আগে এবং বিশ্লেষণের সাথে এগিয়ে যাওয়ার আগে শাপিরো-উইল্কস পরীক্ষা (যদি না অন্যথায় বলা হয়) ব্যবহার করে স্বাভাবিকতার জন্য ডেটা সেটগুলি পরীক্ষা করা হয়েছিল। তাৎপর্য নির্ধারণের জন্য ফিশারের MEL LSD (p < 0.05), একমুখী ANOVA (চিকিৎসা বনাম নিয়ন্ত্রণ গড়) এবং ডানেটের একাধিক তুলনা পরীক্ষা ব্যবহার করে ডেটা সেট বিশ্লেষণ করার পাশাপাশি (p < 0.05)। গ্রাফে উল্লেখযোগ্য p মানগুলি *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 হিসাবে দেখানো হয়েছে। সমস্ত পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ এবং গ্রাফগুলি গ্রাফপ্যাড প্রিজম 9.4.0 ব্যবহার করে সম্পাদিত এবং তৈরি করা হয়েছিল।
TEM চিত্র বিশ্লেষণের জন্য Fiji/ImageJ ম্যাক্রোগুলি GitHub-এ সর্বজনীনভাবে উপলব্ধ: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro। মাইটোকন্ড্রিয়াল ইভেন্ট লোকেটার (MEL) ম্যাক্রো GitHub-এ সর্বজনীনভাবে উপলব্ধ: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin।
মেইলিয়ানা এ., দেবী এনএম এবং বিজয়া এ. মাইটোকন্ড্রিয়া: বিপাক, হোমিওস্ট্যাসিস, স্ট্রেস, বার্ধক্য এবং এপিজেনেটিক্সের প্রধান নিয়ন্ত্রক। ইন্দোনেশিয়ান। জৈব চিকিৎসা বিজ্ঞান। জে. ১৩, ২২১–২৪১ (২০২১)।
বেন-শাচার, ডি. সিজোফ্রেনিয়ায় বহুমুখী মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা, সম্ভাব্য রোগগত লক্ষ্য হিসেবে জটিল I। সিজোফ্রেনিয়া। রিসোর্স। 187, 3–10 (2017)।
বোস, এ. এবং বিল, এমএফ পার্কিনসন রোগে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা। জে. নিউরোকেমিস্ট্রি। ১৩৯, ২১৬–২৩১ (২০১৬)।
শর্মা ভি কে, সিং টি জি এবং মেহতা ভি। স্ট্রেসড মাইটোকন্ড্রিয়া: আলঝাইমার রোগে আক্রমণের লক্ষ্যবস্তু। মাইটোকন্ড্রিয়া 59, 48–57 (2021)।
বেলেঙ্গুয়ার পি., ডুয়ার্ট জেএমএন, শুক পিএফ এবং ফেরেইরা জি.কে. মাইটোকন্ড্রিয়া এবং মস্তিষ্ক: জৈবশক্তিবিদ্যা এবং আরও অনেক কিছু। নিউরোটক্সিন। রিসোর্স। 36, 219–238 (2019)।
রাঙ্গারাজু, ভি. এট আল. প্লিওট্রপিক মাইটোকন্ড্রিয়া: নিউরোনাল ডেভেলপমেন্ট এবং রোগের উপর মাইটোকন্ড্রিয়া'র প্রভাব। জে. নিউরোসায়েন্স। 39, 8200–8208 (2019)।
কার্ডানো-রামোস, সি. এবং মোরাইস, ভিএ নিউরনে মাইটোকন্ড্রিয়াল জৈবজেনেসিস: কীভাবে এবং কোথায়। আন্তর্জাতিকতা। জে. মোহর। বিজ্ঞান। 22, 13059 (2021)।
ইউ, আর., লেন্ডাহল, ইউ., নিস্টার, এম. এবং ঝাও, জে. স্তন্যপায়ী মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যার নিয়ন্ত্রণ: সুযোগ এবং চ্যালেঞ্জ। ফ্রন্ট। এন্ডোক্রাইন। (লাউসান) ১১, ৩৭৪ (২০২০)।
খাচো, এম. এবং স্ল্যাক, আরএস নিউরোজেনেসিস নিয়ন্ত্রণে মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যা: বিকাশ থেকে প্রাপ্তবয়স্ক মস্তিষ্ক পর্যন্ত। বিকাশ। গতিশীল। 247, 47–53 (2018)।