এই প্রবন্ধটি "রোগজীবাণু এবং কীটপতঙ্গের বিরুদ্ধে শিমের প্রতিরোধ ক্ষমতা উন্নত করা" গবেষণা বিষয়ের অংশ, ৫টি প্রবন্ধের সবকটি দেখুন।
ছত্রাকজনিত উদ্ভিদ রোগের নেক্রোসিস স্ক্লেরোটিনিয়া স্ক্লেরোটিওরাম (লিব.) ডি বেরি বিভিন্ন পোষক উদ্ভিদকে সংক্রামিত করার জন্য বহু-স্তরযুক্ত কৌশল ব্যবহার করে। এই গবেষণায় Pseudomonas sclerotiorum দ্বারা সৃষ্ট সাদা ছত্রাকের প্রতি Phaseolus vulgaris L. এর আণবিক, শারীরবৃত্তীয় এবং জৈব রাসায়নিক প্রতিক্রিয়া বৃদ্ধির জন্য বিকল্প ব্যবস্থাপনা কৌশল হিসেবে ডায়ামিন L-ornithine ব্যবহারের প্রস্তাব করা হয়েছে। ইন ভিট্রো পরীক্ষায় দেখা গেছে যে L-ornithine ডোজ-নির্ভর পদ্ধতিতে S. pyrenoidosa এর মাইসেলিয়াল বৃদ্ধিকে উল্লেখযোগ্যভাবে বাধা দেয়। অধিকন্তু, এটি গ্রিনহাউস পরিস্থিতিতে সাদা ছত্রাকের তীব্রতা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করতে পারে। অধিকন্তু, L-ornithine চিকিত্সা করা উদ্ভিদের বৃদ্ধিকে উদ্দীপিত করে, যা নির্দেশ করে যে L-ornithine এর পরীক্ষিত ঘনত্ব চিকিত্সা করা উদ্ভিদের জন্য ফাইটোটক্সিক ছিল না। এছাড়াও, L-অরনিথিন অ-এনজাইমেটিক অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট (সম্পূর্ণ দ্রবণীয় ফেনোলিক এবং ফ্ল্যাভোনয়েড) এবং এনজাইমেটিক অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট (ক্যাটালেস (CAT), পেরোক্সিডেস (POX), এবং পলিফেনল অক্সিডেস (PPO)) এর প্রকাশ বৃদ্ধি করে এবং তিনটি অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট-সম্পর্কিত জিনের (PvCAT1, PvSOD, এবং PvGR) প্রকাশ বৃদ্ধি করে। অধিকন্তু, সিলিকো বিশ্লেষণে S. স্ক্লেরোটিওরাম জিনোমে একটি পুটেটিভ অক্সালোএসেটেট অ্যাসিটাইলহাইড্রোলেজ (SsOAH) প্রোটিনের উপস্থিতি প্রকাশ পায়, যা কার্যকরী বিশ্লেষণ, সংরক্ষিত ডোমেন এবং টপোলজির দিক থেকে Aspergillus fijiensis (AfOAH) এবং Penicillium sp. (PlOAH) এর অক্সালোএসেটেট অ্যাসিটাইলহাইড্রোলেজ (SsOAH) প্রোটিনের সাথে অত্যন্ত মিল ছিল। মজার বিষয় হল, আলুর ডেক্সট্রোজ ব্রোথ (PDB) মাধ্যমের সাথে L-অরনিথিন যোগ করার ফলে S. স্ক্লেরোটিওরাম মাইসেলিয়ায় SsOAH জিনের প্রকাশ উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে। একইভাবে, L-অরনিথিনের বহিরাগত প্রয়োগের ফলে চিকিত্সা করা উদ্ভিদ থেকে সংগৃহীত ছত্রাকের মাইসেলিয়ায় SsOAH জিনের প্রকাশ উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে। পরিশেষে, L-অরনিথিন প্রয়োগের ফলে PDB মাঝারি এবং সংক্রামিত উভয় পাতাতেই অক্সালিক অ্যাসিড নিঃসরণ উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে। উপসংহারে, L-অরনিথিন রেডক্স অবস্থা বজায় রাখার পাশাপাশি সংক্রামিত উদ্ভিদের প্রতিরক্ষা প্রতিক্রিয়া বৃদ্ধিতে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। এই গবেষণার ফলাফল সাদা ছত্রাক নিয়ন্ত্রণ এবং শিম উৎপাদন এবং অন্যান্য ফসলের উপর এর প্রভাব হ্রাস করার জন্য উদ্ভাবনী, পরিবেশ বান্ধব পদ্ধতি বিকাশে সহায়তা করতে পারে।
সাদা ছত্রাক, যা নেক্রোট্রফিক ছত্রাক Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary দ্বারা সৃষ্ট, একটি ধ্বংসাত্মক, ফলন-হ্রাসকারী রোগ যা বিশ্বব্যাপী শিমের (Phaseolus vulgaris L.) উৎপাদনের জন্য একটি গুরুতর হুমকি তৈরি করে (Bolton et al., 2006)। Sclerotinia sclerotiorum হল মাটি-বাহিত ছত্রাকজনিত উদ্ভিদ রোগজীবাণুগুলির মধ্যে একটি যা নিয়ন্ত্রণ করা সবচেয়ে কঠিন, যার 600 টিরও বেশি উদ্ভিদ প্রজাতির বিস্তৃত পোষক পরিসর রয়েছে এবং অ-নির্দিষ্ট উপায়ে পোষক টিস্যুগুলিকে দ্রুত ম্যাসেরেট করার ক্ষমতা রয়েছে (Liang and Rollins, 2018)। প্রতিকূল পরিস্থিতিতে, এটি তার জীবনচক্রের একটি গুরুত্বপূর্ণ পর্যায়ের মধ্য দিয়ে যায়, মাটিতে 'sclerotia' নামক কালো, শক্ত, বীজের মতো কাঠামোর আকারে বা সংক্রামিত উদ্ভিদের মাইসেলিয়াম বা কাণ্ডের পিথে সাদা, তুলতুলে বৃদ্ধির আকারে দীর্ঘ সময় ধরে সুপ্ত থাকে (Schwartz et al., 2005)। S. sclerotiorum sclerotia তৈরি করতে সক্ষম, যার ফলে এটি দীর্ঘ সময় ধরে সংক্রামিত জমিতে বেঁচে থাকতে পারে এবং রোগের সময়ও টিকে থাকতে পারে (Schwartz et al., 2005)। Sclerotia পুষ্টিতে সমৃদ্ধ, দীর্ঘ সময় ধরে মাটিতে টিকে থাকতে পারে এবং পরবর্তী সংক্রমণের জন্য প্রাথমিক ইনোকুলাম হিসেবে কাজ করে (Schwartz et al., 2005)। অনুকূল পরিস্থিতিতে, sclerotia অঙ্কুরিত হয় এবং বায়ুবাহিত স্পোর তৈরি করে যা উদ্ভিদের উপরের সমস্ত অংশকে সংক্রামিত করতে পারে, যার মধ্যে ফুল, কাণ্ড বা শুঁটি অন্তর্ভুক্ত কিন্তু সীমাবদ্ধ নয় (Schwartz et al., 2005)।
স্ক্লেরোটিনিয়া স্ক্লেরোটিওরাম তার পোষক উদ্ভিদকে সংক্রামিত করার জন্য বহু-স্তরীয় কৌশল ব্যবহার করে, যার মধ্যে স্ক্লেরোটিয়াল অঙ্কুরোদগম থেকে লক্ষণ বিকাশ পর্যন্ত একাধিক সমন্বিত ঘটনা জড়িত। প্রাথমিকভাবে, এস. স্ক্লেরোটিওরাম অ্যাপোথেসিয়া নামক মাশরুমের মতো কাঠামো থেকে ঝুলন্ত স্পোর (যাকে অ্যাসকোস্পোর বলা হয়) তৈরি করে, যা বায়ুবাহিত হয়ে সংক্রামিত উদ্ভিদের ধ্বংসাবশেষে অ-গতিশীল স্ক্লেরোটিয়াতে পরিণত হয় (বোল্টন এট আল।, ২০০৬)। এরপর ছত্রাকটি উদ্ভিদের কোষ প্রাচীরের pH নিয়ন্ত্রণ করতে, এনজাইমেটিক অবক্ষয় এবং টিস্যু আক্রমণকে উৎসাহিত করতে (হেগেডাস এবং রিমার, ২০০৫) এবং পোষক উদ্ভিদের অক্সিডেটিভ বিস্ফোরণ দমন করতে অক্সালিক অ্যাসিড, একটি ভাইরুলেন্স ফ্যাক্টর নিঃসরণ করে। এই অ্যাসিডিফিকেশন প্রক্রিয়া উদ্ভিদের কোষ প্রাচীরকে দুর্বল করে, ছত্রাক কোষ প্রাচীরের অবক্ষয়কারী এনজাইমগুলির (CWDEs) স্বাভাবিক এবং দক্ষ ক্রিয়াকলাপের জন্য একটি অনুকূল পরিবেশ প্রদান করে, যার ফলে রোগজীবাণু শারীরিক বাধা অতিক্রম করে এবং পোষক টিস্যুতে প্রবেশ করতে পারে (মার্সিয়ানো এট আল।, ১৯৮৩)। একবার প্রবেশ করার পর, S. sclerotiorum পলিগ্যালাক্টুরোনেজ এবং সেলুলেজের মতো বেশ কিছু CWDE নিঃসরণ করে, যা সংক্রামিত টিস্যুতে এর বিস্তারকে সহজ করে এবং টিস্যু নেক্রোসিস সৃষ্টি করে। ক্ষত এবং হাইফাল ম্যাটের অগ্রগতি সাদা ছাঁচের বৈশিষ্ট্যগত লক্ষণগুলির দিকে পরিচালিত করে (Hegedus and Rimmer, 2005)। ইতিমধ্যে, পোষক উদ্ভিদ প্যাটার্ন রিকগনিশন রিসেপ্টর (PRR) এর মাধ্যমে প্যাথোজেন-সম্পর্কিত আণবিক প্যাটার্ন (PAMP) সনাক্ত করে, যা একের পর এক সংকেত ইভেন্টের সূত্রপাত করে যা শেষ পর্যন্ত প্রতিরক্ষা প্রতিক্রিয়া সক্রিয় করে।
রোগ নিয়ন্ত্রণের কয়েক দশকের প্রচেষ্টা সত্ত্বেও, অন্যান্য বাণিজ্যিক ফসলের মতো শিমেও পর্যাপ্ত প্রতিরোধী জার্মপ্লাজমের ঘাটতি রয়ে গেছে, কারণ রোগজীবাণুর প্রতিরোধ ক্ষমতা, বেঁচে থাকা এবং অভিযোজন ক্ষমতা বেশি। তাই রোগ ব্যবস্থাপনা অত্যন্ত চ্যালেঞ্জিং এবং এর জন্য একটি সমন্বিত, বহুমুখী কৌশল প্রয়োজন যার মধ্যে রয়েছে সাংস্কৃতিক অনুশীলন, জৈবিক নিয়ন্ত্রণ এবং রাসায়নিক ছত্রাকনাশকের সংমিশ্রণ (O'Sullivan et al., 2021)। সাদা ছত্রাকের রাসায়নিক নিয়ন্ত্রণ সবচেয়ে কার্যকর কারণ ছত্রাকনাশক, সঠিকভাবে এবং সঠিক সময়ে প্রয়োগ করা হলে, রোগের বিস্তার কার্যকরভাবে নিয়ন্ত্রণ করতে পারে, সংক্রমণের তীব্রতা কমাতে পারে এবং ফলনের ক্ষতি কমাতে পারে। তবে, ছত্রাকনাশকের উপর অতিরিক্ত ব্যবহার এবং অতিরিক্ত নির্ভরতা S. sclerotiorum এর প্রতিরোধী প্রজাতির উত্থানের দিকে পরিচালিত করতে পারে এবং লক্ষ্যবস্তুবিহীন জীব, মাটির স্বাস্থ্য এবং জলের গুণমানকে নেতিবাচকভাবে প্রভাবিত করতে পারে (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024)। অতএব, পরিবেশ বান্ধব বিকল্প খুঁজে বের করা একটি শীর্ষ অগ্রাধিকার হয়ে উঠেছে।
পলিয়ামিন (PAs), যেমন পুট্রেসসিন, স্পার্মিডিন, স্পার্মাইন এবং ক্যাডাভেরিন, মাটি-বাহিত উদ্ভিদ রোগজীবাণুর বিরুদ্ধে প্রতিশ্রুতিশীল বিকল্প হিসেবে কাজ করতে পারে, যার ফলে বিপজ্জনক রাসায়নিক ছত্রাকনাশকের ব্যবহার সম্পূর্ণ বা আংশিকভাবে হ্রাস পায় (নেহেলা এট আল।, ২০২৪; ইই এট আল।, ২০২৪)। উচ্চতর উদ্ভিদে, PAs অনেক শারীরবৃত্তীয় প্রক্রিয়ায় জড়িত থাকে, যার মধ্যে রয়েছে কোষ বিভাজন, পার্থক্যকরণ এবং অ্যাবায়োটিক এবং জৈবিক চাপের প্রতিক্রিয়া (কিলিনি এবং নেহেলা, ২০২০)। এগুলি অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট হিসেবে কাজ করতে পারে, প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতি (ROS) পরিষ্কার করতে সাহায্য করতে পারে, রেডক্স হোমিওস্ট্যাসিস বজায় রাখতে পারে (Nehela and Killiny, 2023), প্রতিরক্ষা-সম্পর্কিত জিন প্ররোচিত করতে পারে (Romero et al., 2018), বিভিন্ন বিপাকীয় পথ নিয়ন্ত্রণ করতে পারে (Nehela and Killiny, 2023), অন্তঃসত্ত্বা ফাইটোহরমোন (Nehela and Killiny, 2019), পদ্ধতিগত অর্জিত প্রতিরোধ (SAR) প্রতিষ্ঠা করতে পারে এবং উদ্ভিদ-প্যাথোজেন মিথস্ক্রিয়া নিয়ন্ত্রণ করতে পারে (Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022)। এটি লক্ষণীয় যে উদ্ভিদ প্রতিরক্ষায় PA-এর নির্দিষ্ট প্রক্রিয়া এবং ভূমিকা উদ্ভিদের প্রজাতি, রোগজীবাণু এবং পরিবেশগত অবস্থার উপর নির্ভর করে পরিবর্তিত হয়। উদ্ভিদে সর্বাধিক প্রচুর পরিমাণে PA অপরিহার্য পলিমাইন L-অরনিথিন (Killiny and Nehela, 2020) থেকে জৈব সংশ্লেষিত হয়।
উদ্ভিদের বৃদ্ধি এবং বিকাশে L-অরনিথিন একাধিক ভূমিকা পালন করে। উদাহরণস্বরূপ, পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে ধানে (Oryza sativa), অরনিথিন নাইট্রোজেন পুনর্ব্যবহারের সাথে যুক্ত হতে পারে (Liu et al., 2018), ধানের ফলন, গুণমান এবং সুগন্ধ (Lu et al., 2020), এবং জলের চাপের প্রতিক্রিয়া (Yang et al., 2000)। অধিকন্তু, L-অরনিথিনের বহিরাগত প্রয়োগ চিনির বীট গাছে (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) খরা সহনশীলতা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি করেছে এবং পেঁয়াজ (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu and Çavuşoǧlu, 2021) এবং কাজু (Anacardium occidentale) উদ্ভিদে (da Rocha et al., 2012) লবণের চাপ কমিয়েছে। অ্যাবায়োটিক স্ট্রেস ডিফেন্সে L-অরনিথিনের সম্ভাব্য ভূমিকা হতে পারে চিকিত্সা করা উদ্ভিদে প্রোলিন জমাতে এর জড়িত থাকার কারণে। উদাহরণস্বরূপ, প্রোলিন বিপাকের সাথে সম্পর্কিত জিন, যেমন অরনিথাইন ডেল্টা অ্যামিনোট্রান্সফেরেজ (ডেল্টা-ওএটি) এবং প্রোলিন ডিহাইড্রোজেনেস (প্রোডিএইচ১ এবং প্রোডিএইচ২) জিন, পূর্বে অ-হোস্ট সিউডোমোনাস সিরিঞ্জি স্ট্রেনের বিরুদ্ধে নিকোটিয়ানা বেন্থামিয়ানা এবং অ্যারাবিডোপসিস থালিয়ানার প্রতিরক্ষায় জড়িত বলে জানা গেছে (সেন্থিল-কুমার এবং মাইসোর, ২০১২)। অন্যদিকে, রোগজীবাণু বৃদ্ধির জন্য ছত্রাকের অরনিথাইন ডিকারবক্সিলেস (ওডিসি) প্রয়োজন (সিংহ এট আল।, ২০২০)। হোস্ট-প্ররোচিত জিন সাইলেন্সিং (এইচআইজিএস) এর মাধ্যমে ফুসারিয়াম অক্সিস্পোরাম এফ. এসপি. লাইকোপারসিসির ওডিসি লক্ষ্য করে টমেটো গাছের ফুসারিয়াম উইল্টের প্রতিরোধ ক্ষমতা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি করেছে (সিংহ এট আল।, ২০২০)। তবে, ফাইটোপ্যাথোজেনের মতো জৈবিক চাপের বিরুদ্ধে বহির্মুখী অরনিথাইন প্রয়োগের সম্ভাব্য ভূমিকা ভালভাবে অধ্যয়ন করা হয়নি। আরও গুরুত্বপূর্ণ বিষয় হল, রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতার উপর অরনিথিনের প্রভাব এবং এর সাথে সম্পর্কিত জৈব রাসায়নিক এবং শারীরবৃত্তীয় ঘটনাগুলি মূলত অনাবিষ্কৃত রয়ে গেছে।
কার্যকর নিয়ন্ত্রণ কৌশল বিকাশের জন্য শিমের S. sclerotiorum সংক্রমণের জটিলতা বোঝা গুরুত্বপূর্ণ। এই গবেষণায়, আমরা Sclerotinia sclerotiorum সংক্রমণের বিরুদ্ধে শিমের উদ্ভিদের প্রতিরক্ষা ব্যবস্থা এবং প্রতিরোধ ক্ষমতা বৃদ্ধিতে ডায়ামিন L-ornithine-এর সম্ভাব্য ভূমিকা চিহ্নিত করার লক্ষ্য নিয়েছি। আমরা অনুমান করি যে, সংক্রামিত উদ্ভিদের প্রতিরক্ষা প্রতিক্রিয়া বৃদ্ধির পাশাপাশি, L-ornithine রেডক্স অবস্থা বজায় রাখার ক্ষেত্রেও গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। আমরা প্রস্তাব করছি যে L-ornithine-এর সম্ভাব্য প্রভাব এনজাইমেটিক এবং নন-এনজাইমেটিক অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট প্রতিরক্ষা ব্যবস্থা নিয়ন্ত্রণ এবং ছত্রাকজনিত রোগজীবাণু/ভাইরুলেন্স ফ্যাক্টর এবং সংশ্লিষ্ট প্রোটিনের সাথে হস্তক্ষেপের সাথে সম্পর্কিত। L-ornithine-এর এই দ্বৈত কার্যকারিতা এটিকে সাদা ছত্রাকের প্রভাব হ্রাস করার এবং এই শক্তিশালী ছত্রাকজনিত রোগজীবাণুর বিরুদ্ধে সাধারণ শিমের ফসলের প্রতিরোধ ক্ষমতা বৃদ্ধি করার জন্য একটি টেকসই কৌশলের জন্য একটি প্রতিশ্রুতিশীল প্রার্থী করে তোলে। বর্তমান গবেষণার ফলাফল সাদা ছত্রাক নিয়ন্ত্রণ এবং শিমের উৎপাদনের উপর এর প্রভাব হ্রাস করার জন্য উদ্ভাবনী, পরিবেশগতভাবে বন্ধুত্বপূর্ণ পদ্ধতির বিকাশে সহায়তা করতে পারে।
এই গবেষণায়, সাধারণ শিমের একটি সংবেদনশীল বাণিজ্যিক জাত, গিজা ৩ (ফেজোলাস ভালগারিস এল. সিভি. গিজা ৩), পরীক্ষামূলক উপাদান হিসেবে ব্যবহার করা হয়েছিল। মিশরের কৃষি গবেষণা কেন্দ্র (এআরসি), ফিল্ড ক্রপস রিসার্চ ইনস্টিটিউট (এফসিআরআই) এর লেগুম গবেষণা বিভাগ দ্বারা স্বাস্থ্যকর বীজ সরবরাহ করা হয়েছিল। গ্রিনহাউস পরিস্থিতিতে (২৫ ± ২ ডিগ্রি সেলসিয়াস, আপেক্ষিক আর্দ্রতা ৭৫ ± ১%, ৮ ঘন্টা হালকা/১৬ ঘন্টা অন্ধকার) এস. স্ক্লেরোটিওরাম-সংক্রামিত মাটি দিয়ে ভরা প্লাস্টিকের টবে (ভিতরের ব্যাস ৩৫ সেমি, গভীরতা ৫০ সেমি) পাঁচটি বীজ বপন করা হয়েছিল। বপনের ৭-১০ দিন পরে (ডিপিএস), চারাগুলি পাতলা করে পাতলা করা হয়েছিল যাতে প্রতিটি টবে অভিন্ন বৃদ্ধির দুটি চারা এবং তিনটি সম্পূর্ণ প্রসারিত পাতা থাকে। সমস্ত টবে প্রতি দুই সপ্তাহে একবার জল দেওয়া হয়েছিল এবং প্রদত্ত জাতের জন্য প্রস্তাবিত হারে প্রতি মাসে সার দেওয়া হয়েছিল।
৫০০ মিলিগ্রাম/লিটার ঘনত্বের L-ornithinediamine (যা (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid নামেও পরিচিত; Sigma-Aldrich, Darmstadt, জার্মানি) তৈরি করতে প্রথমে ৫০ মিলিগ্রাম ১০০ মিলি জীবাণুমুক্ত পাতিত জলে দ্রবীভূত করা হয়েছিল। এরপর স্টক দ্রবণটি পাতলা করে পরবর্তী পরীক্ষায় ব্যবহার করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, ছয়টি সিরিজের L-ornithine ঘনত্ব (১২.৫, ২৫, ৫০, ৭৫, ১০০ এবং ১২৫ মিলিগ্রাম/লিটার) ইন ভিট্রো পরীক্ষা করা হয়েছিল। এছাড়াও, জীবাণুমুক্ত পাতিত জল নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ (মক) হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল এবং বাণিজ্যিক ছত্রাকনাশক "Rizolex-T" ৫০% ভেজা পাউডার (টোক্লোফস-মিথাইল ২০% + থিরাম ৩০%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egypt) ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল। বাণিজ্যিক ছত্রাকনাশক "রিজোলেক্স-টি" পাঁচটি ঘনত্বে (২, ৪, ৬, ৮ এবং ১০ মিলিগ্রাম/লিটার) ইন ভিট্রো পরীক্ষা করা হয়েছিল।
বাণিজ্যিক খামার থেকে সাদা ছত্রাকের লক্ষণ দেখা যায় এমন সাধারণ শিমের কাণ্ড এবং শুঁটির নমুনা (আক্রমণের হার: ১০-৩০%) সংগ্রহ করা হয়েছিল। যদিও বেশিরভাগ সংক্রামিত উদ্ভিদ উপকরণ প্রজাতি/জাত (সংবেদনশীল বাণিজ্যিক জাত গিজা ৩) দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল, অন্যান্য, বিশেষ করে স্থানীয় বাজার থেকে প্রাপ্ত, অজানা প্রজাতির ছিল। সংগৃহীত সংক্রামিত উপকরণগুলি প্রথমে ০.৫% সোডিয়াম হাইপোক্লোরাইট দ্রবণ দিয়ে ৩ মিনিটের জন্য জীবাণুমুক্ত করা হয়েছিল, তারপর জীবাণুমুক্ত পাতিত জল দিয়ে বেশ কয়েকবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং অতিরিক্ত জল অপসারণের জন্য জীবাণুমুক্ত ফিল্টার পেপার দিয়ে শুকিয়ে মুছে ফেলা হয়েছিল। এরপর সংক্রামিত অঙ্গগুলিকে মাঝারি টিস্যু (স্বাস্থ্যকর এবং সংক্রামিত টিস্যুর মধ্যে) থেকে ছোট ছোট টুকরো করে কেটে আলুর ডেক্সট্রোজ আগর (PDA) মাধ্যমের উপর কালচার করা হয়েছিল এবং স্ক্লেরোটিয়া গঠনকে উদ্দীপিত করার জন্য ১২ ঘন্টা আলো/১২ ঘন্টা অন্ধকার চক্রের সাথে ২৫ ± ২ °C তাপমাত্রায় ৫ দিন ধরে ইনকিউব করা হয়েছিল। মিশ্র বা দূষিত কালচার থেকে ছত্রাকের আইসোলেটগুলি শুদ্ধ করার জন্যও মাইসেলিয়াল টিপ পদ্ধতি ব্যবহার করা হয়েছিল। পরিশোধিত ছত্রাক আইসোলেটটি প্রথমে তার সাংস্কৃতিক রূপগত বৈশিষ্ট্যের উপর ভিত্তি করে শনাক্ত করা হয়েছিল এবং তারপর মাইক্রোস্কোপিক বৈশিষ্ট্যের উপর ভিত্তি করে এটি S. sclerotiorum বলে নিশ্চিত করা হয়েছিল। অবশেষে, কোচের ধারণা পূরণের জন্য সংবেদনশীল সাধারণ শিমের জাত গিজা 3-তে সমস্ত পরিশোধিত আইসোলেটের রোগজীবাণু পরীক্ষা করা হয়েছিল।
এছাড়াও, সবচেয়ে আক্রমণাত্মক S. sclerotiorum isolate (isolate #3) হোয়াইট এট আল., 1990; Baturo-Ciesniewska এট আল., 2017 দ্বারা বর্ণিত অভ্যন্তরীণ ট্রান্সক্রিপশন স্পেসার (ITS) সিকোয়েন্সিংয়ের উপর ভিত্তি করে আরও নিশ্চিত করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, আইসোলেটগুলিকে আলুর ডেক্সট্রোজ ব্রোথ (PDB) এ কালচার করা হয়েছিল এবং 25 ± 2 °C তাপমাত্রায় 5-7 দিনের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। এরপর ছত্রাকের মাইসেলিয়াম সংগ্রহ করা হয়েছিল, চিজক্লথ দিয়ে ফিল্টার করা হয়েছিল, জীবাণুমুক্ত জল দিয়ে দুবার ধুয়ে এবং জীবাণুমুক্ত ফিল্টার পেপার দিয়ে শুকানো হয়েছিল। Quick-DNA™ ছত্রাক/ব্যাকটেরিয়াল মিনিপ্রেপ কিট ব্যবহার করে জিনোমিক ডিএনএ বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024)। এরপর ITS rDNA অঞ্চলটি নির্দিষ্ট প্রাইমার পেয়ার ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; প্রত্যাশিত আকার: 540 bp) ব্যবহার করে প্রশস্ত করা হয়েছিল (Baturo-Ciesniewska et al., 2017)। পরিশোধিত PCR পণ্যগুলি সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য জমা দেওয়া হয়েছিল (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.)। Sanger sequence পদ্ধতি ব্যবহার করে ITS rDNA ক্রমগুলি দ্বিমুখীভাবে ক্রমযুক্ত করা হয়েছিল। এরপর BLASTn সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে GenBank এবং National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) এর সর্বশেষ ডেটার সাথে একত্রিত ক্যোয়ারী সিকোয়েন্সগুলি তুলনা করা হয়েছিল। মলিকুলার ইভোলিউশনারি জেনেটিক্স অ্যানালাইসিস প্যাকেজ (MEGA-11; সংস্করণ 11) (Kumar et al., 2024) এ ClustalW ব্যবহার করে NCBI GenBank (Supplementary Table S1) এর সর্বশেষ ডেটা থেকে প্রাপ্ত 20টি অন্যান্য S. sclerotiorum strains/isolates এর সাথে কোয়েরি সিকোয়েন্সটির তুলনা করা হয়েছিল। সর্বাধিক সম্ভাবনা পদ্ধতি এবং সাধারণ সময়-বিপরীতমুখী নিউক্লিওটাইড প্রতিস্থাপন মডেল (Nei and Kumar, 2000) ব্যবহার করে বিবর্তনীয় বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সর্বাধিক লগ-সম্ভাবনা সহ গাছটি দেখানো হয়েছে। হিউরিস্টিক অনুসন্ধানের জন্য প্রাথমিক গাছটি প্রতিবেশী-যোগদানকারী (NJ) গাছ (Kumar et al., 2024) এবং সর্বাধিক পার্সিমনি (MP) গাছের মধ্যে উচ্চতর লগ-সম্ভাবনা সহ গাছটি বেছে নিয়ে নির্বাচন করা হয়। NJ গাছটি সাধারণ সময়-বিপরীতমুখী মডেল (Nei and Kumar, 2000) ব্যবহার করে গণনা করা একটি জোড়াওয়ালা দূরত্ব ম্যাট্রিক্স ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল।
এল-অরনিথিন এবং ব্যাকটেরিনাশক "রিজোলেক্স-টি" এর জীবাণুনাশক কার্যকলাপ আগর ডিফিউশন পদ্ধতি দ্বারা ইন ভিট্রোতে নির্ধারণ করা হয়েছিল। পদ্ধতি: এল-অরনিথিনের স্টক দ্রবণ (৫০০ মিলিগ্রাম/লিটার) যথাযথ পরিমাণে নিন এবং যথাক্রমে ১২.৫, ২৫, ৫০, ৭৫, ১০০ এবং ১২৫ মিলিগ্রাম/লিটার চূড়ান্ত ঘনত্বের দ্রবণ প্রস্তুত করতে ১০ মিলি পিডিএ পুষ্টি মাধ্যমের সাথে পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে মিশিয়ে নিন। নিয়ন্ত্রণ হিসাবে "রিজোলেক্স-টি" এর পাঁচটি ঘনত্ব (২, ৪, ৬, ৮ এবং ১০ মিলিগ্রাম/লিটার) এবং জীবাণুমুক্ত পাতিত জল ব্যবহার করা হয়েছিল। মাধ্যমটি শক্ত হয়ে যাওয়ার পরে, ৪ মিমি ব্যাসের স্ক্লেরোটিনিয়া স্ক্লেরোটিওরাম কালচারের একটি সদ্য প্রস্তুত মাইসেলিয়াল প্লাগ পেট্রি ডিশের কেন্দ্রে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল এবং ২৫±২°C তাপমাত্রায় কালচার করা হয়েছিল যতক্ষণ না মাইসেলিয়াম পুরো নিয়ন্ত্রণ পেট্রি ডিশকে ঢেকে দেয়, যার পরে ছত্রাকের বৃদ্ধি রেকর্ড করা হয়েছিল। সমীকরণ ১ ব্যবহার করে S. sclerotiorum এর রেডিয়াল বৃদ্ধির শতকরা বাধা গণনা করুন:
পরীক্ষাটি দুবার পুনরাবৃত্তি করা হয়েছিল, প্রতিটি নিয়ন্ত্রণ/পরীক্ষামূলক গোষ্ঠীর জন্য ছয়টি জৈবিক প্রতিলিপি এবং প্রতিটি জৈবিক প্রতিলিপির জন্য পাঁচটি পাত্র (প্রতি পাত্রে দুটি উদ্ভিদ) ব্যবহার করা হয়েছিল। পরীক্ষামূলক ফলাফলের নির্ভুলতা, নির্ভরযোগ্যতা এবং পুনরুৎপাদনযোগ্যতা নিশ্চিত করার জন্য প্রতিটি জৈবিক প্রতিলিপি দুবার (দুটি প্রযুক্তিগত প্রতিলিপি) বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। এছাড়াও, অর্ধ-সর্বোচ্চ প্রতিরোধমূলক ঘনত্ব (IC50) এবং IC99 গণনা করার জন্য প্রোবিট রিগ্রেশন বিশ্লেষণ ব্যবহার করা হয়েছিল (প্রেন্টিস, 1976)।
গ্রিনহাউস পরিস্থিতিতে L-অরনিথিনের সম্ভাব্যতা মূল্যায়নের জন্য, পরপর দুটি পাত্র পরীক্ষা করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, পাত্রগুলি জীবাণুমুক্ত কাদামাটি-বালি মাটি (3:1) দিয়ে ভরা হয়েছিল এবং S. স্ক্লেরোটিওরামের একটি নতুন প্রস্তুত কালচার দিয়ে টিকা দেওয়া হয়েছিল। প্রথমে, S. স্ক্লেরোটিওরামের সবচেয়ে আক্রমণাত্মক আইসোলেট (আইসোলেট #3) একটি স্ক্লেরোটিয়ামকে অর্ধেক করে কেটে, PDA-এর উপর মুখ করে রেখে এবং মাইসেলিয়াল বৃদ্ধিকে উদ্দীপিত করার জন্য 25°C তাপমাত্রায় (24 ঘন্টা) 4 দিনের জন্য ইনকিউবেশন করে কালচার করা হয়েছিল। এরপর চারটি 5 মিমি ব্যাসের আগর প্লাগ অগ্রভাগ থেকে নেওয়া হয়েছিল এবং 100 গ্রাম জীবাণুমুক্ত গম এবং ধানের তুষের মিশ্রণ (1:1, v/v) দিয়ে টিকা দেওয়া হয়েছিল এবং সমস্ত ফ্লাস্ককে 25 ± 2 °C তাপমাত্রায় 12 ঘন্টা আলো/12 ঘন্টা অন্ধকার চক্রের অধীনে 5 দিনের জন্য ইনকিউবেশন করা হয়েছিল স্ক্লেরোটিয়া গঠনকে উদ্দীপিত করার জন্য। মাটি যোগ করার আগে সমস্ত ফ্লাস্কের বিষয়বস্তু পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে মিশ্রিত করা হয়েছিল যাতে একজাতীয়তা নিশ্চিত করা যায়। তারপর, রোগজীবাণুর স্থির ঘনত্ব নিশ্চিত করার জন্য প্রতিটি পাত্রে ১০০ গ্রাম করে কলোনাইজিং ব্রান মিশ্রণ যোগ করা হয়েছিল। ছত্রাকের বৃদ্ধি সক্রিয় করার জন্য টিকা দেওয়া পাত্রগুলিতে জল দেওয়া হয়েছিল এবং ৭ দিনের জন্য গ্রিনহাউস অবস্থায় রাখা হয়েছিল।
এরপর প্রতিটি টবে গিজা ৩ জাতের পাঁচটি বীজ বপন করা হয়। L-ornithine এবং ছত্রাকনাশক Rizolex-T দিয়ে চিকিত্সা করা টবের জন্য, জীবাণুমুক্ত বীজগুলিকে প্রথমে দুটি যৌগের জলীয় দ্রবণে দুই ঘন্টা ভিজিয়ে রাখা হয় যার চূড়ান্ত IC99 ঘনত্ব যথাক্রমে প্রায় 250 mg/L এবং 50 mg/L ছিল, এবং তারপর বপনের আগে এক ঘন্টা বাতাসে শুকানো হয়। অন্যদিকে, নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে বীজগুলিকে জীবাণুমুক্ত পাতিত জলে ভিজিয়ে রাখা হয়। 10 দিন পর, প্রথম জল দেওয়ার আগে, চারাগুলিকে পাতলা করে ফেলা হয়, প্রতিটি টবে কেবল দুটি পরিষ্কার চারা অবশিষ্ট থাকে। উপরন্তু, S. sclerotiorum এর সংক্রমণ নিশ্চিত করার জন্য, একই বিকাশের পর্যায়ে (10 দিন) শিম গাছের কাণ্ড দুটি ভিন্ন স্থানে একটি জীবাণুমুক্ত স্ক্যাল্পেল ব্যবহার করে কাটা হয় এবং প্রতিটি ক্ষতে প্রায় 0.5 গ্রাম উপনিবেশকারী তুষের মিশ্রণ স্থাপন করা হয়, তারপরে উচ্চ আর্দ্রতা প্রয়োগ করা হয় যাতে সমস্ত টিকা দেওয়া উদ্ভিদে সংক্রমণ এবং রোগের বিকাশ উদ্দীপিত হয়। নিয়ন্ত্রণ গাছগুলিকে একইভাবে আহত করা হয়েছিল এবং সমান পরিমাণে (0.5 গ্রাম) জীবাণুমুক্ত, উপনিবেশহীন তুষের মিশ্রণ ক্ষতস্থানে স্থাপন করা হয়েছিল এবং উচ্চ আর্দ্রতার অধীনে বজায় রাখা হয়েছিল যাতে রোগের বিকাশের জন্য পরিবেশ অনুকরণ করা যায় এবং চিকিত্সা গোষ্ঠীগুলির মধ্যে সামঞ্জস্য নিশ্চিত করা যায়।
চিকিৎসা পদ্ধতি: শিমের চারাগুলিতে ৫০০ মিলি জলীয় দ্রবণ L-ornithine (২৫০ মিলিগ্রাম/লি) অথবা ছত্রাকনাশক Rizolex-T (৫০ মিলিগ্রাম/লি) দিয়ে মাটিতে সেচ দেওয়া হয়েছিল, তারপর ১০ দিনের ব্যবধানে তিনবার চিকিৎসা পুনরাবৃত্তি করা হয়েছিল। প্লেসিবো-চিকিৎসা নিয়ন্ত্রণ ব্যবস্থায় ৫০০ মিলি জীবাণুমুক্ত পাতিত জল দিয়ে সেচ দেওয়া হয়েছিল। সমস্ত চিকিৎসা গ্রিনহাউস পরিস্থিতিতে (২৫ ± ২° সেলসিয়াস, ৭৫ ± ১% আপেক্ষিক আর্দ্রতা এবং ৮ ঘন্টা আলো/১৬ ঘন্টা অন্ধকারের আলোককালীন সময়কাল) করা হয়েছিল। সমস্ত টবে পাক্ষিকভাবে জল দেওয়া হয়েছিল এবং প্রতি মাসে সুষম NPK সার (২০-২০-২০, ৩.৬% সালফার এবং TE মাইক্রো উপাদান সহ; জেইন সিডস, মিশর) দিয়ে ৩-৪ গ্রাম/লিটার ঘনত্বে নির্দিষ্ট জাতের জন্য সুপারিশ এবং প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে পাতায় স্প্রে করে শোধন করা হয়েছিল। অন্যথায় বলা না থাকলে, সম্পূর্ণরূপে প্রসারিত পরিপক্ক পাতা (উপর থেকে দ্বিতীয় এবং তৃতীয় পাতা) প্রতিটি জৈবিক প্রতিলিপি থেকে 72 ঘন্টা পরে (hpt) সংগ্রহ করা হয়েছিল, একজাতকরণ, পুল এবং -80 °C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল আরও বিশ্লেষণের জন্য, যার মধ্যে রয়েছে, তবে সীমাবদ্ধ নয়, অক্সিডেটিভ স্ট্রেস সূচকগুলির ইন সিটু হিস্টোকেমিক্যাল স্থানীয়করণ, লিপিড পারক্সিডেশন, এনজাইমেটিক এবং নন-এনজাইমেটিক অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট এবং জিন এক্সপ্রেশন।
টেরান এট আল (২০০৬) দ্বারা সংশোধিত পেটজোল্ট এবং ডিকসন স্কেল (১৯৯৬) এর উপর ভিত্তি করে ১-৯ (পরিপূরক সারণী S2) স্কেল ব্যবহার করে সাদা ছত্রাক সংক্রমণের তীব্রতা সাপ্তাহিক ২১ দিন পর ইনোকুলেশনের (dpi) মূল্যায়ন করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, শিম গাছের কান্ড এবং শাখাগুলি ইন্টারনোড এবং নোড বরাবর ক্ষতের অগ্রগতি অনুসরণ করার জন্য ইনোকুলেশনের বিন্দু থেকে শুরু করে পরীক্ষা করা হয়েছিল। এরপর ইনোকুলেশনের বিন্দু থেকে কান্ড বা শাখা বরাবর সবচেয়ে দূরবর্তী বিন্দু পর্যন্ত ক্ষতের দূরত্ব পরিমাপ করা হয়েছিল এবং ক্ষতের অবস্থানের উপর ভিত্তি করে ১-৯ স্কোর নির্ধারণ করা হয়েছিল, যেখানে (১) ইনোকুলেশনের বিন্দুর কাছে কোনও দৃশ্যমান সংক্রমণ নির্দেশ করে না এবং (২-৯) নোড/ইন্টারনোড বরাবর ক্ষতের আকার এবং অগ্রগতিতে ধীরে ধীরে বৃদ্ধি নির্দেশ করে (পরিপূরক সারণী S2)। সাদা ছত্রাক সংক্রমণের তীব্রতা সূত্র ২ ব্যবহার করে শতাংশে রূপান্তরিত করা হয়েছিল:
এছাড়াও, রোগের অগ্রগতি বক্ররেখা (AUDPC) এর আওতাধীন এলাকাটি সূত্র (Shaner and Finney, 1977) ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল, যা সম্প্রতি সাধারণ শিমের সাদা পচনের জন্য অভিযোজিত হয়েছে (Chauhan et al., 2020) সমীকরণ 3 ব্যবহার করে:
যেখানে Yi = রোগের তীব্রতা ti সময়ে, Yi+1 = পরবর্তী সময়ে রোগের তীব্রতা ti+1, ti = প্রথম পরিমাপের সময় (দিনে), ti+1 = পরবর্তী পরিমাপের সময় (দিনে), n = মোট সময় বিন্দু বা পর্যবেক্ষণ বিন্দুর সংখ্যা। শিম গাছের বৃদ্ধির পরামিতি, যার মধ্যে রয়েছে গাছের উচ্চতা (সেমি), প্রতি গাছে শাখার সংখ্যা এবং প্রতি গাছে পাতার সংখ্যা, সমস্ত জৈবিক প্রতিলিপিতে সাপ্তাহিক 21 দিন ধরে রেকর্ড করা হয়েছিল।
প্রতিটি জৈবিক প্রতিলিপিতে, পাতার নমুনা (উপর থেকে দ্বিতীয় এবং তৃতীয় সম্পূর্ণরূপে বিকশিত পাতা) চিকিৎসার ৪৫ তম দিনে (শেষ চিকিৎসার ১৫ দিন পরে) সংগ্রহ করা হয়েছিল। প্রতিটি জৈবিক প্রতিলিপিতে পাঁচটি পাত্র (প্রতি পাত্রে দুটি গাছ) ছিল। প্রায় ৫০০ মিলিগ্রাম চূর্ণ টিস্যু ব্যবহার করা হয়েছিল সালোকসংশ্লেষী রঙ্গক (ক্লোরোফিল a, ক্লোরোফিল b এবং ক্যারোটিনয়েড) নিষ্কাশনের জন্য ৮০% অ্যাসিটোন অন্ধকারে ৪ °C তাপমাত্রায় ব্যবহার করে। ২৪ ঘন্টা পরে, নমুনাগুলিকে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং সুপারনেট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল ক্লোরোফিল a, ক্লোরোফিল b এবং ক্যারোটিনয়েডের উপাদান নির্ধারণের জন্য একটি UV-160A স্পেকট্রোফটোমিটার (শিমাডজু কর্পোরেশন, জাপান) ব্যবহার করে রঙিনভাবে (লিচটেনথেলার, ১৯৮৭) পদ্ধতি অনুসারে তিনটি ভিন্ন তরঙ্গদৈর্ঘ্যে (A470, A646 এবং A663 nm) শোষণ পরিমাপ করে। অবশেষে, লিচটেনথেলার (১৯৮৭) দ্বারা বর্ণিত নিম্নলিখিত সূত্র ৪-৬ ব্যবহার করে সালোকসংশ্লেষী রঙ্গকের পরিমাণ গণনা করা হয়েছিল।
৭২ ঘন্টা পর চিকিৎসার (hpt) পর, হাইড্রোজেন পারক্সাইড (H2O2) এবং সুপারঅক্সাইড অ্যানিয়ন (O2•−) এর ইন সিটু হিস্টোকেমিক্যাল স্থানীয়করণের জন্য প্রতিটি জৈবিক প্রতিলিপি থেকে পাতা (উপর থেকে দ্বিতীয় এবং তৃতীয় সম্পূর্ণরূপে বিকশিত পাতা) সংগ্রহ করা হয়েছিল। প্রতিটি জৈবিক প্রতিলিপিতে পাঁচটি পাত্র (প্রতি পাত্রে দুটি উদ্ভিদ) ছিল। পদ্ধতির নির্ভুলতা, নির্ভরযোগ্যতা এবং পুনরুৎপাদনযোগ্যতা নিশ্চিত করার জন্য প্রতিটি জৈবিক প্রতিলিপিকে প্রতিলিপিতে (দুটি প্রযুক্তিগত প্রতিলিপি) বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। H2O2 এবং O2•− যথাক্রমে 0.1% 3,3′-ডায়ামিনোবেনজিডিন (DAB; সিগমা-অ্যালড্রিচ, ডার্মস্ট্যাড, জার্মানি) অথবা নাইট্রোব্লু টেট্রাজোলিয়াম (NBT; সিগমা-অ্যালড্রিচ, ডার্মস্ট্যাড, জার্মানি) ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল, রোমেরো-পুয়ের্তাস এট আল. (২০০৪) এবং অ্যাডাম এট আল. (১৯৮৯) দ্বারা বর্ণিত পদ্ধতিগুলি অনুসরণ করে সামান্য পরিবর্তন করা হয়েছিল। H2O2-এর হিস্টোকেমিক্যাল স্থানীয়করণের জন্য, লিফলেটগুলিকে 0.1% DAB দিয়ে 10 mM ট্রিস বাফারে (pH 7.8) ভ্যাকুয়াম ইনফিল্ট্রেট করা হয়েছিল এবং তারপর ঘরের তাপমাত্রায় 60 মিনিটের জন্য আলোতে ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল। লিফলেটগুলিকে 0.15% (v/v) TCA-তে 4:1 (v/v) ইথানল:ক্লোরোফর্মে (আল-গোমহোরিয়া ফার্মাসিউটিক্যালস অ্যান্ড মেডিকেল সাপ্লাইস, কায়রো, মিশর) ব্লিচ করা হয়েছিল এবং তারপর অন্ধকার না হওয়া পর্যন্ত আলোর সংস্পর্শে আনা হয়েছিল। একইভাবে, ভালভগুলিকে 10 mM পটাসিয়াম ফসফেট বাফার (pH 7.8) দিয়ে ভ্যাকুয়াম ইনফিল্ট্রেট করা হয়েছিল যাতে O2•−-এর হিস্টোকেমিক্যাল স্থানীয়করণ করা যায়। লিফলেটগুলিকে ঘরের তাপমাত্রায় 20 মিনিটের জন্য আলোতে ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল, তারপর উপরের মতো ব্লিচ করা হয়েছিল এবং তারপর গাঢ় নীল/বেগুনি দাগ না দেখা পর্যন্ত আলোকিত করা হয়েছিল। ফলস্বরূপ বাদামী (H2O2 সূচক হিসাবে) বা নীল-বেগুনি (O2•− সূচক হিসাবে) রঙের তীব্রতা চিত্র প্রক্রিয়াকরণ প্যাকেজ ImageJ (http://fiji.sc; অ্যাক্সেস করা হয়েছে 7 মার্চ 2024) এর ফিজি সংস্করণ ব্যবহার করে মূল্যায়ন করা হয়েছিল।
ম্যালোনডায়ালডিহাইড (লিপিড পারক্সিডেশনের চিহ্নিতকারী হিসেবে MDA) Du এবং Bramlage (১৯৯২) পদ্ধতি অনুসারে সামান্য পরিবর্তন করে নির্ধারণ করা হয়েছিল। প্রতিটি জৈবিক প্রতিলিপি (উপর থেকে দ্বিতীয় এবং তৃতীয় সম্পূর্ণরূপে বিকশিত পাতা) থেকে পাতাগুলি ৭২ ঘন্টা পরে (hpt) সংগ্রহ করা হয়েছিল। প্রতিটি জৈবিক প্রতিলিপিতে পাঁচটি পাত্র (প্রতি পাত্রে দুটি উদ্ভিদ) অন্তর্ভুক্ত ছিল। পদ্ধতির নির্ভুলতা, নির্ভরযোগ্যতা এবং পুনরুৎপাদনযোগ্যতা নিশ্চিত করার জন্য প্রতিটি জৈবিক প্রতিলিপিকে প্রতিলিপিতে (দুটি প্রযুক্তিগত প্রতিলিপি) বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, 0.5 গ্রাম মাটির পাতার টিস্যু MDA নিষ্কাশনের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল ২০% ট্রাইক্লোরোএসেটিক অ্যাসিড (TCA; মিলিপোরসিগমা, বার্লিংটন, এমএ, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) দিয়ে যার মধ্যে 0.01% বিউটাইলেটেড হাইড্রোক্সিটোলুইন (BHT; সিগমা-অ্যালড্রিচ, সেন্ট লুইস, MO, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) ছিল। এরপর সুপারনেট্যান্টের MDA কন্টেন্টটি UV-160A স্পেকট্রোফটোমিটার (শিমাডজু কর্পোরেশন, জাপান) ব্যবহার করে 532 এবং 600 nm এ শোষণ পরিমাপ করে রঙিনমিতি দ্বারা নির্ধারণ করা হয়েছিল এবং তারপর nmol g−1 FW হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছিল।
নন-এনজাইমেটিক এবং এনজাইমেটিক অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট মূল্যায়নের জন্য, প্রতিটি জৈবিক প্রতিলিপি থেকে পাতা (উপর থেকে দ্বিতীয় এবং তৃতীয় সম্পূর্ণরূপে বিকশিত পাতা) ৭২ ঘন্টা পরে (hpt) সংগ্রহ করা হয়েছিল। প্রতিটি জৈবিক প্রতিলিপিতে পাঁচটি পাত্র (প্রতি পাত্রে দুটি উদ্ভিদ) ছিল। প্রতিটি জৈবিক নমুনা প্রতিলিপিতে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল (দুটি প্রযুক্তিগত নমুনা)। দুটি পাতা তরল নাইট্রোজেন দিয়ে গুঁড়ো করা হয়েছিল এবং সরাসরি এনজাইমেটিক এবং নন-এনজাইমেটিক অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট, মোট অ্যামিনো অ্যাসিড, প্রোলিনের পরিমাণ, জিনের প্রকাশ এবং অক্সালেটের পরিমাণ নির্ধারণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।
কাহকোনেন এট আল (১৯৯৯) দ্বারা বর্ণিত পদ্ধতিতে সামান্য পরিবর্তন করে ফোলিন-সিওকালটিউ রিএজেন্ট (সিগমা-অ্যালড্রিচ, সেন্ট লুইস, MO, USA) ব্যবহার করে মোট দ্রবণীয় ফেনোলিক নির্ধারণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, প্রায় 0.1 গ্রাম সমজাতীয় পাতার টিস্যু 20 মিলি 80% মিথানল দিয়ে 24 ঘন্টার জন্য অন্ধকারে রেখে বের করা হয়েছিল এবং সেন্ট্রিফিউগেশনের পরে সুপারন্যাট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল। নমুনা নির্যাসের 0.1 মিলি 0.5 মিলি ফোলিন-সিওকালটিউ রিএজেন্ট (10%) এর সাথে মিশ্রিত করা হয়েছিল, 30 সেকেন্ডের জন্য ঝাঁকানো হয়েছিল এবং 5 মিনিটের জন্য অন্ধকারে রেখে দেওয়া হয়েছিল। তারপর প্রতিটি টিউবে 0.5 মিলি 20% সোডিয়াম কার্বনেট দ্রবণ (Na2CO3; আল-গোমোরিয়া ফার্মাসিউটিক্যালস অ্যান্ড মেডিকেল সাপ্লাইস কোম্পানি, কায়রো, মিশর) যোগ করা হয়েছিল, পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং অন্ধকারে ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল। ইনকিউবেশনের পর, UV-160A স্পেকট্রোফটোমিটার (শিমাডজু কর্পোরেশন, জাপান) ব্যবহার করে বিক্রিয়ার মিশ্রণের শোষণ 765 nm পরিমাপ করা হয়েছিল। নমুনা নির্যাসে মোট দ্রবণীয় ফেনোলের ঘনত্ব একটি গ্যালিক অ্যাসিড ক্যালিব্রেশন বক্ররেখা (ফিশার সায়েন্টিফিক, হ্যাম্পটন, NH, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল এবং প্রতি গ্রাম তাজা ওজনের (mg GAE g-1 তাজা ওজন) মিলিগ্রাম গ্যালিক অ্যাসিড সমতুল্য হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছিল।
Djeridane et al. (2006) এর পদ্ধতি অনুসারে সামান্য পরিবর্তন করে মোট দ্রবণীয় ফ্ল্যাভোনয়েডের পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, উপরের মিথানল নির্যাসের 0.3 মিলি 5% অ্যালুমিনিয়াম ক্লোরাইড দ্রবণের (AlCl3; ফিশার সায়েন্টিফিক, হ্যাম্পটন, NH, USA) সাথে মিশ্রিত করা হয়েছিল, জোরে জোরে নাড়াচাড়া করা হয়েছিল এবং তারপর ঘরের তাপমাত্রায় 5 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল, তারপরে 0.3 মিলি 10% পটাসিয়াম অ্যাসিটেট দ্রবণ (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) যোগ করা হয়েছিল, পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং অন্ধকারে 30 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করা হয়েছিল। ইনকিউবেশনের পরে, UV-160A স্পেকট্রোফটোমিটার (Shimadzu Corporation, Japan) ব্যবহার করে বিক্রিয়া মিশ্রণের শোষণ 430 nm পরিমাপ করা হয়েছিল। নমুনা নির্যাসে মোট দ্রবণীয় ফ্ল্যাভোনয়েডের ঘনত্ব একটি রুটিন ক্যালিব্রেশন কার্ভ (TCI America, Portland, OR, USA) ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল এবং তারপর প্রতি গ্রাম তাজা ওজনের (mg RE g-1 তাজা ওজন) মিলিগ্রাম রুটিন সমতুল্য হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছিল।
শিমের পাতার মোট মুক্ত অ্যামিনো অ্যাসিডের পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল একটি পরিবর্তিত নিনহাইড্রিন রিএজেন্ট (থার্মো সায়েন্টিফিক কেমিক্যালস, ওয়ালথাম, এমএ, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) ব্যবহার করে যা ইয়োকোয়ামা এবং হিরামাতসু (২০০৩) দ্বারা প্রস্তাবিত এবং সান এট আল. (২০০৬) দ্বারা পরিবর্তিত পদ্ধতির উপর ভিত্তি করে। সংক্ষেপে, ০.১ গ্রাম স্থল টিস্যু pH ৫.৪ বাফার দিয়ে বের করা হয়েছিল এবং ২০০ μL সুপারনেট্যান্টকে ২০০ μL নিনহাইড্রিন (২%) এবং ২০০ μL পাইরিডিন (১০%; স্পেকট্রাম কেমিক্যাল, নিউ ব্রান্সউইক, এনজে, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) দিয়ে বিক্রিয়া করা হয়েছিল, ৩০ মিনিটের জন্য ফুটন্ত জলের স্নানে ইনকিউব করা হয়েছিল, তারপর ঠান্ডা করা হয়েছিল এবং UV-160A স্পেকট্রোফটোমিটার (শিমাদজু কর্পোরেশন, জাপান) ব্যবহার করে ৫৮০ এনএম পরিমাপ করা হয়েছিল। অন্যদিকে, প্রোলিন বেটস পদ্ধতি দ্বারা নির্ধারণ করা হয়েছিল (বেটস এট আল., ১৯৭৩)। প্রোলিন ৩% সালফোসালিসিলিক অ্যাসিড (থার্মো সায়েন্টিফিক কেমিক্যালস, ওয়ালথাম, এমএ, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) দিয়ে নিষ্কাশন করা হয়েছিল এবং সেন্ট্রিফিউগেশনের পরে, ০.৫ মিলি সুপারনাট্যান্ট ১ মিলি হিমবাহ অ্যাসিটিক অ্যাসিড (ফিশার সায়েন্টিফিক, হ্যাম্পটন, এনএইচ, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) এবং নিনহাইড্রিন রিএজেন্টের সাথে মিশ্রিত করা হয়েছিল, ৯০°C তাপমাত্রায় ৪৫ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল, ঠান্ডা করা হয়েছিল এবং উপরে বর্ণিত একই স্পেকট্রোফটোমিটার ব্যবহার করে ৫২০ এনএম তাপমাত্রায় পরিমাপ করা হয়েছিল। পাতার নির্যাসে মোট মুক্ত অ্যামিনো অ্যাসিড এবং প্রোলিন যথাক্রমে গ্লাইসিন এবং প্রোলিন ক্যালিব্রেশন কার্ভ (সিগমা-অ্যালড্রিচ, সেন্ট লুইস, MO, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল এবং mg/g তাজা ওজন হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছিল।
অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট এনজাইমের এনজাইমেটিক কার্যকলাপ নির্ধারণের জন্য, প্রায় 500 মিলিগ্রাম সমজাতীয় টিস্যু 50 মিলিমিটার ট্রিস বাফার (pH 7.8) দিয়ে বের করা হয়েছিল যার মধ্যে 1 মিলিমিটার EDTA-Na2 (সিগমা-অ্যালড্রিচ, সেন্ট লুইস, MO, USA) এবং 7.5% পলিভিনাইলপাইরোলিডোন (PVP; সিগমা-অ্যালড্রিচ, সেন্ট লুইস, MO, USA) ছিল, 10,000 × g তাপমাত্রায় 20 মিনিটের জন্য রেফ্রিজারেশনে (4 °C) সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল, এবং সুপারনেট্যান্ট (অশোধিত এনজাইম নির্যাস) সংগ্রহ করা হয়েছিল (এল-নাগার এট আল।, 2023; ওসমান এট আল।, 2023)। এরপর Catalase (CAT) কে 0.1 M সোডিয়াম ফসফেট বাফারের 2 মিলি (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) এবং 100 μl 269 mM H2O2 দ্রবণ দিয়ে বিক্রিয়া করা হয়েছিল যাতে Aebi (1984) এর পদ্ধতি অনুসারে সামান্য পরিবর্তনের মাধ্যমে এর এনজাইমেটিক কার্যকলাপ নির্ধারণ করা হয় (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023)। Guaiacol-নির্ভর peroxidase (POX) এনজাইমেটিক কার্যকলাপ Harrach et al. (2009) এর পদ্ধতি ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল। (২০০৮) ছোটখাটো পরিবর্তন সহ (এল-নাগার এট আল।, ২০২৩; ওসমান এট আল।, ২০২৩) এবং পলিফেনল অক্সিডেস (পিপিও) এর এনজাইমেটিক কার্যকলাপ নির্ধারণ করা হয়েছিল ১০০ মিলিমিটার সোডিয়াম ফসফেট বাফার (পিএইচ ৬.০), ১০০ μl গুয়াইকল (টিসিআই রাসায়নিক, পোর্টল্যান্ড, ওরেগন, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) এবং ১২ মিলিমিটার H2O2 এর ১০০ μl দিয়ে বিক্রিয়ার পর। পদ্ধতিটি (এল-নাগার এট আল।, ২০২৩; ওসমান এট আল।, ২০২৩) থেকে সামান্য পরিবর্তন করা হয়েছিল। ০.১ মিলিমিটার ফসফেট বাফার (পিএইচ ৬.০) এ নতুনভাবে প্রস্তুত ৩ মিলি ক্যাটেকোল দ্রবণ (থার্মো সায়েন্টিফিক কেমিক্যালস, ওয়ালথাম, এমএ, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) (০.০১ মিলিমিটার) দিয়ে বিক্রিয়ার পর পরীক্ষাটি করা হয়েছিল। CAT কার্যকলাপ পরিমাপ করা হয়েছিল 240 nm (A240) এ H2O2 এর পচন পর্যবেক্ষণ করে, POX কার্যকলাপ পরিমাপ করা হয়েছিল 436 nm (A436) এ শোষণ বৃদ্ধি পর্যবেক্ষণ করে, এবং PPO কার্যকলাপ পরিমাপ করা হয়েছিল UV-160A স্পেকট্রোফটোমিটার (শিমাদজু, জাপান) ব্যবহার করে প্রতি 30 সেকেন্ডে 495 nm (A495) এ শোষণ ওঠানামা রেকর্ড করে।
শেষ চিকিৎসার ৭২ ঘন্টা পরে শিমের পাতায় (দ্বিতীয় এবং তৃতীয় সম্পূর্ণরূপে বিকশিত পাতা) পেরোক্সিসোমাল ক্যাটালেস (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), সুপারঅক্সাইড ডিসমিউটেজ (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), এবং গ্লুটাথিয়ন রিডাক্টেস (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1) সহ তিনটি অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট-সম্পর্কিত জিনের ট্রান্সক্রিপ্ট স্তর সনাক্ত করতে রিয়েল-টাইম RT-PCR ব্যবহার করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে সিম্পলি পি টোটাল RNA এক্সট্রাকশন কিট (ক্যাট. নং BSC52S1; বায়োফ্লাক্স, বায়োরি টেকনোলজি, চীন) ব্যবহার করে RNA বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। তারপর, প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে TOP script™ cDNA সিন্থেসিস কিট ব্যবহার করে cDNA সংশ্লেষিত করা হয়েছিল। উপরের তিনটি জিনের প্রাইমার সিকোয়েন্সগুলি পরিপূরক সারণী S3-এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। গৃহস্থালি জিন হিসেবে PvActin-3 (GenBank অ্যাকসেসন নম্বর: XM_068616709.1) ব্যবহার করা হয়েছিল এবং 2-ΔΔCT পদ্ধতি ব্যবহার করে আপেক্ষিক জিনের প্রকাশ গণনা করা হয়েছিল (Livak and Schmittgen, 2001)। জৈবিক চাপ (সাধারণ শিম এবং অ্যানথ্রাকনোজ ছত্রাক Colletotrichum lindemuthianum এর মধ্যে অসঙ্গতিপূর্ণ মিথস্ক্রিয়া) এবং অজৈব চাপ (খরা, লবণাক্ততা, নিম্ন তাপমাত্রা) এর অধীনে অ্যাক্টিনের স্থিতিশীলতা প্রদর্শিত হয়েছিল (Borges et al., 2012)।
আমরা প্রাথমিকভাবে S. sclerotiorum-এ অক্সালোএসেটেট অ্যাসিটাইলহাইড্রোলেজ (OAH) প্রোটিনের জিনোম-ওয়াইড ইন সিলিকো বিশ্লেষণ করেছি প্রোটিন-প্রোটিন BLAST টুল (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) ব্যবহার করে। সংক্ষেপে, আমরা S. sclerotiorum-এ হোমোলগাস প্রোটিন ম্যাপ করার জন্য কোয়েরি সিকোয়েন্স হিসেবে Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; ট্যাক্সাইড: 1191702; GenBank অ্যাকসেসন নম্বর XP_040799428.1; 342 অ্যামিনো অ্যাসিড) এবং Penicillium lagena (PlOAH; ট্যাক্সাইড: 94218; GenBank অ্যাকসেসন নম্বর XP_056833920.1; 316 অ্যামিনো অ্যাসিড) থেকে OAH ব্যবহার করেছি। (ট্যাক্সাইড: 5180)। ন্যাশনাল সেন্টার ফর বায়োটেকনোলজি ইনফরমেশন (NCBI) ওয়েবসাইট, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/-এ GenBank-এ পাওয়া সাম্প্রতিক S. sclerotiorum জিনোম ডেটার বিপরীতে BLASTp পরীক্ষা করা হয়েছিল।
এছাড়াও, S. sclerotiorum (SsOAH) থেকে ভবিষ্যদ্বাণী করা OAH জিন এবং A. fijiensis CBS 313.89 থেকে AfOAH এবং P. lagena থেকে PlOAH এর বিবর্তনীয় বিশ্লেষণ এবং ফাইলোজেনেটিক ট্রি MEGA11 (Tamura et al., 2021) এবং JTT ম্যাট্রিক্স-ভিত্তিক মডেল (Jones et al., 1992) ব্যবহার করে সর্বাধিক সম্ভাবনা পদ্ধতি ব্যবহার করে অনুমান করা হয়েছিল। ফাইলোজেনেটিক ট্রিটি S. sclerotiorum থেকে ভবিষ্যদ্বাণী করা সমস্ত OAH জিনের (SsOAH) প্রোটিন সিকোয়েন্সের একাধিক অ্যালাইনমেন্ট বিশ্লেষণ এবং Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos and Agarwala, 2007) ব্যবহার করে কোয়েরি সিকোয়েন্সের সাথে একত্রিত করা হয়েছিল। এছাড়াও, S. sclerotiorum থেকে SsOAH-এর সেরা মিলিত অ্যামিনো অ্যাসিড সিকোয়েন্সগুলি ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) ব্যবহার করে কোয়েরি সিকোয়েন্সগুলির (AfOAH এবং PlOAH) (Larkin et al., 2007) সাথে সারিবদ্ধ করা হয়েছিল, এবং ESPript টুল (সংস্করণ 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) ব্যবহার করে সারিবদ্ধকরণে সংরক্ষিত অঞ্চলগুলি ভিজ্যুয়ালাইজ করা হয়েছিল।
তদুপরি, S. sclerotiorum SsOAH-এর পূর্বাভাসিত কার্যকরী প্রতিনিধিত্বমূলক ডোমেন এবং সংরক্ষিত স্থানগুলিকে InterPro টুল (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021) ব্যবহার করে বিভিন্ন পরিবারে ইন্টারেক্টিভভাবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল। অবশেষে, প্রোটিন হোমোলজি/অ্যানালোজি রিকগনিশন ইঞ্জিন (Phyre2 সার্ভার সংস্করণ 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) ব্যবহার করে পূর্বাভাসিত S. sclerotiorum SsOAH-এর ত্রিমাত্রিক (3D) কাঠামো মডেলিং করা হয়েছিল এবং SWISS-MODEL সার্ভার (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014) ব্যবহার করে যাচাই করা হয়েছিল। পূর্বাভাসিত ত্রিমাত্রিক কাঠামো (PDB ফর্ম্যাট) UCSF-Chimera প্যাকেজ (সংস্করণ 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004) ব্যবহার করে ইন্টারেক্টিভভাবে ভিজ্যুয়ালাইজ করা হয়েছিল।
স্ক্লেরোটিনিয়া স্ক্লেরোটিওরামের মাইসেলিয়ায় অক্সালোএসেটেট অ্যাসিটাইলহাইড্রোলেজের (SsOAH; জেনব্যাঙ্ক অ্যাকসেসন নম্বর: XM_001590428.1) ট্রান্সক্রিপশনাল স্তর নির্ধারণের জন্য পরিমাণগত রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্স পিসিআর ব্যবহার করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, এস. স্ক্লেরোটিওরামকে PDB ধারণকারী একটি ফ্লাস্কে টিকা দেওয়া হয়েছিল এবং একটি কাঁপানো ইনকিউবেটারে (মডেল: I2400, নিউ ব্রান্সউইক সায়েন্টিফিক কোং, এডিসন, এনজে, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) 25 ± 2 °C তাপমাত্রায় 150 rpm এ 24 ঘন্টা এবং ধ্রুবক অন্ধকারে (24 ঘন্টা) স্থাপন করা হয়েছিল যাতে মাইসেলিয়াল বৃদ্ধি উদ্দীপিত হয়। এরপর, কোষগুলিকে চূড়ান্ত IC50 ঘনত্বে (প্রায় 40 এবং 3.2 মিলিগ্রাম/লিটার) L-অরনিথাইন এবং ছত্রাকনাশক রিজোলেক্স-টি দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং তারপরে একই পরিস্থিতিতে আরও 24 ঘন্টার জন্য কালচার করা হয়েছিল। ইনকিউবেশনের পর, কালচারগুলিকে 5 মিনিটের জন্য 2500 rpm-এ সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং জিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণের জন্য সুপারনেট্যান্ট (ছত্রাক মাইসেলিয়াম) সংগ্রহ করা হয়েছিল। একইভাবে, সংক্রামিত টিস্যুর পৃষ্ঠে সাদা ছাঁচ এবং তুলা মাইসেলিয়াম তৈরি করা সংক্রামিত উদ্ভিদ থেকে 0, 24, 48, 72, 96 এবং 120 ঘন্টা সংক্রমণের পরে ছত্রাক মাইসেলিয়াম সংগ্রহ করা হয়েছিল। ছত্রাক মাইসেলিয়াম থেকে RNA বের করা হয়েছিল এবং তারপরে উপরে বর্ণিত হিসাবে cDNA সংশ্লেষিত করা হয়েছিল। SsOAH-এর জন্য প্রাইমার সিকোয়েন্সগুলি পরিপূরক সারণি S3-তে তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। SsActin (GenBank অ্যাকসেসন নম্বর: XM_001589919.1) গৃহস্থালি জিন হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল এবং 2-ΔΔΔCT পদ্ধতি ব্যবহার করে আপেক্ষিক জিন এক্সপ্রেশন গণনা করা হয়েছিল (Livak and Schmittgen, 2001)।
জু এবং ঝাং (২০০০) এর পদ্ধতি অনুসারে আলু ডেক্সট্রোজ ব্রোথ (PDB) এবং ছত্রাকজনিত রোগজীবাণু স্ক্লেরোটিনিয়া স্ক্লেরোটিওরাম ধারণকারী উদ্ভিদের নমুনায় অক্সালিক অ্যাসিড নির্ধারণ করা হয়েছিল সামান্য পরিবর্তনের মাধ্যমে। সংক্ষেপে, S. স্ক্লেরোটিওরাম আইসোলেটগুলিকে PDB ধারণকারী ফ্লাস্কে টিকা দেওয়া হয়েছিল এবং তারপর একটি কাঁপানো ইনকিউবেটারে (মডেল I2400, নিউ ব্রান্সউইক সায়েন্টিফিক কোং, এডিসন, এনজে, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) 150 rpm-এ 25 ± 2 °C তাপমাত্রায় 3-5 দিন ধরে ধ্রুবক অন্ধকারে (24 ঘন্টা) মাইসেলিয়াল বৃদ্ধিকে উদ্দীপিত করার জন্য কালচার করা হয়েছিল। ইনকিউবেশনের পরে, ছত্রাক কালচারটি প্রথমে Whatman #1 ফিল্টার পেপারের মাধ্যমে ফিল্টার করা হয়েছিল এবং তারপর অবশিষ্ট মাইসেলিয়াম অপসারণের জন্য 5 মিনিটের জন্য 2500 rpm-এ সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। অক্সালেটের আরও পরিমাণগত নির্ধারণের জন্য সুপারন্যাট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং 4°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল। উদ্ভিদের নমুনা তৈরির জন্য, প্রায় 0.1 গ্রাম উদ্ভিদ টিস্যুর টুকরো তিনবার পাতিত জল (প্রতিবার 2 মিলি) দিয়ে বের করা হয়েছিল। এরপর নমুনাগুলিকে ৫ মিনিটের জন্য ২৫০০ আরপিএম-এ সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল, সুপারনেট্যান্টকে হোয়াটম্যান নং ১ ফিল্টার পেপারের মাধ্যমে শুকিয়ে ফিল্টার করা হয়েছিল এবং আরও বিশ্লেষণের জন্য সংগ্রহ করা হয়েছিল।
অক্সালিক অ্যাসিডের পরিমাণগত বিশ্লেষণের জন্য, বিক্রিয়া মিশ্রণটি একটি কাচের স্টপারড টিউবে নিম্নলিখিত ক্রমে প্রস্তুত করা হয়েছিল: 0.2 মিলি নমুনা (অথবা PDB কালচার ফিল্টারেট বা অক্সালিক অ্যাসিড স্ট্যান্ডার্ড দ্রবণ), 0.11 মিলি ব্রোমোফেনল ব্লু (BPB, 1 mM; ফিশার কেমিক্যাল, পিটসবার্গ, PA, USA), 0.198 মিলি 1 M সালফিউরিক অ্যাসিড (H2SO4; আল-গোমোরিয়া ফার্মাসিউটিক্যালস অ্যান্ড মেডিকেল সাপ্লাইস, কায়রো, মিশর) এবং 0.176 মিলি 100 mM পটাসিয়াম ডাইক্রোমেট (K2Cr2O7; TCI কেমিক্যালস, পোর্টল্যান্ড, OR, USA), এবং তারপর দ্রবণটি পাতিত জলের সাথে 4.8 মিলি মিশ্রিত করা হয়েছিল, জোরে মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং অবিলম্বে 60 °C জল স্নানে রাখা হয়েছিল। 10 মিনিট পরে, 0.5 মিলি সোডিয়াম হাইড্রোক্সাইড দ্রবণ (NaOH; 0.75 M) যোগ করে বিক্রিয়া বন্ধ করা হয়েছিল। UV-160 স্পেকট্রোফটোমিটার (শিমাডজু কর্পোরেশন, জাপান) ব্যবহার করে বিক্রিয়ার মিশ্রণের শোষণ (A600) 600 nm পরিমাপ করা হয়েছিল। কালচার ফিল্টারেট এবং উদ্ভিদের নমুনার পরিমাণ নির্ধারণের জন্য যথাক্রমে PDB এবং পাতিত জল ব্যবহার করা হয়েছিল। কালচার ফিল্টারেটে অক্সালিক অ্যাসিডের ঘনত্ব, যা PDB মাধ্যমের প্রতি মিলিলিটারে মাইক্রোগ্রাম অক্সালিক অ্যাসিড (μg.mL−1) হিসাবে প্রকাশ করা হয়, এবং পাতার নির্যাসে, যা তাজা ওজনের প্রতি গ্রাম (μg.g−1 FW) হিসাবে মাইক্রোগ্রাম অক্সালিক অ্যাসিড হিসাবে প্রকাশ করা হয়, একটি অক্সালিক অ্যাসিড ক্যালিব্রেশন বক্ররেখা (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক কেমিক্যালস, ওয়ালথাম, এমএ, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল।
সমগ্র গবেষণা জুড়ে, সমস্ত পরীক্ষা-নিরীক্ষা সম্পূর্ণরূপে এলোমেলোভাবে তৈরি নকশা (CRD) আকারে ডিজাইন করা হয়েছিল, যেখানে প্রতি চিকিৎসায় ছয়টি জৈবিক প্রতিলিপি এবং প্রতি জৈবিক প্রতিলিপিতে পাঁচটি পাত্র (প্রতি পাত্রে দুটি উদ্ভিদ) ব্যবহার করা হয়েছিল, যদি না অন্যথায় বলা হয়। জৈবিক প্রতিলিপিগুলিকে সদৃশ (দুটি প্রযুক্তিগত প্রতিলিপি) বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। একই পরীক্ষার পুনরুৎপাদনযোগ্যতা পরীক্ষা করার জন্য প্রযুক্তিগত প্রতিলিপি ব্যবহার করা হয়েছিল কিন্তু জাল প্রতিলিপি এড়াতে পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণে ব্যবহার করা হয়নি। ডেটা পরিসংখ্যানগতভাবে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল ভ্যারিয়েন্স বিশ্লেষণ (ANOVA) ব্যবহার করে এবং তারপরে টুকি-ক্রামার সত্যিকার অর্থে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য (HSD) পরীক্ষা (p ≤ 0.05) ব্যবহার করে। ইন ভিট্রো পরীক্ষার জন্য, IC50 এবং IC99 মানগুলি প্রোবিট মডেল ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল এবং 95% আত্মবিশ্বাস ব্যবধান গণনা করা হয়েছিল।
মিশরের এল গাবিয়া গভর্নরেটের বিভিন্ন সয়াবিন ক্ষেত থেকে মোট চারটি আইসোলেট সংগ্রহ করা হয়েছিল। পিডিএ মাধ্যমে, সমস্ত আইসোলেট ক্রিমি সাদা মাইসেলিয়াম তৈরি করেছিল যা দ্রুত তুলা সাদা হয়ে যায় (চিত্র 1A) এবং তারপর স্ক্লেরোটিয়াম পর্যায়ে বেইজ বা বাদামী। স্ক্লেরোটিয়া সাধারণত ঘন, কালো, গোলাকার বা অনিয়মিত আকারের হয়, 5.2 থেকে 7.7 মিমি লম্বা এবং 3.4 থেকে 5.3 মিমি ব্যাস (চিত্র 1B)। যদিও চারটি আইসোলেট 25 ± 2 °C তাপমাত্রায় 10-12 দিন ইনকিউবেশনের পরে কালচার মাধ্যমের প্রান্তে স্ক্লেরোটিয়ার একটি প্রান্তিক প্যাটার্ন তৈরি করেছিল (চিত্র 1A), প্রতি প্লেটে স্ক্লেরোটিয়ার সংখ্যা তাদের মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে আলাদা ছিল (P < 0.001), আইসোলেট 3-তে স্ক্লেরোটিয়ার সর্বাধিক সংখ্যা ছিল (প্রতি প্লেটে 32.33 ± 1.53 স্ক্লেরোটিয়া; চিত্র 1C)। একইভাবে, আইসোলেট #3 অন্যান্য আইসোলেটের তুলনায় PDB তে বেশি অক্সালিক অ্যাসিড উৎপন্ন করে (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; চিত্র 1D)। আইসোলেট #3 ফাইটোপ্যাথোজেনিক ছত্রাক স্ক্লেরোটিনিয়া স্ক্লেরোটিওরামের সাধারণ রূপগত এবং আণুবীক্ষণিক বৈশিষ্ট্য দেখিয়েছে। উদাহরণস্বরূপ, PDA তে, আইসোলেট #3 এর উপনিবেশগুলি দ্রুত বৃদ্ধি পায়, ক্রিমি সাদা (চিত্র 1A), বিপরীত বেইজ বা হালকা স্যামন হলুদ-বাদামী ছিল এবং 9 সেমি ব্যাসের প্লেটের পৃষ্ঠকে সম্পূর্ণরূপে ঢেকে দিতে 25 ± 2°C তাপমাত্রায় 6-7 দিন সময় লাগে। উপরের রূপগত এবং আণুবীক্ষণিক বৈশিষ্ট্যের উপর ভিত্তি করে, আইসোলেট #3 কে স্ক্লেরোটিনিয়া স্ক্লেরোটিওরাম হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছিল।
চিত্র ১. সাধারণ শিমজাতীয় ফসল থেকে S. স্ক্লেরোটিওরাম আইসোলেটের বৈশিষ্ট্য এবং রোগজীবাণু। (A) PDA মাধ্যমে চারটি S. স্ক্লেরোটিওরাম আইসোলেটের মাইসেলিয়াল বৃদ্ধি, (B) চারটি S. স্ক্লেরোটিওরাম আইসোলেটের স্ক্লেরোটিয়া, (C) প্রতি প্লেটে স্ক্লেরোটিয়ার সংখ্যা (), (D) PDB মাধ্যমে অক্সালিক অ্যাসিড নিঃসরণ (μg.mL−1), এবং (E) গ্রিনহাউস পরিস্থিতিতে সংবেদনশীল বাণিজ্যিক শিমজাতীয় জাত গিজা 3-তে চারটি S. স্ক্লেরোটিওরাম আইসোলেটের রোগের তীব্রতা (%)। মানগুলি পাঁচটি জৈবিক প্রতিলিপির গড় ± SD প্রতিনিধিত্ব করে (n = 5)। বিভিন্ন অক্ষর চিকিত্সার মধ্যে পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (p < 0.05)। (F–H) আইসোলেট #3 (dpi) দিয়ে টিকা দেওয়ার 10 দিন পরে যথাক্রমে মাটির উপরের কান্ড এবং সিলিকগুলিতে সাধারণ সাদা ছাঁচের লক্ষণ দেখা দেয়। (I) S. sclerotiorum isolate #3 এর অভ্যন্তরীণ ট্রান্সক্রাইবড স্পেসার (ITS) অঞ্চলের বিবর্তনীয় বিশ্লেষণ সর্বাধিক সম্ভাবনা পদ্ধতি ব্যবহার করে সম্পাদিত হয়েছিল এবং ন্যাশনাল সেন্টার ফর বায়োটেকনোলজি ইনফরমেশন (NCBI) ডাটাবেস (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) থেকে প্রাপ্ত 20টি রেফারেন্স আইসোলেট/স্ট্রেনের সাথে তুলনা করা হয়েছিল। ক্লাস্টারিং লাইনের উপরের সংখ্যাগুলি অঞ্চলের কভারেজ (%) নির্দেশ করে এবং ক্লাস্টারিং লাইনের নীচের সংখ্যাগুলি শাখার দৈর্ঘ্য নির্দেশ করে।
অধিকন্তু, রোগজীবাণু নিশ্চিত করার জন্য, চারটি প্রাপ্ত S. sclerotiorum আইসোলেট ব্যবহার করে গ্রিনহাউস পরিস্থিতিতে সংবেদনশীল বাণিজ্যিক শিমের জাত Giza 3 টিকা দেওয়া হয়, যা কোচের অনুমানের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ (চিত্র 1E)। যদিও প্রাপ্ত সমস্ত ছত্রাক আইসোলেট রোগজীবাণু ছিল এবং সবুজ শিমকে (cv. Giza 3) সংক্রামিত করতে পারে, যার ফলে মাটির উপরের সমস্ত অংশে (চিত্র 1F), বিশেষ করে কান্ডে (চিত্র 1G) এবং শুঁটিতে (চিত্র 1H) টিকা দেওয়ার 10 দিন পরে (dpi), সাধারণ সাদা ছত্রাকের লক্ষণ দেখা দেয়, দুটি স্বাধীন পরীক্ষায় আইসোলেট 3 ছিল সবচেয়ে আক্রমণাত্মক আইসোলেট। শিম গাছে আইসোলেট 3-এর রোগের তীব্রতা (%) সর্বোচ্চ ছিল (যথাক্রমে 7, 14 এবং 21 দিন পরে 24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, এবং 76.7 ± 3.1; চিত্র 1F)।
অভ্যন্তরীণ ট্রান্সক্রিপশন স্পেসার (ITS) সিকোয়েন্সিং (চিত্র 1I) এর উপর ভিত্তি করে সবচেয়ে আক্রমণাত্মক S. স্ক্লেরোটিওরাম আইসোলেট #3 এর সনাক্তকরণ আরও নিশ্চিত করা হয়েছে। আইসোলেট #3 এবং 20 রেফারেন্স আইসোলেট/স্ট্রেনের মধ্যে ফাইলোজেনেটিক বিশ্লেষণে তাদের মধ্যে উচ্চ মিল (>99%) দেখা গেছে। এটি লক্ষণীয় যে S. স্ক্লেরোটিওরাম আইসোলেট #3 (533 bp) এর সাথে শুকনো মটর বীজ থেকে বিচ্ছিন্ন আমেরিকান S. স্ক্লেরোটিওরাম আইসোলেট LPM36 (GenBank অ্যাক্সিয়ন নম্বর MK896659.1; 540 bp) এবং চীনা S. স্ক্লেরোটিওরাম আইসোলেট YKY211 (GenBank অ্যাক্সিয়ন নম্বর OR206374.1; 548 bp) এর উচ্চ মিল রয়েছে, যা ভায়োলেট (ম্যাথিওলা ইনকানা) কাণ্ড পচা সৃষ্টি করে, যার সবকটি ডেনড্রোগ্রামের শীর্ষে পৃথকভাবে গোষ্ঠীভুক্ত করা হয়েছে (চিত্র 1I)। নতুন সিকোয়েন্সটি NCBI ডাটাবেসে জমা করা হয়েছে এবং এর নামকরণ করা হয়েছে “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25” (GenBank accession number PV202792)। দেখা যাচ্ছে যে আইসোলেট 3 হল সবচেয়ে আক্রমণাত্মক আইসোলেট; তাই, পরবর্তী সমস্ত পরীক্ষায় এই আইসোলেটটি অধ্যয়নের জন্য বেছে নেওয়া হয়েছিল।
S. sclerotiorum isolate 3 এর বিরুদ্ধে বিভিন্ন ঘনত্বে (12.5, 25, 50, 75, 100 এবং 125 mg/L) ডায়ামিন L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) এর ব্যাকটেরিয়ারোধী কার্যকলাপ ইন ভিট্রোতে পরীক্ষা করা হয়েছিল। এটি উল্লেখযোগ্য যে L-ornithine একটি ব্যাকটেরিয়ারোধী প্রভাব ফেলে এবং ধীরে ধীরে ডোজ-নির্ভর পদ্ধতিতে S. sclerotiorum hyphae এর রেডিয়াল বৃদ্ধিকে বাধা দেয় (চিত্র 2A, B)। পরীক্ষিত সর্বোচ্চ ঘনত্বে (125 mg/L), L-ornithine সর্বোচ্চ মাইসেলিয়াল বৃদ্ধি বাধা হার (99.62 ± 0.27%; চিত্র 2B) প্রদর্শন করেছে, যা পরীক্ষিত সর্বোচ্চ ঘনত্বে (10 mg/L) বাণিজ্যিক ছত্রাকনাশক Rizolex-T (বাধা হার 99.45 ± 0.39%; চিত্র 2C) এর সমতুল্য ছিল, যা একই রকম কার্যকারিতা নির্দেশ করে।
চিত্র ২. স্ক্লেরোটিনিয়া স্ক্লেরোটিওরামের বিরুদ্ধে এল-অরনিথিনের ইন ভিট্রো অ্যান্টিব্যাকটেরিয়াল কার্যকলাপ। (ক) বাণিজ্যিক ছত্রাকনাশক রিজোলেক্স-টি (১০ মিলিগ্রাম/লিটার) এর সাথে এস. স্ক্লেরোটিওরামের বিরুদ্ধে এল-অরনিথিনের বিভিন্ন ঘনত্বের অ্যান্টিব্যাকটেরিয়াল কার্যকলাপের তুলনা। (খ, গ) যথাক্রমে এল-অরনিথিন (১২.৫, ২৫, ৫০, ৭৫, ১০০ এবং ১২৫ মিলিগ্রাম/লিটার) অথবা রিজোলেক্স-টি (২, ৪, ৬, ৮ এবং ১০ মিলিগ্রাম/লিটার) এর বিভিন্ন ঘনত্বের সাথে চিকিত্সার পরে এস. স্ক্লেরোটিওরাম মাইসেলিয়াল বৃদ্ধির বাধা হার (%)। মানগুলি পাঁচটি জৈবিক প্রতিরূপের গড় ± SD (n = 5) প্রতিনিধিত্ব করে। বিভিন্ন অক্ষর চিকিত্সার মধ্যে পরিসংখ্যানগত পার্থক্য নির্দেশ করে (p < 0.05)। (ঘ, ই) যথাক্রমে এল-অরনিথিন এবং বাণিজ্যিক ছত্রাকনাশক রিজোলেক্স-টি এর প্রোবিট মডেল রিগ্রেশন বিশ্লেষণ। প্রোবিট মডেল রিগ্রেশন লাইনটি একটি শক্ত নীল রেখা হিসাবে দেখানো হয়েছে, এবং আত্মবিশ্বাসের ব্যবধান (95%) একটি ড্যাশযুক্ত লাল রেখা হিসাবে দেখানো হয়েছে।
এছাড়াও, প্রোবিট রিগ্রেশন বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং সংশ্লিষ্ট প্লটগুলি সারণি 1 এবং চিত্র 2D,E তে দেখানো হয়েছে। সংক্ষেপে, L-অরনিথিনের গ্রহণযোগ্য ঢাল মান (y = 2.92x − 4.67) এবং সংশ্লিষ্ট উল্লেখযোগ্য পরিসংখ্যান (কক্স এবং স্নেল R2 = 0.3709, নাগেলকার্কে R2 = 0.4998 এবং p < 0.0001; চিত্র 2D) বাণিজ্যিক ছত্রাকনাশক রিজোলেক্স-টি (y = 1.96x − 0.99, কক্স এবং স্নেল R2 = 0.1242, নাগেলকার্কে R2 = 0.1708 এবং p < 0.0001) (সারণী 1) এর তুলনায় S. স্ক্লেরোটিওরামের বিরুদ্ধে বর্ধিত অ্যান্টিফাঙ্গাল কার্যকলাপ নির্দেশ করে।
সারণী ১. এস. স্ক্লেরোটিওরামের বিরুদ্ধে এল-অরনিথিন এবং বাণিজ্যিক ছত্রাকনাশক "রিজোলেক্স-টি" এর অর্ধ-সর্বোচ্চ প্রতিরোধমূলক ঘনত্ব (IC50) এবং IC99 (mg/l) এর মান।
সামগ্রিকভাবে, L-অরনিথাইন (250 মিলিগ্রাম/লিটার) চিকিৎসা না করা সাধারণ শিম গাছে সাদা ছত্রাকের বিকাশ এবং তীব্রতা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করেছে, যা S. sclerotiorum-সংক্রামিত উদ্ভিদের তুলনায় (নিয়ন্ত্রণ; চিত্র 3A)। সংক্ষেপে, যদিও চিকিৎসা না করা সংক্রামিত নিয়ন্ত্রণ উদ্ভিদের রোগের তীব্রতা ধীরে ধীরে বৃদ্ধি পেয়েছে (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, এবং 92.33 ± 3.06%), L-অরনিথাইন পরীক্ষা জুড়ে রোগের তীব্রতা (%) উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করেছে (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, এবং 26.36 ± 3.07) যথাক্রমে 7, 14 এবং 21 দিন পরে (dpt) (চিত্র 3A)। একইভাবে, যখন S. sclerotiorum-সংক্রামিত শিম গাছগুলিকে 250 mg/L L-ornithine দিয়ে চিকিৎসা করা হয়েছিল, তখন রোগের অগ্রগতি বক্ররেখা (AUDPC) এর আওতাধীন এলাকা অপরিশোধিত নিয়ন্ত্রণে 1274.33 ± 33.13 থেকে কমে 281.03 ± 7.95 এ দাঁড়িয়েছে, যা ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ 50 mg/L Rizolex-T ছত্রাকনাশকের (183.61 ± 7.71; চিত্র 3B) তুলনায় সামান্য কম ছিল। দ্বিতীয় পরীক্ষায়ও একই প্রবণতা লক্ষ্য করা গেছে।
চিত্র ৩. গ্রিনহাউস পরিস্থিতিতে স্ক্লেরোটিনিয়া স্ক্লেরোটিওরাম দ্বারা সৃষ্ট সাধারণ শিমের সাদা পচনের বিকাশের উপর এল-অরনিথিনের বহিরাগত প্রয়োগের প্রভাব। (ক) ২৫০ মিলিগ্রাম/লিটার এল-অরনিথিন দিয়ে চিকিত্সার পরে সাধারণ শিমের সাদা ছাঁচের রোগের অগ্রগতি বক্ররেখা। (খ) এল-অরনিথিন দিয়ে চিকিত্সার পরে সাধারণ শিমের সাদা ছাঁচের রোগের অগ্রগতি বক্ররেখা (AUDPC) এর অধীনে এলাকা। মানগুলি পাঁচটি জৈবিক প্রতিরূপের গড় ± SD (n = 5) প্রতিনিধিত্ব করে। বিভিন্ন অক্ষর চিকিত্সার মধ্যে পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (p < 0.05)।
৪২ দিন পর, বহির্মুখীভাবে ২৫০ মিলিগ্রাম/লিটার এল-অরনিথিন প্রয়োগের ফলে গাছের উচ্চতা (চিত্র ৪ক), প্রতি গাছে শাখা-প্রশাখার সংখ্যা (চিত্র ৪খ) এবং প্রতি গাছে পাতার সংখ্যা (চিত্র ৪গ) ধীরে ধীরে বৃদ্ধি পায়। বাণিজ্যিক ছত্রাকনাশক রিজোলেক্স-টি (৫০ মিলিগ্রাম/লিটার) অধ্যয়ন করা সমস্ত পুষ্টির পরামিতিগুলির উপর সর্বাধিক প্রভাব ফেলেছে, তবে অপরিশোধিত নিয়ন্ত্রণের তুলনায় বহির্মুখীভাবে ২৫০ মিলিগ্রাম/লিটার এল-অরনিথিন প্রয়োগ দ্বিতীয় সর্বোচ্চ প্রভাব ফেলেছে (চিত্র ৪ক-সি)। অন্যদিকে, এল-অরনিথিন চিকিৎসায় সালোকসংশ্লেষী রঙ্গক ক্লোরোফিল a (চিত্র 4D) এবং ক্লোরোফিল b (চিত্র 4E) এর পরিমাণের উপর কোন উল্লেখযোগ্য প্রভাব পড়েনি, তবে নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) এবং ধনাত্মক নিয়ন্ত্রণ (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; চিত্র 4F) এর তুলনায় মোট ক্যারোটিনয়েডের পরিমাণ (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) সামান্য বৃদ্ধি পেয়েছে। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে এল-অরনিথিন চিকিৎসা করা শিমের জন্য ফাইটোটক্সিক নয় এবং এমনকি তাদের বৃদ্ধিকে উদ্দীপিত করতে পারে।
চিত্র ৪. গ্রিনহাউস পরিস্থিতিতে স্ক্লেরোটিনিয়া স্ক্লেরোটিওরাম দ্বারা সংক্রামিত শিমের পাতার বৃদ্ধির বৈশিষ্ট্য এবং সালোকসংশ্লেষণকারী রঞ্জকগুলির উপর বহিরাগত এল-অরনিথিন প্রয়োগের প্রভাব। (ক) গাছের উচ্চতা (সেমি), (খ) প্রতি গাছে শাখা-প্রশাখার সংখ্যা, (গ) প্রতি গাছে পাতার সংখ্যা, (ঘ) ক্লোরোফিল a এর পরিমাণ (mg g-1 fr wt), (ঙ) ক্লোরোফিল b এর পরিমাণ (mg g-1 fr wt), (চ) মোট ক্যারোটিনয়েডের পরিমাণ (mg g-1 fr wt)। মানগুলি হল পাঁচটি জৈবিক প্রতিলিপির গড় ± SD (n = 5)। বিভিন্ন অক্ষর চিকিত্সার মধ্যে পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (p < 0.05)।
প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতির (ROS; হাইড্রোজেন পারক্সাইড [H2O2] হিসাবে প্রকাশিত) এবং মুক্ত র‍্যাডিকেলগুলির (সুপারঅক্সাইড অ্যানিয়ন [O2•−] হিসাবে প্রকাশিত) ইন সিটু হিস্টোকেমিক্যাল স্থানীয়করণ থেকে জানা গেছে যে L-অরনিথিনের (250 mg/L) বহিরাগত প্রয়োগ H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; চিত্র 5A) এবং O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; চিত্র 5B) জমা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করেছে, অপরিশোধিত সংক্রামিত উদ্ভিদ (যথাক্রমে 173.31 ± 12.06 এবং 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) এবং বাণিজ্যিক ছত্রাকনাশক Rizolex-T (170.12 ± 9.50 এবং 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt) 50 mg/L দিয়ে চিকিত্সা করা উদ্ভিদের জমার তুলনায়, যথাক্রমে) ৭২ ঘন্টায়। hpt এর অধীনে H2O2 এবং O2•− এর উচ্চ মাত্রা জমা হয় (চিত্র ৫A, B)। একইভাবে, TCA-ভিত্তিক ম্যালোনডায়ালডিহাইড (MDA) পরীক্ষায় দেখা গেছে যে S. sclerotiorum-সংক্রামিত শিম গাছগুলি তাদের পাতায় MDA (১১৩.৪৮ ± ১০.০২ nmol.g fr wt) এর উচ্চ মাত্রা জমা করে (চিত্র ৫C)। তবে, L-অরনিথিনের বহিরাগত প্রয়োগ লিপিড পারক্সিডেশন উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করে যা চিকিত্সা করা উদ্ভিদে MDA সামগ্রী হ্রাস দ্বারা প্রমাণিত হয় (৩৩.০৮ ± ৪.০০ nmol.g fr wt)।
চিত্র ৫. গ্রিনহাউস পরিস্থিতিতে সংক্রমণের ৭২ ঘন্টা পরে S. sclerotiorum দ্বারা সংক্রামিত শিমের পাতায় অক্সিডেটিভ স্ট্রেস এবং নন-এনজাইমেটিক অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট প্রতিরক্ষা ব্যবস্থার প্রধান চিহ্নিতকারীর উপর বহিরাগত L-অরনিথাইন প্রয়োগের প্রভাব। (A) হাইড্রোজেন পারক্সাইড (H2O2; nmol g−1 FW) ৭২ hpt এ, (B) সুপারঅক্সাইড অ্যানিয়ন (O2•−; nmol g−1 FW) ৭২ hpt এ, (C) ম্যালোন্ডিয়ালডিহাইড (MDA; nmol g−1 FW) ৭২ hpt এ, (D) মোট দ্রবণীয় ফেনল (mg GAE g−1 FW) ৭২ hpt এ, (E) মোট দ্রবণীয় ফ্ল্যাভোনয়েড (mg RE g−1 FW) ৭২ hpt এ, (F) মোট মুক্ত অ্যামিনো অ্যাসিড (mg g−1 FW) ৭২ hpt এ, এবং (G) প্রোলিন সামগ্রী (mg g−1 FW) ৭২ hpt এ। মানগুলি ৫টি জৈবিক প্রতিরূপের (n = ৫) গড় ± আদর্শ বিচ্যুতি (গড় ± SD) প্রতিনিধিত্ব করে। বিভিন্ন অক্ষর চিকিৎসার মধ্যে পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (p < 0.05)।