আমরা পূর্বে জানিয়েছিলাম যে লিভার ফাইব্রোসিসে আক্রান্ত রোগীদের সিরামে অন্ত্র থেকে উৎপন্ন ট্রিপটোফ্যান মেটাবোলাইট ইন্ডোল-৩-প্রোপিওনিক অ্যাসিড (IPA)-এর মাত্রা কম থাকে। এই গবেষণায়, আমরা সিরাম IPA-এর মাত্রার সাপেক্ষে স্থূল লিভারের ট্রান্সক্রিপ্টোম ও ডিএনএ মিথাইলোম এবং ইন ভিট্রোতে হেপাটিক স্টেলেট সেল (HSC)-এর ফিনোটাইপিক নিষ্ক্রিয়করণে IPA-এর ভূমিকা অনুসন্ধান করেছি।
এই গবেষণায় টাইপ ২ ডায়াবেটিস মেলিটাস (T2DM) বিহীন ১১৬ জন স্থূলকায় রোগী (বয়স ৪৬.৮ ± ৯.৩ বছর; বিএমআই: ৪২.৭ ± ৫.০ কেজি/মি²) অন্তর্ভুক্ত ছিলেন, যারা কুওপিও ব্যারিয়াট্রিক সার্জারি সেন্টারে (KOBS) ব্যারিয়াট্রিক সার্জারি করিয়েছিলেন। লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি-মাস স্পেকট্রোমেট্রি (LC-MS) দ্বারা রক্তে সঞ্চালিত আইপিএ (IPA)-এর মাত্রা পরিমাপ করা হয়েছিল, টোটাল আরএনএ সিকোয়েন্সিং দ্বারা লিভার ট্রান্সক্রিপটোম বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং ইনফিনিয়াম হিউম্যানমিথাইলেশন৪৫০ বিডচিপ ব্যবহার করে ডিএনএ মিথাইলেশন বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ইন ভিট্রো পরীক্ষাগুলোর জন্য হিউম্যান হেপাটিক স্টেলেট সেল (LX-2) ব্যবহার করা হয়েছিল।
সিরাম আইপিএ-এর মাত্রা লিভারে অ্যাপোপটোটিক, মাইটোফ্যাজিক এবং দীর্ঘায়ু পথের সাথে জড়িত জিনগুলির অভিব্যক্তির সাথে সম্পর্কযুক্ত ছিল। লিভারের ট্রান্সক্রিপ্ট এবং ডিএনএ মিথাইলেশন প্রোফাইলে AKT সেরিন/থ্রিওনিন কাইনেজ 1 (AKT1) জিনটি ছিল সবচেয়ে প্রাচুর্যপূর্ণ এবং প্রভাবশালী মিথস্ক্রিয়াকারী জিন। আইপিএ প্রয়োগ LX-2 কোষের ফাইব্রোসিস, অ্যাপোপটোসিস এবং বেঁচে থাকা নিয়ন্ত্রণকারী জিনগুলির অভিব্যক্তি পরিবর্তনের মাধ্যমে অ্যাপোপটোসিসকে প্ররোচিত করে, মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসন হ্রাস করে এবং কোষের আকার ও মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিশীলতায় পরিবর্তন আনে।
সামগ্রিকভাবে, এই তথ্যগুলো সমর্থন করে যে আইপিএ-র সম্ভাব্য চিকিৎসাগত প্রভাব রয়েছে এবং এটি অ্যাপোপটোসিস ঘটাতে ও এইচএসসি ফেনোটাইপকে একটি নিষ্ক্রিয় অবস্থার দিকে নিয়ে যেতে পারে, যার ফলে এইচএসসি সক্রিয়করণ এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল বিপাকে হস্তক্ষেপের মাধ্যমে লিভার ফাইব্রোসিস প্রতিরোধের সম্ভাবনা প্রসারিত হয়।
স্থূলতা এবং মেটাবলিক সিনড্রোমের ব্যাপকতার সাথে বিপাকীয়ভাবে সম্পর্কিত ফ্যাটি লিভার ডিজিজ (MASLD)-এর ক্রমবর্ধমান ঘটনা জড়িত; এই রোগটি সাধারণ জনসংখ্যার ২৫% থেকে ৩০% কে প্রভাবিত করে [1]। MASLD-এর কারণের প্রধান পরিণতি হল লিভার ফাইব্রোসিস, একটি গতিশীল প্রক্রিয়া যা ফাইব্রাস এক্সট্রা সেলুলার ম্যাট্রিক্স (ECM)-এর ক্রমাগত জমার দ্বারা চিহ্নিত [2]। লিভার ফাইব্রোসিসে জড়িত প্রধান কোষগুলি হল হেপাটিক স্টেলেট কোষ (HSC), যা চারটি পরিচিত ফেনোটাইপ প্রদর্শন করে: শান্ত, সক্রিয়, নিষ্ক্রিয় এবং বার্ধক্যপ্রাপ্ত [3, 4]। HSC গুলি সক্রিয় হতে পারে এবং একটি শান্ত অবস্থা থেকে উচ্চ শক্তির চাহিদা সহ প্রসারিত ফাইব্রোব্লাস্ট-সদৃশ কোষে রূপান্তরিত হতে পারে, যেখানে α-স্মুথ মাসল অ্যাক্টিন (α-SMA) এবং টাইপ I কোলাজেন (Col-I)-এর প্রকাশ বৃদ্ধি পায় [5, 6]। লিভার ফাইব্রোসিস বিপরীতকরণের সময়, সক্রিয় HSC গুলি অ্যাপোপটোসিস বা নিষ্ক্রিয়করণের মাধ্যমে নির্মূল করা হয়। এই প্রক্রিয়াগুলির মধ্যে রয়েছে ফাইব্রোজেনিক জিনের ডাউনরেগুলেশন এবং প্রোসারভাইভাল জিনের মডুলেশন (যেমন NF-κB এবং PI3K/Akt সিগন্যালিং পাথওয়ে) [7, 8], পাশাপাশি মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্স এবং কার্যকারিতার পরিবর্তন [9]।
অন্ত্রে উৎপাদিত ট্রিপটোফ্যান মেটাবোলাইট ইন্ডোল-৩-প্রোপিওনিক অ্যাসিড (IPA)-এর সিরামের মাত্রা, MASLD সহ মানুষের বিপাকীয় রোগগুলিতে হ্রাস পেতে দেখা গেছে [10–13]। IPA খাদ্যতালিকাগত ফাইবার গ্রহণের সাথে সম্পর্কিত, এর অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট এবং প্রদাহ-বিরোধী প্রভাবের জন্য পরিচিত, এবং ইন ভিভো এবং ইন ভিট্রোতে ডায়েট-প্ররোচিত নন-অ্যালকোহলিক স্টিয়াটোহেপাটাইটিস (NASH) ফেনোটাইপকে প্রশমিত করে [11–14]। আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণা থেকে কিছু প্রমাণ পাওয়া যায়, যা কুওপিও ব্যারিয়াট্রিক সার্জারি স্টাডি (KOBS)-তে দেখিয়েছে যে লিভার ফাইব্রোসিসবিহীন স্থূল রোগীদের তুলনায় লিভার ফাইব্রোসিসযুক্ত রোগীদের সিরাম IPA-এর মাত্রা কম ছিল। অধিকন্তু, আমরা দেখিয়েছি যে IPA চিকিৎসা একটি মানব হেপাটিক স্টেলেট সেল (LX-2) মডেলে কোষের আনুগত্য, কোষের স্থানান্তর এবং হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল সক্রিয়করণের ক্লাসিক্যাল মার্কার জিনগুলির প্রকাশ কমাতে পারে এবং এটি একটি সম্ভাব্য হেপাটোপ্রোটেক্টিভ মেটাবোলাইট [15]। যাইহোক, IPA কীভাবে HSC অ্যাপোপটোসিস এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল বায়োএনার্জেটিক্স সক্রিয় করার মাধ্যমে লিভার ফাইব্রোসিস রিগ্রেশনকে প্ররোচিত করে তা এখনও অস্পষ্ট।
এখানে, আমরা দেখিয়েছি যে স্থূল কিন্তু টাইপ ২ ডায়াবেটিস-বিহীন (KOBS) ব্যক্তিদের যকৃতে সিরাম আইপিএ অ্যাপোপটোসিস, মাইটোফ্যাজি এবং দীর্ঘায়ু পথের সাথে সম্পর্কিত জিনগুলির অভিব্যক্তির সাথে যুক্ত। অধিকন্তু, আমরা দেখেছি যে আইপিএ নিষ্ক্রিয়করণ পথের মাধ্যমে সক্রিয় হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল (HSC)-এর অপসারণ এবং অবক্ষয় ঘটাতে পারে। এই ফলাফলগুলি আইপিএ-এর একটি নতুন ভূমিকা প্রকাশ করে, যা এটিকে যকৃতের ফাইব্রোসিস হ্রাসে সহায়ক একটি সম্ভাব্য চিকিৎসাগত লক্ষ্যে পরিণত করে।
KOBS কোহর্টের একটি পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে লিভার ফাইব্রোসিসযুক্ত রোগীদের রক্তে IPA-এর মাত্রা লিভার ফাইব্রোসিসবিহীন রোগীদের তুলনায় কম ছিল [15]। টাইপ 2 ডায়াবেটিসের সম্ভাব্য বিভ্রান্তিকর প্রভাব বাদ দেওয়ার জন্য, আমরা চলমান KOBS গবেষণা থেকে টাইপ 2 ডায়াবেটিসবিহীন 116 জন স্থূল রোগীকে (গড় বয়স ± এসডি: 46.8 ± 9.3 বছর; বিএমআই: 42.7 ± 5.0 কেজি/মি²) (সারণী 1) গবেষণার জনসংখ্যা হিসাবে নিয়োগ করেছি [16]। সমস্ত অংশগ্রহণকারী লিখিতভাবে অবহিত সম্মতি দিয়েছেন এবং হেলসিঙ্কি ঘোষণার (54/2005, 104/2008 এবং 27/2010) সাথে সঙ্গতি রেখে উত্তর সাভো কাউন্টি হাসপাতালের নৈতিকতা কমিটি দ্বারা গবেষণা প্রোটোকলটি অনুমোদিত হয়েছিল।
ব্যারিয়াট্রিক সার্জারির সময় লিভার বায়োপসি নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং পূর্বে বর্ণিত মানদণ্ড [17, 18] অনুসারে অভিজ্ঞ প্যাথলজিস্টদের দ্বারা হিস্টোলজিক্যালি মূল্যায়ন করা হয়েছিল। মূল্যায়নের মানদণ্ডগুলি পরিপূরক সারণী S1-এ সংক্ষিপ্ত করা হয়েছে এবং পূর্বে বর্ণনা করা হয়েছে [19]।
মেটাবোলোমিক্স বিশ্লেষণের জন্য উপবাসকালীন সিরামের নমুনাগুলি (n = 116) আনটার্গেটেড লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি-মাস স্পেকট্রোমেট্রি (LC-MS) দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতি¹⁹ অনুযায়ী, নমুনাগুলি একটি UHPLC-qTOF-MS সিস্টেম (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। আইসোপ্রোপাইল অ্যালকোহল (IPA) শনাক্তকরণ রিটেনশন টাইম এবং বিশুদ্ধ স্ট্যান্ডার্ডের সাথে MS/MS স্পেকট্রামের তুলনার উপর ভিত্তি করে করা হয়েছিল। পরবর্তী সমস্ত বিশ্লেষণে IPA সিগন্যালের তীব্রতা (পিক এরিয়া) বিবেচনা করা হয়েছিল [20]।
ইলুমিনা হাইসিক 2500 ব্যবহার করে সম্পূর্ণ লিভারের RNA সিকোয়েন্সিং করা হয়েছিল এবং পূর্বে বর্ণিত [19, 21, 22] পদ্ধতি অনুসারে ডেটা প্রিপ্রসেস করা হয়েছিল। আমরা মাইটোমাইনার 4.0 ডাটাবেস [23] থেকে নির্বাচিত 1957টি জিন ব্যবহার করে মাইটোকন্ড্রিয়াল ফাংশন/বায়োজেনেসিসকে প্রভাবিত করে এমন ট্রান্সক্রিপ্টগুলির টার্গেটেড ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ করেছি। পূর্বে বর্ণিত [24, 25] একই পদ্ধতি ব্যবহার করে ইনফিনিয়াম হিউম্যানমিথাইলেশন450 বিডচিপ (ইলুমিনা, সান দিয়েগো, CA, USA) দিয়ে লিভার ডিএনএ মিথাইলেশন বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
অধ্যাপক স্টেফানো রোমিওর সৌজন্যে মানব হেপাটিক স্টেলেট কোষ (LX-2) সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং সেগুলোকে DMEM/F12 মাধ্যমে (বায়োওয়েস্ট, L0093-500, ১% পেন/স্ট্রেপ; লনজা, DE17-602E, ২% এফবিএস; গিবকো, 10270-106) কালচার ও রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল। IPA-এর কার্যকরী মাত্রা নির্বাচন করার জন্য, LX-2 কোষগুলোকে DMEM/F12 মাধ্যমে ২৪ ঘণ্টার জন্য IPA-এর বিভিন্ন ঘনত্ব (১০ μM, ১০০ μM এবং ১ mM; সিগমা, 220027) দিয়ে ট্রিট করা হয়েছিল। অধিকন্তু, HSC-কে নিষ্ক্রিয় করার ক্ষেত্রে IPA-এর ক্ষমতা তদন্ত করার জন্য, LX-2 কোষগুলোকে সিরাম-মুক্ত মাধ্যমে ২৪ ঘণ্টার জন্য ৫ ng/ml TGF-β1 (R&D সিস্টেমস, 240-B-002/CF) এবং ১ mM IPA দিয়ে সহ-ট্রিট করা হয়েছিল। সংশ্লিষ্ট ভেহিকেল কন্ট্রোলের ক্ষেত্রে, TGF-β1 ট্রিটমেন্টের জন্য 0.1% BSA যুক্ত 4 nM HCL এবং IPA ট্রিটমেন্টের জন্য 0.05% DMSO ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং কম্বিনেশন ট্রিটমেন্টের জন্য উভয়ই একসাথে ব্যবহার করা হয়েছিল।
প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুসারে FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) ব্যবহার করে অ্যাপোপটোসিস মূল্যায়ন করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, LX-2 (১ × ১০⁵ কোষ/কূপ) ১২-কূপ প্লেটে সারারাত ধরে কালচার করা হয়েছিল এবং তারপরে IPA অথবা IPA ও TGF-β1-এর একাধিক ডোজ দিয়ে ট্রিট করা হয়েছিল। পরের দিন, ভাসমান এবং লেগে থাকা কোষগুলি সংগ্রহ করে, ট্রিপসিনাইজ করে, PBS দিয়ে ধুয়ে, Annexin V বাইন্ডিং বাফারে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং FITC-Annexin V ও 7-AAD-এর সাথে ১৫ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল।
জীবন্ত কোষের মাইটোকন্ড্রিয়াকে Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) ব্যবহার করে জারণ ক্রিয়াকলাপের জন্য রঞ্জিত করা হয়েছিল। MTR অ্যাসের জন্য, LX-2 কোষগুলিকে IPA এবং TGF-β1 এর সাথে সমান ঘনত্বে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। 24 ঘন্টা পরে, জীবন্ত কোষগুলিকে ট্রিপসিনাইজ করা হয়েছিল, PBS দিয়ে ধোয়া হয়েছিল এবং তারপরে পূর্বে বর্ণিত [26] অনুযায়ী 37 °C তাপমাত্রায় 20 মিনিটের জন্য সিরাম-মুক্ত মাধ্যমে 100 μM MTR এর সাথে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। জীবন্ত কোষের আকারবিদ্যা বিশ্লেষণের জন্য, কোষের আকার এবং সাইটোপ্লাজমিক জটিলতা যথাক্রমে ফরোয়ার্ড স্ক্যাটার (FSC) এবং সাইড স্ক্যাটার (SSC) প্যারামিটার ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
সমস্ত ডেটা (৩০,০০০ ইভেন্ট) নোভোসাইট কোয়ান্টিওন (অ্যাজিলেন্ট) ব্যবহার করে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং নোভোএক্সপ্রেস® ১.৪.১ অথবা ফ্লোজো ভি.১০ সফটওয়্যার ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুসারে, সিহর্স এক্সএফ সেল মাইটো স্ট্রেস সহ সজ্জিত একটি সিহর্স এক্সট্রাসেলুলার ফ্লাক্স অ্যানালাইজার (অ্যাজিলেন্ট টেকনোলজিস, সান্তা ক্লারা, সিএ) ব্যবহার করে রিয়েল টাইমে অক্সিজেন কনসাম্পশন রেট (OCR) এবং এক্সট্রাসেলুলার অ্যাসিডিফিকেশন রেট (ECAR) পরিমাপ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, XF96 সেল কালচার প্লেটে প্রতি ওয়েলে 2 × 104 LX-2 কোষ স্থাপন করা হয়েছিল। সারারাত ইনকিউবেশনের পর, কোষগুলিকে আইসোপ্রোপানল (IPA) এবং TGF-β1 (পরিপূরক পদ্ধতি 1) দিয়ে ট্রিট করা হয়েছিল। সিহর্স এক্সএফ ওয়েভ সফটওয়্যার ব্যবহার করে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল, যার মধ্যে সিহর্স এক্সএফ সেল এনার্জি ফেনোটাইপ টেস্ট রিপোর্ট জেনারেটর অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। এর থেকে, একটি বায়োএনার্জেটিক হেলথ ইনডেক্স (BHI) গণনা করা হয়েছিল [27]।
মোট RNA থেকে cDNA প্রতিলিপি করা হয়েছিল। নির্দিষ্ট পদ্ধতির জন্য, রেফারেন্স [15] দেখুন। মানব 60S রাইবোসোমাল অ্যাসিডিক প্রোটিন P0 (RPLP0) এবং সাইক্লোফিলিন A1 (PPIA) mRNA স্তরকে কনস্টিটিউটিভ জিন কন্ট্রোল হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল। QuantStudio 6 pro রিয়েল-টাইম PCR সিস্টেম (থার্মো ফিশার, ল্যান্ডসমেয়ার, নেদারল্যান্ডস) TaqMan™ ফাস্ট অ্যাডভান্সড মাস্টার মিক্স কিট (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেমস) অথবা Sensifast SYBR Lo-ROX কিট (বায়োলাইন, BIO 94050) এর সাথে ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং তুলনামূলক Ct মান সাইক্লিং প্যারামিটার (ΔΔCt) এবং ∆∆Ct পদ্ধতি ব্যবহার করে আপেক্ষিক জিন এক্সপ্রেশন ফোল্ড গণনা করা হয়েছিল। প্রাইমারগুলির বিশদ বিবরণ পরিপূরক সারণী S2 এবং S3-তে দেওয়া হয়েছে।
পূর্বে বর্ণিত [28] পদ্ধতি অনুসারে DNeasy ব্লাড অ্যান্ড টিস্যু কিট (Qiagen) ব্যবহার করে নিউক্লিয়ার ডিএনএ (ncDNA) এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ (mtDNA) নিষ্কাশন করা হয়েছিল। পরিপূরক পদ্ধতি 2-এ বিস্তারিতভাবে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে, প্রতিটি লক্ষ্য mtDNA অঞ্চলের সাথে তিনটি নিউক্লিয়ার ডিএনএ অঞ্চলের জ্যামিতিক গড়ের অনুপাত (mtDNA/ncDNA) গণনা করে mtDNA-এর আপেক্ষিক পরিমাণ নির্ণয় করা হয়েছিল। mtDNA এবং ncDNA-এর জন্য প্রাইমারগুলির বিবরণ পরিপূরক সারণী S4-এ প্রদান করা হয়েছে।
আন্তঃকোষীয় এবং অন্তঃকোষীয় মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্ক দেখার জন্য জীবন্ত কোষগুলোকে Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) দিয়ে স্টেইন করা হয়েছিল। LX-2 কোষ (1 × 104 কোষ/কূপ) কাঁচের স্লাইডের উপর সংশ্লিষ্ট কাঁচের তলাযুক্ত কালচার প্লেটে (Ibidi GmbH, Martinsried, Germany) কালচার করা হয়েছিল। 24 ঘন্টা পর, জীবন্ত LX-2 কোষগুলোকে 37 °C তাপমাত্রায় 20 মিনিটের জন্য 100 μM MTR দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল এবং পূর্বে বর্ণিত [29] পদ্ধতি অনুসারে কোষের নিউক্লিয়াস DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) দিয়ে স্টেইন করা হয়েছিল। মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কগুলো একটি Zeiss Axio Observer ইনভার্টেড মাইক্রোস্কোপ (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) ব্যবহার করে দেখা হয়েছিল, যা একটি Zeiss LSM 800 কনফোকাল মডিউল দিয়ে সজ্জিত ছিল। এটি 37 °C তাপমাত্রায় 5% CO2 সহ একটি আর্দ্র পরিবেশে 63×NA 1.3 অবজেক্টিভ ব্যবহার করে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। আমরা প্রতিটি নমুনার প্রকারের জন্য দশটি Z-সিরিজ চিত্র সংগ্রহ করেছি। প্রতিটি Z-সিরিজে 30টি অংশ রয়েছে, যার প্রতিটির পুরুত্ব 9.86 μm। প্রতিটি নমুনার জন্য, ZEN 2009 সফটওয়্যার (কার্ল জাইস মাইক্রোইমেজিং জিএমবিএইচ, জেনা, জার্মানি) ব্যবহার করে দশটি ভিন্ন ফিল্ড অফ ভিউ-এর চিত্র সংগ্রহ করা হয়েছিল, এবং পরিপূরক পদ্ধতি 3-এ বিস্তারিত পরামিতি অনুসারে ইমেজজে সফটওয়্যার (v1.54d) [30, 31] ব্যবহার করে মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
কোষগুলোকে প্রথমে ০.১ M ফসফেট বাফারে ২% গ্লুটারালডিহাইড দিয়ে ফিক্স করা হয়েছিল, এরপর ১% অসমিয়াম টেট্রোক্সাইড দ্রবণ (সিগমা অলড্রিচ, এমও, ইউএসএ) দিয়ে ফিক্সেশন করা হয়, অ্যাসিটোন (মার্ক, ডার্মস্ট্যাড, জার্মানি) দিয়ে ধীরে ধীরে ডিহাইড্রেশন করা হয় এবং সবশেষে ইপোক্সি রেজিনে এমবেড করা হয়। আল্ট্রাথিন সেকশন তৈরি করে ১% ইউরেনাইল অ্যাসিটেট (মার্ক, ডার্মস্ট্যাড, জার্মানি) এবং ১% লেড সাইট্রেট (মার্ক, ডার্মস্ট্যাড, জার্মানি) দিয়ে স্টেইন করা হয়েছিল। ৮০ kV অ্যাক্সিলারেটিং ভোল্টেজে একটি JEM 2100F EXII ট্রান্সমিশন ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপ (জেওল লিমিটেড, টোকিও, জাপান) ব্যবহার করে আল্ট্রাস্ট্রাকচারাল ছবিগুলো সংগ্রহ করা হয়েছিল।
একটি জাইস ইনভার্টেড লাইট মাইক্রোস্কোপ (জাইস অ্যাক্সিও ভার্ট.এ১ এবং অ্যাক্সিওক্যাম এমআরএম, জেনা, জার্মানি) ব্যবহার করে ৫০x বিবর্ধনে ফেজ-কনট্রাস্ট মাইক্রোস্কোপির মাধ্যমে ২৪ ঘণ্টা ধরে আইপিএ দ্বারা ট্রিটমেন্ট করা এলএক্স-২ কোষগুলোর অঙ্গসংস্থান বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
ক্লিনিক্যাল ডেটা গড় ± স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন অথবা মধ্যক (আন্তঃচতুর্থক পরিসর: IQR) হিসেবে প্রকাশ করা হয়েছে। তিনটি স্টাডি গ্রুপের মধ্যে পার্থক্য তুলনা করার জন্য একমুখী বৈশ্লেষিক ভেদ (ধারাবাহিক চলকের ক্ষেত্রে) অথবা χ² পরীক্ষা (শ্রেণীগত চলকের ক্ষেত্রে) ব্যবহার করা হয়েছে। একাধিক পরীক্ষার ত্রুটি সংশোধনের জন্য ফলস পজিটিভ রেট (FDR) ব্যবহার করা হয়েছে এবং যেসব জিনের FDR < ০.০৫, সেগুলোকে পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচনা করা হয়েছে। CpG ডিএনএ মিথাইলেশনের সাথে IPA সিগন্যাল ইনটেনসিটির সম্পর্ক নির্ণয়ের জন্য স্পিয়ারম্যান কোরিলেশন অ্যানালাইসিস ব্যবহার করা হয়েছে এবং নমিনাল p মান (p < ০.০৫) রিপোর্ট করা হয়েছে।
রক্তে সঞ্চারিত সিরাম আইপিএ (IPA) মাত্রার সাথে সম্পর্কিত ৩০৯৩টি লিভার ট্রান্সক্রিপ্টের মধ্যে ২৬৮টি ট্রান্সক্রিপ্ট (নমিনাল পি < ০.০১), ১১৯টি মাইটোকন্ড্রিয়া-সংশ্লিষ্ট ট্রান্সক্রিপ্ট (নমিনাল পি < ০.০৫), এবং ৪৩৫০টি সিজি (CpG)-এর জন্য একটি ওয়েব-ভিত্তিক জিন সেট বিশ্লেষণ টুল (WebGestalt) ব্যবহার করে পাথওয়ে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ওভারল্যাপিং জিন খুঁজে বের করার জন্য বিনামূল্যে উপলব্ধ ভেনি ডিবি (Venny DB) (সংস্করণ ২.১.০) টুলটি এবং প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়াকে দৃশ্যমান করার জন্য স্ট্রিংডিবি (StringDB) (সংস্করণ ১১.৫) ব্যবহার করা হয়েছিল।
LX-2 পরীক্ষার জন্য, ডি'আগোস্টিনো-পিয়ারসন পরীক্ষা ব্যবহার করে নমুনাগুলির স্বাভাবিকতা পরীক্ষা করা হয়েছিল। কমপক্ষে তিনটি জৈবিক প্রতিলিপি থেকে তথ্য সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং বনফেরোনি পোস্ট হক পরীক্ষাসহ একমুখী অ্যানোভা (one-way ANOVA) প্রয়োগ করা হয়েছিল। ০.০৫-এর কম পি-মান পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল। তথ্য গড় ± এসডি (SD) হিসাবে উপস্থাপন করা হয়েছে এবং প্রতিটি চিত্রে পরীক্ষার সংখ্যা নির্দেশ করা হয়েছে। সমস্ত বিশ্লেষণ এবং গ্রাফ উইন্ডোজের জন্য গ্রাফপ্যাড প্রিজম ৮ পরিসংখ্যান সফটওয়্যার (গ্রাফপ্যাড সফটওয়্যার ইনকর্পোরেটেড, সংস্করণ ৮.৪.৩, স্যান ডিয়েগো, ইউএসএ) ব্যবহার করে সম্পন্ন করা হয়েছিল।
প্রথমে, আমরা সিরাম আইপিএ স্তরের সাথে যকৃত, সমগ্র দেহ এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ট্রান্সক্রিপ্টের সম্পর্ক অনুসন্ধান করেছি। মোট ট্রান্সক্রিপ্ট প্রোফাইলে, সিরাম আইপিএ স্তরের সাথে সবচেয়ে শক্তিশালী সম্পর্কযুক্ত জিনটি ছিল MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; মাইটোজেন-অ্যাক্টিভেটেড প্রোটিন কাইনেজ-অ্যাক্টিভেটেড প্রোটিন কাইনেজ 3); মাইটোকন্ড্রিয়া-সম্পর্কিত ট্রান্সক্রিপ্ট প্রোফাইলে, সবচেয়ে শক্তিশালী সম্পর্কযুক্ত জিনটি ছিল AKT1 (FDR = 0.7621; AKT সেরিন/থ্রিওনিন কাইনেজ 1) (অতিরিক্ত ফাইল 1 এবং অতিরিক্ত ফাইল 2)।
এরপর আমরা গ্লোবাল ট্রান্সক্রিপ্ট (n = 268; p < 0.01) এবং মাইটোকন্ড্রিয়া-সম্পর্কিত ট্রান্সক্রিপ্ট (n = 119; p < 0.05) বিশ্লেষণ করি এবং পরিশেষে অ্যাপোপটোসিসকে সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ ক্যানোনিকাল পাথওয়ে (p = 0.0089) হিসেবে চিহ্নিত করি। সিরাম আইপিএ স্তরের সাথে সম্পর্কিত মাইটোকন্ড্রিয়াল ট্রান্সক্রিপ্টগুলোর জন্য, আমরা অ্যাপোপটোসিস (FDR = 0.00001), মাইটোফ্যাজি (FDR = 0.00029), এবং টিএনএফ সিগন্যালিং পাথওয়েগুলোর (FDR = 0.000006) উপর মনোযোগ দিই (চিত্র 1A, সারণি 2, এবং পরিপূরক চিত্র 1A-B)।
সিরাম আইপিএ স্তরের সাথে সম্পর্কিত মানব যকৃতে গ্লোবাল, মাইটোকন্ড্রিয়া-সংশ্লিষ্ট ট্রান্সক্রিপ্ট এবং ডিএনএ মিথাইলেশনের ওভারল্যাপিং বিশ্লেষণ। A-তে ২৬৮টি গ্লোবাল ট্রান্সক্রিপ্ট, ১১৯টি মাইটোকন্ড্রিয়া-সংশ্লিষ্ট ট্রান্সক্রিপ্ট এবং ডিএনএ মিথাইলেটেড ট্রান্সক্রিপ্ট দেখানো হয়েছে, যা সিরাম আইপিএ স্তরের সাথে সম্পর্কিত ৩০৯২টি CpG সাইটে ম্যাপ করা হয়েছে (গ্লোবাল ট্রান্সক্রিপ্ট এবং ডিএনএ মিথাইলেটেড ট্রান্সক্রিপ্টের জন্য p-মান < ০.০১ এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ট্রান্সক্রিপ্টের জন্য p-মান < ০.০৫)। প্রধান ওভারল্যাপিং ট্রান্সক্রিপ্টগুলো মাঝখানে দেখানো হয়েছে (AKT1 এবং YKT6)। B-তে, সিরাম আইপিএ স্তরের সাথে উল্লেখযোগ্যভাবে সম্পর্কিত ৫৬টি ওভারল্যাপিং জিন (কালো রেখা অঞ্চল) থেকে অনলাইন টুল StringDB ব্যবহার করে অন্যান্য জিনের সাথে সর্বোচ্চ ইন্টারঅ্যাকশন স্কোর (০.৯০০) সহ ১৩টি জিনের ইন্টারঅ্যাকশন ম্যাপ তৈরি করা হয়েছে। সবুজ: জিন অনটোলজি (GO) সেলুলার কম্পোনেন্ট: মাইটোকন্ড্রিয়া (GO:0005739)-তে ম্যাপ করা জিনসমূহ। প্রাপ্ত তথ্যের (টেক্সট মাইনিং, পরীক্ষা, ডেটাবেস এবং কো-এক্সপ্রেশনের উপর ভিত্তি করে) উপর নির্ভর করে, অন্যান্য প্রোটিনের সাথে মিথস্ক্রিয়ার জন্য AKT1 হলো সর্বোচ্চ স্কোর (০.৯০০) প্রাপ্ত প্রোটিন। নেটওয়ার্ক নোডগুলো প্রোটিনকে এবং এজগুলো প্রোটিনগুলোর মধ্যকার সংযোগকে নির্দেশ করে।
যেহেতু অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটা মেটাবোলাইট ডিএনএ মিথাইলেশনের মাধ্যমে এপিজেনেটিক গঠন নিয়ন্ত্রণ করতে পারে [32], আমরা তদন্ত করেছি যে সিরাম আইপিএ স্তর লিভার ডিএনএ মিথাইলেশনের সাথে সম্পর্কিত কিনা। আমরা দেখেছি যে সিরাম আইপিএ স্তরের সাথে সম্পর্কিত দুটি প্রধান মিথাইলেশন সাইট ছিল প্রোলিন-সেরিন-সমৃদ্ধ অঞ্চল 3 (C19orf55) এবং হিট শক প্রোটিন পরিবার B (ছোট) সদস্য 6 (HSPB6) এর কাছাকাছি (অতিরিক্ত ফাইল 3)। 4350 CpG এর ডিএনএ মিথাইলেশন (p < 0.01) সিরাম আইপিএ স্তরের সাথে সম্পর্কিত ছিল এবং দীর্ঘায়ু নিয়ন্ত্রক পথগুলিতে সমৃদ্ধ ছিল (p = 0.006) (চিত্র 1A, সারণি 2, এবং পরিপূরক চিত্র 1C)।
মানব যকৃতে সিরাম আইপিএ-র মাত্রা, গ্লোবাল ট্রান্সক্রিপ্ট, মাইটোকন্ড্রিয়া-সংশ্লিষ্ট ট্রান্সক্রিপ্ট এবং ডিএনএ মিথাইলেশনের মধ্যকার সম্পর্কের অন্তর্নিহিত জৈবিক প্রক্রিয়াগুলো বোঝার জন্য, আমরা পূর্ববর্তী পাথওয়ে বিশ্লেষণে চিহ্নিত জিনগুলোর একটি ওভারল্যাপ বিশ্লেষণ করেছি (চিত্র ১এ)। ৫৬টি ওভারল্যাপিং জিনের (চিত্র ১এ-র কালো রেখার ভেতরের অংশ) পাথওয়ে এনরিচমেন্ট বিশ্লেষণের ফলাফল দেখিয়েছে যে, অ্যাপোপটোসিস পাথওয়ে (পি = ০.০০০২৯) তিনটি বিশ্লেষণেই সাধারণ দুটি জিনকে চিহ্নিত করেছে: AKT1 এবং YKT6 (YKT6 v-SNARE homolog), যা ভেন ডায়াগ্রামে দেখানো হয়েছে (পরিপূরক চিত্র ২ এবং চিত্র ১এ)। মজার বিষয় হলো, আমরা দেখেছি যে AKT1 (cg19831386) এবং YKT6 (cg24161647) সিরাম আইপিএ-র মাত্রার সাথে ধনাত্মকভাবে সম্পর্কিত (অতিরিক্ত ফাইল ৩)। জিন প্রোডাক্টগুলোর মধ্যে সম্ভাব্য প্রোটিন ইন্টারঅ্যাকশন শনাক্ত করার জন্য, আমরা ৫৬টি ওভারল্যাপিং জিনের মধ্য থেকে সর্বোচ্চ কমন রিজিয়ন স্কোর (০.৯০০) সম্পন্ন ১৩টি জিনকে ইনপুট হিসেবে নির্বাচন করে একটি ইন্টারঅ্যাকশন ম্যাপ তৈরি করেছি। কনফিডেন্স লেভেল (মার্জিনাল কনফিডেন্স) অনুসারে, সর্বোচ্চ স্কোর (০.৯০০) সম্পন্ন AKT1 জিনটি ম্যাপটির শীর্ষে ছিল (চিত্র ১বি)।
পাথওয়ে বিশ্লেষণের উপর ভিত্তি করে, আমরা দেখতে পাই যে অ্যাপোপটোসিসই ছিল প্রধান পাথওয়ে, তাই আমরা তদন্ত করে দেখি যে আইপিএ (IPA) ট্রিটমেন্ট ইন ভিট্রোতে এইচএসসি (HSC)-এর অ্যাপোপটোসিসকে প্রভাবিত করে কিনা। আমরা পূর্বে দেখিয়েছি যে আইপিএ-এর বিভিন্ন ডোজ (10 μM, 100 μM, এবং 1 mM) LX-2 কোষের জন্য অবিষাক্ত ছিল [15]। এই গবেষণায় দেখা গেছে যে 10 μM এবং 100 μM মাত্রায় আইপিএ ট্রিটমেন্ট সজীব এবং মৃত কোষের সংখ্যা বৃদ্ধি করেছে। তবে, কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায়, 1 mM আইপিএ ঘনত্বে কোষের সজীবতা হ্রাস পেয়েছে, যখন কোষ নেক্রোসিসের হার অপরিবর্তিত ছিল (চিত্র 2A, B)। এরপর, LX-2 কোষে অ্যাপোপটোসিস প্ররোচিত করার জন্য সর্বোত্তম ঘনত্ব খুঁজে বের করতে, আমরা 24 ঘন্টার জন্য 10 μM, 100 μM, এবং 1 mM আইপিএ পরীক্ষা করেছি (চিত্র 2A-E এবং পরিপূরক চিত্র 3A-B)। মজার ব্যাপার হলো, IPA 10 μM এবং 100 μM অ্যাপোপটোসিসের হার (%) কমিয়েছিল, তবে কন্ট্রোলের তুলনায় IPA 1 mM লেট অ্যাপোপটোসিস এবং অ্যাপোপটোসিসের হার (%) বাড়িয়েছিল এবং তাই পরবর্তী পরীক্ষার জন্য এটিকে বেছে নেওয়া হয়েছিল (চিত্র 2A–D)।
IPA LX-2 কোষের অ্যাপোপটোসিস ঘটায়। ফ্লো সাইটোমেট্রির মাধ্যমে অ্যাপোপটোসিসের হার এবং কোষের আকার-আকৃতি পরিমাপ করার জন্য অ্যানেক্সিন V এবং 7-AAD ডাবল স্টেইনিং পদ্ধতি ব্যবহার করা হয়েছিল। BA কোষগুলোকে ২৪ ঘণ্টার জন্য ১০ μM, ১০০ μM এবং ১ mM IPA-এর সাথে অথবা সিরাম-মুক্ত মাধ্যমে ২৪ ঘণ্টার জন্য F–H TGF-β1 (৫ ng/ml) এবং ১ mM IPA-এর সাথে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। A: জীবিত কোষ (অ্যানেক্সিন V -/ 7AAD-); B: মৃত কোষ (অ্যানেক্সিন V -/ 7AAD+); C, F: প্রাথমিক (অ্যানেক্সিন V +/ 7AAD-); D, G: বিলম্বিত (অ্যানেক্সিন V+/7AAD.+); E, H: অ্যাপোপটোসিসের হারে মোট প্রাথমিক এবং বিলম্বিত অ্যাপোপটোটিক কোষের শতাংশ (%)। ডেটা গড় ± SD হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছে, n = ৩টি স্বাধীন পরীক্ষা। বোনফেরোনি পোস্ট হক টেস্ট সহ ওয়ান-ওয়ে অ্যানোভা ব্যবহার করে পরিসংখ্যানগত তুলনা করা হয়েছিল। *পি < ০.০৫; ****পি < ০.০০০১
আমরা পূর্বে যেমন দেখিয়েছি, 5 ng/ml TGF-β1 ক্লাসিক্যাল মার্কার জিনের এক্সপ্রেশন বৃদ্ধির মাধ্যমে HSC অ্যাক্টিভেশনকে প্ররোচিত করতে পারে [15]। LX-2 কোষগুলিকে 5 ng/ml TGF-β1 এবং 1 mM IPA একত্রে প্রয়োগ করা হয়েছিল (চিত্র 2E–H)। TGF-β1 প্রয়োগ অ্যাপোপটোসিসের হারে কোনো পরিবর্তন আনেনি, তবে, TGF-β1 প্রয়োগের তুলনায় IPA-এর সহ-প্রয়োগ লেট অ্যাপোপটোসিস এবং অ্যাপোপটোসিসের হার (%) বৃদ্ধি করেছে (চিত্র 2E–H)। এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে 1 mM IPA, TGF-β1-এর প্ররোচনা ছাড়াই LX-2 কোষগুলিতে অ্যাপোপটোসিসকে ত্বরান্বিত করতে পারে।
আমরা LX-2 কোষে মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসনের উপর IPA-এর প্রভাব আরও তদন্ত করেছি। ফলাফলে দেখা গেছে যে, কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় 1 mM IPA অক্সিজেন গ্রহণ হার (OCR) প্যারামিটার—নন-মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসন, বেসাল ও ম্যাক্সিমাল শ্বসন, প্রোটন লিকেজ এবং ATP উৎপাদন—হ্রাস করেছে (চিত্র 3A, B), যদিও বায়োএনার্জেটিক হেলথ ইনডেক্স (BHI)-এর কোনো পরিবর্তন হয়নি।
LX-2 কোষে IPA মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসন হ্রাস করে। মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসন বক্ররেখা (OCR) মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসন প্যারামিটার (নন-মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসন, বেসাল শ্বসন, ম্যাক্সিমাল শ্বসন, প্রোটন লিক, ATP উৎপাদন, SRC এবং BHI) হিসাবে উপস্থাপন করা হয়েছে। কোষ A এবং B-কে যথাক্রমে 10 μM, 100 μM এবং 1 mM IPA-এর সাথে 24 ঘণ্টা ইনকিউবেট করা হয়েছিল। কোষ C এবং D-কে যথাক্রমে TGF-β1 (5 ng/ml) এবং 1 mM IPA-এর সাথে সিরাম-মুক্ত মাধ্যমে 24 ঘণ্টা ইনকিউবেট করা হয়েছিল। CyQuant কিট ব্যবহার করে সমস্ত পরিমাপ DNA-এর পরিমাণের সাথে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। BHI: বায়োএনার্জেটিক হেলথ ইনডেক্স; SRC: রেসপিরেটরি রিজার্ভ ক্যাপাসিটি; OCR: অক্সিজেন কনসাম্পশন রেট। ডেটা গড় ± স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন (SD) হিসাবে উপস্থাপন করা হয়েছে, n = 5 স্বাধীন পরীক্ষা। ওয়ান-ওয়ে অ্যানোভা এবং বনফেরোনি পোস্ট হক টেস্ট ব্যবহার করে পরিসংখ্যানগত তুলনা করা হয়েছিল। *p < 0.05; **p < 0.01; এবং ***পি < ০.০০১
TGF-β1 দ্বারা সক্রিয় LX-2 কোষের জৈবশক্তি প্রোফাইলের উপর IPA-এর প্রভাব সম্পর্কে আরও ব্যাপক ধারণা লাভের জন্য, আমরা OCR দ্বারা মাইটোকন্ড্রিয়াল অক্সিডেটিভ ফসফোরাইলেশন বিশ্লেষণ করেছি (চিত্র ৩সি,ডি)। ফলাফলে দেখা গেছে যে, কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় TGF-β1 প্রয়োগ সর্বোচ্চ শ্বসন, শ্বসন রিজার্ভ ক্যাপাসিটি (SRC) এবং BHI কমাতে পারে (চিত্র ৩সি,ডি)। এছাড়াও, সম্মিলিত প্রয়োগ বেসাল শ্বসন, প্রোটন লিকেজ এবং ATP উৎপাদন হ্রাস করে, কিন্তু SRC এবং BHI শুধুমাত্র TGF-β1 দ্বারা প্রয়োগকৃত নমুনার চেয়ে উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল (চিত্র ৩সি,ডি)।
আমরা সিহর্স (Seahorse) সফটওয়্যার দ্বারা প্রদত্ত “সেলুলার এনার্জি ফেনোটাইপ টেস্ট”ও সম্পাদন করেছি (পরিপূরক চিত্র ৪এ–ডি)। পরিপূরক চিত্র ৩বি-তে যেমন দেখানো হয়েছে, টিজিএফ-বিটা১ (TGF-β1) চিকিৎসার পর ওসিআর (OCR) এবং ইসিএআর (ECAR) উভয় বিপাকীয় সম্ভাবনাই হ্রাস পেয়েছিল, তবে নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর তুলনায় সংমিশ্রণ এবং আইপিএ (IPA) চিকিৎসা গোষ্ঠীতে কোনো পার্থক্য পরিলক্ষিত হয়নি। অধিকন্তু, নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর তুলনায় সংমিশ্রণ এবং আইপিএ চিকিৎসার পর ওসিআর-এর ভিত্তি এবং স্ট্রেস উভয় স্তরই হ্রাস পেয়েছিল (পরিপূরক চিত্র ৪সি)। মজার বিষয় হলো, সংমিশ্রণ থেরাপির ক্ষেত্রেও একটি অনুরূপ প্যাটার্ন পরিলক্ষিত হয়েছিল, যেখানে টিজিএফ-বিটা১ চিকিৎসার তুলনায় ইসিএআর-এর ভিত্তি এবং স্ট্রেস স্তরে কোনো পরিবর্তন দেখা যায়নি (পরিপূরক চিত্র ৪সি)। এইচএসসি-তে, মাইটোকন্ড্রিয়াল অক্সিডেটিভ ফসফোরাইলেশনের হ্রাস এবং টিজিএফ-বিটা১ চিকিৎসার সংস্পর্শে আসার পর এসসিআর (SCR) এবং বিএইচআই (BHI) পুনরুদ্ধার করার সংমিশ্রণ চিকিৎসার ক্ষমতা বিপাকীয় সম্ভাবনাকে (ওসিআর এবং ইসিএআর) পরিবর্তন করেনি। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে IPA HSC-এর জৈবশক্তি হ্রাস করতে পারে, যা থেকে বোঝা যায় যে IPA একটি নিম্ন শক্তি প্রোফাইল প্ররোচিত করতে পারে যা HSC ফেনোটাইপকে নিষ্ক্রিয়করণের দিকে স্থানান্তরিত করে (পরিপূরক চিত্র 4D)।
মাইটোchondrial আকার ও নেটওয়ার্ক সংযোগের ত্রিমাত্রিক পরিমাণ নির্ণয় এবং MTR স্টেইনিং ব্যবহার করে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্সের উপর IPA-এর প্রভাব অনুসন্ধান করা হয়েছিল (চিত্র ৪ এবং পরিপূরক চিত্র ৫)। চিত্র ৪ দেখায় যে, কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায়, TGF-β1 ট্রিটমেন্ট গড় পৃষ্ঠতল ক্ষেত্রফল, শাখার সংখ্যা, মোট শাখার দৈর্ঘ্য এবং শাখা সংযোগস্থলের সংখ্যা হ্রাস করেছে (চিত্র ৪ক এবং খ) এবং মাইটোকন্ড্রিয়ার অনুপাতকে গোলাকার থেকে মধ্যবর্তী আকারে পরিবর্তন করেছে (চিত্র ৪গ)। কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় শুধুমাত্র IPA ট্রিটমেন্ট গড় মাইটোকন্ড্রিয়াল আয়তন হ্রাস করেছে এবং মাইটোকন্ড্রিয়ার অনুপাতকে গোলাকার থেকে মধ্যবর্তী আকারে পরিবর্তন করেছে (চিত্র ৪ক)। বিপরীতে, গোলাকারত্ব, গড় শাখার দৈর্ঘ্য এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেন পটেনশিয়াল-নির্ভর MTR দ্বারা মূল্যায়িত মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ অপরিবর্তিত ছিল (চিত্র ৪ক এবং ঙ) এবং এই প্যারামিটারগুলো গ্রুপগুলোর মধ্যে ভিন্ন ছিল না। সব মিলিয়ে, এই ফলাফলগুলো ইঙ্গিত দেয় যে TGF-β1 এবং IPA ট্রিটমেন্ট জীবন্ত LX-2 কোষে মাইটোকন্ড্রিয়ার আকার ও আয়তনের পাশাপাশি নেটওয়ার্কের জটিলতাকে নিয়ন্ত্রণ করে।
আইপিএ (IPA) এলএক্স-২ (LX-2) কোষে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্স এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ-এর প্রাচুর্য পরিবর্তন করে। এ. সিরাম-মুক্ত মাধ্যমে ২৪ ঘণ্টা ধরে টিজিএফ-বিটা১ (TGF-β1) (৫ ন্যানোগ্রাম/মিলি) এবং ১ মিলিমিটার আইপিএ (IPA) দিয়ে ইনকিউবেট করা জীবন্ত এলএক্স-২ (LX-2) কোষের প্রতিনিধিত্বমূলক কনফোকাল চিত্র, যেখানে মাইটোট্র্যাকার™ রেড সিএমএক্সরস (Mitotracker™ Red CMXRos) দিয়ে রঞ্জিত মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্ক এবং ডিপিআই (DAPI) দিয়ে নীল রঙে রঞ্জিত নিউক্লিয়াস দেখানো হয়েছে। প্রতিটি গ্রুপের জন্য সমস্ত ডেটাতে কমপক্ষে ১৫টি চিত্র ছিল। আমরা প্রতিটি নমুনার ধরনের জন্য ১০টি জেড-স্ট্যাক (Z-stack) চিত্র সংগ্রহ করেছি। প্রতিটি জেড-অক্ষ অনুক্রমে ৩০টি স্লাইস ছিল, যার প্রতিটির পুরুত্ব ছিল ৯.৮৬ মাইক্রোমিটার। স্কেল বার: ১০ মাইক্রোমিটার। বি. চিত্রে অ্যাডাপ্টিভ থ্রেশহোল্ডিং প্রয়োগ করে চিহ্নিত প্রতিনিধিত্বমূলক বস্তুসমূহ (শুধুমাত্র মাইটোকন্ড্রিয়া)। প্রতিটি গ্রুপের সমস্ত কোষের জন্য মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজিক্যাল নেটওয়ার্ক সংযোগের পরিমাণগত বিশ্লেষণ এবং তুলনা করা হয়েছিল। সি. মাইটোকন্ড্রিয়াল আকৃতির অনুপাতের ফ্রিকোয়েন্সি। ০-এর কাছাকাছি মান গোলাকার আকৃতি নির্দেশ করে, এবং ১-এর কাছাকাছি মান তন্তুময় আকৃতি নির্দেশ করে। ডি মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ (mtDNA)-এর পরিমাণ ‘উপকরণ ও পদ্ধতি’ অংশে বর্ণিত পদ্ধতিতে নির্ণয় করা হয়েছিল। ই ‘উপকরণ ও পদ্ধতি’ অংশে বর্ণিত পদ্ধতিতে ফ্লো সাইটোমেট্রির (৩০,০০০ ইভেন্ট) মাধ্যমে মাইটোট্র্যাকার™ রেড সিএমএক্সরস (Mitotracker™ Red CMXRos) বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। উপাত্ত গড় ± এসডি (SD) হিসাবে উপস্থাপন করা হয়েছে, n = ৩টি স্বাধীন পরীক্ষা। পরিসংখ্যানগত তুলনা একমুখী অ্যানোভা (one-way ANOVA) এবং বনফেরোনি পোস্ট হক টেস্ট (Bonferroni post hoc test) ব্যবহার করে করা হয়েছিল। *পি < ০.০৫; **পি < ০.০১; ***পি < ০.০০১; ****পি < ০.০০০০১
এরপর আমরা মাইটোকন্ড্রিয়ার সংখ্যার সূচক হিসেবে LX-2 কোষে mtDNA-এর পরিমাণ বিশ্লেষণ করি। কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায়, TGF-β1-প্রয়োগকৃত গ্রুপে mtDNA-এর পরিমাণ বৃদ্ধি পেয়েছিল (চিত্র 4D)। TGF-β1-প্রয়োগকৃত গ্রুপের তুলনায়, সম্মিলিত চিকিৎসা গ্রুপে mtDNA-এর পরিমাণ হ্রাস পেয়েছিল (চিত্র 4D), যা থেকে বোঝা যায় যে IPA সম্ভবত mtDNA-এর পরিমাণ এবং মাইটোকন্ড্রিয়ার সংখ্যা ও মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসনও হ্রাস করতে পারে (চিত্র 3C)। অধিকন্তু, সম্মিলিত চিকিৎসায় IPA mtDNA-এর পরিমাণ হ্রাস করলেও MTR-মধ্যস্থ মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপকে প্রভাবিত করেনি (চিত্র 4A–C)।
আমরা LX-2 কোষে ফাইব্রোসিস, অ্যাপোপটোসিস, সারভাইভাল এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্সের সাথে সম্পর্কিত জিনগুলির mRNA স্তরের সাথে IPA-এর সম্পর্ক অনুসন্ধান করেছি (চিত্র 5A–D)। কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায়, TGF-β1-চিকিৎসিত গ্রুপে কোলাজেন টাইপ I α2 চেইন (COL1A2), α-স্মুথ মাসল অ্যাকটিন (αSMA), ম্যাট্রিক্স মেটালোপ্রোটিনেজ 2 (MMP2), টিস্যু ইনহিবিটর অফ মেটালোপ্রোটিনেজ 1 (TIMP1), এবং ডাইনামিন 1-লাইক জিন (DRP1)-এর মতো জিনগুলির বর্ধিত এক্সপ্রেশন দেখা গেছে, যা বর্ধিত ফাইব্রোসিস এবং অ্যাক্টিভেশন নির্দেশ করে। অধিকন্তু, কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায়, TGF-β1 চিকিৎসা নিউক্লিয়ার প্রেগনেন এক্স রিসেপ্টর (PXR), ক্যাসপেজ 8 (CASP8), MAPKAPK3, ইনহিবিটর অফ বি-সেল α, এনহ্যান্সার অফ নিউক্লিয়ার ফ্যাক্টর κ জিন লাইট পেপটাইড (NFκB1A), এবং ইনহিবিটর অফ নিউক্লিয়ার ফ্যাক্টর κB কাইনেজ সাবইউনিট β (IKBKB)-এর mRNA স্তর হ্রাস করেছে (চিত্র 5A–D)। TGF-β1 চিকিৎসার তুলনায়, TGF-β1 এবং IPA-এর সম্মিলিত চিকিৎসায় COL1A2 এবং MMP2-এর এক্সপ্রেশন হ্রাস পেয়েছে, কিন্তু PXR, TIMP1, B-cell lymphoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, এবং IKBKB-এর mRNA মাত্রা বৃদ্ধি পেয়েছে। IPA চিকিৎসায় MMP2, Bcl-2-associated protein X (BAX), AKT1, optic atrophy protein 1 (OPA1), এবং mitochondrial fusion protein 2 (MFN2)-এর এক্সপ্রেশন উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে, যেখানে কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় CASP8, NFκB1A, NFκB1B, এবং IKBKB-এর এক্সপ্রেশন বৃদ্ধি পেয়েছে। তবে, caspase-3 (CASP3), apoptotic peptidase activating factor 1 (APAF1), mitochondrial fusion protein 1 (MFN1), এবং fission protein 1 (FIS1)-এর এক্সপ্রেশনে কোনো পার্থক্য পাওয়া যায়নি। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলো থেকে বোঝা যায় যে আইপিএ (IPA) চিকিৎসা ফাইব্রোসিস, অ্যাপোপটোসিস, সারভাইভাল এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ডাইনামিক্সের সাথে সম্পর্কিত জিনগুলোর এক্সপ্রেশনকে মডিউলেট করে। আমাদের ডেটা থেকে বোঝা যায় যে আইপিএ চিকিৎসা LX-2 কোষে ফাইব্রোসিস কমায়; একই সাথে, এটি ফেনোটাইপকে ইনঅ্যাকটিভেশনের দিকে স্থানান্তরিত করার মাধ্যমে সারভাইভালকে উদ্দীপিত করে।
IPA, LX-2 কোষে ফাইব্রোব্লাস্ট, অ্যাপোপটোটিক, ভাইয়াবিলিটি এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্স জিনের এক্সপ্রেশনকে মডিউলেট করে। সিরাম-মুক্ত মাধ্যমে ২৪ ঘণ্টা ধরে TGF-β1 এবং IPA দ্বারা LX-2 কোষগুলিকে ইন্ডুস করার পর, হিস্টোগ্রামগুলি এন্ডোজেনাস কন্ট্রোল (RPLP0 বা PPIA)-এর সাপেক্ষে mRNA এক্সপ্রেশন প্রদর্শন করে। A ফাইব্রোব্লাস্ট, B অ্যাপোপটোটিক কোষ, C জীবিত কোষ এবং D মাইটোকন্ড্রিয়াল ডায়নামিক্স জিনের এক্সপ্রেশন নির্দেশ করে। ডেটা গড় ± স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন (SD) হিসাবে উপস্থাপন করা হয়েছে, n = ৩টি স্বাধীন পরীক্ষা। ওয়ান-ওয়ে অ্যানোভা এবং বনফেরোনি পোস্ট হক টেস্ট ব্যবহার করে পরিসংখ্যানগত তুলনা করা হয়েছে। *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
এরপর, ফ্লো সাইটোমেট্রির মাধ্যমে কোষের আকার (FSC-H) এবং সাইটোপ্লাজমিক জটিলতার (SSC-H) পরিবর্তন মূল্যায়ন করা হয়েছিল (চিত্র 6A,B), এবং IPA চিকিৎসার পর কোষের গঠনগত পরিবর্তন ট্রান্সমিশন ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপি (TEM) এবং ফেজ কনট্রাস্ট মাইক্রোস্কোপির মাধ্যমে মূল্যায়ন করা হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 6A-B)। প্রত্যাশিতভাবেই, কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় TGF-β1-চিকিৎসিত গ্রুপের কোষগুলোর আকার বৃদ্ধি পেয়েছিল (চিত্র 6A,B), যা রাফ এন্ডোপ্লাজমিক রেটিকুলাম (ER*) এবং ফ্যাগোলাইসোসোমের (P) চিরাচরিত প্রসারণ প্রদর্শন করে, যা হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল (HSC) সক্রিয়করণ নির্দেশ করে (পরিপূরক চিত্র 6A)। তবে, TGF-β1-চিকিৎসিত গ্রুপের তুলনায়, TGF-β1 এবং IPA-এর সম্মিলিত চিকিৎসা গ্রুপে কোষের আকার, সাইটোপ্লাজমিক জটিলতা (চিত্র 6A,B) এবং ER*-এর পরিমাণ হ্রাস পেয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 6A)। অধিকন্তু, কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় IPA প্রয়োগ কোষের আকার, সাইটোপ্লাজমিক জটিলতা (চিত্র ৬ক,খ), P এবং ER* এর পরিমাণ (পরিপূরক চিত্র ৬ক) হ্রাস করেছে। এছাড়াও, কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় IPA প্রয়োগের ২৪ ঘণ্টা পর অ্যাপোপটোটিক কোষের পরিমাণ বৃদ্ধি পেয়েছে (সাদা তীরচিহ্ন, পরিপূরক চিত্র ৬খ)। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলো থেকে বোঝা যায় যে ১ mM IPA, HSC অ্যাপোপটোসিসকে উদ্দীপিত করতে এবং TGF-β1 দ্বারা প্ররোচিত কোষের আকারগত প্যারামিটারের পরিবর্তনগুলোকে বিপরীতমুখী করতে পারে, যার ফলে এটি কোষের আকার ও জটিলতাকে নিয়ন্ত্রণ করে, যা সম্ভবত HSC নিষ্ক্রিয়করণের সাথে সম্পর্কিত।
আইপিএ (IPA) এলএক্স-২ (LX-2) কোষের আকার এবং সাইটোপ্লাজমিক জটিলতা পরিবর্তন করে। ফ্লো সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র। এই বিশ্লেষণে এলএক্স-২ কোষের জন্য নির্দিষ্ট একটি গেটিং কৌশল ব্যবহার করা হয়েছে: কোষের সমষ্টি নির্ধারণের জন্য এসএসসি-এ/এফএসসি-এ (SSC-A/FSC-A), ডাবলেট শনাক্ত করার জন্য এফএসসি-এইচ/এফএসসি-এ (FSC-H/FSC-A), এবং কোষের আকার ও জটিলতা বিশ্লেষণের জন্য এসএসসি-এইচ/এফএসসি-এইচ (SSC-H/FSC-H)। কোষগুলোকে সিরাম-মুক্ত মাধ্যমে টিজিএফ-বিটা১ (TGF-β1) (৫ ন্যানোগ্রাম/মিলিলিটার) এবং ১ মিলিমিটার আইপিএ (IPA)-এর সাথে ২৪ ঘণ্টা ইনকিউবেট করা হয়েছিল। কোষের আকার এবং সাইটোপ্লাজমিক জটিলতা বিশ্লেষণের জন্য এলএক্স-২ কোষগুলোকে নিম্ন বাম চতুর্ভাগ (এসএসসি-এইচ-/এফএসসি-এইচ-), উচ্চ বাম চতুর্ভাগ (এসএসসি-এইচ+/এফএসসি-এইচ-), নিম্ন ডান চতুর্ভাগ (এসএসসি-এইচ-/এফএসসি-এইচ+), এবং উচ্চ ডান চতুর্ভাগ (এসএসসি-এইচ+/এফএসসি-এইচ+)-এ ভাগ করা হয়েছিল। খ. FSC-H (ফরওয়ার্ড স্ক্যাটার, কোষের আকার) এবং SSC-H (সাইড স্ক্যাটার, সাইটোপ্লাজমিক জটিলতা) ব্যবহার করে ফ্লো সাইটোমেট্রির মাধ্যমে কোষের আকারবিদ্যা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল (৩০,০০০ ইভেন্ট)। ডেটা গড় ± এসডি (স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন) হিসাবে উপস্থাপন করা হয়েছে, n = ৩টি স্বাধীন পরীক্ষা। ওয়ান-ওয়ে অ্যানোভা এবং বনফেরোনি পোস্ট হক টেস্ট ব্যবহার করে পরিসংখ্যানগত তুলনা করা হয়েছিল। *p < ০.০৫; **p < ০.০১; ***p < ০.০০১ এবং ****p < ০.০০০০১
আইপিএ-এর মতো অন্ত্রের মেটাবোলাইটগুলি গবেষণার একটি আলোচিত বিষয় হয়ে উঠেছে, যা ইঙ্গিত দেয় যে অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটায় নতুন লক্ষ্যবস্তু আবিষ্কৃত হতে পারে। তাই এটি আকর্ষণীয় যে আইপিএ, একটি মেটাবোলাইট যা আমরা মানুষের লিভার ফাইব্রোসিসের সাথে যুক্ত করেছি [15], প্রাণীর মডেলে একটি সম্ভাব্য অ্যান্টি-ফাইব্রোটিক যৌগ হিসাবে দেখানো হয়েছে [13, 14]। এখানে, আমরা প্রথমবারের মতো টাইপ 2 ডায়াবেটিস (T2D) ছাড়া স্থূল ব্যক্তিদের মধ্যে সিরাম আইপিএ এবং গ্লোবাল লিভার ট্রান্সক্রিপ্টোমিক্স এবং ডিএনএ মিথাইলেশনের মধ্যে একটি সম্পর্ক প্রদর্শন করছি, যা অ্যাপোপটোসিস, মাইটোফেজি এবং দীর্ঘায়ু, সেইসাথে লিভার হোমিওস্ট্যাসিস নিয়ন্ত্রণকারী একটি সম্ভাব্য ক্যান্ডিডেট জিন AKT1-কে তুলে ধরে। আমাদের গবেষণার আরেকটি নতুনত্ব হল যে আমরা LX-2 কোষে অ্যাপোপটোসিস, কোষের আকারবিদ্যা, মাইটোকন্ড্রিয়াল বায়োএনার্জেটিক্স এবং ডায়নামিক্সের সাথে আইপিএ চিকিৎসার মিথস্ক্রিয়া প্রদর্শন করেছি, যা একটি নিম্ন শক্তি বর্ণালী নির্দেশ করে যা HSC ফেনোটাইপকে নিষ্ক্রিয়করণের দিকে স্থানান্তরিত করে, আইপিএ-কে লিভার ফাইব্রোসিস উন্নত করার জন্য একটি সম্ভাব্য প্রার্থী করে তোলে।
আমরা দেখতে পেয়েছি যে অ্যাপোপটোসিস, মাইটোফ্যাজি এবং দীর্ঘায়ু হলো সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ ক্যানোনিকাল পাথওয়ে যা রক্তে সঞ্চালিত সিরাম IPA-এর সাথে সম্পর্কিত লিভারের জিনগুলিতে সমৃদ্ধ। মাইটোকন্ড্রিয়াল কোয়ালিটি কন্ট্রোল (MQC) সিস্টেমের ব্যাঘাত মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিসফাংশন, মাইটোফ্যাজি এবং অ্যাপোপটোসিসের দিকে পরিচালিত করতে পারে, যার ফলে MASLD-এর ঘটনাকে উৎসাহিত করে [33, 34]। অতএব, আমরা অনুমান করতে পারি যে IPA লিভারে অ্যাপোপটোসিস, মাইটোফ্যাজি এবং দীর্ঘায়ুর মাধ্যমে কোষের গতিশীলতা এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল অখণ্ডতা বজায় রাখতে জড়িত থাকতে পারে। আমাদের ডেটা দেখিয়েছে যে তিনটি অ্যাসেতেই দুটি জিন সাধারণ ছিল: YKT6 এবং AKT1। এটি উল্লেখযোগ্য যে YKT6 একটি SNARE প্রোটিন যা কোষ ঝিল্লি ফিউশন প্রক্রিয়ায় জড়িত। এটি অটোফ্যাগোসোমে STX17 এবং SNAP29-এর সাথে একটি ইনিসিয়েশন কমপ্লেক্স তৈরি করে অটোফ্যাজি এবং মাইটোফ্যাজিতে ভূমিকা পালন করে, যার ফলে অটোফ্যাগোসোম এবং লাইসোসোমের ফিউশনকে উৎসাহিত করে [35]। তাছাড়া, YKT6-এর কার্যকারিতা হ্রাস পেলে মাইটোফ্যাজি ব্যাহত হয়[36], যেখানে YKT6-এর আপরেগুলেশন হেপাটোসেলুলার কার্সিনোমা (HCC)-এর অগ্রগতির সাথে সম্পর্কিত, যা কোষের বেঁচে থাকার হার বৃদ্ধি দেখায়[37]। অন্যদিকে, AKT1 হলো সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ মিথস্ক্রিয়াকারী জিন এবং এটি যকৃতের রোগসমূহে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে, যার মধ্যে রয়েছে PI3K/AKT সিগন্যালিং পাথওয়ে, কোষচক্র, কোষ স্থানান্তর, কোষ বৃদ্ধি, ফোকাল অ্যাডহেশন, মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকারিতা এবং কোলাজেন নিঃসরণ[38–40]। সক্রিয় PI3K/AKT সিগন্যালিং পাথওয়ে হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল (HSC)-কে সক্রিয় করতে পারে, যা এক্সট্রাসেলুলার ম্যাট্রিক্স (ECM) উৎপাদনের জন্য দায়ী কোষ, এবং এর কার্যকারিতার ত্রুটি লিভার ফাইব্রোসিসের উৎপত্তি ও অগ্রগতিতে অবদান রাখতে পারে[40]। এছাড়াও, AKT হলো কোষের বেঁচে থাকার অন্যতম প্রধান ফ্যাক্টর যা p53-নির্ভর কোষ অ্যাপোপটোসিসকে বাধা দেয়, এবং AKT-এর সক্রিয়করণ লিভার কোষের অ্যাপোপটোসিস প্রতিরোধের সাথে সম্পর্কিত হতে পারে[41, 42]। প্রাপ্ত ফলাফল থেকে বোঝা যায় যে, হেপাটোসাইট কোষের অ্যাপোপটোসিসে প্রবেশ করা বা বেঁচে থাকার সিদ্ধান্তকে প্রভাবিত করার মাধ্যমে আইপিএ লিভারের মাইটোকন্ড্রিয়া-সম্পর্কিত অ্যাপোপটোসিসে জড়িত থাকতে পারে। এই প্রভাবগুলো AKT এবং/অথবা YKT6 ক্যান্ডিডেট জিন দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হতে পারে, যেগুলো লিভারের হোমিওস্ট্যাসিসের জন্য অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ।
আমাদের ফলাফল দেখিয়েছে যে 1 mM IPA, TGF-β1 চিকিৎসা নির্বিশেষে LX-2 কোষে অ্যাপোপটোসিস প্ররোচিত করে এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসন হ্রাস করে। এটি উল্লেখযোগ্য যে ফাইব্রোসিস সমাধান এবং হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল (HSC) সক্রিয়করণের জন্য অ্যাপোপটোসিস একটি প্রধান পথ, এবং এটি লিভার ফাইব্রোসিসের পরিবর্তনযোগ্য শারীরবৃত্তীয় প্রতিক্রিয়ার একটি মূল ঘটনাও [4, 43]। অধিকন্তু, সম্মিলিত চিকিৎসার পর LX-2 কোষে BHI-এর পুনরুদ্ধার মাইটোকন্ড্রিয়াল জৈবশক্তির নিয়ন্ত্রণে IPA-এর সম্ভাব্য ভূমিকা সম্পর্কে নতুন অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করেছে। বিশ্রামরত এবং নিষ্ক্রিয় অবস্থায়, হেমাটোপয়েটিক কোষগুলি সাধারণত ATP উৎপাদনের জন্য মাইটোকন্ড্রিয়াল অক্সিডেটিভ ফসফোরাইলেশন ব্যবহার করে এবং তাদের বিপাকীয় কার্যকলাপ কম থাকে। অন্যদিকে, HSC সক্রিয়করণ গ্লাইকোলাইটিক অবস্থায় প্রবেশের শক্তির চাহিদা মেটাতে মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসন এবং জৈব সংশ্লেষণ বৃদ্ধি করে [44]। IPA যে বিপাকীয় সম্ভাবনা এবং ECAR-কে প্রভাবিত করেনি, তা থেকে বোঝা যায় যে গ্লাইকোলাইটিক পথটি কম অগ্রাধিকার পায়। একইভাবে, অন্য একটি গবেষণায় দেখা গেছে যে 1 mM IPA কার্ডিওমায়োসাইট, মানব হেপাটোসাইট কোষ লাইন (Huh7) এবং মানব নাভির শিরা এন্ডোথেলিয়াল কোষ (HUVEC)-এ মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসন শৃঙ্খলের কার্যকলাপ নিয়ন্ত্রণ করতে সক্ষম; যাইহোক, কার্ডিওমায়োসাইটে গ্লাইকোলাইসিসের উপর IPA-এর কোনও প্রভাব পাওয়া যায়নি, যা ইঙ্গিত করে যে IPA অন্যান্য ধরণের কোষের জৈবশক্তিকে প্রভাবিত করতে পারে [45]। অতএব, আমরা অনুমান করি যে 1 mM IPA একটি মৃদু রাসায়নিক আনকাপলার হিসাবে কাজ করতে পারে, কারণ এটি mtDNA-এর পরিমাণ পরিবর্তন না করেই ফাইব্রোজেনিক জিনের প্রকাশ, কোষের আকার এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল জৈবশক্তিকে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করতে পারে [46]। মাইটোকন্ড্রিয়াল আনকাপলারগুলি কালচার-প্ররোচিত ফাইব্রোসিস এবং HSC সক্রিয়করণকে বাধা দিতে পারে [47] এবং আনকাপলিং প্রোটিন (UCP) বা অ্যাডেনিন নিউক্লিওটাইড ট্রান্সলোকেজ (ANT)-এর মতো নির্দিষ্ট প্রোটিন দ্বারা নিয়ন্ত্রিত বা প্ররোচিত মাইটোকন্ড্রিয়াল ATP উৎপাদন হ্রাস করতে পারে। কোষের ধরণের উপর নির্ভর করে, এই ঘটনাটি কোষকে অ্যাপোপটোসিস থেকে রক্ষা করতে পারে এবং/অথবা অ্যাপোপটোসিসকে উৎসাহিত করতে পারে [46]। তবে, হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল নিষ্ক্রিয়করণে মাইটোকন্ড্রিয়াল আনকাপলার হিসেবে আইপিএ-এর ভূমিকা স্পষ্ট করার জন্য আরও গবেষণার প্রয়োজন রয়েছে।
এরপর আমরা জীবন্ত LX-2 কোষে মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসনের পরিবর্তনগুলি মাইটোকন্ড্রিয়াল আকারবিদ্যায় প্রতিফলিত হয় কিনা তা তদন্ত করেছি। মজার বিষয় হল, TGF-β1 চিকিৎসা মাইটোকন্ড্রিয়ার অনুপাতকে গোলাকার থেকে মধ্যবর্তী আকারে পরিবর্তন করে, মাইটোকন্ড্রিয়াল শাখা হ্রাস পায় এবং DRP1 এর প্রকাশ বৃদ্ধি পায়, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিশনের একটি মূল ফ্যাক্টর [48]। অধিকন্তু, মাইটোকন্ড্রিয়াল খণ্ডায়ন সামগ্রিক নেটওয়ার্ক জটিলতার সাথে সম্পর্কিত, এবং ফিউশন থেকে ফিশনে রূপান্তর হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল (HSC) সক্রিয়করণের জন্য গুরুত্বপূর্ণ, যেখানে মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিশন বাধা দিলে HSC অ্যাপোপটোসিস হয় [49]। সুতরাং, আমাদের ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে TGF-β1 চিকিৎসা মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কের জটিলতা হ্রাস করতে পারে এবং শাখা হ্রাস করতে পারে, যা সক্রিয় হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল (HSC) এর সাথে যুক্ত মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিশনে বেশি দেখা যায়। অধিকন্তু, আমাদের ডেটা দেখিয়েছে যে IPA মাইটোকন্ড্রিয়ার অনুপাতকে গোলাকার থেকে মধ্যবর্তী আকারে পরিবর্তন করতে পারে, যার ফলে OPA1 এবং MFN2 এর প্রকাশ হ্রাস পায়। গবেষণায় দেখা গেছে যে OPA1 এর ডাউনরেগুলেশন মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেন পটেনশিয়াল হ্রাস করতে পারে এবং কোষের অ্যাপোপটোসিসকে ট্রিগার করতে পারে [50]। MFN2 মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিউশন এবং অ্যাপোপটোসিসে মধ্যস্থতা করে বলে জানা যায় [51]। প্রাপ্ত ফলাফলগুলি থেকে বোঝা যায় যে TGF-β1 এবং/অথবা IPA দ্বারা LX-2 কোষের আবেশন মাইটোকন্ড্রিয়ার আকার এবং আয়তন, সেইসাথে সক্রিয়করণ অবস্থা এবং নেটওয়ার্কের জটিলতাকে নিয়ন্ত্রণ করে।
আমাদের ফলাফল ইঙ্গিত করে যে TGFβ-1 এবং IPA-এর সম্মিলিত চিকিৎসা অ্যাপোপটোসিস-এড়ানো কোষগুলিতে ফাইব্রোসিস, অ্যাপোপটোসিস এবং বেঁচে থাকা-সম্পর্কিত জিনের mRNA এক্সপ্রেশন নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে mtDNA এবং কোষের আকারগত পরামিতি কমাতে পারে। প্রকৃতপক্ষে, IPA, AKT1 এবং COL1A2 ও MMP2-এর মতো গুরুত্বপূর্ণ ফাইব্রোসিস জিনের mRNA এক্সপ্রেশন স্তর কমিয়েছে, কিন্তু CASP8-এর এক্সপ্রেশন স্তর বাড়িয়েছে, যা অ্যাপোপটোসিসের সাথে সম্পর্কিত। আমাদের ফলাফল দেখিয়েছে যে IPA চিকিৎসার পরে, BAX এক্সপ্রেশন কমেছে এবং TIMP1 পরিবারের সাবইউনিট, BCL-2 এবং NF-κB-এর mRNA এক্সপ্রেশন বেড়েছে, যা ইঙ্গিত করে যে IPA অ্যাপোপটোসিস এড়ানো হেমাটোপয়েটিক স্টেম কোষে (HSCs) বেঁচে থাকার সংকেত উদ্দীপিত করতে পারে। এই অণুগুলি সক্রিয় হেমাটোপয়েটিক স্টেম কোষে প্রো-সারভাইভাল সংকেত হিসাবে কাজ করতে পারে, যা অ্যান্টি-অ্যাপোপটোটিক প্রোটিনের (যেমন Bcl-2) বর্ধিত এক্সপ্রেশন, প্রো-অ্যাপোপটোটিক BAX-এর হ্রাসপ্রাপ্ত এক্সপ্রেশন এবং TIMP ও NF-κB-এর মধ্যে একটি জটিল আন্তঃক্রিয়ার সাথে সম্পর্কিত হতে পারে [5, 7]। IPA, PXR-এর মাধ্যমে তার প্রভাব বিস্তার করে, এবং আমরা দেখেছি যে TGF-β1 এবং IPA-এর সম্মিলিত চিকিৎসায় PXR mRNA এক্সপ্রেশনের মাত্রা বৃদ্ধি পায়, যা HSC অ্যাক্টিভেশন দমনের ইঙ্গিত দেয়। সক্রিয় PXR সিগন্যালিং ইন ভিভো এবং ইন ভিট্রো উভয় ক্ষেত্রেই HSC অ্যাক্টিভেশনকে বাধা দেয় বলে জানা যায় [52, 53]। আমাদের ফলাফল ইঙ্গিত দেয় যে IPA অ্যাপোপটোসিসকে উৎসাহিত করে, ফাইব্রোসিস এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল মেটাবলিজম হ্রাস করে, এবং সারভাইভাল সিগন্যাল বৃদ্ধি করে সক্রিয় HSC-এর অপসারণে অংশগ্রহণ করতে পারে, যা হলো সেইসব সাধারণ প্রক্রিয়া যা সক্রিয় HSC ফেনোটাইপকে একটি নিষ্ক্রিয় ফেনোটাইপে রূপান্তরিত করে। অ্যাপোপটোসিসে IPA-এর সম্ভাব্য কার্যপ্রণালী এবং ভূমিকার আরেকটি সম্ভাব্য ব্যাখ্যা হলো, এটি মূলত মাইটোফ্যাজি (অভ্যন্তরীণ পথ) এবং বাহ্যিক TNF সিগন্যালিং পথের (সারণী 1) মাধ্যমে অকার্যকর মাইটোকন্ড্রিয়া অপসারণ করে, যা সরাসরি NF-κB সারভাইভাল সিগন্যালিং পথের (পরিপূরক চিত্র 7) সাথে যুক্ত। মজার ব্যাপার হল, IPA-সম্পর্কিত সমৃদ্ধ জিনগুলি অ্যাপোপটোটিক পথে প্রো-অ্যাপোপটোটিক এবং প্রো-সারভাইভাল সংকেত প্ররোচিত করতে সক্ষম [54], যা পরামর্শ দেয় যে IPA এই জিনগুলির সাথে মিথস্ক্রিয়া করে অ্যাপোপটোটিক পথ বা বেঁচে থাকাকে প্ররোচিত করতে পারে। যাইহোক, HSC সক্রিয়করণের সময় IPA কীভাবে অ্যাপোপটোসিস বা বেঁচে থাকাকে প্ররোচিত করে এবং এর যান্ত্রিক পথগুলি এখনও অস্পষ্ট।
আইপিএ (IPA) হলো একটি মাইক্রোবিয়াল মেটাবোলাইট যা অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটার মাধ্যমে খাদ্য থেকে প্রাপ্ত ট্রিপটোফ্যান থেকে তৈরি হয়। গবেষণায় দেখা গেছে যে অন্ত্রের পরিবেশে এর প্রদাহ-বিরোধী, অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট এবং এপিজেনেটিক নিয়ন্ত্রক বৈশিষ্ট্য রয়েছে।[55] গবেষণায় দেখা গেছে যে আইপিএ অন্ত্রের প্রতিবন্ধকতার কার্যকারিতা নিয়ন্ত্রণ করতে পারে এবং জারণ চাপ কমাতে পারে, যা এর স্থানীয় শারীরবৃত্তীয় প্রভাবে অবদান রাখতে পারে।[56] প্রকৃতপক্ষে, আইপিএ রক্ত ​​সঞ্চালনের মাধ্যমে লক্ষ্য অঙ্গগুলিতে পরিবাহিত হয়, এবং যেহেতু আইপিএ ট্রিপটোফ্যান, সেরোটোনিন এবং ইন্ডোল ডেরিভেটিভগুলির সাথে একটি অনুরূপ প্রধান মেটাবোলাইট কাঠামো ভাগ করে নেয়, তাই আইপিএ বিপাকীয় ক্রিয়া প্রদর্শন করে যার ফলে প্রতিযোগিতামূলক বিপাকীয় পরিণতি ঘটে।[52] আইপিএ এনজাইম বা রিসেপ্টরগুলিতে বাইন্ডিং সাইটের জন্য ট্রিপটোফ্যান-উদ্ভূত মেটাবোলাইটগুলির সাথে প্রতিযোগিতা করতে পারে, যা সম্ভাব্যভাবে স্বাভাবিক বিপাকীয় পথগুলিকে ব্যাহত করে। এটি এর থেরাপিউটিক উইন্ডো আরও ভালভাবে বোঝার জন্য এর ফার্মাকোকাইনেটিক্স এবং ফার্মাকোডাইনামিক্সের উপর আরও গবেষণার প্রয়োজনীয়তা তুলে ধরে।[57] এটি এখনও দেখা বাকি যে হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল (HSC)-এর ক্ষেত্রেও এটি ঘটতে পারে কিনা।
আমরা স্বীকার করি যে আমাদের গবেষণার কিছু সীমাবদ্ধতা রয়েছে। আইপিএ-এর সাথে সম্পর্কিত সম্পর্কগুলি বিশেষভাবে পরীক্ষা করার জন্য, আমরা টাইপ ২ ডায়াবেটিস মেলিটাস (T2DM) রোগীদের বাদ দিয়েছি। আমরা স্বীকার করি যে এটি টাইপ ২ ডায়াবেটিস মেলিটাস এবং উন্নত লিভার রোগে আক্রান্ত রোগীদের ক্ষেত্রে আমাদের গবেষণার ফলাফলের ব্যাপক প্রয়োগযোগ্যতাকে সীমাবদ্ধ করে। যদিও মানুষের সিরামে আইপিএ-এর শারীরবৃত্তীয় ঘনত্ব 1–10 μM [11, 20], 1 mM আইপিএ-এর ঘনত্ব সর্বোচ্চ অ-বিষাক্ত ঘনত্ব [15] এবং অ্যাপোপটোসিসের সর্বোচ্চ হারের উপর ভিত্তি করে বেছে নেওয়া হয়েছিল, যেখানে নেক্রোটিক কোষের জনসংখ্যার শতাংশে কোনও পার্থক্য ছিল না। যদিও এই গবেষণায় আইপিএ-এর অতি-শারীরবৃত্তীয় মাত্রা ব্যবহার করা হয়েছে, বর্তমানে আইপিএ-এর কার্যকর ডোজ সম্পর্কে কোনও ঐকমত্য নেই [52]। যদিও আমাদের ফলাফলগুলি তাৎপর্যপূর্ণ, আইপিএ-এর ব্যাপক বিপাকীয় পরিণতি এখনও গবেষণার একটি সক্রিয় ক্ষেত্র। অধিকন্তু, সিরাম আইপিএ-এর মাত্রা এবং লিভার ট্রান্সক্রিপ্টের ডিএনএ মিথাইলেশনের মধ্যে সম্পর্ক নিয়ে আমাদের গবেষণার ফলাফলগুলি কেবল হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল (HSC) থেকেই নয়, লিভার টিস্যু থেকেও প্রাপ্ত হয়েছিল। ট্রান্সক্রিপ্টোম বিশ্লেষণ থেকে আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণার ফলাফলের উপর ভিত্তি করে আমরা মানব LX-2 কোষ ব্যবহার করার সিদ্ধান্ত নিয়েছি, যেখানে দেখা গেছে যে IPA হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল (HSC) সক্রিয়করণের সাথে সম্পর্কিত [15], এবং HSC-গুলি লিভার ফাইব্রোসিসের অগ্রগতিতে জড়িত প্রধান কোষ। লিভার একাধিক ধরণের কোষ দ্বারা গঠিত, তাই IPA-এর ভূমিকা এবং অন্যান্য লিভার কোষের সাথে এর মিথস্ক্রিয়া অধ্যয়নের জন্য হেপাটোসাইট-HSC-ইমিউন সেল সহ-কালচার সিস্টেমের মতো অন্যান্য কোষ মডেল, ক্যাসপেজ সক্রিয়করণ এবং ডিএনএ খণ্ডনের সাথে মিলিত পদ্ধতি এবং প্রোটিন স্তর সহ এর কার্যপ্রণালী বিবেচনা করা উচিত।