আমরা পূর্বে রিপোর্ট করেছি যে লিভার ফাইব্রোসিস রোগীদের মধ্যে অন্ত্র থেকে প্রাপ্ত ট্রিপটোফান মেটাবোলাইট ইন্ডোল-3-প্রোপিওনিক অ্যাসিড (IPA) এর সিরাম স্তর কম থাকে। এই গবেষণায়, আমরা সিরাম IPA স্তরের সাথে সম্পর্কিত স্থূল লিভারের ট্রান্সক্রিপ্টোম এবং ডিএনএ মিথাইলোম অনুসন্ধান করেছি, পাশাপাশি ইন ভিট্রোতে হেপাটিক স্টেলেট কোষ (HSCs) এর ফেনোটাইপিক নিষ্ক্রিয়তা প্ররোচিত করার ক্ষেত্রে IPA এর ভূমিকাও পরীক্ষা করেছি।
এই গবেষণায় ১১৬ জন স্থূলকায় রোগীকে অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল যাদের টাইপ ২ ডায়াবেটিস মেলিটাস (T2DM) ছিল না (বয়স ৪৬.৮ ± ৯.৩ বছর; BMI: ৪২.৭ ± ৫.০ কেজি/মিটার²) যারা কুওপিও ব্যারিয়াট্রিক সার্জারি সেন্টারে (KOBS) ব্যারিয়াট্রিক সার্জারি করিয়েছিলেন। তরল ক্রোমাটোগ্রাফি-ভর স্পেকট্রোমেট্রি (LC-MS) দ্বারা সঞ্চালিত IPA স্তর পরিমাপ করা হয়েছিল, মোট RNA সিকোয়েন্সিং দ্বারা লিভার ট্রান্সক্রিপ্টোম বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং Infinium HumanMethylation450 BeadChip ব্যবহার করে DNA মিথাইলেশন বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ইন ভিট্রো পরীক্ষার জন্য হিউম্যান হেপাটিক স্টেলেট কোষ (LX-2) ব্যবহার করা হয়েছিল।
লিভারের অ্যাপোপটোটিক, মাইটোফ্যাজিক এবং দীর্ঘায়ু পথের সাথে জড়িত জিনের প্রকাশের সাথে সিরাম আইপিএ স্তরের সম্পর্ক ছিল। লিভার ট্রান্সক্রিপ্ট এবং ডিএনএ মিথাইলেশন প্রোফাইলে AKT সেরিন/থ্রিওনাইন কাইনেজ 1 (AKT1) জিনটি ছিল সবচেয়ে প্রচুর এবং প্রভাবশালী ইন্টারঅ্যাক্টিং জিন। আইপিএ চিকিৎসার ফলে অ্যাপোপটোসিস, মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসন হ্রাস পায় এবং LX-2 কোষের ফাইব্রোসিস, অ্যাপোপটোসিস এবং বেঁচে থাকার জন্য পরিচিত জিনের প্রকাশকে মডিউল করে কোষের আকারবিদ্যা এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যা পরিবর্তিত হয়।
একসাথে নেওয়া হলে, এই তথ্যগুলি সমর্থন করে যে IPA-এর সম্ভাব্য থেরাপিউটিক প্রভাব রয়েছে এবং এটি অ্যাপোপটোসিসকে প্ররোচিত করতে পারে এবং HSC ফেনোটাইপকে একটি নিষ্ক্রিয় অবস্থায় স্থানান্তরিত করতে পারে, যার ফলে HSC সক্রিয়করণ এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল বিপাককে হস্তক্ষেপ করে লিভার ফাইব্রোসিসকে বাধা দেওয়ার সম্ভাবনা বৃদ্ধি পায়।
স্থূলতা এবং বিপাকীয় সিন্ড্রোমের প্রাদুর্ভাব বিপাকীয়ভাবে সম্পর্কিত ফ্যাটি লিভার ডিজিজ (MASLD) এর ক্রমবর্ধমান প্রকোপের সাথে যুক্ত; এই রোগটি সাধারণ জনসংখ্যার 25% থেকে 30% কে প্রভাবিত করে [1]। MASLD এর কারণ হল লিভার ফাইব্রোসিস, একটি গতিশীল প্রক্রিয়া যা তন্তুযুক্ত বহির্কোষীয় ম্যাট্রিক্স (ECM) [2] এর ক্রমাগত জমা দ্বারা চিহ্নিত করা হয়। লিভার ফাইব্রোসিসে জড়িত প্রধান কোষ হল হেপাটিক স্টেলেট কোষ (HSCs), যা চারটি পরিচিত ফেনোটাইপ প্রদর্শন করে: নিশ্চল, সক্রিয়, নিষ্ক্রিয় এবং সেন্সেন্ট [3, 4]। HSC গুলিকে সক্রিয় করা যেতে পারে এবং একটি নিশ্চল ফর্ম থেকে উচ্চ শক্তি চাহিদা সহ প্রলিফারেটিভ ফাইব্রোব্লাস্ট-সদৃশ কোষে রূপান্তরিত করা যেতে পারে, যার মধ্যে α-মসৃণ পেশী অ্যাক্টিন (α-SMA) এবং টাইপ I কোলাজেন (Col-I) [5, 6] এর বর্ধিত প্রকাশ রয়েছে। লিভার ফাইব্রোসিস বিপরীতকরণের সময়, সক্রিয় HSC গুলি অ্যাপোপটোসিস বা নিষ্ক্রিয়তার মাধ্যমে নির্মূল করা হয়। এই প্রক্রিয়াগুলির মধ্যে রয়েছে ফাইব্রোজেনিক জিনের নিম্ননিয়ন্ত্রণ এবং প্রোসারভাইভাল জিনের (যেমন NF-κB এবং PI3K/Akt সিগন্যালিং পথ) মড্যুলেশন [7, 8], সেইসাথে মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যা এবং কার্যকারিতার পরিবর্তন [9]।
অন্ত্রে উৎপাদিত ট্রিপটোফান মেটাবোলাইট ইন্ডোল-৩-প্রোপিওনিক অ্যাসিড (IPA) এর সিরাম স্তর, যা MASLD সহ মানুষের বিপাকীয় রোগে হ্রাস পেয়েছে [10-13]। IPA খাদ্যতালিকাগত ফাইবার গ্রহণের সাথে সম্পর্কিত, এটি তার অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট এবং প্রদাহ-বিরোধী প্রভাবের জন্য পরিচিত এবং ভিভো এবং ইন ভিট্রোতে খাদ্য-প্ররোচিত নন-অ্যালকোহলিক স্টিটোহেপাটাইটিস (NASH) ফেনোটাইপকে কমিয়ে দেয় [11-14]। আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণায় কিছু প্রমাণ পাওয়া গেছে, যা দেখিয়েছে যে কুওপিও ব্যারিয়াট্রিক সার্জারি স্টাডি (KOBS) -এ লিভার ফাইব্রোসিসবিহীন স্থূলকায় রোগীদের তুলনায় লিভার ফাইব্রোসিস রোগীদের মধ্যে সিরাম IPA স্তর কম ছিল। অধিকন্তু, আমরা দেখিয়েছি যে IPA চিকিত্সা মানব হেপাটিক স্টেলেট কোষ (LX-2) মডেলে কোষ আঠালোকরণ, কোষ স্থানান্তর এবং হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল সক্রিয়করণের ধ্রুপদী চিহ্নিতকারী জিনের প্রকাশ কমাতে পারে এবং এটি একটি সম্ভাব্য হেপাটোপ্রোটেক্টিভ মেটাবোলাইট [15]। তবে, এটি এখনও স্পষ্ট নয় যে IPA কীভাবে HSC অ্যাপোপটোসিস এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল বায়োএনার্জেটিক্স সক্রিয় করে লিভার ফাইব্রোসিস রিগ্রেশনকে প্ররোচিত করে।
এখানে, আমরা দেখাচ্ছি যে সিরাম IPA স্থূল কিন্তু টাইপ 2 ডায়াবেটিস (KOBS) নন এমন ব্যক্তিদের লিভারে অ্যাপোপটোসিস, মাইটোফ্যাজি এবং দীর্ঘায়ু পথগুলিতে সমৃদ্ধ জিনের প্রকাশের সাথে সম্পর্কিত। তদুপরি, আমরা দেখেছি যে IPA নিষ্ক্রিয়করণ পথের মাধ্যমে সক্রিয় হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল (HSCs) এর ক্লিয়ারেন্স এবং অবক্ষয়কে প্ররোচিত করতে পারে। এই ফলাফলগুলি IPA-এর জন্য একটি অভিনব ভূমিকা প্রকাশ করে, যা এটিকে লিভার ফাইব্রোসিস রিগ্রেশনকে উৎসাহিত করার জন্য একটি সম্ভাব্য থেরাপিউটিক লক্ষ্য করে তোলে।
KOBS কোহর্টের পূর্ববর্তী একটি গবেষণায় দেখা গেছে যে লিভার ফাইব্রোসিস রোগীদের লিভার ফাইব্রোসিসবিহীন রোগীদের তুলনায় কম সঞ্চালিত IPA স্তর ছিল [15]। টাইপ 2 ডায়াবেটিসের সম্ভাব্য বিভ্রান্তিকর প্রভাব বাদ দেওয়ার জন্য, আমরা চলমান KOBS গবেষণা থেকে টাইপ 2 ডায়াবেটিসবিহীন 116 জন স্থূলকায় রোগী (গড় বয়স ± SD: 46.8 ± 9.3 বছর; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (সারণী 1) কে অধ্যয়নের জনসংখ্যা হিসাবে [16] হিসাবে নিয়োগ করেছি। সমস্ত অংশগ্রহণকারী লিখিতভাবে অবহিত সম্মতি দিয়েছেন এবং হেলসিঙ্কির ঘোষণাপত্র (54/2005, 104/2008 এবং 27/2010) অনুসারে নর্থ সাভো কাউন্টি হাসপাতালের নীতিশাস্ত্র কমিটি দ্বারা অধ্যয়ন প্রোটোকল অনুমোদিত হয়েছে।
ব্যারিয়াট্রিক সার্জারির সময় লিভার বায়োপসি নমুনাগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং পূর্বে বর্ণিত মানদণ্ড [17, 18] অনুসারে অভিজ্ঞ রোগ বিশেষজ্ঞদের দ্বারা হিস্টোলজিক্যালি মূল্যায়ন করা হয়েছিল। মূল্যায়নের মানদণ্ডগুলি পরিপূরক সারণি S1 এ সংক্ষিপ্ত করা হয়েছে এবং পূর্বে বর্ণনা করা হয়েছে [19]।
মেটাবোলোমিক্স বিশ্লেষণের জন্য (n = 116) অলক্ষ্যবিহীন তরল ক্রোমাটোগ্রাফি-মাস স্পেকট্রোমেট্রি (LC-MS) দ্বারা ফাস্টিং সিরাম নমুনা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। পূর্বে বর্ণিত হিসাবে UHPLC-qTOF-MS সিস্টেম (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany) ব্যবহার করে নমুনাগুলি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল19। আইসোপ্রোপাইল অ্যালকোহল (IPA) সনাক্তকরণ ধারণ সময় এবং বিশুদ্ধ মানের সাথে MS/MS বর্ণালীর তুলনার উপর ভিত্তি করে করা হয়েছিল। পরবর্তী সমস্ত বিশ্লেষণে IPA সংকেত তীব্রতা (শীর্ষ এলাকা) বিবেচনা করা হয়েছিল [20]।
ইলুমিনা হাইসেক ২৫০০ ব্যবহার করে পুরো লিভারের আরএনএ সিকোয়েন্সিং করা হয়েছিল এবং পূর্বে বর্ণিত [19, 21, 22] অনুসারে ডেটা প্রিপ্রসেস করা হয়েছিল। আমরা মাইটোমাইনার 4.0 ডাটাবেস থেকে নির্বাচিত 1957 জিন ব্যবহার করে মাইটোকন্ড্রিয়াল ফাংশন/বায়োজেনেসিসকে প্রভাবিত করে এমন ট্রান্সক্রিপ্টের লক্ষ্যবস্তু ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ করেছি [23]। পূর্বে বর্ণিত একই পদ্ধতি ব্যবহার করে ইনফিনিয়াম হিউম্যানমিথাইলেশন450 বিডচিপ (ইলুমিনা, সান দিয়েগো, সিএ, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) ব্যবহার করে লিভারের ডিএনএ মিথাইলেশন বিশ্লেষণ করা হয়েছিল [24, 25]।
মানব হেপাটিক স্টেলেট কোষ (LX-2) অধ্যাপক স্টেফানো রোমিও দ্বারা সদয়ভাবে সরবরাহ করা হয়েছিল এবং DMEM/F12 মাধ্যমে (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) কালচার এবং রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল। IPA এর কার্যকরী ডোজ নির্বাচন করার জন্য, LX-2 কোষগুলিকে DMEM/F12 মাধ্যমে 24 ঘন্টার জন্য IPA এর বিভিন্ন ঘনত্ব (10 μM, 100 μM এবং 1 mM; Sigma, 220027) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। অধিকন্তু, HSC গুলিকে নিষ্ক্রিয় করার জন্য IPA এর ক্ষমতা তদন্ত করার জন্য, LX-2 কোষগুলিকে 5 ng/ml TGF-β1 (R&D সিস্টেম, 240-B-002/CF) এবং 1 mM IPA দিয়ে সিরাম-মুক্ত মাধ্যমে 24 ঘন্টার জন্য সহ-চিকিৎসা করা হয়েছিল। সংশ্লিষ্ট যানবাহন নিয়ন্ত্রণের জন্য, TGF-β1 চিকিৎসার জন্য 0.1% BSA ধারণকারী 4 nM HCL ব্যবহার করা হয়েছিল এবং IPA চিকিৎসার জন্য 0.05% DMSO ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং উভয়ই সম্মিলিত চিকিৎসার জন্য একসাথে ব্যবহার করা হয়েছিল।
প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit ব্যবহার করে 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) ব্যবহার করে অ্যাপোপটোসিস মূল্যায়ন করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, LX-2 (1 × 105 কোষ/কূপ) রাতারাতি 12-কূপ প্লেটে কালচার করা হয়েছিল এবং তারপর IPA বা IPA এবং TGF-β1 এর একাধিক ডোজ দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। পরের দিন, ভাসমান এবং আনুগত্যকারী কোষগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল, ট্রিপসিনাইজ করা হয়েছিল, PBS দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল, Annexin V বাইন্ডিং বাফারে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং FITC-Annexin V এবং 7-AAD দিয়ে 15 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল।
জীবন্ত কোষের মাইটোকন্ড্রিয়াকে Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, কার্লসব্যাড, CA) ব্যবহার করে জারণ কার্যকলাপের জন্য দাগ দেওয়া হয়েছিল। MTR অ্যাসেসের জন্য, LX-2 কোষগুলিকে IPA এবং TGF-β1 দিয়ে সমান ঘনত্বে ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল। 24 ঘন্টা পরে, জীবন্ত কোষগুলিকে ট্রিপসিনাইজ করা হয়েছিল, PBS দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল, এবং তারপর পূর্বে বর্ণিত [26] অনুসারে 20 মিনিটের জন্য 37 °C তাপমাত্রায় সিরাম-মুক্ত মাধ্যমে 100 μM MTR দিয়ে ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল। জীবন্ত কোষের রূপবিদ্যা বিশ্লেষণের জন্য, যথাক্রমে ফরোয়ার্ড স্ক্যাটার (FSC) এবং সাইড স্ক্যাটার (SSC) পরামিতি ব্যবহার করে কোষের আকার এবং সাইটোপ্লাজমিক জটিলতা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
সমস্ত তথ্য (৩০,০০০ ইভেন্ট) NovoCyte Quanteon (Agilent) ব্যবহার করে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং NovoExpress® 1.4.1 অথবা FlowJo V.10 সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
নির্মাতার নির্দেশ অনুসারে সিহর্স এক্সট্রাসেলুলার ফ্লাক্স অ্যানালাইজার (অ্যাজিলেন্ট টেকনোলজিস, সান্তা ক্লারা, সিএআর) ব্যবহার করে রিয়েল টাইমে অক্সিজেন খরচ হার (ওসিআর) এবং এক্সট্রাসেলুলার অ্যাসিডিফিকেশন হার (ইসিএআর) পরিমাপ করা হয়েছিল। সিহর্স এক্সএফ সেল মিটো স্ট্রেস দিয়ে সজ্জিত সিহর্স এক্সএফ সেল ফ্লাক্স অ্যানালাইজার (অ্যাজিলেন্ট টেকনোলজিস, সান্তা ক্লারা, সিএআর) ব্যবহার করে রিয়েল টাইমে পরিমাপ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, 2 × 104 LX-2 কোষ/কূপ XF96 কোষ কালচার প্লেটে সিড করা হয়েছিল। রাতারাতি ইনকিউবেশনের পরে, কোষগুলিকে আইসোপ্রোপ্যানল (আইপিএ) এবং TGF-β1 (পরিপূরক পদ্ধতি 1) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। সিহর্স এক্সএফ ওয়েভ সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল, যার মধ্যে সিহর্স এক্সএফ সেল এনার্জি ফেনোটাইপ টেস্ট রিপোর্ট জেনারেটর অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। এ থেকে, একটি বায়োএনার্জেটিক হেলথ ইনডেক্স (BHI) গণনা করা হয়েছিল [27]।
মোট RNA কে cDNA তে রূপান্তরিত করা হয়েছিল। নির্দিষ্ট পদ্ধতির জন্য, রেফারেন্স দেখুন [15]। মানব 60S রাইবোসোমাল অ্যাসিডিক প্রোটিন P0 (RPLP0) এবং সাইক্লোফিলিন A1 (PPIA) mRNA স্তরগুলি গঠনমূলক জিন নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল। QuantStudio 6 pro Real-Time PCR সিস্টেম (থার্মো ফিশার, ল্যান্ডসমিয়ার, নেদারল্যান্ডস) TaqMan™ ফাস্ট অ্যাডভান্সড মাস্টার মিক্স কিট (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেমস) অথবা Sensifast SYBR Lo-ROX কিট (বায়োলিন, BIO 94050) এর সাথে ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং তুলনামূলক Ct মান সাইক্লিং প্যারামিটার (ΔΔCt) এবং ∆∆Ct পদ্ধতি ব্যবহার করে আপেক্ষিক জিন এক্সপ্রেশন ভাঁজ গণনা করা হয়েছিল। প্রাইমারের বিশদ পরিপূরক সারণী S2 এবং S3 এ সরবরাহ করা হয়েছে।
পূর্বে বর্ণিত DNeasy রক্ত ​​এবং টিস্যু কিট (Qiagen) ব্যবহার করে নিউক্লিয়ার DNA (ncDNA) এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল DNA (mtDNA) বের করা হয়েছিল [28]। পরিপূরক পদ্ধতি 2-এ বর্ণিত তিনটি নিউক্লিয়ার DNA অঞ্চলের (mtDNA/ncDNA) জ্যামিতিক গড়ের সাথে প্রতিটি লক্ষ্য mtDNA অঞ্চলের অনুপাত গণনা করে mtDNA-এর আপেক্ষিক পরিমাণ গণনা করা হয়েছিল। mtDNA এবং ncDNA-এর জন্য প্রাইমারের বিশদ বিবরণ পরিপূরক সারণি S4-এ দেওয়া হয়েছে।
জীবন্ত কোষগুলিকে Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, কার্লসব্যাড, CA) দিয়ে রঙ করা হয়েছিল যাতে আন্তঃকোষীয় এবং আন্তঃকোষীয় মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কগুলি কল্পনা করা যায়। LX-2 কোষগুলি (1 × 104 কোষ/কূপ) কাচের স্লাইডে কাচের তলাবিশিষ্ট কালচার প্লেটে (Ibidi GmbH, Martinsried, জার্মানি) কালচার করা হয়েছিল। 24 ঘন্টা পরে, জীবন্ত LX-2 কোষগুলিকে 37 °C তাপমাত্রায় 20 মিনিটের জন্য 100 μM MTR দিয়ে ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল এবং কোষের নিউক্লিয়াসকে DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) দিয়ে রঙ করা হয়েছিল যেমনটি পূর্বে বর্ণিত হয়েছে [29]। মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্কগুলিকে Zeiss Axio Observer inverted মাইক্রোস্কোপ (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, জার্মানি) ব্যবহার করে ভিজ্যুয়ালাইজ করা হয়েছিল যা Zeiss LSM 800 কনফোকাল মডিউল দিয়ে সজ্জিত 37 °C তাপমাত্রায় 5% CO2 সহ একটি আর্দ্র পরিবেশে 63×NA 1.3 অবজেক্টিভ ব্যবহার করে। আমরা প্রতিটি নমুনা ধরণের জন্য দশটি Z-সিরিজ ছবি সংগ্রহ করেছি। প্রতিটি Z-সিরিজে 30টি বিভাগ রয়েছে, প্রতিটির পুরুত্ব 9.86 μm। প্রতিটি নমুনার জন্য, ZEN 2009 সফ্টওয়্যার (কার্ল জেইস মাইক্রোইমেজিং জিএমবিএইচ, জেনা, জার্মানি) ব্যবহার করে দশটি ভিন্ন দৃশ্যক্ষেত্রের ছবি সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং পরিপূরক পদ্ধতি 3-এ বর্ণিত পরামিতি অনুসারে ImageJ সফ্টওয়্যার (v1.54d) [30, 31] ব্যবহার করে মাইটোকন্ড্রিয়াল মরফোলজি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
কোষগুলিকে 0.1 M ফসফেট বাফারে 2% গ্লুটারালডিহাইড দিয়ে স্থির করা হয়েছিল, তারপরে 1% অসমিয়াম টেট্রোক্সাইড দ্রবণ (সিগমা অ্যালড্রিচ, MO, USA) দিয়ে স্থির করা হয়েছিল, ধীরে ধীরে অ্যাসিটোন দিয়ে ডিহাইড্রেট করা হয়েছিল (Merck, Darmstadt, জার্মানি) এবং অবশেষে ইপোক্সি রজনে এমবেড করা হয়েছিল। অতি পাতলা অংশগুলি প্রস্তুত করা হয়েছিল এবং 1% ইউরেনিল অ্যাসিটেট (Merck, Darmstadt, জার্মানি) এবং 1% সীসা সাইট্রেট (Merck, Darmstadt, জার্মানি) দিয়ে রঙ করা হয়েছিল। 80 kV এর ত্বরক ভোল্টেজে JEM 2100F EXII ট্রান্সমিশন ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপ (JEOL Ltd, টোকিও, জাপান) ব্যবহার করে আল্ট্রাস্ট্রাকচারাল ছবিগুলি পাওয়া গিয়েছিল।
Zeiss ইনভার্টেড লাইট মাইক্রোস্কোপ (Zeiss Axio Vert.A1 এবং AxioCam MRm, Jena, জার্মানি) ব্যবহার করে 50x ম্যাগনিফিকেশনে ফেজ-কনট্রাস্ট মাইক্রোস্কোপির মাধ্যমে 24 ঘন্টা ধরে IPA দিয়ে চিকিত্সা করা LX-2 কোষের রূপবিদ্যা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
ক্লিনিক্যাল তথ্যকে গড় ± স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন বা মিডিয়ান (ইন্টারকোয়ার্টাইল রেঞ্জ: IQR) হিসেবে প্রকাশ করা হয়েছিল। তিনটি গবেষণা গোষ্ঠীর মধ্যে পার্থক্য তুলনা করার জন্য ভ্যারিয়েন্সের একমুখী বিশ্লেষণ (ক্রমাগত ভেরিয়েবল) বা χ² পরীক্ষা (শ্রেণীবদ্ধ ভেরিয়েবল) ব্যবহার করা হয়েছিল। একাধিক পরীক্ষার জন্য সংশোধন করার জন্য মিথ্যা পজিটিভ রেট (FDR) ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং FDR < 0.05 সহ জিনগুলিকে পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচনা করা হয়েছিল। IPA সংকেত তীব্রতার সাথে CpG DNA মিথাইলেশনের সম্পর্ক স্থাপনের জন্য স্পিয়ারম্যান পারস্পরিক সম্পর্ক বিশ্লেষণ ব্যবহার করা হয়েছিল, নামমাত্র p মান (p < 0.05) রিপোর্ট করা হয়েছিল।
পাথওয়ে বিশ্লেষণ একটি ওয়েব-ভিত্তিক জিন সেট বিশ্লেষণ টুল (ওয়েবগেস্টাল্ট) ব্যবহার করে করা হয়েছিল ২৬৮টি ট্রান্সক্রিপ্ট (নামমাত্র p < 0.01), ১১৯টি মাইটোকন্ড্রিয়া-সম্পর্কিত ট্রান্সক্রিপ্ট (নামমাত্র p < 0.05), এবং ৩০৯৩টি লিভার ট্রান্সক্রিপ্টের মধ্যে ৪৩৫০টি CpG যা সঞ্চালিত সিরাম IPA স্তরের সাথে সম্পর্কিত ছিল। অবাধে উপলব্ধ ভেনি ডিবি (সংস্করণ ২.১.০) টুলটি ওভারল্যাপিং জিন খুঁজে বের করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল এবং স্ট্রিংডিবি (সংস্করণ ১১.৫) প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া কল্পনা করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।
LX-2 পরীক্ষার জন্য, D'Agostino-Pearson পরীক্ষা ব্যবহার করে নমুনাগুলির স্বাভাবিকতা পরীক্ষা করা হয়েছিল। কমপক্ষে তিনটি জৈবিক প্রতিলিপি থেকে তথ্য সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং বনফেরোনি পোস্টহক পরীক্ষার মাধ্যমে একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়েছিল। 0.05 এর কম p-মান পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল। তথ্যগুলি গড় ± SD হিসাবে উপস্থাপন করা হয়েছে এবং প্রতিটি চিত্রে পরীক্ষার সংখ্যা নির্দেশিত হয়েছে। সমস্ত বিশ্লেষণ এবং গ্রাফগুলি উইন্ডোজের জন্য গ্রাফপ্যাড প্রিজম 8 পরিসংখ্যানগত সফ্টওয়্যার (গ্রাফপ্যাড সফটওয়্যার ইনকর্পোরেটেড, সংস্করণ 8.4.3, সান দিয়েগো, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) ব্যবহার করে সম্পাদিত হয়েছিল।
প্রথমে, আমরা লিভার, পুরো শরীর এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ট্রান্সক্রিপ্টের সাথে সিরাম IPA স্তরের সম্পর্ক অনুসন্ধান করেছি। মোট ট্রান্সক্রিপ্ট প্রোফাইলে, সিরাম IPA স্তরের সাথে যুক্ত সবচেয়ে শক্তিশালী জিন ছিল MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; মাইটোজেন-সক্রিয় প্রোটিন কাইনেজ-সক্রিয় প্রোটিন কাইনেজ 3); মাইটোকন্ড্রিয়া-সম্পর্কিত ট্রান্সক্রিপ্ট প্রোফাইলে, সবচেয়ে শক্তিশালী সম্পর্কিত জিন ছিল AKT1 (FDR = 0.7621; AKT সেরিন/থ্রিওনাইন কাইনেজ 1) (অতিরিক্ত ফাইল 1 এবং অতিরিক্ত ফাইল 2)।
এরপর আমরা গ্লোবাল ট্রান্সক্রিপ্ট (n = 268; p < 0.01) এবং মাইটোকন্ড্রিয়া-সম্পর্কিত ট্রান্সক্রিপ্ট (n = 119; p < 0.05) বিশ্লেষণ করেছি, যা শেষ পর্যন্ত অ্যাপোপটোসিসকে সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ ক্যানোনিকাল পথ (p = 0.0089) হিসেবে চিহ্নিত করেছে। সিরাম IPA স্তরের সাথে সম্পর্কিত মাইটোকন্ড্রিয়াল ট্রান্সক্রিপ্টের জন্য, আমরা অ্যাপোপটোসিস (FDR = 0.00001), মাইটোফ্যাজি (FDR = 0.00029), এবং TNF সিগন্যালিং পথ (FDR = 0.000006) (চিত্র 1A, টেবিল 2, এবং পরিপূরক চিত্র 1A-B) এর উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করেছি।
সিরাম IPA স্তরের সাথে মানব লিভারে গ্লোবাল, মাইটোকন্ড্রিয়া-সম্পর্কিত ট্রান্সক্রিপ্ট এবং DNA মিথাইলেশনের ওভারল্যাপিং বিশ্লেষণ। A 268টি গ্লোবাল ট্রান্সক্রিপ্ট, 119টি মাইটোকন্ড্রিয়া-সম্পর্কিত ট্রান্সক্রিপ্ট এবং DNA মিথাইলেটেড ট্রান্সক্রিপ্ট প্রতিনিধিত্ব করে যা সিরাম IPA স্তরের সাথে সম্পর্কিত 3092টি CpG সাইটে ম্যাপ করা হয়েছে (গ্লোবাল ট্রান্সক্রিপ্ট এবং DNA মিথাইলেটেডের জন্য p মান < 0.01, এবং মাইটোকন্ড্রিয়া ট্রান্সক্রিপ্টের জন্য p মান < 0.05)। প্রধান ওভারল্যাপিং ট্রান্সক্রিপ্টগুলি মাঝখানে দেখানো হয়েছে (AKT1 এবং YKT6)। B অন্যান্য জিনের সাথে সর্বোচ্চ ইন্টারঅ্যাকশন স্কোর (0.900) সহ 13টি জিনের ইন্টারঅ্যাকশন ম্যাপটি 56টি ওভারল্যাপিং জিন (কালো রেখা অঞ্চল) থেকে তৈরি করা হয়েছিল যা অনলাইন টুল StringDB ব্যবহার করে সিরাম IPA স্তরের সাথে উল্লেখযোগ্যভাবে যুক্ত ছিল। সবুজ: জিনগুলি জিন অন্টোলজি (GO) সেলুলার উপাদানের সাথে ম্যাপ করা হয়েছে: মাইটোকন্ড্রিয়া (GO:0005739)। AKT1 হল সেই প্রোটিন যা ডেটার উপর ভিত্তি করে অন্যান্য প্রোটিনের সাথে মিথস্ক্রিয়ার জন্য সর্বোচ্চ স্কোর (0.900) পেয়েছে (টেক্সট মাইনিং, পরীক্ষা, ডাটাবেস এবং সহ-প্রকাশের উপর ভিত্তি করে)। নেটওয়ার্ক নোডগুলি প্রোটিনকে প্রতিনিধিত্ব করে এবং প্রান্তগুলি প্রোটিনের মধ্যে সংযোগকে প্রতিনিধিত্ব করে।
যেহেতু অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটা মেটাবোলাইটগুলি ডিএনএ মিথাইলেশনের মাধ্যমে এপিজেনেটিক গঠন নিয়ন্ত্রণ করতে পারে [32], আমরা তদন্ত করেছি যে সিরাম আইপিএ স্তরগুলি লিভার ডিএনএ মিথাইলেশনের সাথে সম্পর্কিত কিনা। আমরা দেখতে পেয়েছি যে সিরাম আইপিএ স্তরের সাথে সম্পর্কিত দুটি প্রধান মিথাইলেশন সাইট প্রোলিন-সেরিন-সমৃদ্ধ অঞ্চল 3 (C19orf55) এবং হিট শক প্রোটিন ফ্যামিলি বি (ছোট) সদস্য 6 (HSPB6) (অতিরিক্ত ফাইল 3) এর কাছাকাছি ছিল। 4350 CpG (p < 0.01) এর ডিএনএ মিথাইলেশন সিরাম আইপিএ স্তরের সাথে সম্পর্কিত ছিল এবং দীর্ঘায়ু নিয়ন্ত্রক পথগুলিতে সমৃদ্ধ হয়েছিল (p = 0.006) (চিত্র 1A, টেবিল 2, এবং পরিপূরক চিত্র 1C)।
সিরাম IPA স্তর, গ্লোবাল ট্রান্সক্রিপ্ট, মাইটোকন্ড্রিয়া-সম্পর্কিত ট্রান্সক্রিপ্ট এবং মানব লিভারে DNA মিথাইলেশনের মধ্যে সম্পর্ক বোঝার জন্য, আমরা পূর্ববর্তী পাথওয়ে বিশ্লেষণে (চিত্র 1A) চিহ্নিত জিনগুলির একটি ওভারল্যাপ বিশ্লেষণ করেছি। 56টি ওভারল্যাপিং জিনের (চিত্র 1A-তে কালো রেখার ভিতরে) পাথওয়ে সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণের ফলাফল দেখিয়েছে যে অ্যাপোপটোসিস পাথওয়ে (p = 0.00029) তিনটি বিশ্লেষণে সাধারণ দুটি জিনকে হাইলাইট করেছে: AKT1 এবং YKT6 (YKT6 v-SNARE হোমোলগ), যেমনটি ভেন ডায়াগ্রামে দেখানো হয়েছে (পরিপূরক চিত্র 2 এবং চিত্র 1A)। মজার বিষয় হল, আমরা দেখতে পেয়েছি যে AKT1 (cg19831386) এবং YKT6 (cg24161647) সিরাম IPA স্তরের সাথে ইতিবাচকভাবে সম্পর্কযুক্ত ছিল (অতিরিক্ত ফাইল 3)। জিন পণ্যগুলির মধ্যে সম্ভাব্য প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া সনাক্ত করতে, আমরা ইনপুট হিসাবে 56টি ওভারল্যাপিং জিনের মধ্যে সর্বোচ্চ সাধারণ অঞ্চল স্কোর (0.900) সহ 13টি জিন নির্বাচন করেছি এবং একটি ইন্টারঅ্যাকশন মানচিত্র তৈরি করেছি। আত্মবিশ্বাসের স্তর (প্রান্তিক আত্মবিশ্বাস) অনুসারে, সর্বোচ্চ স্কোর (0.900) সহ AKT1 জিনটি শীর্ষে ছিল (চিত্র 1B)।
পথ বিশ্লেষণের উপর ভিত্তি করে, আমরা দেখতে পেলাম যে অ্যাপোপটোসিসই প্রধান পথ, তাই আমরা তদন্ত করেছিলাম যে IPA চিকিৎসা HSC-এর ইন ভিট্রো অ্যাপোপটোসিসকে প্রভাবিত করবে কিনা। আমরা পূর্বে দেখিয়েছি যে IPA-এর বিভিন্ন ডোজ (10 μM, 100 μM, এবং 1 mM) LX-2 কোষের জন্য অ-বিষাক্ত ছিল [15]। এই গবেষণায় দেখা গেছে যে 10 μM এবং 100 μM-এ IPA চিকিৎসা কার্যকর এবং নেক্রোটিক কোষের সংখ্যা বৃদ্ধি করেছে। তবে, নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর তুলনায়, কোষের কার্যকারিতা 1 mM IPA ঘনত্বে হ্রাস পেয়েছে, যখন কোষের নেক্রোসিসের হার অপরিবর্তিত রয়েছে (চিত্র 2A, B)। এরপর, LX-2 কোষে অ্যাপোপটোসিস প্ররোচিত করার জন্য সর্বোত্তম ঘনত্ব খুঁজে পেতে, আমরা 24 ঘন্টার জন্য 10 μM, 100 μM এবং 1 mM IPA পরীক্ষা করেছি (চিত্র 2A-E এবং পরিপূরক চিত্র 3A-B)। মজার বিষয় হল, IPA 10 μM এবং 100 μM অ্যাপোপটোসিস হার (%) হ্রাস করেছে, তবে, IPA 1 mM নিয়ন্ত্রণের তুলনায় দেরীতে অ্যাপোপটোসিস এবং অ্যাপোপটোসিস হার (%) বৃদ্ধি করেছে এবং তাই আরও পরীক্ষার জন্য বেছে নেওয়া হয়েছে (চিত্র 2A–D)।
IPA LX-2 কোষের অ্যাপোপটোসিসকে প্ররোচিত করে। অ্যানেক্সিন V এবং 7-AAD ডাবল স্টেইনিং পদ্ধতি ব্যবহার করে ফ্লো সাইটোমেট্রি দ্বারা অ্যাপোপটোটিক রেট এবং কোষের রূপবিদ্যা পরিমাপ করা হয়েছিল। BA কোষগুলিকে 24 ঘন্টার জন্য 10 μM, 100 μM এবং 1 mM IPA দিয়ে অথবা F–H TGF-β1 (5 ng/ml) এবং 1 mM IPA দিয়ে 24 ঘন্টার জন্য সিরাম-মুক্ত মাধ্যমে ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল। A: জীবন্ত কোষ (Annexin V -/ 7AAD-); B: নেক্রোটিক কোষ (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: প্রাথমিক (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: দেরী (Annexin V+/7AAD.+); E, H: অ্যাপোপটোটিক হারে মোট প্রাথমিক এবং দেরী অ্যাপোপটোটিক কোষের শতাংশ (%)। তথ্য গড় ± SD, n = 3 স্বাধীন পরীক্ষা হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছে। বনফেরোনি পোস্টহক পরীক্ষার সাথে একমুখী আনোভা ব্যবহার করে পরিসংখ্যানগত তুলনা করা হয়েছিল। *p < 0.05; ****p < 0.0001
যেমনটি আমরা আগে দেখিয়েছি, 5 ng/ml TGF-β1 ক্লাসিক্যাল মার্কার জিনের প্রকাশ বৃদ্ধি করে HSC সক্রিয়করণকে প্ররোচিত করতে পারে [15]। LX-2 কোষগুলিকে 5 ng/ml TGF-β1 এবং 1 mM IPA সংমিশ্রণে চিকিত্সা করা হয়েছিল (চিত্র 2E–H)। TGF-β1 চিকিত্সা অ্যাপোপটোসিস হার পরিবর্তন করেনি, তবে, IPA সহ-চিকিৎসা TGF-β1 চিকিত্সার তুলনায় দেরী অ্যাপোপটোসিস এবং অ্যাপোপটোসিস হার (%) বৃদ্ধি করেছে (চিত্র 2E–H)। এই ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে 1 mM IPA TGF-β1 আবেশন ছাড়াই LX-2 কোষে অ্যাপোপটোসিসকে উন্নীত করতে পারে।
আমরা LX-2 কোষে মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসনের উপর IPA-এর প্রভাব আরও তদন্ত করেছি। ফলাফলে দেখা গেছে যে 1 mM IPA অক্সিজেন খরচ হার (OCR) পরামিতি হ্রাস করেছে: নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর তুলনায় নন-মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসন, বেসাল এবং সর্বাধিক শ্বসন, প্রোটন লিক এবং ATP উৎপাদন (চিত্র 3A, B), যেখানে জৈবশক্তিসম্পন্ন স্বাস্থ্য সূচক (BHI) পরিবর্তিত হয়নি।
IPA LX-2 কোষে মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসন হ্রাস করে। মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসন বক্ররেখা (OCR) মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসন পরামিতি (অ-মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসন, বেসাল শ্বসন, সর্বাধিক শ্বসন, প্রোটন লিক, ATP প্রজন্ম, SRC এবং BHI) হিসাবে উপস্থাপিত হয়। কোষ A এবং B যথাক্রমে 10 μM, 100 μM এবং 1 mM IPA দিয়ে 24 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল। কোষ C এবং D যথাক্রমে 24 ঘন্টার জন্য সিরাম-মুক্ত মাধ্যমে TGF-β1 (5 ng/ml) এবং 1 mM IPA দিয়ে ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল। CyQuant কিট ব্যবহার করে সমস্ত পরিমাপ DNA সামগ্রীতে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। BHI: জৈবশক্তিশালী স্বাস্থ্য সূচক; SRC: শ্বসন সংরক্ষণ ক্ষমতা; OCR: অক্সিজেন খরচ হার। ডেটা গড় ± স্ট্যান্ডার্ড বিচ্যুতি (SD), n = 5 স্বাধীন পরীক্ষা হিসাবে উপস্থাপন করা হয়েছে। একমুখী ANOVA এবং Bonferroni পোস্টহক পরীক্ষা ব্যবহার করে পরিসংখ্যানগত তুলনা করা হয়েছিল। *p < 0.05; **p < 0.01; এবং ***p < 0.001
TGF-β1-সক্রিয় LX-2 কোষের জৈবশক্তিশালী প্রোফাইলের উপর IPA-এর প্রভাব সম্পর্কে আরও বিস্তৃত ধারণা অর্জনের জন্য, আমরা OCR দ্বারা মাইটোকন্ড্রিয়াল অক্সিডেটিভ ফসফোরিলেশন বিশ্লেষণ করেছি (চিত্র 3C,D)। ফলাফলগুলি দেখায় যে TGF-β1 চিকিত্সা নিয়ন্ত্রণ গ্রুপের তুলনায় সর্বাধিক শ্বসন, শ্বাসযন্ত্রের রিজার্ভ ক্ষমতা (SRC) এবং BHI হ্রাস করতে পারে (চিত্র 3C,D)। এছাড়াও, সংমিশ্রণ চিকিত্সা বেসাল শ্বসন, প্রোটন লিক এবং ATP উৎপাদন হ্রাস করেছে, তবে SRC এবং BHI TGF-β1 (চিত্র 3C,D) দিয়ে চিকিত্সা করা তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল।
আমরা সিহর্স সফটওয়্যার দ্বারা সরবরাহিত "কোষীয় শক্তি ফেনোটাইপ পরীক্ষা"ও করেছি (পরিপূরক চিত্র 4A–D)। পরিপূরক চিত্র 3B তে দেখানো হয়েছে, TGF-β1 চিকিৎসার পরে OCR এবং ECAR উভয় বিপাকীয় সম্ভাবনা হ্রাস পেয়েছে, তবে, নিয়ন্ত্রণ গ্রুপের তুলনায় সংমিশ্রণ এবং IPA চিকিৎসা গ্রুপে কোনও পার্থক্য পরিলক্ষিত হয়নি। তদুপরি, নিয়ন্ত্রণ গ্রুপের তুলনায় সংমিশ্রণ এবং IPA চিকিৎসার পরে OCR এর বেসাল এবং স্ট্রেস উভয় স্তরই হ্রাস পেয়েছে (পরিপূরক চিত্র 4C)। মজার বিষয় হল, সংমিশ্রণ থেরাপির সাথে একই ধরণের প্যাটার্ন পরিলক্ষিত হয়েছে, যেখানে TGF-β1 চিকিৎসার তুলনায় ECAR এর বেসাল এবং স্ট্রেস স্তরে কোনও পরিবর্তন পরিলক্ষিত হয়নি (পরিপূরক চিত্র 4C)। HSC গুলিতে, মাইটোকন্ড্রিয়াল অক্সিডেটিভ ফসফোরাইলেশন হ্রাস এবং TGF-β1 চিকিৎসার সংস্পর্শে আসার পরে SCR এবং BHI পুনরুদ্ধার করার জন্য সংমিশ্রণ চিকিত্সার ক্ষমতা বিপাকীয় সম্ভাবনা (OCR এবং ECAR) পরিবর্তন করেনি। একসাথে নেওয়া হলে, এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে IPA HSC-তে জৈবশক্তি হ্রাস করতে পারে, যা পরামর্শ দেয় যে IPA একটি নিম্ন শক্তিমান প্রোফাইল তৈরি করতে পারে যা HSC ফেনোটাইপকে নিষ্ক্রিয়তার দিকে নিয়ে যায় (পরিপূরক চিত্র 4D)।
মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যার উপর IPA-এর প্রভাব মাইটোকন্ড্রিয়াল রূপবিদ্যা এবং নেটওয়ার্ক সংযোগের ত্রিমাত্রিক পরিমাপের পাশাপাশি MTR স্টেইনিং (চিত্র 4 এবং পরিপূরক চিত্র 5) ব্যবহার করে তদন্ত করা হয়েছিল। চিত্র 4 দেখায় যে, নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর সাথে তুলনা করে, TGF-β1 চিকিত্সা গড় পৃষ্ঠের ক্ষেত্রফল, শাখা সংখ্যা, মোট শাখা দৈর্ঘ্য এবং শাখা সংযোগ সংখ্যা (চিত্র 4A এবং B) হ্রাস করেছে এবং মাইটোকন্ড্রিয়ার অনুপাতকে গোলাকার থেকে মধ্যবর্তী রূপবিদ্যায় পরিবর্তন করেছে (চিত্র 4C)। শুধুমাত্র IPA চিকিত্সা নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর (চিত্র 4A) তুলনায় গড় মাইটোকন্ড্রিয়াল আয়তন হ্রাস করেছে এবং মাইটোকন্ড্রিয়ালের অনুপাতকে গোলাকার থেকে মধ্যবর্তী রূপবিদ্যায় পরিবর্তন করেছে। বিপরীতে, মাইটোকন্ড্রিয়াল ঝিল্লি সম্ভাব্যতা-নির্ভর MTR (চিত্র 4A এবং E) দ্বারা মূল্যায়ন করা গোলকত্ব, গড় শাখা দৈর্ঘ্য এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ অপরিবর্তিত ছিল এবং এই পরামিতিগুলি গোষ্ঠীগুলির মধ্যে পার্থক্য করেনি। একসাথে নেওয়া হলে, এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে TGF-β1 এবং IPA চিকিত্সা জীবন্ত LX-2 কোষে মাইটোকন্ড্রিয়াল আকৃতি এবং আকারের পাশাপাশি নেটওয়ার্ক জটিলতাকে সংশোধন করে বলে মনে হচ্ছে।
IPA LX-2 কোষে মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যা এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল DNA প্রাচুর্য পরিবর্তন করে। A. TGF-β1 (5 ng/ml) এবং 1 mM IPA দিয়ে 24 ঘন্টা ধরে সিরাম-মুক্ত মাধ্যমে ইনকিউবেটেড লাইভ LX-2 কোষের প্রতিনিধিত্বমূলক কনফোকাল চিত্র যা মাইটোট্র্যাকার™ লাল CMXRos দিয়ে দাগযুক্ত মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্ক এবং DAPI দিয়ে নীল রঙযুক্ত নিউক্লিয়াস দেখায়। সমস্ত ডেটাতে প্রতি গ্রুপে কমপক্ষে 15টি চিত্র রয়েছে। আমরা প্রতিটি নমুনা ধরণের জন্য 10টি Z-স্ট্যাক চিত্র পেয়েছি। প্রতিটি Z-অক্ষ ক্রমানুসারে 30টি স্লাইস রয়েছে, প্রতিটির পুরুত্ব 9.86 μm। স্কেল বার: 10 μm। B. ছবিতে অভিযোজিত থ্রেশহোল্ডিং প্রয়োগ করে চিহ্নিত প্রতিনিধিত্বমূলক বস্তু (শুধুমাত্র মাইটোকন্ড্রিয়া)। প্রতিটি গ্রুপের সমস্ত কোষের জন্য মাইটোকন্ড্রিয়াল রূপগত নেটওয়ার্ক সংযোগের পরিমাণগত বিশ্লেষণ এবং তুলনা করা হয়েছিল। C. মাইটোকন্ড্রিয়াল আকৃতির অনুপাতের ফ্রিকোয়েন্সি। 0 এর কাছাকাছি মানগুলি গোলাকার আকার নির্দেশ করে এবং 1 এর কাছাকাছি মানগুলি ফিলামেন্টাস আকার নির্দেশ করে। D মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ (mtDNA) এর উপাদানগুলি উপকরণ এবং পদ্ধতিতে বর্ণিত হিসাবে নির্ধারণ করা হয়েছিল। E মাইটোট্র্যাকার™ রেড CMXRos বিশ্লেষণটি উপকরণ এবং পদ্ধতিতে বর্ণিত ফ্লো সাইটোমেট্রি (30,000 ইভেন্ট) দ্বারা সম্পাদিত হয়েছিল। ডেটা গড় ± SD, n = 3 টি স্বাধীন পরীক্ষা হিসাবে উপস্থাপন করা হয়েছে। একমুখী ANOVA এবং বনফেরোনি পোস্ট হক পরীক্ষা ব্যবহার করে পরিসংখ্যানগত তুলনা করা হয়েছিল। *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
এরপর আমরা LX-2 কোষে mtDNA কন্টেন্টকে মাইটোকন্ড্রিয়াল সংখ্যার সূচক হিসেবে বিশ্লেষণ করেছি। নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর সাথে তুলনা করলে, TGF-β1-চিকিৎসা করা গ্রুপে mtDNA কন্টেন্ট বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 4D)। TGF-β1-চিকিৎসা করা গ্রুপের সাথে তুলনা করলে, সংমিশ্রণ চিকিৎসা গোষ্ঠীতে (চিত্র 4D) mtDNA কন্টেন্ট হ্রাস পেয়েছে, যা পরামর্শ দেয় যে IPA mtDNA কন্টেন্ট এবং সম্ভবত মাইটোকন্ড্রিয়াল সংখ্যার পাশাপাশি মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসন (চিত্র 3C) হ্রাস করতে পারে। অধিকন্তু, IPA সংমিশ্রণ চিকিৎসায় mtDNA কন্টেন্ট হ্রাস করেছে বলে মনে হচ্ছে কিন্তু MTR-মধ্যস্থতাযুক্ত মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপকে প্রভাবিত করেনি (চিত্র 4A-C)।
আমরা LX-2 কোষে ফাইব্রোসিস, অ্যাপোপটোসিস, বেঁচে থাকা এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যার সাথে সম্পর্কিত জিনের mRNA স্তরের সাথে IPA-এর সম্পর্ক অনুসন্ধান করেছি (চিত্র 5A–D)। নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর সাথে তুলনা করে, TGF-β1-চিকিৎসা করা গোষ্ঠীতে কোলাজেন টাইপ I α2 চেইন (COL1A2), α-মসৃণ পেশী অ্যাক্টিন (αSMA), ম্যাট্রিক্স মেটালোপ্রোটিনেজ 2 (MMP2), মেটালোপ্রোটিনেজ 1 (TIMP1) এর টিস্যু ইনহিবিটার এবং ডাইনামিন 1-লাইক জিন (DRP1) এর মতো জিনের বর্ধিত প্রকাশ দেখা গেছে, যা বর্ধিত ফাইব্রোসিস এবং সক্রিয়করণ নির্দেশ করে। অধিকন্তু, নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর সাথে তুলনা করে, TGF-β1 চিকিত্সা নিউক্লিয়ার প্রেগনেন X রিসেপ্টর (PXR), ক্যাসপেস 8 (CASP8), MAPKAPK3, B-কোষ α এর ইনহিবিটার, নিউক্লিয়ার ফ্যাক্টর κ জিন লাইট পেপটাইড (NFκB1A) এর বর্ধক এবং নিউক্লিয়ার ফ্যাক্টর κB কাইনেজ সাবইউনিট β (IKBKB) এর ইনহিবিটার (চিত্র 5A–D) এর mRNA স্তর হ্রাস করেছে। TGF-β1 চিকিৎসার তুলনায়, TGF-β1 এবং IPA এর সাথে সম্মিলিত চিকিৎসা COL1A2 এবং MMP2 এর প্রকাশ কমিয়েছে, কিন্তু PXR, TIMP1, B-cell lymphoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, এবং IKBKB এর mRNA মাত্রা বৃদ্ধি করেছে। IPA চিকিৎসা MMP2, Bcl-2-সম্পর্কিত প্রোটিন X (BAX), AKT1, অপটিক অ্যাট্রোফি প্রোটিন 1 (OPA1), এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিউশন প্রোটিন 2 (MFN2) এর প্রকাশ উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করেছে, যেখানে নিয়ন্ত্রণ গ্রুপের তুলনায় CASP8, NFκB1A, NFκB1B, এবং IKBKB এর প্রকাশ বৃদ্ধি পেয়েছে। তবে, ক্যাসপেস-3 (CASP3), অ্যাপোপটোটিক পেপটাইডেস অ্যাক্টিভেটিং ফ্যাক্টর 1 (APAF1), মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিউশন প্রোটিন 1 (MFN1), এবং ফিশন প্রোটিন 1 (FIS1) এর প্রকাশে কোনও পার্থক্য পাওয়া যায়নি। সম্মিলিতভাবে, এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে IPA চিকিৎসা ফাইব্রোসিস, অ্যাপোপটোসিস, বেঁচে থাকা এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল গতিবিদ্যার সাথে সম্পর্কিত জিনের প্রকাশকে নিয়ন্ত্রণ করে। আমাদের তথ্য থেকে জানা যায় যে IPA চিকিৎসা LX-2 কোষে ফাইব্রোসিস হ্রাস করে; একই সাথে, এটি ফেনোটাইপকে নিষ্ক্রিয়তার দিকে স্থানান্তরিত করে বেঁচে থাকার জন্য উদ্দীপিত করে।
IPA LX-2 কোষে ফাইব্রোব্লাস্ট, অ্যাপোপটোটিক, ভায়াবিলিটি এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ডাইনামিক্স জিনের প্রকাশকে নিয়ন্ত্রণ করে। LX-2 কোষগুলিকে 24 ঘন্টা ধরে সিরাম-মুক্ত মাধ্যমে TGF-β1 এবং IPA দিয়ে প্ররোচিত করার পরে হিস্টোগ্রামগুলি এন্ডোজেনাস কন্ট্রোল (RPLP0 বা PPIA) এর সাপেক্ষে mRNA এক্সপ্রেশন প্রদর্শন করে। A ফাইব্রোব্লাস্ট নির্দেশ করে, B অ্যাপোপটোটিক কোষ নির্দেশ করে, C বেঁচে থাকা কোষ নির্দেশ করে এবং D মাইটোকন্ড্রিয়াল ডাইনামিক্স জিন এক্সপ্রেশন নির্দেশ করে। ডেটা গড় ± স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন (SD), n = 3 স্বাধীন পরীক্ষা হিসাবে উপস্থাপন করা হয়। একমুখী ANOVA এবং বনফেরোনি পোস্ট হক পরীক্ষা ব্যবহার করে পরিসংখ্যানগত তুলনা করা হয়েছিল। *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
তারপর, কোষের আকার (FSC-H) এবং সাইটোপ্লাজমিক জটিলতা (SSC-H) এর পরিবর্তনগুলি ফ্লো সাইটোমেট্রি (চিত্র 6A,B) দ্বারা মূল্যায়ন করা হয়েছিল, এবং IPA চিকিত্সার পরে কোষের আকারবিদ্যার পরিবর্তনগুলি ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি (TEM) এবং ফেজ কনট্রাস্ট মাইক্রোস্কোপি (পরিপূরক চিত্র 6A-B) দ্বারা মূল্যায়ন করা হয়েছিল। প্রত্যাশিত হিসাবে, TGF-β1-চিকিত্সা করা গোষ্ঠীর কোষগুলি নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর (চিত্র 6A,B) তুলনায় আকারে বৃদ্ধি পেয়েছে, যা রুক্ষ এন্ডোপ্লাজমিক রেটিকুলাম (ER*) এবং ফ্যাগোলাইসোসোম (P) এর ক্লাসিক সম্প্রসারণ দেখায়, যা হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল (HSC) সক্রিয়করণ নির্দেশ করে (পরিপূরক চিত্র 6A)। তবে, TGF-β1-চিকিত্সা করা গোষ্ঠীর সাথে তুলনা করলে, TGF-β1 এবং IPA সংমিশ্রণ চিকিত্সা গোষ্ঠীতে কোষের আকার, সাইটোপ্লাজমিক জটিলতা (চিত্র 6A,B) এবং ER* সামগ্রী হ্রাস পেয়েছে (পরিপূরক চিত্র 6A)। তদুপরি, IPA চিকিৎসা নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর তুলনায় কোষের আকার, সাইটোপ্লাজমিক জটিলতা (চিত্র 6A, B), P এবং ER* কন্টেন্ট (পরিপূরক চিত্র 6A) হ্রাস করেছে। এছাড়াও, নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর তুলনায় IPA চিকিৎসার 24 ঘন্টা পরে অ্যাপোপটোটিক কোষের কন্টেন্ট বৃদ্ধি পেয়েছে (সাদা তীর, পরিপূরক চিত্র 6B)। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে 1 mM IPA HSC অ্যাপোপটোসিসকে উদ্দীপিত করতে পারে এবং TGF-β1 দ্বারা প্ররোচিত কোষের আকারগত পরামিতিগুলির পরিবর্তনগুলিকে বিপরীত করতে পারে, যার ফলে কোষের আকার এবং জটিলতা নিয়ন্ত্রণ করে, যা HSC নিষ্ক্রিয়তার সাথে যুক্ত হতে পারে।
IPA LX-2 কোষে কোষের আকার এবং সাইটোপ্লাজমিক জটিলতা পরিবর্তন করে। ফ্লো সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র। বিশ্লেষণে LX-2 কোষের জন্য নির্দিষ্ট একটি গেটিং কৌশল ব্যবহার করা হয়েছে: কোষের জনসংখ্যা নির্ধারণের জন্য SSC-A/FSC-A, ডাবলেট সনাক্ত করার জন্য FSC-H/FSC-A এবং কোষের আকার এবং জটিলতা বিশ্লেষণের জন্য SSC-H/FSC-H। কোষগুলিকে 24 ঘন্টার জন্য সিরাম-মুক্ত মাধ্যমে TGF-β1 (5 ng/ml) এবং 1 mM IPA দিয়ে ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল। LX-2 কোষগুলিকে নীচের বাম চতুর্ভুজ (SSC-H-/FSC-H-), উপরের বাম চতুর্ভুজ (SSC-H+/FSC-H-), নীচের ডান চতুর্ভুজ (SSC-H-/FSC-H+), এবং উপরের ডান চতুর্ভুজ (SSC-H+/FSC-H+) কোষের আকার এবং সাইটোপ্লাজমিক জটিলতা বিশ্লেষণের জন্য বিতরণ করা হয়েছিল। B. FSC-H (ফরোয়ার্ড স্ক্যাটার, কোষের আকার) এবং SSC-H (পার্শ্ব স্ক্যাটার, সাইটোপ্লাজমিক জটিলতা) (30,000 ইভেন্ট) ব্যবহার করে ফ্লো সাইটোমেট্রি দ্বারা কোষের রূপবিদ্যা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ডেটা গড় ± SD, n = 3টি স্বাধীন পরীক্ষা হিসাবে উপস্থাপন করা হয়েছে। একমুখী ANOVA এবং Bonferroni পোস্ট হক পরীক্ষা ব্যবহার করে পরিসংখ্যানগত তুলনা করা হয়েছিল। *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 এবং ****p < 0.0001
IPA-এর মতো অন্ত্রের বিপাকগুলি গবেষণার একটি আলোচিত বিষয় হয়ে উঠেছে, যা পরামর্শ দেয় যে অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটায় নতুন লক্ষ্যবস্তু আবিষ্কৃত হতে পারে। তাই এটি আকর্ষণীয় যে IPA, একটি বিপাক যা আমরা মানুষের লিভার ফাইব্রোসিসের সাথে যুক্ত করেছি [15], প্রাণী মডেলগুলিতে একটি সম্ভাব্য অ্যান্টি-ফাইব্রোটিক যৌগ হিসাবে দেখানো হয়েছে [13, 14]। এখানে, আমরা প্রথমবারের মতো টাইপ 2 ডায়াবেটিস (T2D) ছাড়া স্থূল ব্যক্তিদের মধ্যে সিরাম IPA এবং গ্লোবাল লিভার ট্রান্সক্রিপ্টমিক্স এবং DNA মিথাইলেশনের মধ্যে একটি সম্পর্ক প্রদর্শন করেছি, যা অ্যাপোপটোসিস, মাইটোফ্যাজি এবং দীর্ঘায়ুকে তুলে ধরে, সেইসাথে লিভার হোমিওস্ট্যাসিস নিয়ন্ত্রণকারী একটি সম্ভাব্য প্রার্থী জিন AKT1। আমাদের গবেষণার আরেকটি নতুনত্ব হল যে আমরা LX-2 কোষে অ্যাপোপটোসিস, কোষের রূপবিদ্যা, মাইটোকন্ড্রিয়াল জৈবশক্তি এবং গতিবিদ্যার সাথে IPA চিকিত্সার মিথস্ক্রিয়া প্রদর্শন করেছি, যা একটি নিম্ন শক্তি বর্ণালী নির্দেশ করে যা HSC ফেনোটাইপকে নিষ্ক্রিয়তার দিকে স্থানান্তরিত করে, IPA কে লিভার ফাইব্রোসিস উন্নত করার জন্য একটি সম্ভাব্য প্রার্থী করে তোলে।
আমরা দেখেছি যে অ্যাপোপটোসিস, মাইটোফ্যাজি এবং দীর্ঘায়ু ছিল লিভার জিনে সমৃদ্ধ সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ ক্যানোনিকাল পথ যা সঞ্চালনকারী সিরাম IPA-এর সাথে যুক্ত। মাইটোকন্ড্রিয়াল মান নিয়ন্ত্রণ (MQC) সিস্টেমের ব্যাঘাত মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা, মাইটোফ্যাজি এবং অ্যাপোপটোসিসের দিকে পরিচালিত করতে পারে, যার ফলে MASLD [33, 34] এর ঘটনা ঘটাতে পারে। অতএব, আমরা অনুমান করতে পারি যে IPA লিভারে অ্যাপোপটোসিস, মাইটোফ্যাজি এবং দীর্ঘায়ুর মাধ্যমে কোষের গতিশীলতা এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল অখণ্ডতা বজায় রাখার সাথে জড়িত থাকতে পারে। আমাদের তথ্য দেখায় যে তিনটি পরীক্ষায় দুটি জিন সাধারণ ছিল: YKT6 এবং AKT1। এটি লক্ষণীয় যে YKT6 হল একটি SNARE প্রোটিন যা কোষের ঝিল্লি ফিউশন প্রক্রিয়ায় জড়িত। এটি অটোফ্যাগোসোমে STX17 এবং SNAP29 এর সাথে একটি দীক্ষা জটিল গঠন করে অটোফ্যাগি এবং মাইটোফ্যাজিতে ভূমিকা পালন করে, যার ফলে অটোফ্যাগোসোম এবং লাইসোসোমের ফিউশন প্রচার করে [35]। অধিকন্তু, YKT6 ফাংশন হ্রাসের ফলে মাইটোফ্যাজি [36] প্রতিবন্ধক হয়, অন্যদিকে YKT6 এর আপরেগুলেশন হেপাটোসেলুলার কার্সিনোমা (HCC) এর অগ্রগতির সাথে সম্পর্কিত, যা কোষের বেঁচে থাকার হার বৃদ্ধি দেখায় [37]। অন্যদিকে, AKT1 হল সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ ইন্টারঅ্যাক্টিং জিন এবং লিভারের রোগে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে, যার মধ্যে রয়েছে PI3K/AKT সিগন্যালিং পথ, কোষ চক্র, কোষ স্থানান্তর, বিস্তার, ফোকাল আনুগত্য, মাইটোকন্ড্রিয়াল ফাংশন এবং কোলাজেন নিঃসরণ [38-40]। সক্রিয় PI3K/AKT সিগন্যালিং পথ হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল (HSCs) সক্রিয় করতে পারে, যা বহির্কোষীয় ম্যাট্রিক্স (ECM) উৎপাদনের জন্য দায়ী কোষ, এবং এর অব্যবস্থা লিভার ফাইব্রোসিসের সংঘটন এবং অগ্রগতিতে অবদান রাখতে পারে [40]। এছাড়াও, AKT হল মূল কোষ বেঁচে থাকার কারণগুলির মধ্যে একটি যা p53-নির্ভর কোষ অ্যাপোপটোসিসকে বাধা দেয় এবং AKT সক্রিয়করণ লিভার কোষ অ্যাপোপটোসিসের বাধার সাথে যুক্ত হতে পারে [41, 42]। প্রাপ্ত ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে আইপিএ লিভারের মাইটোকন্ড্রিয়া-সম্পর্কিত অ্যাপোপটোসিসে জড়িত থাকতে পারে, হেপাটোসাইটগুলির অ্যাপোপটোসিসে প্রবেশ বা বেঁচে থাকার মধ্যে সিদ্ধান্তকে প্রভাবিত করে। এই প্রভাবগুলি AKT এবং/অথবা YKT6 প্রার্থী জিন দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হতে পারে, যা লিভার হোমিওস্ট্যাসিসের জন্য গুরুত্বপূর্ণ।
আমাদের ফলাফলে দেখা গেছে যে TGF-β1 চিকিৎসার বাইরে LX-2 কোষে 1 mM IPA অ্যাপোপটোসিস প্ররোচিত করে এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসন হ্রাস করে। এটি উল্লেখযোগ্য যে অ্যাপোপটোসিস ফাইব্রোসিস রেজোলিউশন এবং হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল (HSC) সক্রিয়করণের একটি প্রধান পথ, এবং লিভার ফাইব্রোসিসের বিপরীতমুখী শারীরবৃত্তীয় প্রতিক্রিয়ার একটি গুরুত্বপূর্ণ ঘটনা [4, 43]। অধিকন্তু, সংমিশ্রণ চিকিৎসার পরে LX-2 কোষে BHI পুনরুদ্ধার মাইটোকন্ড্রিয়াল জৈবশক্তি নিয়ন্ত্রণে IPA-এর সম্ভাব্য ভূমিকা সম্পর্কে নতুন অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে। বিশ্রামরত এবং নিষ্ক্রিয় অবস্থায়, হেমাটোপয়েটিক কোষগুলি সাধারণত ATP তৈরি করতে মাইটোকন্ড্রিয়াল অক্সিডেটিভ ফসফোরাইলেশন ব্যবহার করে এবং কম বিপাকীয় কার্যকলাপ ধারণ করে। অন্যদিকে, HSC সক্রিয়করণ গ্লাইকোলাইটিক অবস্থায় প্রবেশের শক্তির চাহিদা পূরণের জন্য মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসন এবং জৈব সংশ্লেষণকে উন্নত করে [44]। IPA বিপাকীয় সম্ভাবনা এবং ECAR-কে প্রভাবিত করেনি তা ইঙ্গিত দেয় যে গ্লাইকোলাইটিক পথকে কম অগ্রাধিকার দেওয়া হয়। একইভাবে, আরেকটি গবেষণায় দেখা গেছে যে 1 mM IPA কার্ডিওমায়োসাইট, হিউম্যান হেপাটোসাইট কোষ লাইন (Huh7) এবং হিউম্যান আম্বিলিক্যাল ভেইন এন্ডোথেলিয়াল কোষ (HUVEC) -এ মাইটোকন্ড্রিয়াল রেসপিরেটরি চেইন অ্যাক্টিভিটি মডিউল করতে সক্ষম হয়েছিল; তবে, কার্ডিওমায়োসাইটগুলিতে গ্লাইকোলাইসিসের উপর IPA-এর কোনও প্রভাব পাওয়া যায়নি, যা পরামর্শ দেয় যে IPA অন্যান্য কোষের ধরণের জৈবশক্তিকে প্রভাবিত করতে পারে [45]। অতএব, আমরা অনুমান করি যে 1 mM IPA একটি হালকা রাসায়নিক আনকাপ্লার হিসাবে কাজ করতে পারে, কারণ এটি mtDNA-এর পরিমাণ পরিবর্তন না করেই ফাইব্রোজেনিক জিন এক্সপ্রেশন, কোষের রূপবিদ্যা এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল বায়োএনকাপ্লারগুলিকে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করতে পারে [46]। মাইটোকন্ড্রিয়াল আনকাপ্লারগুলি কালচার-প্ররোচিত ফাইব্রোসিস এবং HSC অ্যাক্টিভেশনকে বাধা দিতে পারে [47] এবং আনকাপ্লিং প্রোটিন (UCP) বা অ্যাডেনিন নিউক্লিওটাইড ট্রান্সলোকেস (ANT) এর মতো নির্দিষ্ট প্রোটিন দ্বারা নিয়ন্ত্রিত বা প্ররোচিত মাইটোকন্ড্রিয়াল ATP উৎপাদন হ্রাস করতে পারে। কোষের ধরণের উপর নির্ভর করে, এই ঘটনাটি কোষগুলিকে অ্যাপোপটোসিস থেকে রক্ষা করতে পারে এবং/অথবা অ্যাপোপটোসিসকে উৎসাহিত করতে পারে [46]। তবে, হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল নিষ্ক্রিয়করণে মাইটোকন্ড্রিয়াল আনকাপলার হিসেবে IPA-এর ভূমিকা ব্যাখ্যা করার জন্য আরও গবেষণা প্রয়োজন।
এরপর আমরা অনুসন্ধান করেছিলাম যে জীবন্ত LX-2 কোষে মাইটোকন্ড্রিয়াল রূপবিদ্যায় মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বসনের পরিবর্তনগুলি প্রতিফলিত হয় কিনা। মজার বিষয় হল, TGF-β1 চিকিৎসা মাইটোকন্ড্রিয়াল অনুপাতকে গোলাকার থেকে মধ্যবর্তীতে পরিবর্তন করে, মাইটোকন্ড্রিয়াল শাখা হ্রাস এবং DRP1 এর বর্ধিত প্রকাশের সাথে, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল বিদারণের একটি মূল কারণ [48]। অধিকন্তু, মাইটোকন্ড্রিয়াল ফ্র্যাগমেন্টেশন সামগ্রিক নেটওয়ার্ক জটিলতার সাথে সম্পর্কিত, এবং ফিউশন থেকে ফিশনে রূপান্তর হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল (HSC) সক্রিয়করণের জন্য অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ, যেখানে মাইটোকন্ড্রিয়াল বিদারণের বাধা HSC অ্যাপোপটোসিসের দিকে পরিচালিত করে [49]। সুতরাং, আমাদের ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে TGF-β1 চিকিৎসা মাইটোকন্ড্রিয়াল নেটওয়ার্ক জটিলতা হ্রাস করতে পারে শাখা হ্রাসের সাথে, যা সক্রিয় হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল (HSC) এর সাথে যুক্ত মাইটোকন্ড্রিয়াল বিদারণে বেশি দেখা যায়। অধিকন্তু, আমাদের তথ্য দেখায় যে IPA মাইটোকন্ড্রিয়ার অনুপাতকে গোলাকার থেকে মধ্যবর্তী আকারে পরিবর্তন করতে পারে, যার ফলে OPA1 এবং MFN2 এর প্রকাশ হ্রাস পায়। গবেষণায় দেখা গেছে যে OPA1 এর অবনমন মাইটোকন্ড্রিয়াল ঝিল্লি সম্ভাবনা হ্রাস করতে পারে এবং কোষ অ্যাপোপটোসিসকে ট্রিগার করতে পারে [50]। MFN2 মাইটোকন্ড্রিয়াল ফিউশন এবং অ্যাপোপটোসিসের মধ্যস্থতাকারী হিসেবে পরিচিত [51]। প্রাপ্ত ফলাফল থেকে বোঝা যায় যে TGF-β1 এবং/অথবা IPA দ্বারা LX-2 কোষের আবেশন মাইটোকন্ড্রিয়াল আকৃতি এবং আকার, সেইসাথে অ্যাক্টিভেশন অবস্থা এবং নেটওয়ার্ক জটিলতাকে সংশোধন করে বলে মনে হয়।
আমাদের ফলাফল ইঙ্গিত দেয় যে TGFβ-1 এবং IPA এর সংমিশ্রণ চিকিৎসা অ্যাপোপটোসিস এড়িয়ে যাওয়া কোষগুলিতে ফাইব্রোসিস, অ্যাপোপটোসিস এবং বেঁচে থাকার সাথে সম্পর্কিত জিনের mRNA প্রকাশ নিয়ন্ত্রণ করে mtDNA এবং কোষের রূপগত পরামিতি হ্রাস করতে পারে। প্রকৃতপক্ষে, IPA AKT1 এবং COL1A2 এবং MMP2 এর মতো গুরুত্বপূর্ণ ফাইব্রোসিস জিনের mRNA প্রকাশের স্তর হ্রাস করেছে, কিন্তু CASP8 এর প্রকাশের স্তর বৃদ্ধি করেছে, যা অ্যাপোপটোসিসের সাথে সম্পর্কিত। আমাদের ফলাফল দেখায় যে IPA চিকিৎসার পরে, BAX প্রকাশ হ্রাস পেয়েছে এবং TIMP1 পরিবারের সাবইউনিট, BCL-2 এবং NF-κB এর mRNA প্রকাশ বৃদ্ধি পেয়েছে, যা পরামর্শ দেয় যে IPA হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল (HSCs) তে বেঁচে থাকার সংকেতগুলিকে উদ্দীপিত করতে পারে যা অ্যাপোপটোসিস এড়িয়ে যায়। এই অণুগুলি সক্রিয় হেমাটোপয়েটিক স্টেম কোষগুলিতে বেঁচে থাকার পক্ষে-সক্রিয় সংকেত হিসাবে কাজ করতে পারে, যা অ্যান্টি-অ্যাপোপটোটিক প্রোটিনের (যেমন Bcl-2) বর্ধিত প্রকাশ, প্রো-অ্যাপোপটোটিক BAX এর হ্রাসপ্রাপ্ত প্রকাশ এবং TIMP এবং NF-κB এর মধ্যে একটি জটিল ইন্টারপ্লে [5, 7] এর সাথে যুক্ত হতে পারে। IPA PXR এর মাধ্যমে তার প্রভাব প্রয়োগ করে, এবং আমরা দেখেছি যে TGF-β1 এবং IPA এর সাথে সংমিশ্রণ চিকিৎসা PXR mRNA এক্সপ্রেশনের মাত্রা বৃদ্ধি করে, যা HSC সক্রিয়করণের দমন নির্দেশ করে। সক্রিয় PXR সিগন্যালিং ভিভো এবং ইন ভিট্রো উভয় ক্ষেত্রেই HSC সক্রিয়করণকে বাধা দেয় বলে জানা যায় [52, 53]। আমাদের ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে IPA অ্যাপোপটোসিসকে উৎসাহিত করে, ফাইব্রোসিস এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল বিপাক হ্রাস করে এবং বেঁচে থাকার সংকেতগুলিকে উন্নত করে সক্রিয় HSC এর ক্লিয়ারেন্সে অংশগ্রহণ করতে পারে, যা সাধারণ প্রক্রিয়া যা সক্রিয় HSC ফেনোটাইপকে একটি নিষ্ক্রিয় একটিতে রূপান্তর করে। অ্যাপোপটোসিসে IPA এর সম্ভাব্য প্রক্রিয়া এবং ভূমিকার আরেকটি সম্ভাব্য ব্যাখ্যা হল যে এটি মূলত মাইটোফ্যাজি (অভ্যন্তরীণ পথ) এবং বহিরাগত TNF সংকেত পথ (সারণী 1) এর মাধ্যমে অকার্যকর মাইটোকন্ড্রিয়াকে পরিষ্কার করে, যা সরাসরি NF-κB বেঁচে থাকার সংকেত পথের সাথে যুক্ত (পরিপূরক চিত্র 7)। মজার বিষয় হল, IPA-সম্পর্কিত সমৃদ্ধ জিনগুলি অ্যাপোপটোটিক পথ [54]-এ প্রো-অ্যাপোপটোটিক এবং প্রো-অ্যাপোপটোটিক সংকেত প্ররোচিত করতে সক্ষম, যা পরামর্শ দেয় যে IPA এই জিনগুলির সাথে মিথস্ক্রিয়া করে অ্যাপোপটোটিক পথ বা বেঁচে থাকার জন্য প্ররোচিত করতে পারে। তবে, HSC সক্রিয়করণের সময় IPA কীভাবে অ্যাপোপটোসিস বা বেঁচে থাকার জন্য প্ররোচিত করে এবং এর যান্ত্রিক পথগুলি এখনও অস্পষ্ট।
IPA হল একটি মাইক্রোবিয়াল মেটাবোলাইট যা খাদ্যতালিকাগত ট্রিপটোফান থেকে অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটার মাধ্যমে তৈরি হয়। গবেষণায় দেখা গেছে যে এর অন্ত্রের পরিবেশে প্রদাহ-বিরোধী, অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট এবং এপিজেনেটিক নিয়ন্ত্রক বৈশিষ্ট্য রয়েছে।[55] গবেষণায় দেখা গেছে যে IPA অন্ত্রের বাধা ফাংশনকে সংশোধন করতে পারে এবং জারণ চাপ কমাতে পারে, যা এর স্থানীয় শারীরবৃত্তীয় প্রভাবে অবদান রাখতে পারে।[56] প্রকৃতপক্ষে, IPA রক্ত ​​সঞ্চালনের মাধ্যমে লক্ষ্য অঙ্গগুলিতে পরিবহন করা হয়, এবং যেহেতু IPA ট্রিপটোফান, সেরোটোনিন এবং ইন্ডোল ডেরিভেটিভসের সাথে একই রকম প্রধান মেটাবোলাইট কাঠামো ভাগ করে, তাই IPA বিপাকীয় ক্রিয়া সম্পাদন করে যার ফলে প্রতিযোগিতামূলক বিপাকীয় পরিণতি হয়।[52] IPA এনজাইম বা রিসেপ্টরগুলিতে আবদ্ধ স্থানগুলির জন্য ট্রিপটোফান থেকে প্রাপ্ত মেটাবোলাইটগুলির সাথে প্রতিযোগিতা করতে পারে, যা সম্ভাব্যভাবে স্বাভাবিক বিপাকীয় পথগুলিকে ব্যাহত করে। এটি এর থেরাপিউটিক উইন্ডোটি আরও ভালভাবে বোঝার জন্য এর ফার্মাকোকাইনেটিক্স এবং ফার্মাকোডাইনামিক্সের উপর আরও গবেষণার প্রয়োজনীয়তা তুলে ধরে।[57] এটি হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল (HSCs) তেও ঘটতে পারে কিনা তা এখনও দেখা বাকি।
আমরা স্বীকার করি যে আমাদের গবেষণায় কিছু সীমাবদ্ধতা রয়েছে। বিশেষ করে IPA-এর সাথে সম্পর্কিত সম্পর্ক পরীক্ষা করার জন্য, আমরা টাইপ 2 ডায়াবেটিস মেলিটাস (T2DM) রোগীদের বাদ দিয়েছি। আমরা স্বীকার করি যে এটি টাইপ 2 ডায়াবেটিস মেলিটাস এবং উন্নত লিভার রোগের রোগীদের ক্ষেত্রে আমাদের ফলাফলের বিস্তৃত প্রযোজ্যতা সীমিত করে। যদিও মানুষের সিরামে IPA-এর শারীরবৃত্তীয় ঘনত্ব 1-10 μM [11, 20], সর্বোচ্চ অ-বিষাক্ত ঘনত্ব [15] এবং অ্যাপোপটোসিসের সর্বোচ্চ হারের উপর ভিত্তি করে 1 mM IPA-এর ঘনত্ব বেছে নেওয়া হয়েছিল, নেক্রোটিক কোষের জনসংখ্যার শতাংশে কোনও পার্থক্য ছাড়াই। যদিও এই গবেষণায় IPA-এর সুপারফিজিওলজিক্যাল স্তর ব্যবহার করা হয়েছিল, IPA-এর কার্যকর ডোজ সম্পর্কে বর্তমানে কোনও ঐক্যমত্য নেই [52]। যদিও আমাদের ফলাফল উল্লেখযোগ্য, IPA-এর বৃহত্তর বিপাকীয় ভাগ্য গবেষণার একটি সক্রিয় ক্ষেত্র হিসাবে রয়ে গেছে। তদুপরি, সিরাম IPA স্তর এবং লিভার ট্রান্সক্রিপ্টের DNA মিথাইলেশনের মধ্যে সংযোগের উপর আমাদের ফলাফলগুলি কেবল হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল (HSC) থেকে নয়, লিভার টিস্যু থেকেও প্রাপ্ত হয়েছিল। ট্রান্সক্রিপ্টোম বিশ্লেষণ থেকে আমাদের পূর্ববর্তী ফলাফলের উপর ভিত্তি করে আমরা মানব LX-2 কোষ ব্যবহার করার সিদ্ধান্ত নিয়েছি যে IPA হেমাটোপয়েটিক স্টেম সেল (HSC) সক্রিয়করণের সাথে যুক্ত [15], এবং HSC হল লিভার ফাইব্রোসিসের অগ্রগতিতে জড়িত প্রধান কোষ। লিভার একাধিক ধরণের কোষ নিয়ে গঠিত, তাই অন্যান্য কোষ মডেল যেমন হেপাটোসাইট-HSC-ইমিউন কোষ সহ-সংস্কৃতি ব্যবস্থা, ক্যাসপেস অ্যাক্টিভেশন এবং ডিএনএ ফ্র্যাগমেন্টেশনের সাথে মিলিত, সেইসাথে প্রোটিন স্তর সহ কর্মের প্রক্রিয়া বিবেচনা করা উচিত IPA এর ভূমিকা এবং অন্যান্য লিভার কোষের ধরণের সাথে এর মিথস্ক্রিয়া অধ্যয়ন করার জন্য।