এই প্রবন্ধটি “রোগজীবাণু ও কীটপতঙ্গের বিরুদ্ধে শিম জাতীয় ফসলের প্রতিরোধ ক্ষমতা বৃদ্ধি” শীর্ষক গবেষণা বিষয়টির অংশ, সকল ৫টি প্রবন্ধ দেখুন।
ছত্রাকজনিত উদ্ভিদ রোগ নেক্রোসিসের কারণকারী জীবাণু স্ক্লেরোটিনিয়া স্ক্লেরোটিওরাম (লিব.) ডি বেরি বিভিন্ন পোষক উদ্ভিদকে সংক্রমিত করার জন্য একটি বহুস্তরীয় কৌশল ব্যবহার করে। এই গবেষণায় সিউডোমোনাস স্ক্লেরোটিওরাম দ্বারা সৃষ্ট সাদা ছত্রাকের বিরুদ্ধে ফেসিওলাস ভালগারিস এল. উদ্ভিদের আণবিক, শারীরবৃত্তীয় এবং জৈব-রাসায়নিক প্রতিক্রিয়া বাড়ানোর জন্য একটি বিকল্প ব্যবস্থাপনা কৌশল হিসেবে ডায়ামিন এল-অরনিথিন ব্যবহারের প্রস্তাব করা হয়েছে। এল-অরনিথিন একটি নন-প্রোটিন অ্যামিনো অ্যাসিড যা অন্যান্য অত্যাবশ্যকীয় অ্যামিনো অ্যাসিডের সংশ্লেষণকে উদ্দীপিত করে। ইন ভিট্রো পরীক্ষায় দেখা গেছে যে এল-অরনিথিন মাত্রা-নির্ভর পদ্ধতিতে এস. পাইরেনোইডোসার মাইসেলিয়াল বৃদ্ধিকে উল্লেখযোগ্যভাবে বাধা দেয়। অধিকন্তু, এটি গ্রিনহাউস পরিস্থিতিতে সাদা ছত্রাকের তীব্রতা উল্লেখযোগ্যভাবে কমাতে পারে। এছাড়াও, এল-অরনিথিন প্রয়োগকৃত উদ্ভিদের বৃদ্ধিকে উদ্দীপিত করে, যা নির্দেশ করে যে এল-অরনিথিনের পরীক্ষিত ঘনত্বগুলো প্রয়োগকৃত উদ্ভিদের জন্য ফাইটোটক্সিক ছিল না। এছাড়াও, এল-অরনিথিন নন-এনজাইমেটিক অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট (মোট দ্রবণীয় ফেনোলিক এবং ফ্ল্যাভোনয়েড) এবং এনজাইমেটিক অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট (ক্যাটালেজ (CAT), পারঅক্সিডেজ (POX), এবং পলিফেনল অক্সিডেজ (PPO))-এর এক্সপ্রেশন বৃদ্ধি করে এবং তিনটি অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট-সম্পর্কিত জিনের (PvCAT1, PvSOD, এবং PvGR) এক্সপ্রেশন বাড়িয়ে দেয়। অধিকন্তু, ইন সিলিকো বিশ্লেষণে এস. স্ক্লেরোটিওরাম জিনোমে একটি সম্ভাব্য অক্সালোঅ্যাসিটেট অ্যাসিটাইলহাইড্রোলেজ (SsOAH) প্রোটিনের উপস্থিতি প্রকাশ পেয়েছে, যা কার্যকরী বিশ্লেষণ, সংরক্ষিত ডোমেইন এবং টপোলজির দিক থেকে অ্যাসপারজিলাস ফিজিয়েনসিস (AfOAH) এবং পেনিসিলিয়াম স্প. (PlOAH)-এর অক্সালোঅ্যাসিটেট অ্যাসিটাইলহাইড্রোলেজ (SsOAH) প্রোটিনের সাথে অত্যন্ত সাদৃশ্যপূর্ণ ছিল। মজার বিষয় হলো, পটেটো ডেক্সট্রোজ ব্রথ (PDB) মাধ্যমে এল-অরনিথিন যোগ করার ফলে এস. স্ক্লেরোটিওরাম মাইসেলিয়াতে SsOAH জিনের এক্সপ্রেশন উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পায়। একইভাবে, বাহ্যিকভাবে এল-অরনিথিন প্রয়োগ করলে পরীক্ষিত উদ্ভিদ থেকে সংগৃহীত ছত্রাকের মাইসেলিয়ায় SsOAH জিনের প্রকাশ উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পায়। পরিশেষে, এল-অরনিথিন প্রয়োগ পিডিবি মাধ্যম এবং আক্রান্ত পাতা উভয় ক্ষেত্রেই অক্সালিক অ্যাসিড নিঃসরণ উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করে। উপসংহারে বলা যায়, এল-অরনিথিন আক্রান্ত উদ্ভিদের জারণ-বিজারণ অবস্থা বজায় রাখা এবং প্রতিরক্ষা প্রতিক্রিয়া বৃদ্ধিতে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। এই গবেষণার ফলাফল সাদা ছত্রাক নিয়ন্ত্রণ এবং শিম উৎপাদন ও অন্যান্য ফসলের উপর এর প্রভাব প্রশমিত করার জন্য উদ্ভাবনী ও পরিবেশবান্ধব পদ্ধতি তৈরিতে সহায়ক হতে পারে।
নেক্রোট্রফিক ছত্রাক Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary দ্বারা সৃষ্ট সাদা ছত্রাক একটি বিধ্বংসী ও ফলন-হ্রাসকারী রোগ, যা বিশ্বব্যাপী শিম (Phaseolus vulgaris L.) উৎপাদনের জন্য একটি গুরুতর হুমকি (Bolton et al., 2006)। Sclerotinia sclerotiorum হলো মাটিবাহিত ছত্রাকজনিত উদ্ভিদ রোগজীবাণুগুলোর মধ্যে অন্যতম, যা নিয়ন্ত্রণ করা সবচেয়ে কঠিন। এর পোষক পরিসর ৬০০-এরও বেশি উদ্ভিদ প্রজাতি এবং এটি অনির্দিষ্টভাবে দ্রুত পোষক কলাকে পচিয়ে ফেলার ক্ষমতা রাখে (Liang and Rollins, 2018)। প্রতিকূল পরিস্থিতিতে, এটি তার জীবনচক্রের একটি সংকটপূর্ণ পর্যায়ে প্রবেশ করে এবং দীর্ঘ সময় ধরে সুপ্ত অবস্থায় থাকে। এই সময়ে এটি মাটিতে 'স্ক্লেরোশিয়া' নামক কালো, শক্ত, বীজের মতো কাঠামো হিসেবে অথবা আক্রান্ত উদ্ভিদের মাইসেলিয়াম বা কাণ্ডের মজ্জায় সাদা, তুলতুলে বৃদ্ধি হিসেবে দেখা যায় (Schwartz et al., 2005)। S. sclerotiorum স্ক্লেরোশিয়া গঠন করতে সক্ষম, যা একে সংক্রমিত জমিতে দীর্ঘ সময় ধরে টিকে থাকতে এবং রোগের সময়ও টিকে থাকতে সাহায্য করে (Schwartz et al., 2005)। স্ক্লেরোশিয়া পুষ্টিতে সমৃদ্ধ, মাটিতে দীর্ঘ সময় ধরে টিকে থাকতে পারে এবং পরবর্তী সংক্রমণের জন্য প্রাথমিক জীবাণু হিসেবে কাজ করে (Schwartz et al., 2005)। অনুকূল পরিস্থিতিতে, স্ক্লেরোশিয়া অঙ্কুরিত হয় এবং বায়ুবাহিত রেণু উৎপন্ন করে যা উদ্ভিদের মাটির উপরের সমস্ত অংশকে সংক্রমিত করতে পারে, যার মধ্যে ফুল, কাণ্ড বা শুঁটি অন্তর্ভুক্ত, তবে এগুলিতেই সীমাবদ্ধ নয় (Schwartz et al., 2005)।
স্ক্লেরোটিনিয়া স্ক্লেরোটিওরাম তার পোষক উদ্ভিদকে সংক্রমিত করার জন্য একটি বহুস্তরীয় কৌশল ব্যবহার করে, যার মধ্যে স্ক্লেরোশিয়ার অঙ্কুরোদগম থেকে শুরু করে রোগের লক্ষণ প্রকাশ পর্যন্ত ধারাবাহিক সমন্বিত ঘটনা অন্তর্ভুক্ত থাকে। প্রাথমিকভাবে, এস. স্ক্লেরোটিওরাম অ্যাপোথেসিয়া নামক মাশরুমের মতো কাঠামো থেকে ভাসমান স্পোর (যাকে অ্যাসকোস্পোর বলা হয়) তৈরি করে, যা বাতাসে ভেসে বেড়ায় এবং সংক্রমিত উদ্ভিদের ধ্বংসাবশেষের উপর নিশ্চল স্ক্লেরোশিয়ায় পরিণত হয় (বোল্টন এট আল., ২০০৬)। এরপর ছত্রাকটি অক্সালিক অ্যাসিড নামক একটি ভাইরুলেন্স ফ্যাক্টর নিঃসরণ করে, যা উদ্ভিদের কোষ প্রাচীরের pH নিয়ন্ত্রণ করে, এনজাইমেটিক অবক্ষয় ও কলা আক্রমণকে ত্বরান্বিত করে (হেগেডাস এবং রিমার, ২০০৫), এবং পোষক উদ্ভিদের অক্সিডেটিভ বার্স্টকে দমন করে। এই অম্লীকরণ প্রক্রিয়াটি উদ্ভিদের কোষ প্রাচীরকে দুর্বল করে দেয়, যা ছত্রাকের কোষ প্রাচীর অবক্ষয়কারী এনজাইমগুলির (CWDEs) স্বাভাবিক ও কার্যকর কার্যকলাপের জন্য একটি অনুকূল পরিবেশ তৈরি করে, ফলে রোগজীবাণুটি ভৌত ​​বাধা অতিক্রম করে পোষক কলায় প্রবেশ করতে পারে (মার্সিয়ানো এট আল., ১৯৮৩)। একবার দেহে প্রবেশ করলে, এস. স্ক্লেরোটিওরাম পলিগ্যালাকচুরোনেজ এবং সেলুলেজের মতো বেশ কিছু কোষ-বাহিত রোগজীবাণু (CWDE) নিঃসরণ করে, যা আক্রান্ত কলায় এর বিস্তারকে সহজ করে এবং কলার নেক্রোসিস ঘটায়। ক্ষত এবং হাইফাল ম্যাটের অগ্রগতির ফলে সাদা ছাঁচের বৈশিষ্ট্যসূচক লক্ষণ দেখা দেয় (হেগেডাস এবং রিমার, ২০০৫)। এদিকে, পোষক উদ্ভিদ প্যাটার্ন রিকগনিশন রিসেপ্টর (PRR)-এর মাধ্যমে রোগজীবাণু-সম্পর্কিত আণবিক প্যাটার্ন (PAMP) শনাক্ত করে, যা ধারাবাহিক সংকেত আদান-প্রদানের প্রক্রিয়াকে উদ্দীপ্ত করে এবং অবশেষে প্রতিরক্ষা ব্যবস্থা সক্রিয় করে তোলে।
কয়েক দশক ধরে রোগ নিয়ন্ত্রণের প্রচেষ্টা সত্ত্বেও, রোগজীবাণুর প্রতিরোধ ক্ষমতা, টিকে থাকা এবং অভিযোজন ক্ষমতার কারণে অন্যান্য বাণিজ্যিক ফসলের মতো শিম ফসলেও পর্যাপ্ত প্রতিরোধী জার্মপ্লাজমের ঘাটতি রয়ে গেছে। তাই রোগ ব্যবস্থাপনা অত্যন্ত কঠিন এবং এর জন্য একটি সমন্বিত, বহুমুখী কৌশল প্রয়োজন, যার মধ্যে চাষাবাদ পদ্ধতি, জৈবিক নিয়ন্ত্রণ এবং রাসায়নিক ছত্রাকনাশকের সংমিশ্রণ অন্তর্ভুক্ত থাকে (ও'সুলিভান এট আল., ২০২১)। সাদা ছত্রাকের রাসায়নিক নিয়ন্ত্রণ সবচেয়ে কার্যকর, কারণ ছত্রাকনাশক সঠিকভাবে এবং সঠিক সময়ে প্রয়োগ করা হলে রোগের বিস্তার কার্যকরভাবে নিয়ন্ত্রণ করতে, সংক্রমণের তীব্রতা কমাতে এবং ফলনের ক্ষতি হ্রাস করতে পারে। তবে, ছত্রাকনাশকের অতিরিক্ত ব্যবহার এবং এর উপর অতিরিক্ত নির্ভরতার ফলে এস. স্ক্লেরোটিওরাম (S. sclerotiorum)-এর প্রতিরোধী স্ট্রেইনের উদ্ভব হতে পারে এবং এটি অ-লক্ষ্য জীব, মাটির স্বাস্থ্য এবং জলের গুণমানের উপর নেতিবাচক প্রভাব ফেলতে পারে (লে কোয়েন্তে এট আল., ২০১৬; সেরেসিনি এট আল., ২০২৪)। তাই, পরিবেশবান্ধব বিকল্প খুঁজে বের করা একটি শীর্ষ অগ্রাধিকার হয়ে উঠেছে।
পুট্রেসিন, স্পারমিডিন, স্পারমিন এবং ক্যাডাভেরিনের মতো পলিঅ্যামাইন (PA) মাটিবাহিত উদ্ভিদের রোগজীবাণুর বিরুদ্ধে একটি সম্ভাবনাময় বিকল্প হিসেবে কাজ করতে পারে, যার ফলে বিপজ্জনক রাসায়নিক ছত্রাকনাশকের ব্যবহার সম্পূর্ণ বা আংশিকভাবে হ্রাস পায় (নেহেলা প্রমুখ, ২০২৪; ই প্রমুখ, ২০২৪)। উচ্চতর উদ্ভিদে, PA অনেক শারীরবৃত্তীয় প্রক্রিয়ায় জড়িত থাকে, যার মধ্যে কোষ বিভাজন, পার্থক্যকরণ এবং অজৈব ও জৈব পীড়নের প্রতি সাড়াদান অন্যতম (কিলিনি ও নেহেলা, ২০২০)। এরা অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট হিসেবে কাজ করতে পারে, রিঅ্যাক্টিভ অক্সিজেন স্পিসিস (ROS) অপসারণে সাহায্য করতে পারে, রিডক্স হোমিওস্ট্যাসিস বজায় রাখতে পারে (নেহেলা ও কিলিনি, ২০২৩), প্রতিরক্ষা-সম্পর্কিত জিনকে উদ্দীপিত করতে পারে (রোমেরো প্রমুখ, ২০১৮), বিভিন্ন বিপাকীয় পথ নিয়ন্ত্রণ করতে পারে (নেহেলা ও কিলিনি, ২০২৩), অন্তঃস্থ ফাইটো হরমোনকে নিয়ন্ত্রণ করতে পারে (নেহেলা ও কিলিনি, ২০১৯), সিস্টেমিক অ্যাকোয়ার্ড রেজিস্ট্যান্স (SAR) প্রতিষ্ঠা করতে পারে এবং উদ্ভিদ-রোগজীবাণু মিথস্ক্রিয়া নিয়ন্ত্রণ করতে পারে (নেহেলা ও কিলিনি, ২০২০; আসিজা প্রমুখ, ২০২২; চেরভনিক, ২০২২)। এটি লক্ষণীয় যে, উদ্ভিদের প্রতিরক্ষায় পলিঅ্যামাইনের (PA) নির্দিষ্ট কার্যপ্রণালী এবং ভূমিকা উদ্ভিদের প্রজাতি, রোগজীবাণু এবং পরিবেশগত অবস্থার উপর নির্ভর করে পরিবর্তিত হয়। উদ্ভিদে সবচেয়ে প্রাচুর্যপূর্ণ পলিঅ্যামাইনটি অপরিহার্য পলিঅ্যামাইন এল-অরনিথিন থেকে জৈব-সংশ্লেষিত হয় (কিলিনি ও নেহেলা, ২০২০)।
উদ্ভিদের বৃদ্ধি ও বিকাশে এল-অর্নিথিন একাধিক ভূমিকা পালন করে। উদাহরণস্বরূপ, পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে ধানে (Oryza sativa) অর্নিথিন নাইট্রোজেন পুনর্ব্যবহার (লিউ এট আল., ২০১৮), ধানের ফলন, গুণমান ও সুগন্ধ (লু এট আল., ২০২০) এবং জলীয় চাপের প্রতিক্রিয়ার (ইয়াং এট আল., ২০০০) সাথে সম্পর্কিত হতে পারে। অধিকন্তু, এল-অর্নিথিনের বাহ্যিক প্রয়োগ সুগার বিটে (Beta vulgaris) খরা সহনশীলতা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি করেছে (হুসেইন এট আল., ২০১৯) এবং পেঁয়াজ (Allium Cepa) (কাভুশোগলু এবং কাভুশোগলু, ২০২১) ও কাজু (Anacardium occidentale) উদ্ভিদে (দা রোচা এট আল., ২০১২) লবণাক্ততার চাপ কমিয়েছে। অজৈব চাপ প্রতিরক্ষায় এল-অর্নিথিনের সম্ভাব্য ভূমিকাটি সম্ভবত প্রয়োগকৃত উদ্ভিদে প্রোলিন সঞ্চয়ের সাথে এর সম্পৃক্ততার কারণে হয়ে থাকে। উদাহরণস্বরূপ, প্রোলিন বিপাক সম্পর্কিত জিন, যেমন অরনিথিন ডেল্টা অ্যামিনোট্রান্সফেরেজ (ডেল্টা-ওএটি) এবং প্রোলিন ডিহাইড্রোজিনেজ (প্রোডিএইচ১ এবং প্রোডিএইচ২) জিন, পূর্বে নিকোটিয়ানা বেন্থামিয়ানা এবং অ্যারাবিডোপসিস থ্যালিয়ানা উদ্ভিদের অ-পোষক সিউডোমোনাস সিরিঞ্জি স্ট্রেইনের বিরুদ্ধে প্রতিরক্ষায় জড়িত বলে জানা গেছে (সেন্থিল-কুমার এবং মহীশূর, ২০১২)। অন্যদিকে, রোগজীবাণুর বৃদ্ধির জন্য ছত্রাকের অরনিথিন ডিকারবক্সিলেজ (ওডিসি) প্রয়োজন (সিং প্রমুখ, ২০২০)। পোষক-প্ররোচিত জিন সাইলেন্সিং (এইচআইজিএস)-এর মাধ্যমে ফিউসারিয়াম অক্সিস্পোরাম এফ. এসপি. লাইকোপারিসি-এর ওডিসি-কে লক্ষ্যবস্তু করার ফলে টমেটো গাছের ফিউসারিয়াম উইল্ট রোগের বিরুদ্ধে প্রতিরোধ ক্ষমতা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (সিং প্রমুখ, ২০২০)। তবে, উদ্ভিদ রোগজীবাণুর মতো জৈবিক চাপের বিরুদ্ধে বাহ্যিক অরনিথিন প্রয়োগের সম্ভাব্য ভূমিকা নিয়ে ভালোভাবে গবেষণা করা হয়নি। আরও গুরুত্বপূর্ণ বিষয় হলো, রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতার উপর অরনিথিনের প্রভাব এবং এর সাথে সম্পর্কিত জৈব রাসায়নিক ও শারীরবৃত্তীয় ঘটনাগুলো এখনও অনেকাংশে অনাবিষ্কৃত রয়ে গেছে।
শিম জাতীয় ফসলে S. sclerotiorum সংক্রমণের জটিলতা বোঝা কার্যকর নিয়ন্ত্রণ কৌশল বিকাশের জন্য গুরুত্বপূর্ণ। এই গবেষণায়, আমরা শিম জাতীয় উদ্ভিদের প্রতিরক্ষা ব্যবস্থা এবং Sclerotinia sclerotiorum সংক্রমণের বিরুদ্ধে প্রতিরোধ ক্ষমতা বৃদ্ধিতে একটি মূল উপাদান হিসেবে ডায়ামিন এল-অরনিথিনের সম্ভাব্য ভূমিকা শনাক্ত করার লক্ষ্য নিয়েছি। আমরা অনুমান করি যে, আক্রান্ত উদ্ভিদের প্রতিরক্ষা প্রতিক্রিয়া বাড়ানোর পাশাপাশি, এল-অরনিথিন উদ্ভিদের জারণ-বিজারণ অবস্থা বজায় রাখতেও একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। আমরা প্রস্তাব করছি যে এল-অরনিথিনের সম্ভাব্য প্রভাবগুলো এনজাইমেটিক এবং নন-এনজাইমেটিক অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট প্রতিরক্ষা ব্যবস্থার নিয়ন্ত্রণ এবং ছত্রাকের রোগ সৃষ্টিকারী/বিষাক্ত উপাদান ও সংশ্লিষ্ট প্রোটিনের সাথে হস্তক্ষেপের সাথে সম্পর্কিত। এল-অরনিথিনের এই দ্বৈত কার্যকারিতা এটিকে সাদা ছত্রাকের প্রভাব প্রশমিত করতে এবং এই শক্তিশালী ছত্রাকঘটিত রোগজীবাণুর বিরুদ্ধে সাধারণ শিম জাতীয় ফসলের প্রতিরোধ ক্ষমতা বাড়ানোর জন্য একটি টেকসই কৌশলের প্রতিশ্রুতিশীল উপাদান হিসেবে তৈরি করে। বর্তমান গবেষণার ফলাফল সাদা ছত্রাক নিয়ন্ত্রণ এবং শিম জাতীয় ফসল উৎপাদনে এর প্রভাব প্রশমিত করার জন্য উদ্ভাবনী, পরিবেশবান্ধব পদ্ধতি বিকাশে সহায়তা করতে পারে।
এই গবেষণায়, পরীক্ষামূলক উপাদান হিসেবে সাধারণ শিমের একটি সংবেদনশীল বাণিজ্যিক জাত, গিজা ৩ (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) ব্যবহার করা হয়েছে। মিশরের কৃষি গবেষণা কেন্দ্র (ARC)-এর অধীনস্থ মাঠ ফসল গবেষণা ইনস্টিটিউট (FCRI)-এর লেগিউম গবেষণা বিভাগ থেকে স্বাস্থ্যকর বীজ সৌজন্যমূলকভাবে সরবরাহ করা হয়েছিল। গ্রিনহাউসের পরিবেশে (২৫ ± ২ °C, আপেক্ষিক আর্দ্রতা ৭৫ ± ১%, ৮ ঘণ্টা আলো/১৬ ঘণ্টা অন্ধকার) S. sclerotiorum-আক্রান্ত মাটি ভর্তি প্লাস্টিকের টবে (অভ্যন্তরীণ ব্যাস ৩৫ সেমি, গভীরতা ৫০ সেমি) পাঁচটি করে বীজ বপন করা হয়েছিল। বীজ বপনের ৭-১০ দিন পর, প্রতিটি টবে সুষম বৃদ্ধি এবং তিনটি সম্পূর্ণ প্রসারিত পাতাযুক্ত কেবল দুটি চারা রেখে বাকিগুলো তুলে ফেলা হয়। টবের সমস্ত গাছে প্রতি দুই সপ্তাহে একবার জল দেওয়া হতো এবং নির্দিষ্ট জাতের জন্য সুপারিশকৃত হারে মাসিক সার প্রয়োগ করা হতো।
৫০০ মিলিগ্রাম/লিটার ঘনত্বের এল-অরনিথিনডায়ামিন (যা (+)-(S)-2,5-ডায়ামিনোপেন্টানোয়িক অ্যাসিড নামেও পরিচিত; সিগমা-অলড্রিচ, ডার্মস্ট্যাড, জার্মানি) প্রস্তুত করার জন্য, প্রথমে ৫০ মিলিগ্রাম ১০০ মিলি জীবাণুমুক্ত পাতিত জলে দ্রবীভূত করা হয়েছিল। এরপর স্টক দ্রবণটিকে লঘু করে পরবর্তী পরীক্ষাগুলোতে ব্যবহার করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, এল-অরনিথিনের ছয়টি ঘনত্বের সিরিজ (১২.৫, ২৫, ৫০, ৭৫, ১০০, এবং ১২৫ মিলিগ্রাম/লিটার) ইন ভিট্রো পদ্ধতিতে পরীক্ষা করা হয়েছিল। এছাড়াও, জীবাণুমুক্ত পাতিত জলকে নেগেটিভ কন্ট্রোল (মক) হিসেবে এবং বাণিজ্যিক ছত্রাকনাশক “রাইজোলেক্স-টি” ৫০% ওয়েটেবল পাউডার (টোক্লোফস-মিথাইল ২০% + থিরাম ৩০%; কেজেড-কাফর এল জায়াত পেস্টিসাইডস অ্যান্ড কেমিক্যালস কোম্পানি, কাফর এল জায়াত, গারবিয়া গভর্নরেট, মিশর)-কে পজিটিভ কন্ট্রোল হিসেবে ব্যবহার করা হয়েছিল। বাণিজ্যিক ছত্রাকনাশক “রাইজোলেক্স-টি” পাঁচটি ঘনত্বে (২, ৪, ৬, ৮ এবং ১০ মিলিগ্রাম/লিটার) ইন ভিট্রো পদ্ধতিতে পরীক্ষা করা হয়েছিল।
বাণিজ্যিক খামার থেকে সাদা ছত্রাকের সাধারণ লক্ষণযুক্ত (আক্রমণের হার: ১০-৩০%) শিমের কাণ্ড ও শুঁটির নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল। যদিও বেশিরভাগ আক্রান্ত উদ্ভিদ উপাদান প্রজাতি/জাত (সংবেদনশীল বাণিজ্যিক জাত গিজা ৩) দ্বারা শনাক্ত করা হয়েছিল, অন্যগুলো, বিশেষ করে যেগুলো স্থানীয় বাজার থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল, সেগুলো ছিল অজানা প্রজাতির। সংগৃহীত আক্রান্ত উপাদানগুলোর উপরিভাগ প্রথমে ০.৫% সোডিয়াম হাইপোক্লোরাইট দ্রবণ দিয়ে ৩ মিনিটের জন্য জীবাণুমুক্ত করা হয়েছিল, তারপর জীবাণুমুক্ত পাতিত জল দিয়ে কয়েকবার ধুয়ে অতিরিক্ত জল অপসারণের জন্য জীবাণুমুক্ত ফিল্টার পেপার দিয়ে মুছে শুকানো হয়েছিল। এরপর আক্রান্ত অঙ্গগুলোকে মধ্যবর্তী টিস্যু (সুস্থ এবং আক্রান্ত টিস্যুর মাঝখানের অংশ) থেকে ছোট ছোট টুকরো করে কেটে পটেটো ডেক্সট্রোজ অ্যাগার (পিডিএ) মাধ্যমে কালচার করা হয়েছিল এবং স্ক্লেরোশিয়া গঠন উদ্দীপিত করার জন্য ২৫ ± ২ °C তাপমাত্রায় ১২ ঘণ্টা আলো/১২ ঘণ্টা অন্ধকার চক্রে ৫ দিনের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। মিশ্র বা দূষিত কালচার থেকে ছত্রাকের আইসোলেট বিশুদ্ধ করার জন্য মাইসেলিয়াল টিপ পদ্ধতিও ব্যবহার করা হয়েছিল। বিশুদ্ধ ছত্রাক আইসোলেটটিকে প্রথমে এর কালচারাল মরফোলজিক্যাল বৈশিষ্ট্যের ভিত্তিতে শনাক্ত করা হয় এবং পরবর্তীতে মাইক্রোস্কোপিক বৈশিষ্ট্যের মাধ্যমে এটিকে S. sclerotiorum হিসেবে নিশ্চিত করা হয়। পরিশেষে, কচ-এর স্বতঃসিদ্ধগুলো পূরণের জন্য সমস্ত বিশুদ্ধ আইসোলেটের রোগ সৃষ্টিকারী ক্ষমতা সংবেদনশীল সাধারণ শিম জাত গিজা ৩-এর উপর পরীক্ষা করা হয়।
এছাড়াও, হোয়াইট এট আল., ১৯৯০; বাতুরো-সিয়েসনিউস্কা এট আল., ২০১৭-এ বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে ইন্টারনাল ট্রান্সক্রাইবড স্পেসার (ITS) সিকোয়েন্সিং-এর মাধ্যমে সবচেয়ে আক্রমণাত্মক এস. স্ক্লেরোটিওরাম আইসোলেট (আইসোলেট #৩)-কে আরও নিশ্চিত করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, আইসোলেটগুলোকে পটেটো ডেক্সট্রোজ ব্রথে (PDB) কালচার করা হয়েছিল এবং ২৫ ± ২ °C তাপমাত্রায় ৫-৭ দিন ইনকিউবেট করা হয়েছিল। এরপর ছত্রাকের মাইসেলিয়াম সংগ্রহ করে, চিজক্লথের মধ্য দিয়ে ছেঁকে, জীবাণুমুক্ত জল দিয়ে দুবার ধুয়ে এবং জীবাণুমুক্ত ফিল্টার পেপার দিয়ে শুকানো হয়েছিল। কুইক-ডিএনএ™ ফাঙ্গাল/ব্যাকটেরিয়াল মিনিপ্রেপ কিট (কুরামায়ে-ইজিওকা, ১৯৯৭; আতাল্লাহ এট আল., ২০২২, ২০২৪) ব্যবহার করে জিনোমিক ডিএনএ পৃথক করা হয়েছিল। এরপর নির্দিষ্ট প্রাইমার জোড়া ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; প্রত্যাশিত আকার: ৫৪০ bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017) ব্যবহার করে ITS rDNA অঞ্চলটি অ্যামপ্লিফাই করা হয়েছিল। পরিশোধিত PCR প্রোডাক্টগুলো সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য বেইজিং আওকে ডিংশেং বায়োটেকনোলজি কোং, লিমিটেড-এ জমা দেওয়া হয়েছিল। স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং পদ্ধতি ব্যবহার করে ITS rDNA সিকোয়েন্সগুলো দ্বিমুখীভাবে সিকোয়েন্স করা হয়েছিল। এরপর অ্যাসেম্বল করা কোয়েরি সিকোয়েন্সগুলো BLASTn সফটওয়্যার ব্যবহার করে জেনব্যাঙ্ক এবং ন্যাশনাল সেন্টার ফর বায়োটেকনোলজি ইনফরমেশন (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)-এর সর্বশেষ তথ্যের সাথে তুলনা করা হয়েছিল। মলিকিউলার ইভোলিউশনারি জেনেটিক্স অ্যানালাইসিস প্যাকেজ (MEGA-11; সংস্করণ 11) (কুমার এট আল., ২০২৪)-এর ক্লাস্টালডব্লিউ (ClustalW) ব্যবহার করে, এনসিবিআই জেনব্যাঙ্ক (NCBI GenBank)-এর সর্বশেষ ডেটা (পরিপূরক সারণি S1) থেকে প্রাপ্ত ২০টি অন্যান্য এস. স্ক্লেরোটিওরাম (S. sclerotiorum) স্ট্রেইন/আইসোলেটের সাথে কোয়েরি সিকোয়েন্সটির তুলনা করা হয়েছিল। ম্যাক্সিমাম লাইকলিহুড পদ্ধতি এবং জেনারেল টাইম-রিভার্সিবল নিউক্লিওটাইড সাবস্টিটিউশন মডেল (নেই এবং কুমার, ২০০০) ব্যবহার করে বিবর্তনীয় বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সর্বোচ্চ লগ-লাইকলিহুডযুক্ত ট্রি-টি দেখানো হয়েছে। হিউরিস্টিক অনুসন্ধানের জন্য প্রাথমিক ট্রি-টি নেইবার-জয়েনিং (NJ) ট্রি (কুমার এট আল., ২০২৪) এবং ম্যাক্সিমাম পারসিমনি (MP) ট্রি-এর মধ্যে থেকে উচ্চতর লগ-লাইকলিহুডযুক্ত ট্রি-টি বেছে নিয়ে নির্বাচন করা হয়। জেনারেল টাইম-রিভার্সিবল মডেল (নেই এবং কুমার, ২০০০) ব্যবহার করে গণনা করা একটি পেয়ারওয়াইজ ডিসটেন্স ম্যাট্রিক্সের মাধ্যমে এনজে (NJ) ট্রি-টি তৈরি করা হয়েছিল।
অ্যাগার ডিফিউশন পদ্ধতির মাধ্যমে ইন ভিট্রো পদ্ধতিতে এল-অরনিথিন এবং ব্যাকটেরিয়ানাশক “রাইজোলেক্স-টি”-এর ব্যাকটেরিয়ারোধী কার্যকারিতা নির্ণয় করা হয়েছিল। পদ্ধতি: এল-অরনিথিনের স্টক সলিউশনের (৫০০ মিগ্রা/লি) উপযুক্ত পরিমাণ নিয়ে ১০ মিলি পিডিএ নিউট্রিয়েন্ট মিডিয়ামের সাথে ভালোভাবে মিশিয়ে যথাক্রমে ১২.৫, ২৫, ৫০, ৭৫, ১০০ এবং ১২৫ মিগ্রা/লি চূড়ান্ত ঘনত্বের দ্রবণ প্রস্তুত করা হয়। কন্ট্রোল হিসেবে ছত্রাকনাশক “রাইজোলেক্স-টি”-এর পাঁচটি ঘনত্ব (২, ৪, ৬, ৮ এবং ১০ মিগ্রা/লি) এবং জীবাণুমুক্ত পাতিত জল ব্যবহার করা হয়েছিল। মিডিয়ামটি জমাট বাঁধার পর, স্ক্লেরোটিনিয়া স্ক্লেরোটিওরাম কালচারের ৪ মিমি ব্যাসের একটি সদ্য প্রস্তুত মাইসেলিয়াল প্লাগ পেট্রি ডিশের কেন্দ্রে স্থানান্তর করা হয় এবং ২৫±২° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় কালচার করা হয় যতক্ষণ না মাইসেলিয়াম পুরো কন্ট্রোল পেট্রি ডিশটি ঢেকে ফেলে, যার পরে ছত্রাকের বৃদ্ধি রেকর্ড করা হয়। সমীকরণ ১ ব্যবহার করে S. sclerotiorum-এর ব্যাসার্ধীয় বৃদ্ধির শতকরা বাধা নির্ণয় করুন:
পরীক্ষাটি দুইবার পুনরাবৃত্তি করা হয়েছিল, যেখানে প্রতিটি নিয়ন্ত্রণ/পরীক্ষামূলক দলের জন্য ছয়টি জৈবিক প্রতিলিপি এবং প্রতিটি জৈবিক প্রতিলিপির জন্য পাঁচটি টব (প্রতি টবে দুটি গাছ) ছিল। পরীক্ষামূলক ফলাফলের নির্ভুলতা, নির্ভরযোগ্যতা এবং পুনরুৎপাদনযোগ্যতা নিশ্চিত করার জন্য প্রতিটি জৈবিক প্রতিলিপি দুইবার (দুটি প্রযুক্তিগত প্রতিলিপি) বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। এছাড়াও, অর্ধ-সর্বোচ্চ প্রতিরোধক ঘনত্ব (IC50) এবং IC99 (প্রেন্টিস, ১৯৭৬) গণনা করার জন্য প্রোবিট রিগ্রেশন বিশ্লেষণ ব্যবহার করা হয়েছিল।
গ্রিনহাউস পরিবেশে এল-অরনিথিনের কার্যকারিতা মূল্যায়নের জন্য পরপর দুটি টবে পরীক্ষা চালানো হয়েছিল। সংক্ষেপে, টবগুলো জীবাণুমুক্ত এঁটেল-বালি মাটি (৩:১) দিয়ে ভরা হয়েছিল এবং এস. স্ক্লেরোটিওরামের সদ্য প্রস্তুত কালচার দিয়ে ইনোকুলেট করা হয়েছিল। প্রথমে, এস. স্ক্লেরোটিওরামের সবচেয়ে আক্রমণাত্মক আইসোলেট (আইসোলেট #৩) এর একটি স্ক্লেরোশিয়ামকে অর্ধেক করে কেটে, সেটিকে একটি পিডিএ-তে উপুড় করে রেখে এবং মাইসেলিয়াল বৃদ্ধি উদ্দীপিত করার জন্য ৪ দিন ধরে ২৫° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় অবিরাম অন্ধকারে (২৪ ঘণ্টা) ইনকিউবেট করে কালচার করা হয়েছিল। এরপর, অগ্রভাগ থেকে ৫ মিমি ব্যাসের চারটি অ্যাগার প্লাগ নেওয়া হয়েছিল এবং ১০০ গ্রাম গম ও চালের তুষের (১:১, ভি/ভি) একটি জীবাণুমুক্ত মিশ্রণ দিয়ে ইনোকুলেট করা হয়েছিল। স্ক্লেরোশিয়া গঠন উদ্দীপিত করার জন্য সমস্ত ফ্লাস্ক ৫ দিন ধরে ২৫ ± ২ ° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় একটি ১২ ঘণ্টা আলো/১২ ঘণ্টা অন্ধকার চক্রের অধীনে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। মাটি যোগ করার আগে সমস্ত ফ্লাস্কের উপাদানগুলো ভালোভাবে মিশিয়ে সমসত্ত্বতা নিশ্চিত করা হয়েছিল। এরপর, রোগজীবাণুর একটি স্থির ঘনত্ব নিশ্চিত করার জন্য প্রতিটি টবে ১০০ গ্রাম উপনিবেশ স্থাপনকারী তুষের মিশ্রণ যোগ করা হয়েছিল। ছত্রাকের বৃদ্ধি সক্রিয় করার জন্য জীবাণুযুক্ত টবগুলিতে জল দেওয়া হয়েছিল এবং ৭ দিনের জন্য গ্রিনহাউসের পরিবেশে রাখা হয়েছিল।
এরপর প্রতিটি টবে গিজা ৩ জাতের পাঁচটি করে বীজ বপন করা হয়েছিল। এল-অরনিথিন এবং ছত্রাকনাশক রাইজোলেক্স-টি দ্বারা শোধিত টবগুলোর ক্ষেত্রে, জীবাণুমুক্ত বীজগুলোকে প্রথমে যথাক্রমে প্রায় ২৫০ মিলিগ্রাম/লিটার এবং ৫০ মিলিগ্রাম/লিটার চূড়ান্ত IC99 ঘনত্বের দুটি যৌগের জলীয় দ্রবণে দুই ঘণ্টা ভিজিয়ে রাখা হয়েছিল এবং বপনের আগে এক ঘণ্টা ধরে বাতাসে শুকানো হয়েছিল। অন্যদিকে, নেগেটিভ কন্ট্রোল হিসেবে বীজগুলোকে জীবাণুমুক্ত পাতিত জলে ভিজিয়ে রাখা হয়েছিল। ১০ দিন পর, প্রথমবার জল দেওয়ার আগে, চারাগাছগুলো পাতলা করে প্রতিটি টবে কেবল দুটি করে পরিচ্ছন্ন চারা রাখা হয়েছিল। এছাড়াও, এস. স্ক্লেরোটিওরাম দ্বারা সংক্রমণ নিশ্চিত করার জন্য, একই বিকাশ পর্যায়ে (১০ দিন) থাকা শিম গাছের কাণ্ড একটি জীবাণুমুক্ত স্ক্যালপেল ব্যবহার করে দুটি ভিন্ন স্থান থেকে কাটা হয়েছিল এবং প্রতিটি ক্ষতের মধ্যে প্রায় ০.৫ গ্রাম কলোনাইজিং ব্রান মিশ্রণ রাখা হয়েছিল। এরপর সমস্ত ইনোকুলেটেড গাছে সংক্রমণ এবং রোগের বিকাশকে উদ্দীপিত করার জন্য উচ্চ আর্দ্রতা প্রয়োগ করা হয়েছিল। নিয়ন্ত্রণ উদ্ভিদগুলিতেও একইভাবে ক্ষত সৃষ্টি করা হয়েছিল এবং ক্ষতস্থানে সমপরিমাণ (০.৫ গ্রাম) জীবাণুমুক্ত, জীবাণুবিহীন তুষের মিশ্রণ রেখে উচ্চ আর্দ্রতায় রাখা হয়েছিল, যাতে রোগের বিকাশের পরিবেশ অনুকরণ করা যায় এবং পরীক্ষামূলক দলগুলির মধ্যে সামঞ্জস্য নিশ্চিত করা যায়।
পরিচর্যা পদ্ধতি: শিমের চারাকে মাটিতে সেচ দেওয়ার মাধ্যমে ৫০০ মিলি এল-অরনিথিন (২৫০ মিলিগ্রাম/লিটার) বা ছত্রাকনাশক রিজোলেক্স-টি (৫০ মিলিগ্রাম/লিটার)-এর জলীয় দ্রবণ দিয়ে জল দেওয়া হয়েছিল, এবং তারপর ১০ দিনের ব্যবধানে এই পরিচর্যা তিনবার পুনরাবৃত্তি করা হয়েছিল। প্লেসিবো-প্রয়োগকৃত নিয়ন্ত্রিত চারাগুলিতে ৫০০ মিলি জীবাণুমুক্ত পাতিত জল দিয়ে সেচ দেওয়া হয়েছিল। সমস্ত পরিচর্যা গ্রিনহাউসের পরিবেশে (২৫ ± ২°সে, ৭৫ ± ১% আপেক্ষিক আর্দ্রতা, এবং ৮ ঘণ্টা আলো/১৬ ঘণ্টা অন্ধকারের আলোককাল) সম্পন্ন করা হয়েছিল। সমস্ত টবে পাক্ষিকভাবে জল দেওয়া হতো এবং নির্দিষ্ট জাতের সুপারিশ ও প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুযায়ী পাতায় স্প্রে করে ৩-৪ গ্রাম/লিটার ঘনত্বে একটি সুষম এনপিকে সার (২০-২০-২০, ৩.৬% সালফার এবং টিই মাইক্রোএলিমেন্টস সহ; জেইন সিডস, মিশর) মাসিক ভিত্তিতে প্রয়োগ করা হতো। অন্যথা উল্লেখ না থাকলে, চিকিৎসার ৭২ ঘন্টা পরে (hpt) প্রতিটি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেট থেকে সম্পূর্ণরূপে প্রসারিত পরিপক্ক পাতা (উপর থেকে ২য় এবং ৩য় পাতা) সংগ্রহ করা হয়েছিল, সেগুলোকে হোমোজিনাইজ করে, একত্রিত করা হয়েছিল এবং পরবর্তী বিশ্লেষণের জন্য -৮০ °C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল। এই বিশ্লেষণের মধ্যে অন্তর্ভুক্ত ছিল, কিন্তু সীমাবদ্ধ ছিল না, অক্সিডেটিভ স্ট্রেস সূচকের ইন সিটু হিস্টোকেমিক্যাল স্থানীয়করণ, লিপিড পারঅক্সিডেশন, এনজাইমেটিক ও নন-এনজাইমেটিক অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট এবং জিন এক্সপ্রেশন।
পেটজোল্ড এবং ডিকসন স্কেল (১৯৯৬) যা টেরান এট আল. (২০০৬) দ্বারা সংশোধিত, তার উপর ভিত্তি করে ১-৯ স্কেল (পরিপূরক সারণি S2) ব্যবহার করে ইনোকুলেশনের ২১ দিন পর (dpi) থেকে প্রতি সপ্তাহে সাদা ছত্রাক সংক্রমণের তীব্রতা মূল্যায়ন করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, পর্বমধ্য এবং পর্ব বরাবর ক্ষতের অগ্রগতি অনুসরণ করার জন্য ইনোকুলেশনের স্থান থেকে শিম গাছের কাণ্ড এবং শাখাগুলি পরীক্ষা করা হয়েছিল। এরপর ইনোকুলেশনের স্থান থেকে কাণ্ড বা শাখার সবচেয়ে দূরবর্তী বিন্দু পর্যন্ত ক্ষতের দূরত্ব পরিমাপ করা হয়েছিল এবং ক্ষতের অবস্থানের উপর ভিত্তি করে ১-৯ এর একটি স্কোর নির্ধারণ করা হয়েছিল, যেখানে (১) ইনোকুলেশনের স্থানের কাছাকাছি কোনও দৃশ্যমান সংক্রমণ না থাকাকে নির্দেশ করে এবং (২-৯) ক্ষতের আকারের ধীরে ধীরে বৃদ্ধি এবং পর্ব/পর্বমধ্য বরাবর অগ্রগতিকে নির্দেশ করে (পরিপূরক সারণি S2)। এরপর সূত্র ২ ব্যবহার করে সাদা ছত্রাক সংক্রমণের তীব্রতাকে শতাংশে রূপান্তরিত করা হয়েছিল:
এছাড়াও, রোগ অগ্রগতি বক্ররেখার অধীনস্থ ক্ষেত্রফল (AUDPC) (Shaner and Finney, 1977) সূত্র ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল, যা সম্প্রতি (Chauhan et al., 2020) সমীকরণ ৩ ব্যবহার করে সাধারণ শিমের সাদা পচা রোগের জন্য অভিযোজিত হয়েছে:
যেখানে Yi = ti সময়ে রোগের তীব্রতা, Yi+1 = পরবর্তী ti+1 সময়ে রোগের তীব্রতা, ti = প্রথম পরিমাপের সময় (দিনে), ti+1 = পরবর্তী পরিমাপের সময় (দিনে), n = মোট সময় বিন্দু বা পর্যবেক্ষণ বিন্দুর সংখ্যা। সমস্ত জৈবিক প্রতিলিপিতে ২১ দিন ধরে সাপ্তাহিক ভিত্তিতে শিম গাছের বৃদ্ধির পরামিতি, যেমন গাছের উচ্চতা (সেমি), প্রতি গাছে শাখার সংখ্যা এবং প্রতি গাছে পাতার সংখ্যা, লিপিবদ্ধ করা হয়েছিল।
প্রতিটি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেটে, ট্রিটমেন্টের ৪৫ দিন পর (শেষ ট্রিটমেন্টের ১৫ দিন পর) পাতার নমুনা (উপর থেকে দ্বিতীয় এবং তৃতীয় সম্পূর্ণ বিকশিত পাতা) সংগ্রহ করা হয়েছিল। প্রতিটি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেটে পাঁচটি টব ছিল (প্রতি টবে দুটি করে গাছ)। প্রায় ৫০০ মিলিগ্রাম চূর্ণ করা টিস্যু থেকে অন্ধকারে ৪ ডিগ্রি সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ৮০% অ্যাসিটোন ব্যবহার করে সালোকসংশ্লেষী রঞ্জক (ক্লোরোফিল এ, ক্লোরোফিল বি এবং ক্যারোটিনয়েড) নিষ্কাশন করা হয়েছিল। ২৪ ঘণ্টা পর, নমুনাগুলোকে সেন্ট্রিফিউজ করা হয় এবং সুপারন্যাট্যান্ট সংগ্রহ করে (লিচটেনথালার, ১৯৮৭)-এর পদ্ধতি অনুসারে একটি UV-160A স্পেকট্রোফটোমিটার (শিমাজু কর্পোরেশন, জাপান) ব্যবহার করে তিনটি ভিন্ন তরঙ্গদৈর্ঘ্যে (Δ470, Δ646 এবং Δ663 nm) শোষণমাত্রা পরিমাপের মাধ্যমে কালারমেট্রিকভাবে ক্লোরোফিল এ, ক্লোরোফিল বি এবং ক্যারোটিনয়েডের পরিমাণ নির্ণয় করা হয়। অবশেষে, লিচটেনথালার (১৯৮৭) কর্তৃক বর্ণিত ৪-৬ নং সূত্র ব্যবহার করে সালোকসংশ্লেষী রঞ্জক পদার্থের পরিমাণ গণনা করা হয়েছিল।
চিকিৎসার ৭২ ঘন্টা পরে (hpt), হাইড্রোজেন পারক্সাইড (H2O2) এবং সুপারঅক্সাইড অ্যানায়ন (O2•−) এর ইন সিটু হিস্টোকেমিক্যাল স্থানীয়করণের জন্য প্রতিটি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেট থেকে পাতা (উপর থেকে দ্বিতীয় এবং তৃতীয় সম্পূর্ণ বিকশিত পাতা) সংগ্রহ করা হয়েছিল। প্রতিটি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেট পাঁচটি টব নিয়ে গঠিত ছিল (প্রতি টবে দুটি গাছ)। পদ্ধতির নির্ভুলতা, নির্ভরযোগ্যতা এবং পুনরুৎপাদনযোগ্যতা নিশ্চিত করার জন্য প্রতিটি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেট দ্বৈতভাবে (দুটি টেকনিক্যাল রেপ্লিকেট) বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। H2O2 এবং O2•− যথাক্রমে ০.১% ৩,৩′-ডায়ামিনোবেঞ্জিডিন (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) বা নাইট্রোব্লু টেট্রাজোলিয়াম (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) ব্যবহার করে নির্ণয় করা হয়েছিল, যা Romero-Puertas et al. (2004) এবং Adam et al. (1989) দ্বারা বর্ণিত পদ্ধতি অনুসরণ করে সামান্য পরিবর্তন সহ করা হয়েছিল। ইন সিটুতে H2O2-এর হিস্টোকেমিক্যাল অবস্থান নির্ণয়ের জন্য, লিফলেটগুলোকে ১০ mM ট্রিস বাফারে (pH ৭.৮) ০.১% DAB দিয়ে ভ্যাকুয়াম ইনফিলট্রেট করা হয়েছিল এবং তারপর ৬০ মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় আলোতে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। লিফলেটগুলোকে ৪:১ (v/v) ইথানল:ক্লোরোফর্মে (আল-গমহুরিয়া ফার্মাসিউটিক্যালস অ্যান্ড মেডিকেল সাপ্লাইস, কায়রো, মিশর) ০.১৫% (v/v) TCA দিয়ে ব্লিচ করা হয়েছিল এবং তারপর গাঢ় না হওয়া পর্যন্ত আলোতে রাখা হয়েছিল। একইভাবে, ইন সিটুতে O2•−-এর হিস্টোকেমিক্যাল অবস্থান নির্ণয়ের জন্য, কপাটিকাগুলোকে ০.১ w/v % HBT যুক্ত ১০ mM পটাশিয়াম ফসফেট বাফার (pH ৭.৮) দিয়ে ভ্যাকুয়াম ইনফিলট্রেট করা হয়েছিল। লিফলেটগুলোকে ২০ মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় আলোতে ইনকিউবেট করা হয়েছিল, তারপর পূর্বের ন্যায় ব্লিচ করা হয়েছিল এবং তারপর গাঢ় নীল/বেগুনি দাগ না দেখা যাওয়া পর্যন্ত আলোকিত করা হয়েছিল। ফলস্বরূপ সৃষ্ট বাদামী (H2O2 নির্দেশক হিসেবে) অথবা নীল-বেগুনি (O2•− নির্দেশক হিসেবে) রঙের তীব্রতা, ইমেজ প্রসেসিং প্যাকেজ ImageJ-এর ফিজি সংস্করণ (http://fiji.sc; সংগ্রহের তারিখ ৭ মার্চ ২০২৪) ব্যবহার করে মূল্যায়ন করা হয়েছিল।
ডু এবং ব্রামলেজ (১৯৯২)-এর পদ্ধতিতে সামান্য পরিবর্তনসহ ম্যালনডাইঅ্যালডিহাইড (এমডিএ; লিপিড পারঅক্সিডেশনের নির্দেশক হিসেবে) নির্ণয় করা হয়েছিল। প্রতিটি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেট থেকে চিকিৎসার ৭২ ঘণ্টা পর (hpt) পাতা (উপর থেকে দ্বিতীয় এবং তৃতীয় সম্পূর্ণ বিকশিত পাতা) সংগ্রহ করা হয়েছিল। প্রতিটি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেটে পাঁচটি টব ছিল (প্রতি টবে দুটি গাছ)। পদ্ধতির নির্ভুলতা, নির্ভরযোগ্যতা এবং পুনরুৎপাদনযোগ্যতা নিশ্চিত করার জন্য প্রতিটি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেট দ্বৈতভাবে (দুটি টেকনিক্যাল রেপ্লিকেট) বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, ০.৫ গ্রাম গুঁড়ো করা পাতার টিস্যু থেকে এমডিএ নিষ্কাশনের জন্য ২০% ট্রাইক্লোরোঅ্যাসিটিক অ্যাসিড (টিসিএ; মিলিপোরসিগমা, বার্লিংটন, এমএ, ইউএসএ) ব্যবহার করা হয়েছিল, যাতে ০.০১% বিউটাইলেটেড হাইড্রোক্সিটলুইন (বিএইচটি; সিগমা-অলড্রিচ, সেন্ট লুইস, এমও, ইউএসএ) মেশানো ছিল। এরপর একটি UV-160A স্পেকট্রোফটোমিটার (শিমাজু কর্পোরেশন, জাপান) ব্যবহার করে ৫৩২ এবং ৬০০ nm-এ শোষণমাত্রা পরিমাপের মাধ্যমে সুপারন্যাট্যান্টে থাকা MDA-এর পরিমাণ বর্ণমিতিকভাবে নির্ণয় করা হয় এবং এটিকে nmol g−1 FW এককে প্রকাশ করা হয়।
নন-এনজাইমেটিক এবং এনজাইমেটিক অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট মূল্যায়নের জন্য, চিকিৎসার ৭২ ঘন্টা পরে (hpt) প্রতিটি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেট থেকে পাতা (উপর থেকে দ্বিতীয় এবং তৃতীয় সম্পূর্ণ বিকশিত পাতা) সংগ্রহ করা হয়েছিল। প্রতিটি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেট পাঁচটি টব নিয়ে গঠিত ছিল (প্রতি টবে দুটি গাছ)। প্রতিটি বায়োলজিক্যাল নমুনা দ্বৈতভাবে (দুটি টেকনিক্যাল নমুনা) বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। দুটি পাতা তরল নাইট্রোজেন দিয়ে গুঁড়ো করে এনজাইমেটিক ও নন-এনজাইমেটিক অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট, মোট অ্যামিনো অ্যাসিড, প্রোলিনের পরিমাণ, জিন এক্সপ্রেশন এবং অক্সালেটের পরিমাণ নির্ধারণের জন্য সরাসরি ব্যবহার করা হয়েছিল।
কাহকোনেন এট আল. (১৯৯৯) দ্বারা বর্ণিত পদ্ধতির সামান্য পরিবর্তন সহ ফলিন-সিওকালটিউ রিএজেন্ট (সিগমা-অলড্রিচ, সেন্ট লুইস, এমও, ইউএসএ) ব্যবহার করে মোট দ্রবণীয় ফেনোলিকস নির্ধারণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, প্রায় ০.১ গ্রাম সমজাতীয় পাতার টিস্যু ২০ মিলি ৮০% মিথানল দিয়ে অন্ধকারে ২৪ ঘন্টা ধরে নিষ্কাশন করা হয়েছিল এবং সেন্ট্রিফিউগেশনের পর সুপারন্যাট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল। নমুনা নিষ্কাশনের ০.১ মিলি ০.৫ মিলি ফলিন-সিওকালটিউ রিএজেন্ট (১০%) এর সাথে মিশ্রিত করে ৩০ সেকেন্ড ঝাঁকানো হয়েছিল এবং ৫ মিনিটের জন্য অন্ধকারে রেখে দেওয়া হয়েছিল। তারপর প্রতিটি টিউবে ০.৫ মিলি ২০% সোডিয়াম কার্বনেট দ্রবণ (Na2CO3; আল-গমহুরিয়া ফার্মাসিউটিক্যালস অ্যান্ড মেডিকেল সাপ্লাইস কোম্পানি, কায়রো, মিশর) যোগ করে ভালোভাবে মেশানো হয়েছিল এবং ঘরের তাপমাত্রায় অন্ধকারে ১ ঘন্টা ইনকিউবেট করা হয়েছিল। ইনকিউবেশনের পর, একটি UV-160A স্পেকট্রোফটোমিটার (শিমাজু কর্পোরেশন, জাপান) ব্যবহার করে ৭৬৫ nm-এ বিক্রিয়া মিশ্রণের শোষণমাত্রা পরিমাপ করা হয়েছিল। নমুনা নির্যাসগুলিতে মোট দ্রবণীয় ফেনলের ঘনত্ব একটি গ্যালিক অ্যাসিড ক্যালিব্রেশন কার্ভ (ফিশার সায়েন্টিফিক, হ্যাম্পটন, এনএইচ, ইউএসএ) ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল এবং প্রতি গ্রাম তাজা ওজনে মিলিগ্রাম গ্যালিক অ্যাসিড সমতুল্য (mg GAE g-1 fresh weight) হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছিল।
জেরিডান এট আল. (২০০৬)-এর পদ্ধতি অনুসারে, সামান্য পরিবর্তনসহ মোট দ্রবণীয় ফ্ল্যাভোনয়েডের পরিমাণ নির্ণয় করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, উপরোক্ত মিথানল নির্যাসের ০.৩ মিলি-এর সাথে ৫% অ্যালুমিনিয়াম ক্লোরাইড দ্রবণের (AlCl3; ফিশার সায়েন্টিফিক, হ্যাম্পটন, এনএইচ, ইউএসএ) ০.৩ মিলি মেশানো হয়, ভালোভাবে নাড়ানো হয় এবং তারপর ঘরের তাপমাত্রায় ৫ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়। এরপরে ১০% পটাশিয়াম অ্যাসিটেট দ্রবণের (আল-গমহুরিয়া ফার্মাসিউটিক্যালস অ্যান্ড মেডিকেল সাপ্লাইস, কায়রো, মিশর) ০.৩ মিলি যোগ করে ভালোভাবে মেশানো হয় এবং ঘরের তাপমাত্রায় অন্ধকারে ৩০ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়। ইনকিউবেশনের পরে, একটি ইউভি-১৬০এ স্পেকট্রোফটোমিটার (শিমাজু কর্পোরেশন, জাপান) ব্যবহার করে বিক্রিয়া মিশ্রণের শোষণ ক্ষমতা ৪৩০ এনএম-এ পরিমাপ করা হয়েছিল। নমুনা নির্যাসে মোট দ্রবণীয় ফ্ল্যাভোনয়েডের ঘনত্ব একটি রুটিন ক্যালিব্রেশন কার্ভ (টিসিআই আমেরিকা, পোর্টল্যান্ড, ওআর, ইউএসএ) ব্যবহার করে নির্ণয় করা হয়েছিল এবং তারপরে প্রতি গ্রাম তাজা ওজনে রুটিন সমতুল্য মিলিগ্রাম (mg RE g-1 fresh weight) হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছিল।
ইয়োকোয়ামা ও হিরামাৎসু (২০০৩) কর্তৃক প্রস্তাবিত এবং সান এট আল. (২০০৬) কর্তৃক সংশোধিত পদ্ধতির উপর ভিত্তি করে একটি পরিবর্তিত নিনহাইড্রিন রিএজেন্ট (থার্মো সায়েন্টিফিক কেমিক্যালস, ওয়ালথাম, এমএ, ইউএসএ) ব্যবহার করে শিম পাতার মোট মুক্ত অ্যামিনো অ্যাসিডের পরিমাণ নির্ণয় করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, ০.১ গ্রাম চূর্ণিত টিস্যু পিএইচ ৫.৪ বাফার দিয়ে নিষ্কাশন করা হয়েছিল, এবং ২০০ μL সুপারন্যাট্যান্টের সাথে ২০০ μL নিনহাইড্রিন (২%) এবং ২০০ μL পাইরিডিন (১০%; স্পেকট্রাম কেমিক্যাল, নিউ ব্রান্সউইক, এনজে, ইউএসএ) মিশিয়ে ৩০ মিনিটের জন্য ফুটন্ত জলের স্নানে ইনকিউবেট করা হয়েছিল, তারপর ঠান্ডা করে একটি ইউভি-১৬০এ স্পেকট্রোফটোমিটার (শিমাজু কর্পোরেশন, জাপান) ব্যবহার করে ৫৮০ nm-এ পরিমাপ করা হয়েছিল। অন্যদিকে, প্রোলিন বেটস পদ্ধতি (বেটস এট আল., ১৯৭৩) দ্বারা নির্ণয় করা হয়েছিল। ৩% সালফোসালিসাইলিক অ্যাসিড (থার্মো সায়েন্টিফিক কেমিক্যালস, ওয়ালথাম, এমএ, ইউএসএ) দিয়ে প্রোলিন নিষ্কাশন করা হয়েছিল এবং সেন্ট্রিফিউগেশনের পর, ০.৫ মিলি সুপারন্যাট্যান্টের সাথে ১ মিলি গ্লেসিয়াল অ্যাসিটিক অ্যাসিড (ফিশার সায়েন্টিফিক, হ্যাম্পটন, এনএইচ, ইউএসএ) এবং নিনহাইড্রিন রিএজেন্ট মিশিয়ে ৯০°C তাপমাত্রায় ৪৫ মিনিট ইনকিউবেট করা হয়, এরপর ঠান্ডা করে পূর্বের উল্লিখিত একই স্পেকট্রোফটোমিটার ব্যবহার করে ৫২০ nm-এ পরিমাপ করা হয়। পাতার নির্যাসে মোট মুক্ত অ্যামিনো অ্যাসিড এবং প্রোলিন যথাক্রমে গ্লাইসিন এবং প্রোলিন ক্যালিব্রেশন কার্ভ (সিগমা-অলড্রিচ, সেন্ট লুইস, এমও, ইউএসএ) ব্যবহার করে নির্ণয় করা হয়েছিল এবং প্রতি গ্রাম তাজা ওজনে মিলিগ্রাম (mg/g) হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছিল।
অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট এনজাইমের এনজাইমেটিক কার্যকলাপ নির্ধারণ করার জন্য, প্রায় ৫০০ মিলিগ্রাম হোমোজেনাইজড টিস্যুকে ৩ মিলি ৫০ mM ট্রিস বাফার (pH ৭.৮) দিয়ে নিষ্কাশন করা হয়েছিল, যাতে ১ mM EDTA-Na2 (সিগমা-অলড্রিচ, সেন্ট লুইস, এমও, ইউএসএ) এবং ৭.৫% পলিভিনাইলপাইরোলিডোন (PVP; সিগমা-অলড্রিচ, সেন্ট লুইস, এমও, ইউএসএ) ছিল। এরপর এটিকে রেফ্রিজারেশনে (৪ °C) রেখে ২০ মিনিটের জন্য ১০,০০০ × g গতিতে সেন্ট্রিফিউজ করা হয় এবং সুপারন্যাট্যান্ট (অপরিশোধিত এনজাইম নির্যাস) সংগ্রহ করা হয় (এল-নাগার এট আল., ২০২৩; ওসমান এট আল., ২০২৩)। Aebi (1984)-এর পদ্ধতি অনুসারে সামান্য পরিবর্তনসহ (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) ক্যাটালেজ (CAT)-এর এনজাইমেটিক সক্রিয়তা নির্ধারণ করার জন্য, এটিকে 2 ml 0.1 M সোডিয়াম ফসফেট বাফার (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) এবং 100 μl 269 mM H2O2 দ্রবণের সাথে বিক্রিয়া করানো হয়। Harrach et al. (2009)-এর পদ্ধতি ব্যবহার করে গুয়াইয়াকল-নির্ভর পারঅক্সিডেজ (POX)-এর এনজাইমেটিক সক্রিয়তা নির্ধারণ করা হয়েছিল। (২০০৮) সামান্য পরিবর্তনসহ (এল-নাগার এট আল., ২০২৩; ওসমান এট আল., ২০২৩) এবং ২.২ মিলি ১০০ mM সোডিয়াম ফসফেট বাফার (pH ৬.০), ১০০ μl গুয়াইকোল (টিসিআই কেমিক্যালস, পোর্টল্যান্ড, ওআর, ইউএসএ) এবং ১০০ μl ১২ mM H2O2-এর সাথে বিক্রিয়ার পর পলিফেনল অক্সিডেজ (PPO)-এর এনজাইমেটিক সক্রিয়তা নির্ণয় করা হয়েছিল। পদ্ধতিটি (এল-নাগার এট আল., ২০২৩; ওসমান এট আল., ২০২৩) থেকে সামান্য পরিবর্তিত করা হয়েছিল। ০.১ M ফসফেট বাফারে (pH ৬.০) সদ্য প্রস্তুতকৃত ৩ মিলি ক্যাটেকোল দ্রবণ (থার্মো সায়েন্টিফিক কেমিক্যালস, ওয়ালথাম, এমএ, ইউএসএ) (০.০১ M)-এর সাথে বিক্রিয়ার পর এই অ্যাসেটি সম্পন্ন করা হয়েছিল। একটি UV-160A স্পেকট্রোফটোমিটার (শিমাজু, জাপান) ব্যবহার করে ৩ মিনিট ধরে প্রতি ৩০ সেকেন্ডে CAT-এর সক্রিয়তা পরিমাপ করা হয়েছিল 240 nm (A240)-এ H2O2-এর বিয়োজন পর্যবেক্ষণ করে, POX-এর সক্রিয়তা পরিমাপ করা হয়েছিল 436 nm (A436)-এ শোষণের বৃদ্ধি পর্যবেক্ষণ করে এবং PPO-এর সক্রিয়তা পরিমাপ করা হয়েছিল 495 nm (A495)-এ শোষণের ওঠানামা রেকর্ড করে।
শেষ ট্রিটমেন্টের ৭২ ঘণ্টা পর শিম গাছের পাতায় (উপর থেকে দ্বিতীয় ও তৃতীয় সম্পূর্ণ বিকশিত পাতা) পেরোক্সিসোমাল ক্যাটারেজ (PvCAT1; জেনব্যাঙ্ক অ্যাকসেশন নং KF033307.1), সুপারঅক্সাইড ডিসমিউটেজ (PvSOD; জেনব্যাঙ্ক অ্যাকসেশন নং XM_068639556.1), এবং গ্লুটাথায়ন রিডাক্টেজ (PvGR; জেনব্যাঙ্ক অ্যাকসেশন নং KY195009.1) সহ তিনটি অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট-সম্পর্কিত জিনের ট্রান্সক্রিপ্ট লেভেল শনাক্ত করার জন্য রিয়েল-টাইম RT-PCR ব্যবহার করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুযায়ী সিম্পলি পি টোটাল আরএনএ এক্সট্র্যাকশন কিট (ক্যাট. নং BSC52S1; বায়োফ্লাক্স, বায়োরি টেকনোলজি, চীন) ব্যবহার করে আরএনএ পৃথক করা হয়েছিল। তারপর, প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুযায়ী টপ স্ক্রিপ্ট™ সিডিএনএ সিন্থেসিস কিট ব্যবহার করে সিডিএনএ সংশ্লেষণ করা হয়েছিল। উপরোক্ত তিনটি জিনের প্রাইমার সিকোয়েন্স সাপ্লিমেন্টারি টেবিল S3-তে তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। PvActin-3 (GenBank অ্যাকসেশন নম্বর: XM_068616709.1)-কে হাউসকিপিং জিন হিসেবে ব্যবহার করা হয়েছিল এবং 2-ΔΔCT পদ্ধতি (Livak and Schmittgen, 2001) ব্যবহার করে আপেক্ষিক জিন এক্সপ্রেশন গণনা করা হয়েছিল। জৈবিক চাপ (সাধারণ শিম জাতীয় উদ্ভিদ এবং অ্যানথ্রাকনোজ ছত্রাক Colletotrichum lindemuthianum-এর মধ্যে অসামঞ্জস্যপূর্ণ মিথস্ক্রিয়া) এবং অজৈবিক চাপের (খরা, লবণাক্ততা, নিম্ন তাপমাত্রা) অধীনে অ্যাক্টিনের স্থিতিশীলতা প্রদর্শন করা হয়েছিল (Borges et al., 2012)।
আমরা প্রাথমিকভাবে প্রোটিন-প্রোটিন ব্লাস্ট টুল (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) ব্যবহার করে S. sclerotiorum-এ অক্সালোঅ্যাসিটেট অ্যাসিটাইলহাইড্রোলেজ (OAH) প্রোটিনের একটি জিনোম-ব্যাপী ইন সিলিকো বিশ্লেষণ সম্পন্ন করেছি। সংক্ষেপে, আমরা S. sclerotiorum (ট্যাক্সাইড: 5180)-এ সমজাতীয় প্রোটিনটির ম্যাপিং করার জন্য কোয়েরি সিকোয়েন্স হিসেবে Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; ট্যাক্সাইড: 1191702; জেনব্যাঙ্ক অ্যাকসেশন নম্বর XP_040799428.1; 342 অ্যামিনো অ্যাসিড) এবং Penicillium lagena (PlOAH; ট্যাক্সাইড: 94218; জেনব্যাঙ্ক অ্যাকসেশন নম্বর XP_056833920.1; 316 অ্যামিনো অ্যাসিড) থেকে প্রাপ্ত OAH ব্যবহার করেছি। ন্যাশনাল সেন্টার ফর বায়োটেকনোলজি ইনফরমেশন (NCBI)-এর ওয়েবসাইট, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/-এ অবস্থিত জেনব্যাঙ্ক-এর সর্বসম্প্রতি উপলব্ধ S. sclerotiorum জিনোম ডেটার উপর BLASTp প্রয়োগ করা হয়েছিল।
এছাড়াও, MEGA11 (Tamura et al., 2021)-এ ম্যাক্সিমাম লাইকলিহুড পদ্ধতি এবং JTT ম্যাট্রিক্স-ভিত্তিক মডেল (Jones et al., 1992) ব্যবহার করে S. sclerotiorum থেকে পূর্বাভাসিত OAH জিন (SsOAH) এবং A. fijiensis CBS 313.89 থেকে AfOAH ও P. lagena থেকে PlOAH-এর বিবর্তনীয় বিশ্লেষণ ও ফাইলোজেনেটিক ট্রি অনুমান করা হয়েছিল। Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos and Agarwala, 2007) ব্যবহার করে ফাইলোজেনেটিক ট্রি-টিকে S. sclerotiorum থেকে সমস্ত পূর্বাভাসিত OAH জিন (SsOAH) এবং কোয়েরি সিকোয়েন্সের প্রোটিন সিকোয়েন্সের মাল্টিপল অ্যালাইনমেন্ট বিশ্লেষণের সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল। এছাড়াও, S. sclerotiorum থেকে প্রাপ্ত SsOAH-এর সেরা মিলে যাওয়া অ্যামিনো অ্যাসিড সিকোয়েন্সগুলোকে ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) ব্যবহার করে কোয়েরি সিকোয়েন্সগুলোর (AfOAH এবং PlOAH) (Larkin et al., 2007) সাথে অ্যালাইন করা হয়েছিল, এবং অ্যালাইনমেন্টের সংরক্ষিত অঞ্চলগুলোকে ESPript টুল (সংস্করণ 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) ব্যবহার করে দৃশ্যমান করা হয়েছিল।
অধিকন্তু, S. sclerotiorum SsOAH-এর পূর্বাভাসিত কার্যকরী প্রতিনিধি ডোমেইন এবং সংরক্ষিত স্থানসমূহকে InterPro টুল (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021) ব্যবহার করে ইন্টারেক্টিভভাবে বিভিন্ন পরিবারে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল। পরিশেষে, Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 সার্ভার সংস্করণ 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) ব্যবহার করে পূর্বাভাসিত S. sclerotiorum SsOAH-এর ত্রিমাত্রিক (3D) গঠন মডেলিং করা হয়েছিল এবং SWISS-MODEL সার্ভার (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014) ব্যবহার করে এর বৈধতা যাচাই করা হয়েছিল। পূর্বাভাসিত ত্রিমাত্রিক কাঠামোসমূহ (PDB ফরম্যাট) UCSF-Chimera প্যাকেজ (সংস্করণ 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004) ব্যবহার করে ইন্টারেক্টিভভাবে দৃশ্যমান করা হয়েছিল।
Sclerotinia sclerotiorum-এর মাইসেলিয়ায় অক্সালোঅ্যাসিটেট অ্যাসিটাইলহাইড্রোলেজ (SsOAH; জেনব্যাঙ্ক অ্যাকসেশন নম্বর: XM_001590428.1)-এর ট্রান্সক্রিপশনাল লেভেল নির্ধারণ করার জন্য কোয়ান্টিটেটিভ রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্স পিসিআর (Quantitative real-time fluorescence PCR) ব্যবহার করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, মাইসেলিয়ার বৃদ্ধি উদ্দীপিত করার জন্য S. sclerotiorum-কে PDB যুক্ত একটি ফ্লাস্কে ইনোকুলেট করা হয় এবং একটি শেকিং ইনকিউবেটরে (মডেল: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ২৫ ± ২ °C তাপমাত্রায় ১৫০ rpm গতিতে ২৪ ঘণ্টা এবং অবিরাম অন্ধকারে রাখা হয়। এরপরে, কোষগুলোকে L-অরনিথিন এবং ছত্রাকনাশক Rizolex-T দ্বারা চূড়ান্ত IC50 ঘনত্বে (যথাক্রমে প্রায় ৪০ এবং ৩.২ মিলিগ্রাম/লিটার) ট্রিট করা হয় এবং তারপর একই পরিস্থিতিতে আরও ২৪ ঘণ্টা কালচার করা হয়। ইনকিউবেশনের পর, কালচারগুলোকে ২৫০০ আরপিএম গতিতে ৫ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয় এবং জিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণের জন্য সুপারন্যাট্যান্ট (ছত্রাকের মাইসেলিয়াম) সংগ্রহ করা হয়। একইভাবে, সংক্রমণের ০, ২৪, ৪৮, ৭২, ৯৬ এবং ১২০ ঘণ্টা পরে সেইসব সংক্রমিত উদ্ভিদ থেকে ছত্রাকের মাইসেলিয়াম সংগ্রহ করা হয়, যেগুলোর সংক্রমিত টিস্যুর পৃষ্ঠে সাদা ছত্রাক এবং তুলার মতো মাইসেলিয়াম তৈরি হয়েছিল। ছত্রাকের মাইসেলিয়াম থেকে আরএনএ নিষ্কাশন করা হয় এবং তারপর উপরে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে সিডিএনএ সংশ্লেষণ করা হয়। SsOAH-এর প্রাইমার সিকোয়েন্সগুলো সাপ্লিমেন্টারি টেবিল S3-তে তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। SsActin (জেনব্যাঙ্ক অ্যাকসেশন নম্বর: XM_001589919.1)-কে হাউসকিপিং জিন হিসেবে ব্যবহার করা হয় এবং ২-ΔΔCT পদ্ধতি (লিভাক ও শ্মিটগেন, ২০০১) ব্যবহার করে আপেক্ষিক জিন এক্সপ্রেশন গণনা করা হয়।
জু এবং ঝাং (২০০০)-এর পদ্ধতিতে সামান্য পরিবর্তন এনে পটেটো ডেক্সট্রোজ ব্রথ (PDB) এবং ছত্রাকঘটিত রোগজীবাণু স্ক্লেরোটিনিয়া স্ক্লেরোটিওরাম (Sclerotinia sclerotiorum) যুক্ত উদ্ভিদের নমুনায় অক্সালিক অ্যাসিড নির্ণয় করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, S. sclerotiorum আইসোলেটগুলিকে PDB যুক্ত ফ্লাস্কে ইনোকুলেট করা হয়েছিল এবং তারপর মাইসেলিয়ামের বৃদ্ধি উদ্দীপিত করার জন্য একটি শেকিং ইনকিউবেটরে (মডেল I2400, নিউ ব্রান্সউইক সায়েন্টিফিক কোং, এডিসন, এনজে, ইউএসএ) ১৫০ rpm গতিতে ২৫ ± ২ °C তাপমাত্রায় ৩-৫ দিন ধরে অবিরাম অন্ধকারে (২৪ ঘণ্টা) কালচার করা হয়েছিল। ইনকিউবেশনের পর, ছত্রাকের কালচারটিকে প্রথমে হোয়াটম্যান #১ ফিল্টার পেপারের মাধ্যমে ফিল্টার করা হয়েছিল এবং তারপর অবশিষ্ট মাইসেলিয়াম অপসারণের জন্য ২৫০০ rpm গতিতে ৫ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। সুপারন্যাট্যান্ট সংগ্রহ করে অক্সালেটের পরবর্তী পরিমাণগত নির্ণয়ের জন্য ৪°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল। উদ্ভিদ নমুনা প্রস্তুত করার জন্য, প্রায় ০.১ গ্রাম উদ্ভিদ কলার খণ্ডাংশ পাতিত জল (প্রতিবার ২ মিলি) দিয়ে তিনবার নিষ্কাশন করা হয়েছিল। এরপর নমুনাগুলোকে ২৫০০ আরপিএম গতিতে ৫ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়, উপরিভাগের তরল অংশটি হোয়াটম্যান নং ১ ফিল্টার পেপারের মাধ্যমে শুষ্কভাবে ছেঁকে পরবর্তী বিশ্লেষণের জন্য সংগ্রহ করা হয়।
অক্সালিক অ্যাসিডের পরিমাণগত বিশ্লেষণের জন্য, একটি কাঁচের ছিপিযুক্ত টিউবে নিম্নলিখিত ক্রমে বিক্রিয়া মিশ্রণটি প্রস্তুত করা হয়েছিল: ০.২ মিলি নমুনা (অথবা পিডিবি কালচার ফিলট্রেট বা অক্সালিক অ্যাসিড স্ট্যান্ডার্ড দ্রবণ), ০.১১ মিলি ব্রোমোফেনল ব্লু (বিপিবি, ১ এমএম; ফিশার কেমিক্যাল, পিটসবার্গ, পিএ, ইউএসএ), ০.১৯৮ মিলি ১ এম সালফিউরিক অ্যাসিড (H2SO4; আল-গমহুরিয়া ফার্মাসিউটিক্যালস অ্যান্ড মেডিকেল সাপ্লাইস, কায়রো, মিশর) এবং ০.১৭৬ মিলি ১০০ এমএম পটাশিয়াম ডাইক্রোমেট (K2Cr2O7; টিসিআই কেমিক্যালস, পোর্টল্যান্ড, ওআর, ইউএসএ)। এরপর দ্রবণটিকে পাতিত জল দিয়ে ৪.৮ মিলি পর্যন্ত লঘু করে, ভালোভাবে মেশানো হয় এবং অবিলম্বে একটি ৬০ ডিগ্রি সেলসিয়াস ওয়াটার বাথে রাখা হয়। ১০ মিনিট পর, ০.৫ মিলি সোডিয়াম হাইড্রোক্সাইড দ্রবণ (NaOH; ০.৭৫ এম) যোগ করে বিক্রিয়াটি বন্ধ করা হয়। একটি ইউভি-১৬০ স্পেকট্রোফটোমিটার (শিমাজু কর্পোরেশন, জাপান) ব্যবহার করে বিক্রিয়া মিশ্রণের শোষণমাত্রা (A600) ৬০০ nm-এ পরিমাপ করা হয়েছিল। কালচার ফিলট্রেট এবং উদ্ভিদের নমুনার পরিমাণ নির্ণয়ের জন্য যথাক্রমে পিডিবি এবং পাতিত জলকে কন্ট্রোল হিসেবে ব্যবহার করা হয়েছিল। কালচার ফিলট্রেটে অক্সালিক অ্যাসিডের ঘনত্ব, যা প্রতি মিলিলিটার পিডিবি মিডিয়ামে মাইক্রোগ্রাম অক্সালিক অ্যাসিড (μg.mL−1) হিসেবে প্রকাশ করা হয়েছে, এবং পাতার নির্যাসে এর ঘনত্ব, যা প্রতি গ্রাম তাজা ওজনে মাইক্রোগ্রাম অক্সালিক অ্যাসিড (μg.g−1 FW) হিসেবে প্রকাশ করা হয়েছে, তা একটি অক্সালিক অ্যাসিড ক্যালিব্রেশন কার্ভ (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক কেমিক্যালস, ওয়ালথাম, এমএ, ইউএসএ) ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল।
গবেষণা চলাকালীন, অন্যথা উল্লেখ না থাকলে, সমস্ত পরীক্ষা একটি সম্পূর্ণ এলোমেলো নকশায় (CRD) ডিজাইন করা হয়েছিল, যেখানে প্রতিটি ট্রিটমেন্টের জন্য ছয়টি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেট এবং প্রতিটি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেটে পাঁচটি পাত্র (প্রতি পাত্রে দুটি গাছ) ছিল। বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেটগুলো দ্বৈতভাবে (দুটি টেকনিক্যাল রেপ্লিকেট) বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। একই পরীক্ষার পুনরুৎপাদনযোগ্যতা যাচাই করার জন্য টেকনিক্যাল রেপ্লিকেটগুলো ব্যবহার করা হয়েছিল, কিন্তু অপ্রয়োজনীয় রেপ্লিকেট এড়ানোর জন্য পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণে এগুলো ব্যবহার করা হয়নি। ডেটা পরিসংখ্যানগতভাবে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল অ্যানালাইসিস অফ ভ্যারিয়েন্স (ANOVA) এবং তারপরে টুকেই-ক্র্যামার অনেস্টলি সিগনিফিক্যান্ট ডিফারেন্স (HSD) পরীক্ষা (p ≤ 0.05) ব্যবহার করে। ইন ভিট্রো পরীক্ষার জন্য, প্রোবিট মডেল ব্যবহার করে IC50 এবং IC99 মান গণনা করা হয়েছিল এবং ৯৫% কনফিডেন্স ইন্টারভ্যাল নির্ণয় করা হয়েছিল।
মিশরের এল ঘাবিয়া গভর্নরেটের বিভিন্ন সয়াবিন ক্ষেত থেকে মোট চারটি আইসোলেট সংগ্রহ করা হয়েছিল। পিডিএ মাধ্যমে, সমস্ত আইসোলেট ক্রিম-সাদা মাইসেলিয়াম তৈরি করে যা দ্রুত তুলার মতো সাদা (চিত্র ১এ) এবং তারপর স্ক্লেরোশিয়াম পর্যায়ে বেইজ বা বাদামী রঙে পরিণত হয়। স্ক্লেরোশিয়ামগুলো সাধারণত ঘন, কালো, গোলাকার বা অনিয়মিত আকারের হয়, ৫.২ থেকে ৭.৭ মিমি লম্বা এবং ৩.৪ থেকে ৫.৩ মিমি ব্যাসযুক্ত (চিত্র ১বি)। যদিও চারটি আইসোলেট ২৫ ± ২ °C তাপমাত্রায় ১০-১২ দিন ইনকিউবেশনের পর কালচার মিডিয়ামের কিনারায় স্ক্লেরোশিয়ার একটি প্রান্তিক বিন্যাস তৈরি করেছিল (চিত্র ১এ), তাদের মধ্যে প্রতি প্লেটে স্ক্লেরোশিয়ার সংখ্যা উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন ছিল (পি < ০.০০১), যার মধ্যে আইসোলেট ৩-এ সর্বাধিক সংখ্যক স্ক্লেরোশিয়াম ছিল (প্রতি প্লেটে ৩২.৩৩ ± ১.৫৩টি স্ক্লেরোশিয়াম; চিত্র ১সি)। একইভাবে, আইসোলেট #৩ অন্যান্য আইসোলেটের তুলনায় পিডিবি-তে বেশি অক্সালিক অ্যাসিড উৎপাদন করেছিল (৩.৩৩ ± ০.৪৯ μg.mL−1; চিত্র ১ডি)। আইসোলেট #৩ উদ্ভিদ রোগ সৃষ্টিকারী ছত্রাক Sclerotinia sclerotiorum-এর সাধারণ রূপগত এবং আণুবীক্ষণিক বৈশিষ্ট্য প্রদর্শন করেছিল। উদাহরণস্বরূপ, পিডিএ-তে, আইসোলেট #৩-এর কলোনিগুলো দ্রুত বৃদ্ধি পেয়েছিল, ক্রিম সাদা রঙের ছিল (চিত্র ১এ), এর উল্টো পিঠ ছিল বেইজ বা হালকা স্যামন হলুদ-বাদামী, এবং ২৫ ± ২°C তাপমাত্রায় ৯ সেমি ব্যাসের একটি প্লেটের পৃষ্ঠ সম্পূর্ণরূপে আবৃত করতে ৬-৭ দিন সময় লেগেছিল। উপরোক্ত রূপগত এবং আণুবীক্ষণিক বৈশিষ্ট্যের উপর ভিত্তি করে, আইসোলেট #৩-কে Sclerotinia sclerotiorum হিসাবে শনাক্ত করা হয়েছিল।
চিত্র ১. সাধারণ শিম জাতীয় ফসল থেকে প্রাপ্ত S. sclerotiorum আইসোলেটসমূহের বৈশিষ্ট্য এবং রোগ সৃষ্টিকারী ক্ষমতা। (A) PDA মাধ্যমে চারটি S. sclerotiorum আইসোলেটের মাইসেলিয়াল বৃদ্ধি, (B) চারটি S. sclerotiorum আইসোলেটের স্ক্লেরোশিয়া, (C) স্ক্লেরোশিয়ার সংখ্যা (প্রতি প্লেটে), (D) PDB মাধ্যমে অক্সালিক অ্যাসিড নিঃসরণ (μg.mL−1), এবং (E) গ্রিনহাউস পরিবেশে সংবেদনশীল বাণিজ্যিক শিম জাতীয় ফসলের জাত গিজা ৩-এর উপর চারটি S. sclerotiorum আইসোলেটের রোগের তীব্রতা (%). মানগুলো পাঁচটি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেটের (n = 5) গড় ± স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন (SD) নির্দেশ করে। ভিন্ন অক্ষরগুলো ট্রিটমেন্টগুলোর মধ্যে পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ পার্থক্য নির্দেশ করে (p < 0.05)। (F–H) আইসোলেট #৩ দ্বারা ইনোকুলেশনের ১০ দিন পর (dpi), যথাক্রমে মাটির উপরের কাণ্ড এবং শুঁটিতে সাদা ছত্রাকের সাধারণ লক্ষণ দেখা যায়। (I) সর্বোচ্চ সম্ভাব্যতা পদ্ধতি ব্যবহার করে S. sclerotiorum আইসোলেট #3-এর অভ্যন্তরীণ ট্রান্সক্রাইবড স্পেসার (ITS) অঞ্চলের বিবর্তনীয় বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং ন্যাশনাল সেন্টার ফর বায়োটেকনোলজি ইনফরমেশন (NCBI) ডাটাবেস (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) থেকে প্রাপ্ত 20টি রেফারেন্স আইসোলেট/স্ট্রেনের সাথে তুলনা করা হয়েছিল। ক্লাস্টারিং লাইনের উপরের সংখ্যাগুলি অঞ্চলের কভারেজ (%) নির্দেশ করে এবং ক্লাস্টারিং লাইনের নীচের সংখ্যাগুলি শাখার দৈর্ঘ্য নির্দেশ করে।
অধিকন্তু, রোগ সৃষ্টিকারী ক্ষমতা নিশ্চিত করার জন্য, প্রাপ্ত চারটি S. sclerotiorum আইসোলেটকে গ্রিনহাউস পরিবেশে সংবেদনশীল বাণিজ্যিক শিম জাত গিজা ৩-এ ইনোকুলেট করা হয়েছিল, যা কচ-এর স্বীকার্যের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ (চিত্র ১ই)। যদিও প্রাপ্ত সমস্ত ছত্রাক আইসোলেটই রোগ সৃষ্টিকারী ছিল এবং সবুজ শিম (জাত গিজা ৩)-কে সংক্রমিত করতে সক্ষম ছিল, যা ইনোকুলেশনের ১০ দিন পর (dpi) গাছের মাটির উপরের সমস্ত অংশে (চিত্র ১চ), বিশেষ করে কাণ্ডে (চিত্র ১ছ) এবং শুঁটিতে (চিত্র ১জ) সাদা ছাঁচের সাধারণ লক্ষণ সৃষ্টি করে, দুটি পৃথক পরীক্ষায় আইসোলেট ৩ ছিল সবচেয়ে আক্রমণাত্মক। শিম গাছে আইসোলেট ৩-এর রোগের তীব্রতা (%) ছিল সর্বোচ্চ (সংক্রমণের ৭, ১৪ এবং ২১ দিন পর যথাক্রমে ২৪.০ ± ৪.০, ৫৮.০ ± ২.০ এবং ৭৬.৭ ± ৩.১; চিত্র ১চ)।
ইন্টারনাল ট্রান্সক্রাইবড স্পেসার (ITS) সিকোয়েন্সিং-এর মাধ্যমে সবচেয়ে আক্রমণাত্মক S. sclerotiorum আইসোলেট #3-এর শনাক্তকরণ আরও নিশ্চিত করা হয়েছিল (চিত্র 1I)। আইসোলেট #3 এবং ২০টি রেফারেন্স আইসোলেট/স্ট্রেনের মধ্যে ফাইলোজেনেটিক বিশ্লেষণে তাদের মধ্যে উচ্চ সাদৃশ্য (>99%) দেখা গেছে। এটি উল্লেখযোগ্য যে S. sclerotiorum আইসোলেট #3 (533 bp)-এর সাথে শুকনো মটর বীজ থেকে বিচ্ছিন্ন আমেরিকান S. sclerotiorum আইসোলেট LPM36 (GenBank অ্যাকসেশন নম্বর MK896659.1; 540 bp) এবং ভায়োলেট (Matthiola incana) গাছের কাণ্ড পচা রোগ সৃষ্টিকারী চীনা S. sclerotiorum আইসোলেট YKY211 (GenBank অ্যাকসেশন নম্বর OR206374.1; 548 bp)-এর উচ্চ সাদৃশ্য রয়েছে, যাদের সবগুলোই ডেনড্রোগ্রামের শীর্ষে আলাদাভাবে দলবদ্ধ করা হয়েছে (চিত্র 1I)। নতুন সিকোয়েন্সটি এনসিবিআই (NCBI) ডেটাবেসে জমা করা হয়েছে এবং এর নামকরণ করা হয়েছে “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25” (জেনব্যাঙ্ক অ্যাকসেশন নম্বর PV202792)। দেখা যায় যে, আইসোলেট ৩ হলো সবচেয়ে বেশি আক্রমণাত্মক আইসোলেট; তাই, পরবর্তী সমস্ত পরীক্ষায় গবেষণার জন্য এই আইসোলেটটিকেই বেছে নেওয়া হয়েছিল।
ইন ভিট্রো পদ্ধতিতে S. sclerotiorum আইসোলেট ৩-এর বিরুদ্ধে বিভিন্ন ঘনমাত্রায় (১২.৫, ২৫, ৫০, ৭৫, ১০০ এবং ১২৫ মিগ্রা/লি) ডাইঅ্যামাইন এল-অরনিথিন (সিগমা-অলড্রিচ, ডার্মস্ট্যাড, জার্মানি)-এর ব্যাকটেরিয়ারোধী কার্যকারিতা পরীক্ষা করা হয়েছিল। এটি লক্ষণীয় যে, এল-অরনিথিন একটি ব্যাকটেরিয়ারোধী প্রভাব দেখিয়েছে এবং মাত্রা-নির্ভর পদ্ধতিতে ধীরে ধীরে S. sclerotiorum হাইফির ব্যাসার্ধ বরাবর বৃদ্ধিকে বাধা দিয়েছে (চিত্র ২এ, বি)। পরীক্ষিত সর্বোচ্চ ঘনমাত্রায় (১২৫ মিগ্রা/লি), এল-অরনিথিন মাইসেলিয়াল বৃদ্ধি রোধের সর্বোচ্চ হার (৯৯.৬২ ± ০.২৭%; চিত্র ২বি) প্রদর্শন করেছে, যা পরীক্ষিত সর্বোচ্চ ঘনমাত্রায় (১০ মিগ্রা/লি) বাণিজ্যিক ছত্রাকনাশক রিজোলেক্স-টি (রোধের হার ৯৯.৪৫ ± ০.৩৯%; চিত্র ২সি)-এর সমতুল্য ছিল, যা উভয়ের প্রায় একই রকম কার্যকারিতা নির্দেশ করে।
চিত্র ২. স্ক্লেরোটিনিয়া স্ক্লেরোটিওরাম-এর বিরুদ্ধে এল-অরনিথিন-এর ইন ভিট্রো ব্যাকটেরিয়ারোধী কার্যকারিতা। (ক) বাণিজ্যিক ছত্রাকনাশক রিজোলেক্স-টি (১০ মিগ্রা/লি)-এর সাথে এস. স্ক্লেরোটিওরাম-এর বিরুদ্ধে এল-অরনিথিন-এর বিভিন্ন ঘনত্বের ব্যাকটেরিয়ারোধী কার্যকারিতার তুলনা। (খ, গ) যথাক্রমে এল-অরনিথিন-এর বিভিন্ন ঘনত্ব (১২.৫, ২৫, ৫০, ৭৫, ১০০ এবং ১২৫ মিগ্রা/লি) বা রিজোলেক্স-টি (২, ৪, ৬, ৮ এবং ১০ মিগ্রা/লি) দ্বারা চিকিৎসার পর এস. স্ক্লেরোটিওরাম-এর মাইসেলিয়াল বৃদ্ধির বাধাদানের হার (%)। মানগুলো পাঁচটি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেটের (n = ৫) গড় ± এসডি (স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন) নির্দেশ করে। ভিন্ন অক্ষরগুলো চিকিৎসাগুলোর মধ্যে পরিসংখ্যানগত পার্থক্য নির্দেশ করে (p < ০.০৫)। (ঘ, ঙ) যথাক্রমে এল-অরনিথিন এবং বাণিজ্যিক ছত্রাকনাশক রিজোলেক্স-টি-এর প্রোবিট মডেল রিগ্রেশন বিশ্লেষণ। প্রোবিট মডেলের রিগ্রেশন লাইনটি একটি নিরেট নীল রেখা হিসাবে এবং কনফিডেন্স ইন্টারভাল (৯৫%) একটি ড্যাশযুক্ত লাল রেখা হিসাবে দেখানো হয়েছে।
এছাড়াও, প্রোবিট রিগ্রেশন বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং এর সংশ্লিষ্ট প্লটগুলো সারণি ১ এবং চিত্র ২ডি,ই-তে দেখানো হয়েছে। সংক্ষেপে, এল-অরনিথিনের গ্রহণযোগ্য ঢালের মান (y = 2.92x − 4.67) এবং এর সাথে সম্পর্কিত তাৎপর্যপূর্ণ পরিসংখ্যান (কক্স ও স্নেল R2 = 0.3709, নাগেলকার্কে R2 = 0.4998 এবং p < 0.0001; চিত্র ২ডি) বাণিজ্যিক ছত্রাকনাশক রিজোলেক্স-টি (y = 1.96x − 0.99, কক্স ও স্নেল R2 = 0.1242, নাগেলকার্কে R2 = 0.1708 এবং p < 0.0001) (সারণি ১)-এর তুলনায় এস. স্ক্লেরোটিওরামের বিরুদ্ধে এর উন্নততর ছত্রাক-বিরোধী কার্যকারিতা নির্দেশ করে।
সারণি ১. এস. স্ক্লেরোটিওরাম-এর বিরুদ্ধে এল-অর্নিথিন এবং বাণিজ্যিক ছত্রাকনাশক “রাইজোলেক্স-টি”-এর অর্ধ-সর্বোচ্চ প্রতিরোধক ঘনত্ব (IC50) এবং IC99 (mg/l)-এর মান।
সামগ্রিকভাবে, চিকিৎসাবিহীন S. sclerotiorum-আক্রান্ত গাছের (কন্ট্রোল; চিত্র 3A) তুলনায়, L-ornithine (250 mg/L) প্রয়োগকৃত শিম গাছে সাদা ছত্রাকের বিকাশ এবং তীব্রতা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করেছে। সংক্ষেপে, যদিও চিকিৎসাবিহীন আক্রান্ত কন্ট্রোল গাছগুলোর রোগের তীব্রতা ক্রমান্বয়ে বৃদ্ধি পেয়েছিল (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, এবং 92.33 ± 3.06%), L-ornithine পুরো পরীক্ষা জুড়ে রোগের তীব্রতা (%) উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করেছে (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, এবং 26.36 ± 3.07) যথাক্রমে চিকিৎসার ৭, ১৪, এবং ২১ দিন পরে (চিত্র 3A)। একইভাবে, যখন S. sclerotiorum-আক্রান্ত শিম গাছকে 250 mg/L L-ornithine দিয়ে শোধন করা হয়েছিল, তখন রোগের অগ্রগতি বক্ররেখার নিচের ক্ষেত্রফল (AUDPC) শোধনবিহীন নিয়ন্ত্রণের 1274.33 ± 33.13 থেকে কমে 281.03 ± 7.95 হয়েছিল, যা পজিটিভ কন্ট্রোল 50 mg/L Rizolex-T ছত্রাকনাশকের (183.61 ± 7.71; চিত্র 3B) চেয়ে সামান্য কম ছিল। দ্বিতীয় পরীক্ষায়ও একই প্রবণতা পরিলক্ষিত হয়েছিল।
চিত্র ৩. গ্রিনহাউস পরিবেশে স্ক্লেরোটিনিয়া স্ক্লেরোটিওরাম দ্বারা সৃষ্ট সাধারণ শিমের সাদা পচা রোগের বিকাশের উপর এল-অরনিথিনের বাহ্যিক প্রয়োগের প্রভাব। (ক) ২৫০ মিগ্রা/লিটার এল-অরনিথিন দিয়ে চিকিৎসার পর সাধারণ শিমের সাদা ছাঁচ রোগের অগ্রগতি রেখাচিত্র। (খ) এল-অরনিথিন দিয়ে চিকিৎসার পর সাধারণ শিমের সাদা ছাঁচ রোগের অগ্রগতি রেখাচিত্রের নিচের ক্ষেত্রফল (AUDPC)। মানগুলো পাঁচটি জৈবিক প্রতিলিপির (n = 5) গড় ± আদর্শ বিচ্যুতি (SD) নির্দেশ করে। ভিন্ন অক্ষরগুলো চিকিৎসাগুলোর মধ্যে পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ পার্থক্য নির্দেশ করে (p < 0.05)।
২৫০ মিলিগ্রাম/লিটার এল-অরনিথিনের বাহ্যিক প্রয়োগ ৪২ দিন পর গাছের উচ্চতা (চিত্র ৪ক), গাছপ্রতি শাখার সংখ্যা (চিত্র ৪খ), এবং গাছপ্রতি পাতার সংখ্যা (চিত্র ৪গ) ক্রমান্বয়ে বৃদ্ধি করেছে। যদিও পরীক্ষিত সমস্ত পুষ্টিগত প্যারামিটারের উপর বাণিজ্যিক ছত্রাকনাশক রিজোলেক্স-টি (৫০ মিলিগ্রাম/লিটার)-এর প্রভাব ছিল সর্বাধিক, তবে অপরিশোধিত নিয়ন্ত্রণের তুলনায় ২৫০ মিলিগ্রাম/লিটার এল-অরনিথিনের বাহ্যিক প্রয়োগের প্রভাব ছিল দ্বিতীয় সর্বাধিক (চিত্র ৪ক-গ)। অন্যদিকে, এল-অরনিথিন প্রয়োগ সালোকসংশ্লেষী রঞ্জক ক্লোরোফিল এ (চিত্র ৪ডি) এবং ক্লোরোফিল বি (চিত্র ৪ই)-এর পরিমাণে কোনো উল্লেখযোগ্য প্রভাব ফেলেনি, কিন্তু নেগেটিভ কন্ট্রোল (০.৪৪ ± ০.০২ মিগ্রা/গ্রাম তাজা ওজন) এবং পজিটিভ কন্ট্রোলের (০.৪৬ ± ০.০২ মিগ্রা/গ্রাম তাজা ওজন; চিত্র ৪এফ) তুলনায় মোট ক্যারোটিনয়েডের পরিমাণ (০.৫৬ ± ০.০৩ মিগ্রা/গ্রাম তাজা ওজন) সামান্য বৃদ্ধি করেছে। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলো ইঙ্গিত দেয় যে এল-অরনিথিন প্রয়োগকৃত শিম জাতীয় উদ্ভিদের জন্য বিষাক্ত নয় এবং এমনকি তাদের বৃদ্ধিকে উদ্দীপিত করতে পারে।
চিত্র ৪। গ্রিনহাউস পরিবেশে স্ক্লেরোটিনিয়া স্ক্লেরোটিওরাম দ্বারা আক্রান্ত শিম পাতার বৃদ্ধি বৈশিষ্ট্য এবং সালোকসংশ্লেষী রঞ্জক পদার্থের উপর বাহ্যিক এল-অরনিথিন প্রয়োগের প্রভাব। (ক) গাছের উচ্চতা (সেমি), (খ) প্রতি গাছে শাখার সংখ্যা, (গ) প্রতি গাছে পাতার সংখ্যা, (ঘ) ক্লোরোফিল ‘এ’ এর পরিমাণ (মিলিগ্রাম গ্রাম-১ তাজা ওজন), (ঙ) ক্লোরোফিল ‘বি’ এর পরিমাণ (মিলিগ্রাম গ্রাম-১ তাজা ওজন), (চ) মোট ক্যারোটিনয়েডের পরিমাণ (মিলিগ্রাম গ্রাম-১ তাজা ওজন)। মানগুলো পাঁচটি জৈবিক প্রতিলিপির (n = 5) গড় ± এসডি। ভিন্ন অক্ষরগুলো ট্রিটমেন্টগুলোর মধ্যে পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ পার্থক্য নির্দেশ করে (পি < ০.০৫)।
প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতি (ROS; হাইড্রোজেন পারক্সাইড [H2O2] হিসাবে প্রকাশিত) এবং মুক্ত মূলক (সুপারঅক্সাইড অ্যানায়ন [O2•−] হিসাবে প্রকাশিত)-এর ইন সিটু হিস্টোকেমিক্যাল স্থানীয়করণ থেকে দেখা যায় যে, এল-অর্নিথিন (২৫০ মিলিগ্রাম/লিটার) এর বাহ্যিক প্রয়োগ H2O2 (৯৬.০৫ ± ৫.৩৩ ন্যানোমোল.গ্রাম−১ তাজা ওজন; চিত্র ৫ক) এবং O2•− (৩২.৬৯ ± ৮.৫৬ ন্যানোমোল.গ্রাম−১ তাজা ওজন; চিত্র ৫খ)-এর সঞ্চয়নকে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করেছে। এই হ্রাস অপরিশোধিত সংক্রমিত উদ্ভিদ (যথাক্রমে ১৭৩.৩১ ± ১২.০৬ এবং ১৪৯.৩৫ ± ৭.৯৪ ন্যানোমোল.গ্রাম−১ তাজা ওজন) এবং ৫০ মিলিগ্রাম/লিটার বাণিজ্যিক ছত্রাকনাশক রিজোলেক্স-টি (১৭০.১২ ± ৯.৫০ এবং ১৫৭.০০) দ্বারা শোধিত উদ্ভিদের সঞ্চয়নের তুলনায় কম ছিল। ৭২ ঘণ্টায় যথাক্রমে ± ৭.৮১ ন্যানোমোল.গ্রাম−১ তাজা ওজন) পাওয়া যায়। উচ্চ তাপমাত্রার অধীনে উচ্চ মাত্রার H2O2 এবং O2•− জমা হয়েছিল (চিত্র ৫এ, বি)। একইভাবে, টিসিএ-ভিত্তিক ম্যালনডাইঅ্যালডিহাইড (এমডিএ) পরীক্ষায় দেখা গেছে যে এস. স্ক্লেরোটিওরাম-আক্রান্ত শিম গাছের পাতায় উচ্চ মাত্রার এমডিএ (১১৩.৪৮ ± ১০.০২ ন্যানোমোল.গ্রাম তাজা ওজন) জমা হয়েছিল (চিত্র ৫সি)। তবে, এল-অরনিথিনের বাহ্যিক প্রয়োগ লিপিড পারঅক্সিডেশন উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করে, যা পরীক্ষাধীন গাছগুলিতে এমডিএ-এর পরিমাণ হ্রাসের মাধ্যমে প্রমাণিত হয় (৩৩.০৮ ± ৪.০০ ন্যানোমোল.গ্রাম তাজা ওজন)।
চিত্র ৫। গ্রিনহাউস পরিবেশে সংক্রমণের ৭২ ঘণ্টা পর S. sclerotiorum দ্বারা আক্রান্ত শিম পাতায় জারণ পীড়নের প্রধান নির্দেশক এবং অ-এনজাইমীয় অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট প্রতিরক্ষা ব্যবস্থার উপর বাহ্যিক এল-অরনিথিন প্রয়োগের প্রভাব। (A) ৭২ ঘন্টা পর হাইড্রোজেন পারক্সাইড (H2O2; nmol g−1 FW), (B) ৭২ ঘন্টা পর সুপারঅক্সাইড অ্যানায়ন (O2•−; nmol g−1 FW), (C) ৭২ ঘন্টা পর ম্যালনডাইঅ্যালডিহাইড (MDA; nmol g−1 FW), (D) ৭২ ঘন্টা পর মোট দ্রবণীয় ফেনল (mg GAE g−1 FW), (E) ৭২ ঘন্টা পর মোট দ্রবণীয় ফ্ল্যাভোনয়েড (mg RE g−1 FW), (F) ৭২ ঘন্টা পর মোট মুক্ত অ্যামিনো অ্যাসিড (mg g−1 FW), এবং (G) ৭২ ঘন্টা পর প্রোলিনের পরিমাণ (mg g−1 FW)। মানগুলো ৫টি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেটের (n = 5) গড় ± স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন (গড় ± SD) নির্দেশ করে। ভিন্ন ভিন্ন অক্ষরগুলো ট্রিটমেন্টগুলোর মধ্যে পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ পার্থক্য নির্দেশ করে (p < 0.05)।