ক্ষরণ পথে প্রোটিন বাছাইকরণ কোষের বিভাজন এবং হোমিওস্ট্যাসিস বজায় রাখার জন্য অপরিহার্য। শেল-মধ্যস্থ বাছাইকরণ ছাড়াও, ক্ষরণ পরিবহন প্রক্রিয়ায় কাইনেসিন বাছাইকরণে লিপিডের ভূমিকা একটি দীর্ঘদিনের মৌলিক প্রশ্ন যা এখনও অমীমাংসিত। এখানে, আমরা ত্রিমাত্রিক যুগপৎ বহু-রঙা উচ্চ-রেজোলিউশন রিয়েল-টাইম ইমেজিংয়ের মাধ্যমে ইন ভিভো প্রমাণ করেছি যে, অত্যন্ত দীর্ঘ সেরামাইড লিপিড অংশযুক্ত সদ্য সংশ্লেষিত গ্লাইকোসিলফসফ্যাটিডাইলিনোসিটল-স্থিরীকৃত প্রোটিনগুলো গুচ্ছবদ্ধ হয় এবং বিশেষায়িত এন্ডোপ্লাজমিক রেটিকুলাম নির্গমন স্থানে শ্রেণীবদ্ধ হয়, যা ট্রান্সমেমব্রেন প্রোটিন দ্বারা ব্যবহৃত স্থান থেকে ভিন্ন। এছাড়াও, আমরা দেখিয়েছি যে এন্ডোপ্লাজমিক রেটিকুলাম মেমব্রেনে সেরামাইডের শৃঙ্খল দৈর্ঘ্য এই বাছাইকরণ নির্বাচনীতার জন্য অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ। আমাদের এই গবেষণাটি ক্ষরণ পথে লিপিড শৃঙ্খল দৈর্ঘ্যের উপর ভিত্তি করে প্রোটিন কার্গোকে নির্বাচনী নির্গমন স্থানে শ্রেণীবদ্ধ করার প্রথম প্রত্যক্ষ ইন ভিভো প্রমাণ প্রদান করে।
ইউক্যারিওটিক কোষে, এন্ডোপ্লাজমিক রেটিকুলাম (ER)-এ সংশ্লেষিত প্রোটিনগুলি তাদের উপযুক্ত কোষীয় গন্তব্যে পৌঁছে দেওয়ার জন্য সিক্রেটরি পথের মাধ্যমে পরিবহনের সময় বাছাই করা হয় (1)। কোট-মধ্যস্থ বাছাই ছাড়াও, দীর্ঘদিন ধরে ধারণা করা হচ্ছিল যে নির্দিষ্ট লিপিডগুলি নির্দিষ্ট প্রোটিনের জন্য নির্দিষ্ট ঝিল্লি ডোমেনে গুচ্ছবদ্ধ করে নির্বাচনী নির্গমন বিন্দু হিসাবেও কাজ করতে পারে (2-5)। যাইহোক, এই সম্ভাব্য লিপিড-ভিত্তিক প্রক্রিয়াটি প্রমাণ করার জন্য এখনও সরাসরি ইন ভিভো প্রমাণের অভাব রয়েছে। এই মৌলিক সমস্যাটি সমাধান করার জন্য, আমরা ইস্টে অধ্যয়ন করেছি কিভাবে গ্লাইকোসিলফসফ্যাটিডাইলিনোসিটল (GPI) অ্যাঙ্করযুক্ত প্রোটিন (GPI-AP) ER থেকে ভিন্নভাবে রপ্তানি হয়। GPI-AP হল বিভিন্ন ধরণের লিপিড-সংযুক্ত কোষ পৃষ্ঠের প্রোটিন (6, 7)। GPI-AP হল একটি ক্ষরিত প্রোটিন যা গ্লাইকোলিপিড অংশ (GPI অ্যাঙ্কর) এর মাধ্যমে প্লাজমা ঝিল্লির বাইরের স্তরে সংযুক্ত থাকে। তারা ER লুমেনে রক্ষণশীল পোস্ট-ট্রান্সলেশনাল পরিবর্তন হিসাবে GPI অ্যাঙ্কর গ্রহণ করে (8)। সংযুক্ত হওয়ার পর, GPI-AP গলজি অ্যাপারেটাসের (5, 9) মধ্য দিয়ে ER থেকে প্লাজমা মেমব্রেনে যায়। GPI অ্যাঙ্করের উপস্থিতির কারণে GPI-AP ট্রান্সমেমব্রেন সিক্রেটেড প্রোটিন (অন্যান্য প্লাজমা মেমব্রেন প্রোটিন সহ) থেকে আলাদাভাবে সিক্রেটরি পাথওয়ে (5, 9, 10) বরাবর পরিবাহিত হয়। ইস্ট কোষে, GPI-AP এন্ডোপ্লাজমিক রেটিকুলামে অন্যান্য সিক্রেটেড প্রোটিন থেকে আলাদা হয়ে যায় এবং তারপর কোট প্রোটিন কমপ্লেক্স II (COPII) দ্বারা আবৃত অনন্য ভেসিকলে প্যাক করা হয় (6, 7)। ER এক্সপোর্ট প্রক্রিয়ায় এই শ্রেণিবিন্যাস প্রক্রিয়ার নির্ধারকগুলি অস্পষ্ট, তবে ধারণা করা হয় যে এই প্রক্রিয়ার জন্য লিপিডের প্রয়োজন হতে পারে, বিশেষ করে GPI অ্যাঙ্করের লিপিড অংশের কাঠামোগত পুনর্গঠন (5, 8)। ইস্টে, GPI সংযুক্ত হওয়ার সাথে সাথেই GPI লিপিড পুনর্গঠন শুরু হয় এবং অনেক ক্ষেত্রে, এটি সেরামাইডকে 26-কার্বন দীর্ঘ-শৃঙ্খল স্যাচুরেটেড ফ্যাটি অ্যাসিড (C26:0) এর সাথে আবদ্ধ করে (11, 12)। এখন পর্যন্ত ইস্ট কোষ দ্বারা উৎপাদিত প্রধান সেরামাইড হলো C26 সেরামাইড। এটি ER-এ সংশ্লেষিত হয় এবং এর বেশিরভাগই COPII ভেসিকলের মাধ্যমে গলজি অ্যাপারেটাসে রপ্তানি করা হয় (13)। GPI-AP-এর ER থেকে রপ্তানির জন্য বিশেষভাবে চলমান সেরামাইড সংশ্লেষণ প্রয়োজন (14, 15), এবং ফলস্বরূপ, গলজি অ্যাপারেটাসে সেরামাইডকে ইনোসিটল ফসফেট সেরামাইডে (IPC) রূপান্তর GPI অ্যাঙ্কর সংশ্লেষণের উপর নির্ভর করে (16)। কৃত্রিম ঝিল্লি দিয়ে জৈব-ভৌত গবেষণায় দেখা গেছে যে খুব দীর্ঘ অ্যাসাইল চেইন সেরামাইডগুলি একত্রিত হয়ে অনন্য ভৌত বৈশিষ্ট্য সহ সুশৃঙ্খল ডোমেন তৈরি করতে পারে (17, 18)। এই তথ্যগুলি এই অনুমানের দিকে পরিচালিত করে যে C26 সেরামাইড এবং C26 সেরামাইড সহ GPI-AP তাদের ভৌত বৈশিষ্ট্য ব্যবহার করে অপেক্ষাকৃত অগোছালো ER ঝিল্লির লিপিড পরিবেশে সুশৃঙ্খল অঞ্চলে একত্রিত হয়। এটি প্রধানত ছোট এবং অসম্পৃক্ত গ্লিসারোলিপিড (C16:1 এবং C18:1) দ্বারা গঠিত (19, 20)। এই অঞ্চলগুলি নির্দিষ্ট ER প্রস্থান স্থানগুলিতে (ERES) নির্বাচনীভাবে ফোকাস করবে, যেখানে সেরামাইড এবং সেরামাইড-ভিত্তিক GPI-AP একই উৎসর্গীকৃত COPII ভেসিকলে (5) গলজিতে সহ-পরিবাহিত হতে পারে।
এই গবেষণায়, আমরা সুপার-রেজোলিউশন কনফোকাল রিয়েল-টাইম ইমেজিং মাইক্রোস্কোপি (SCLIM) ব্যবহার করে এই লিপিড-ভিত্তিক প্রক্রিয়াটি সরাসরি পরীক্ষা করেছি, যা একটি অত্যাধুনিক মাইক্রোস্কোপি কৌশল যা জীবন্ত কোষে ফ্লুরোসেন্টভাবে লেবেলযুক্ত প্রোটিন, ত্রি-রঙা এবং ত্রিমাত্রিক (3D) চিত্রগুলি একই সাথে পর্যবেক্ষণ করতে পারে, যার রেজোলিউশন এবং গতি অত্যন্ত উচ্চ (21, 22)।
S. cerevisiae-তে ER ত্যাগ করার পর ট্রান্সমেমব্রেন সিক্রেটেড প্রোটিন থেকে C26 সেরামাইড গ্রুপ সহ সাধারণ GPI-AP কীভাবে স্ক্রিন করা হয় তা আরও সংজ্ঞায়িত করার জন্য আমরা প্রথমে SCLIM প্রযুক্তি প্রয়োগ করেছি। ER-এর শ্রেণিবিন্যাস পরীক্ষা করার জন্য, আমরা একটি জেনেটিক সিস্টেম ব্যবহার করেছি যা ইন ভিভোতে (7, 23) ERES-এ প্রবেশকারী নতুন সংশ্লেষিত কার্গোকে সরাসরি দেখতে পারে। কার্গো হিসাবে, আমরা সবুজ ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন (GFP) দিয়ে লেবেলযুক্ত C26 সেরামাইড-ভিত্তিক GPI-AP Gas1 এবং নিয়ার-ইনফ্রারেড ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন (iRFP) দিয়ে লেবেলযুক্ত ট্রান্সমেমব্রেন সিক্রেটেড প্রোটিন Mid2 বেছে নিয়েছি, যাদের উভয়ই প্লাজমা মেমব্রেনকে লক্ষ্য করে (24-26)। sec31-1 তাপমাত্রা-সংবেদনশীল মিউট্যান্টে, এই দুটি কার্গো একটি গ্যালাকটোজ-ইনডিউসিবল প্রোমোটার এবং একটি কনস্টিটিউটিভ ERES মার্কারের অধীনে প্রকাশিত হয়। চরম তাপমাত্রায় (৩৭°সে), যেহেতু sec31-1 মিউটেশনটি COPII কোট উপাদান Sec31-এর কার্যকারিতাকে প্রভাবিত করে COPII অঙ্কুরোদগম এবং ER থেকে নির্গমনকে বাধা দেয়, তাই নতুন সংশ্লেষিত কার্গো ER-এ জমা হয় (23)। কম তাপমাত্রায় (২৪°সে) ঠান্ডা করার পর, sec31-1 মিউট্যান্ট কোষগুলো ক্ষরণ এলাকা থেকে পুনরুদ্ধার লাভ করে এবং জমা হওয়া নতুন সংশ্লেষিত কার্গো ER থেকে নির্গত হতে শুরু করে। CLIM ভিজ্যুয়ালাইজেশন দেখিয়েছে যে, ৩৭°সে তাপমাত্রায় ইনকিউবেশনের পরেও sec31-1 মিউট্যান্ট কোষগুলোর ER-এ নতুন সংশ্লেষিত Gas1-GFP এবং Mid2-iRFP-এর বেশিরভাগই জমা ছিল এবং তারপর ২৪°সে তাপমাত্রায় ৫ মিনিটের জন্য তা নির্গত হয় (চিত্র ১)। যেহেতু Mid2-iRFP সম্পূর্ণ ER মেমব্রেনে বিস্তৃত থাকে এবং Gas1-GFP বিচ্ছিন্ন ER মেমব্রেন এলাকায় ঘনীভূত ও জমা হয়, তাই তাদের বন্টন সম্পূর্ণ ভিন্ন (চিত্র ১, A থেকে C এবং মুভি S1)। এছাড়াও, চিত্র 1D-তে যেমন দেখানো হয়েছে, Gas1-GFP ক্লাস্টারে Mid2-iRFP নেই। এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে GPI-AP এবং ট্রান্সমেমব্রেন প্রোটিনগুলি প্রাথমিকভাবে বিভিন্ন ER মেমব্রেন অঞ্চলে পৃথক হয়ে গিয়েছিল। Gas1-GFP ক্লাস্টারটি mCherry-এর COPII কোট প্রোটিন Sec13 দিয়ে লেবেলযুক্ত একটি নির্দিষ্ট ERES-এর সংলগ্ন (চিত্র 1, E এবং F, এবং মুভি S1) (23)।
sec31-1 কোষগুলো গ্যালাকটোজ-প্ররোচিত নিঃসরণ, একটি দীর্ঘ অ্যাসাইল চেইন (C26) সেরামাইড GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, সবুজ) এবং ট্রান্সমেমব্রেন প্রোটিন Mid2-iRFP (TMP, নীল) প্রকাশ করে এবং এই গঠনমূলক ERES লেবেলিং Sec13-mCherry (ERES, ম্যাজেন্টা) ৩৭°C তাপমাত্রায় ৩০ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল, ২৪°C তাপমাত্রায় সরানো হয়েছিল এবং ৫ মিনিট পরে SCLIM দ্বারা চিত্রিত করা হয়েছিল। (A থেকে C) একটি প্লেনের (A) একটি প্রতিনিধিত্বমূলক মার্জড বা একক ২ডি চিত্র, ১০টি z-সেকশনের (B) একটি ২ডি প্রজেকশন চিত্র অথবা কার্গো এবং ERES মার্কারের (C) একটি ৩ডি কোষ গোলার্ধের চিত্র দেখায়। স্কেল বার ১μm (A এবং B)। স্কেল একক হল ০.৫৫১μm (C)। Gas1-GFP বিচ্ছিন্ন ER অঞ্চল বা ক্লাস্টারে সনাক্ত করা হয়েছিল, যখন Mid2-iRFP ER মেমব্রেন জুড়ে সনাক্ত এবং বিতরণ করা হয়েছিল (C)। (D) গ্রাফটি সাদা তীরচিহ্নিত রেখা (বামে) বরাবর Gas1-GFP ক্লাস্টারে Gas1-GFP এবং Mid2-iRFP-এর আপেক্ষিক ফ্লুরোসেন্স তীব্রতা দেখায়। AU, যথেচ্ছ একক। (E এবং F) পণ্য এবং ERES চিহ্নকে একত্রিত করে তৈরি ত্রিমাত্রিক (3D) চিত্রটি উপস্থাপন করে। নির্দিষ্ট ERES-এর কাছাকাছি Gas1-GFP ক্লাস্টারগুলো শনাক্ত করা হয়েছিল। স্কেল একক হলো ০.৫৫১μm। (F) সাদা নিরেট তীরচিহ্নটি ERES-এর সাথে সংশ্লিষ্ট Gas1-GFP ক্লাস্টারটিকে চিহ্নিত করে। মাঝের এবং ডানদিকের প্যানেলগুলো একত্রিত বিবর্ধিত ত্রিমাত্রিক চিত্র এবং নির্বাচিত Gas1-GFP ক্লাস্টারটির একটি ঘূর্ণিত দৃশ্য দেখায়।
Gas1-GFP ক্লাস্টার এবং একটি নির্দিষ্ট ERES-এর মধ্যেকার ঘনিষ্ঠ স্থানিক সম্পর্ক ইঙ্গিত করে যে Gas1-GFP নির্বাচিত ERES-এ প্রবেশ করতে পারে, যা Mid2-iRFP-এর ER থেকে বেরিয়ে যাওয়ার জন্য ব্যবহৃত নির্বাচনশীলতা থেকে ভিন্ন। এই সম্ভাবনাটি যাচাই করার জন্য, আমরা শুধুমাত্র একটি বা দুটি কার্গোর জন্য ERES অনুপাত পরিমাপ করেছি (চিত্র ২, A থেকে C)। আমরা দেখেছি যে বেশিরভাগ ERES (৭০%) শুধুমাত্র এক ধরনের কার্গো ধারণ করে। চিত্র ২C-এর নিচের ছবিতে শুধুমাত্র Gas1-GFP (চিত্র ১) বা শুধুমাত্র Mid2-iRFP (চিত্র ২) সহ ERES-এর দুটি সাধারণ উদাহরণ দেখানো হয়েছে। এর বিপরীতে, প্রায় ২০% ERES-এ দুটি কার্গো থাকে যা একই এলাকায় একে অপরের উপর উপরিপাতিত হয়। দেখা গেছে যে কিছু ERES (১০%) দুই ধরনের কার্গো ধারণ করলেও, সেগুলো সুস্পষ্টভাবে ভিন্ন ভিন্ন এলাকায় বিচ্ছিন্ন ছিল। অতএব, এই পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ দেখায় যে ER থেকে বেরিয়ে যাওয়ার পর, GPI-AP Gas1-GFP এবং ট্রান্সমেমব্রেন কার্গো Mid2-iRFP ভিন্ন ভিন্ন ERES-এ বিভক্ত হয়ে যায় (চিত্র ২D)। এই বাছাই দক্ষতা পূর্ববর্তী জৈব রাসায়নিক বিশ্লেষণ (6) এবং রূপগত নির্ধারণ (7) এর সাথে খুব সামঞ্জস্যপূর্ণ। আমরা ERES-এ প্রবেশকারী কোয়ারেন্টাইন করা কার্গোর আচরণও পর্যবেক্ষণ করতে পারি (চিত্র 2E এবং মুভি S2)। চিত্র 2E দেখায় যে Gas1-GFP (প্যানেল 3) বা Mid2-iRFP (প্যানেল 4) এর কেবল একটি ছোট অংশ একদিক থেকে ERES-এ প্রবেশ করে এবং একটি বিচ্ছিন্ন এলাকায় সীমাবদ্ধ থাকে। চিত্র 2E এর প্যানেল 5 দেখায় যে Gas1-GFP এবং Mid2-iRFP কখনও কখনও একই ERES-এ পাওয়া যায়, কিন্তু তারা ভিন্ন দিক থেকে প্রবেশ করে এবং পৃথক অঞ্চলে কেন্দ্রীভূত হয় যা ভিন্ন COPII ভেসিকলকে প্রতিনিধিত্ব করতে পারে। আমরা আরও নিশ্চিত করেছি যে C26 সেরামাইড-ভিত্তিক GPI-AP Gas1 এর নির্বাচনী ERES হিসাবে পর্যবেক্ষণ করা পৃথকীকরণ এবং শ্রেণিবিন্যাস নির্দিষ্ট, কারণ অন্য একটি ট্রান্সমেমব্রেন সিক্রেশন কার্গো, GFP-ট্যাগযুক্ত প্লাজমা মেমব্রেন প্রোটিন Axl2 (27), Mid2-iRFP এর মতো একই রকম আচরণ দেখায়। (ছবি S1 এবং মুভি S3)। নতুনভাবে সংশ্লেষিত Axl2-GFP, Mid2-iRFP-এর মতোই ER মেমব্রেন জুড়ে বণ্টিত হয় (চিত্র S1, A এবং B), এবং বেশিরভাগ ERES-এ Mid2-iRFP-এর সাথে সহ-অবস্থান করে (চিত্র S1, B থেকে D)। চিত্র S1C-এর প্যানেল ১ এবং ২-এ ERES-এর দুটি সাধারণ উদাহরণ দেখানো হয়েছে যেখানে দুটি ট্রান্সমেমব্রেন কার্গো একে অপরের উপর উপরিপাতিত হয়। এই ক্ষেত্রে, উভয় বস্তুই একসাথে ERES-এ প্রবেশ করে (চিত্র S1E, প্যানেল ৩ এবং মুভি S3)।
গ্যালাকটোজ-প্ররোচিত ক্ষরণ, Gas1-GFP (GPI-AP, সবুজ) এবং Mid2-iRFP (TMP, নীল) এবং গঠনমূলক ERES লেবেলিং Sec13-mCherry (ERES, ম্যাজেন্টা) প্রকাশকারী sec31-1 কোষগুলিকে ৩৭°C তাপমাত্রায় রাখা হয়েছিল। ৩০ মিনিট ইনকিউবেট করার পর, ক্ষরণ ব্লকটি মুক্ত করার জন্য সেগুলিকে ২৪°C তাপমাত্রায় স্থানান্তর করা হয় এবং ২০ মিনিট পর SCLIM দিয়ে ছবি তোলা হয়। (A থেকে C) কার্গো এবং ERES দ্বারা চিহ্নিত ১০টি z-সেকশনের প্রতিনিধিত্বমূলক ২ডি প্রজেকশন চিত্র (A; স্কেল বার, ১μm) অথবা ৩ডি কোষ গোলার্ধের চিত্র (B এবং C; স্কেল একক, ০.৪৫৬μm)। (B)-এর নিচের প্যানেল এবং (C)-এর প্যানেলটি শুধুমাত্র ERES (ম্যাজেন্টা)-তে উপস্থিত উপাদানগুলি [Gas1-GFP (ধূসর) এবং Mid2-iRFP (হালকা নীল)] দেখানোর জন্য প্রক্রিয়াজাত চিত্র প্রদর্শন করে। (C) খোলা তীর: ERES শুধুমাত্র একটি কার্গো বহন করে (1 থেকে 4)। ধূসর তীর: ERES-এ পৃথকীকৃত কার্গো রয়েছে (5)। সাদা নিরেট তীর: ERES-এ সহ-অবস্থিত কার্গো রয়েছে। নিচে: নির্বাচিত একক ERES-এ শুধুমাত্র Gas1-GFP (1) বা Mid2-iRFP (2) রয়েছে। স্কেল বার, 100 nm। (D) (C)-তে বর্ণিত আলোকচিত্রের পরিমাণগত বিশ্লেষণ। ERES-এর গড় শতাংশ যা শুধুমাত্র একটি কার্গো (Gas1-GFP বা Mid2-iRFP), পৃথকীকৃত কার্গো এবং ওভারল্যাপিং কার্গো ধারণ করে। তিনটি স্বাধীন পরীক্ষায়, 54টি কোষে n=432। এরর বার = SD। দ্বি-পুচ্ছ অসমজোড় t পরীক্ষা। *** P = 0.0002। (E) (C) দ্বারা চিহ্নিত কোয়ারেন্টাইন করা কার্গোর নির্বাচিত ERES-এর 3D চিত্র। Gas1-GFP (সবুজ) (3) বা Mid2-iRFP (নীল) (4) একদিক থেকে ERES (ম্যাজেন্টা)-এ প্রবেশ করে এবং ERES-এর মধ্যে একটি ছোট এলাকায় সীমাবদ্ধ থাকে। কখনও কখনও, উভয় ধরণের কার্গো একই দিক থেকে একই ERES (5) এ প্রবেশ করে এবং ERES এর মধ্যে একটি বিচ্ছিন্ন এলাকায় সীমাবদ্ধ থাকে। স্কেল বার, 100 nm।
এরপরে, আমরা এই অনুমানটি পরীক্ষা করেছি যে ER ঝিল্লিতে উপস্থিত দীর্ঘ অ্যাসাইল চেইন সেরামাইড (C26) নির্দিষ্ট ERES-এ Gas1-এর সুনির্দিষ্ট ক্লাস্টারিং এবং সর্টিংকে চালিত করে। এই লক্ষ্যে, আমরা একটি পরিবর্তিত ইস্ট স্ট্রেন GhLag1 ব্যবহার করেছি, যেখানে দুটি এন্ডোজেনাস সেরামাইড সিন্থেস Lag1 এবং Lac1-কে GhLag1 (তুলার Lag1 হোমোলগ) দ্বারা প্রতিস্থাপন করা হয়েছিল, যার ফলে এমন একটি ইস্ট স্ট্রেন তৈরি হয়েছে যার কোষ ঝিল্লি ওয়াইল্ড টাইপের চেয়ে ছোট (চিত্র 3A) (28)। ভর বর্ণালিবীক্ষণ (MS) বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে ওয়াইল্ড-টাইপ স্ট্রেনগুলিতে, মোট সেরামাইডের 95% হল খুব দীর্ঘ (C26) চেইন সেরামাইড, যেখানে GhLag1-এ, 85% সেরামাইড খুব দীর্ঘ (C18 এবং C16), মাত্র 2% সেরামাইড খুব দীর্ঘ (C26) চেইন সেরামাইড। যদিও এখন পর্যন্ত GhLag1 মেমব্রেনে C18 এবং C16 সেরামাইডই প্রধানত শনাক্ত করা হয়েছে, MS বিশ্লেষণ আরও নিশ্চিত করেছে যে GhLag1 স্ট্রেইনে প্রকাশিত Gas1-GFP-এর GPI অ্যাঙ্করে C26 সেরামাইড রয়েছে, যা ওয়াইল্ড-টাইপ লিপিডের সাথে তুলনীয়। গুণমান একই (চিত্র 3A) (26)। অতএব, এর মানে হল যে সেরামাইড রিমডেলিং এনজাইম Cwh43 C26 সেরামাইডের জন্য অত্যন্ত নির্বাচনী, যেমনটি চিত্র 26-এ দেখানো হয়েছে, এটি GhLag1 স্ট্রেইনে অল্প পরিমাণে C26 সেরামাইড থেকে অগ্রাধিকারমূলকভাবে GPI অ্যাঙ্কর অন্তর্ভুক্ত করে। S2 (29)। তা সত্ত্বেও, GhLag1-এর কোষ ঝিল্লিতে মূলত শুধুমাত্র C18-C16 সেরামাইড থাকে, যেখানে Gas1-GFP-তে এখনও C26 সেরামাইড রয়েছে। এই ঘটনাটি এই স্ট্রেইনকে ER-এ মেমব্রেন সেরামাইডের অ্যাসাইল চেইন দৈর্ঘ্যের সমস্যা সমাধানের জন্য একটি আদর্শ উপকরণে পরিণত করে। শ্রেণি এবং বাছাইয়ের অনুমানমূলক ভূমিকা। তারপর, আমরা প্রথমে প্রচলিত ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির মাধ্যমে sec31-1 এর একটি তাপমাত্রা-সংবেদনশীল মিউট্যান্ট অ্যালিল সহ GhLag1-এ C26 Gas1-GFP এর গুচ্ছাকারে জমা হওয়ার ক্ষমতা অধ্যয়ন করেছি, যেখানে ER মেমব্রেন সেরামাইডে কেবল দীর্ঘ (C18-C16) চেইন বিদ্যমান (চিত্র 3)। আমরা লক্ষ্য করেছি যে sec31-1-এ, বেশিরভাগ Gas1-GFP গুচ্ছাকারে কেন্দ্রীভূত ছিল, যেখানে দীর্ঘ (C18-C16) সেরামাইড সহ sec31-1 GhLag1-এর ER মেমব্রেনে Gas1-GFP প্রধানত গুচ্ছাকারে ছিল না এবং পুরো ER মেমব্রেন জুড়ে ছড়িয়ে ছিল। সুনির্দিষ্টভাবে বলতে গেলে, যেহেতু C26 সেরামাইড-ভিত্তিক গুচ্ছায়ন নির্দিষ্ট ERES (চিত্র 1) এর সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত, তাই আমরা পরবর্তীতে তদন্ত করেছি যে এই প্রক্রিয়াটি ER এক্সপোর্ট প্রোটিন পদ্ধতির কার্যকারিতাকেও জড়িত করতে পারে কিনা। GPI-AP ER এক্সপোর্টের জন্য একটি বিশেষ COPII সিস্টেম ব্যবহার করে, যা GPI অ্যাঙ্করের গ্লাইক্যান অংশের Ted1 এর কাঠামোগত পুনর্গঠন দ্বারা সক্রিয়ভাবে নিয়ন্ত্রিত হয় (30, 31)। পুনঃসংযোজিত GPI-গ্লাইক্যান তখন ট্রান্সমেমব্রেন কার্গো রিসেপ্টর p24 কমপ্লেক্স দ্বারা স্বীকৃত হয়, যা ফলস্বরূপ Lst1-কে বেছে বেছে নিয়োগ করে, যা প্রধান COPII কার্গো বাইন্ডিং সাবইউনিট Sec24-এর একটি নির্দিষ্ট আইসোফর্ম, এবং একটি GPI-AP-সমৃদ্ধ COPII ভেসিকেল গঠনের জন্য প্রয়োজনীয় (31-33)। অতএব, আমরা sec31-1 মিউট্যান্ট স্ট্রেনের সাথে এই একক প্রোটিনগুলির (p24 কমপ্লেক্সের উপাদান Emp24, GPI-গ্লাইক্যান রিমডেলিং এনজাইম Ted1 এবং নির্দিষ্ট COPII সাবইউনিট Lst1) বিলোপকে একত্রিত করে একটি ডাবল মিউট্যান্ট তৈরি করেছি এবং তাদের দ্বারা Gas1-ক্লাস্টার GFP গঠন করা সম্ভব কিনা তা অধ্যয়ন করেছি (চিত্র 3)। আমরা লক্ষ্য করেছি যে sec31-1emp24Δ এবং sec31-1ted1Δ-তে, Gas1-GFP প্রধানত গুচ্ছবদ্ধ নয় এবং ER মেমব্রেন জুড়ে ছড়িয়ে থাকে, যেমনটি পূর্বে sec31-1 GhLag1-এ দেখা গিয়েছিল, যেখানে sec31-1lst1Δ-তে Gas1-GFP sec31-1-এর মতোই আচরণ করে। এই ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে ER মেমব্রেনে C26 সেরামাইডের উপস্থিতি ছাড়াও, Gas1-GFP-এর গুচ্ছবদ্ধ হওয়ার জন্য p24 কমপ্লেক্সের সাথে আবদ্ধ হওয়াও প্রয়োজন, এবং এর জন্য নির্দিষ্ট Lst1 রিক্রুটমেন্টের প্রয়োজন হয় না। এরপর, আমরা এই সম্ভাবনাটি খতিয়ে দেখেছি যে ER মেমব্রেনে সেরামাইডের চেইন দৈর্ঘ্য p24-এর সাথে Gas1-GFP-এর আবদ্ধ হওয়াকে নিয়ন্ত্রণ করতে পারে। তবে, আমরা দেখেছি যে মেমব্রেনে C18-C16 সেরামাইডের উপস্থিতি p24 কমপ্লেক্স দ্বারা পুনর্গঠিত GPI-গ্লাইক্যান (চিত্র S3 এবং S4, A এবং B) অথবা GPI-AP-এর সাথে আবদ্ধ হওয়া এবং GPI-AP রপ্তানি করার ক্ষমতাকে প্রভাবিত করে না। COPII সাবটাইপ Lst1 নিয়োগ করুন (চিত্র S4C)। অতএব, C26 সেরামাইড-নির্ভর ক্লাস্টারিংয়ের জন্য বিভিন্ন ER এক্সপোর্ট প্রোটিন মেকানিজমের সাথে প্রোটিন ইন্টারঅ্যাকশনের প্রয়োজন হয় না, বরং এটি লিপিডের দৈর্ঘ্য দ্বারা চালিত একটি বিকল্প সর্টিং মেকানিজমকে সমর্থন করে। এরপর, আমরা বিশ্লেষণ করে দেখেছি যে, ER মেমব্রেনে সেরামাইড অ্যাসাইল চেইনের দৈর্ঘ্য Gas1-GFP-কে একটি নির্বাচনী ERES হিসেবে কার্যকরভাবে শ্রেণীবদ্ধ করার জন্য গুরুত্বপূর্ণ কিনা। যেহেতু স্বল্প-দৈর্ঘ্যের সেরামাইডযুক্ত GhLag1 স্ট্রেইনের Gas1 ER ত্যাগ করে প্লাজমা মেমব্রেনে প্রবেশ করে (চিত্র S5), আমরা বিশ্বাস করি যে, যদি সর্টিং সেরামাইড অ্যাসাইল চেইনের দৈর্ঘ্য দ্বারা চালিত হয়, তবে GhLag1 স্ট্রেইনের Gas1 একই মেমব্রেনের ERES পণ্যকে পুনঃনির্দেশিত ও অতিক্রম করতে পারে।
(A) GhLag1-এর কোষ ঝিল্লিতে প্রধানত ছোট C18-C16 সেরামাইড থাকে, যেখানে Gas1-GFP-এর GPI অ্যাঙ্করে এখনও ওয়াইল্ড-টাইপ কোষের মতোই C26 IPC রয়েছে। উপরে: ভর বর্ণালিবীক্ষণ (MS) দ্বারা ওয়াইল্ড-টাইপ (Wt) এবং GhLag1p স্ট্রেইনের কোষ ঝিল্লিতে সেরামাইডের অ্যাসাইল চেইন দৈর্ঘ্যের বিশ্লেষণ। ডেটাটি মোট সেরামাইডের শতাংশকে প্রতিনিধিত্ব করে। তিনটি স্বাধীন পরীক্ষার গড়। এরর বার = SD। দ্বি-পুচ্ছ অযুগ্ম টি পরীক্ষা। **** P ＜0.0001। নিচের প্যানেল: ওয়াইল্ড-টাইপ এবং GhLag1p স্ট্রেইনে প্রকাশিত Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI অ্যাঙ্করে উপস্থিত IPC-এর অ্যাসাইল চেইন দৈর্ঘ্যের MS বিশ্লেষণ। ডেটাটি মোট IPC সংকেতের শতাংশকে প্রতিনিধিত্ব করে। পাঁচটি স্বাধীন পরীক্ষার গড়। এরর বার = SD। দ্বি-পুচ্ছ অযুগ্ম টি পরীক্ষা। ns, গুরুত্বপূর্ণ নয়। P = 0.9134। (B) গ্যালাকটোজ-প্ররোচিত Gas1-GFP প্রকাশকারী sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ এবং sec31-1lst1Δ কোষগুলির ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফ, যেগুলিকে ৩৭°C তাপমাত্রায় ৩০ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল এবং ২৪°C তাপমাত্রার পরে রুটিন ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি করার জন্য পাস ডাউন করা হয়েছিল। সাদা তীরচিহ্ন: ER Gas1-GFP ক্লাস্টার। খোলা তীরচিহ্ন: ক্লাস্টারবিহীন Gas1-GFP সম্পূর্ণ ER মেমব্রেনে ছড়িয়ে আছে, যা ER-এর বৈশিষ্ট্যপূর্ণ নিউক্লিয়ার রিং স্টেইনিং দেখাচ্ছে। স্কেল বার, ৫μm। (C) (B)-তে বর্ণিত ফটোমাইক্রোগ্রাফের পরিমাণগত বিশ্লেষণ। বিন্দুযুক্ত Gas1-GFP গঠনসহ কোষের গড় শতাংশ। তিনটি স্বাধীন পরীক্ষায়, n≥৩০০ কোষ। এরর বার = SD। দ্বি-পুচ্ছ অসমজোড় t পরীক্ষা। **** P ＜০.০০০১।
এই সমস্যাটি সরাসরি সমাধান করার জন্য, আমরা sec31-1 তাপমাত্রা-সংবেদনশীল মিউট্যান্ট অ্যালিলযুক্ত GhLag1-এ Gas1-GFP এবং Mid2-iRFP-এর SCLIM ভিজ্যুয়ালাইজেশন সম্পন্ন করেছি (চিত্র ৪ এবং মুভি S4)। ER-কে ৩৭°C তাপমাত্রায় ধরে রাখার পর এবং পরবর্তীতে ২৪°C তাপমাত্রায় মুক্ত করার পর, প্রচলিত মাইক্রোস্কোপের মাধ্যমে পর্যবেক্ষণ করে দেখা গেছে যে, নতুন সংশ্লেষিত Gas1-GFP-এর বেশিরভাগই গুচ্ছবদ্ধ ছিল না এবং ER মেমব্রেন জুড়ে ছড়িয়ে ছিল (চিত্র ৪, A এবং B)। এছাড়াও, ERES-এর একটি বড় অংশ (৬৭%) এর মধ্যে দুই ধরনের কার্গো সহ-অবস্থান করে (চিত্র ৪D)। চিত্র ৪C-এর প্যানেল ১ এবং ২-এ Gas1-GFP এবং Mid2-GFP-এর উপরিপাতনসহ ERES-এর দুটি সাধারণ উদাহরণ দেখানো হয়েছে। এছাড়াও, উভয় পণ্যই একই ERES-এ অন্তর্ভুক্ত হয়েছিল (চিত্র ৪E, প্যানেল ৩ এবং মুভি S4)। অতএব, আমাদের ফলাফল নির্দেশ করে যে, ER মেমব্রেনে সেরামাইড অ্যাসাইল চেইনের দৈর্ঘ্য ER প্রোটিনের একত্রীকরণ এবং শ্রেণিবিন্যাসের একটি গুরুত্বপূর্ণ নির্ধারক।
গ্যালাকটোজ-প্ররোচিত ক্ষরণ, Gas1-GFP (GPI-AP, সবুজ) এবং Mid2-iRFP (TMP, নীল) ও গঠনগতভাবে ERES-লেবেলযুক্ত Sec13-mCherry (ERES, ম্যাজেন্টা) প্রকাশকারী Sec31-1 GhLag1 কোষগুলোকে ৩৭°C তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করুন। ৩০ মিনিট ধরে এটি চালিয়ে যান, ক্ষরণ মুক্ত করার জন্য তাপমাত্রা ২৪°C-তে নামিয়ে আনুন এবং ২০ মিনিট পর SCLIM দিয়ে ছবি তুলুন। (A থেকে C) কার্গো এবং ERES দ্বারা চিহ্নিত ১০টি z-সেকশনের প্রতিনিধিত্বমূলক ২ডি প্রজেকশন ছবি (A; স্কেল বার, ১μm) অথবা ৩ডি কোষ গোলার্ধের ছবি (B এবং C; স্কেল একক, ০.৪৫μm)। (B)-এর নিচের প্যানেল এবং (C)-এর প্যানেলটি শুধুমাত্র ERES (ম্যাজেন্টা)-তে উপস্থিত উপাদানগুলো [Gas1-GFP (ধূসর) এবং Mid2-iRFP (হালকা নীল)] দেখানোর জন্য প্রক্রিয়াজাত ছবি প্রদর্শন করে। (C) সাদা ভরাট তীরচিহ্ন: ERES, পণ্যসমূহের উপরিপাতন। খোলা তীরচিহ্ন: ERES-এ কেবলমাত্র একটি আইটেম রয়েছে। নিচের প্যানেল: নির্বাচিত ERES-টিতে (C)-তে চিহ্নিত উপরিপাতিত পণ্য (১ এবং ২) রয়েছে। স্কেল বার, ১০০ nm। (D) (C)-তে বর্ণিত আলোক-অণুবীক্ষণিক চিত্রের পরিমাণগত বিশ্লেষণ। sec31-1 এবং sec31-1 GhLag1 ইউনিটগুলিতে, কেবলমাত্র একটি কার্গো (Gas1-GFP বা Mid2-iRFP) অন্তর্ভুক্ত রয়েছে, এবং বিচ্ছিন্ন কার্গো ও উপরিপাতিত কার্গোর জন্য ERES-এর গড় শতাংশ। তিনটি স্বাধীন পরীক্ষায়, ৫৪টি কোষে n = ৪৩২ (sec31-1) এবং ৪৭টি কোষে n = ৪৩০ (sec31-1 GhLag1)। এরর বার = SD। দ্বি-পুচ্ছ অসমজোড় t পরীক্ষা। *** P = ০.০০০২ (sec31-1) এবং ** P = ০.০০৩১ (sec31-1 GhLag1)। (E) (C)-তে চিহ্নিত ওভারল্যাপিং কার্গো (3) সহ নির্বাচিত ERES-এর 3D চিত্র। Gas1-GFP (সবুজ) এবং Mid2-iRFP (নীল) একই দিক থেকে ERES (ম্যাজেন্টা)-এর দিকে অগ্রসর হয় এবং একই ERES সীমাবদ্ধ এলাকায় থাকে। স্কেল বার, 100 nm।
এই গবেষণাটি সরাসরি ইন ভিভো প্রমাণ দেয় যে, লিপিড-ভিত্তিক প্রোটিন কার্গোসমূহ সিক্রেটরি পাথওয়েতে নির্দিষ্ট এক্সপোর্ট সাইটে (ERES) শ্রেণীবদ্ধ হয় এবং এই শ্রেণীবদ্ধকরণের নির্বাচনীতার জন্য অ্যাসাইল চেইনের দৈর্ঘ্যের গুরুত্ব প্রকাশ করে। SCLIM নামক একটি শক্তিশালী ও অত্যাধুনিক মাইক্রোস্কোপি কৌশল ব্যবহার করে আমরা ইস্ট কোষে নতুন সংশ্লেষিত Gas1-GFP (একটি প্রধান প্লাজমা মেমব্রেন GPI-AP যার একটি খুব দীর্ঘ অ্যাসাইল চেইন (C26) সেরামাইড লিপিড অংশ রয়েছে) প্রদর্শন করেছি। বিচ্ছিন্ন ER-এ গুচ্ছবদ্ধ অঞ্চলগুলো নির্দিষ্ট ERES-এর সাথে যুক্ত থাকে, যেখানে ট্রান্সমেমব্রেন সিক্রেটেড প্রোটিনগুলো ER মেমব্রেন জুড়ে ছড়িয়ে থাকে (চিত্র ১)। এছাড়াও, এই দুই ধরনের পণ্য নির্বাচনীভাবে ভিন্ন ভিন্ন ERES-এ প্রবেশ করে (চিত্র ২)। যখন মেমব্রেনের কোষীয় সেরামাইডের অ্যাসাইল চেইনের দৈর্ঘ্য C26 থেকে C18-C16-এ হ্রাস পায়, তখন Gas1-GFP গুচ্ছটি বিচ্ছিন্ন ER অঞ্চলে বিভক্ত হয়ে যায় এবং Gas1-GFP একই ERES-এর মাধ্যমে ট্রান্সমেমব্রেন প্রোটিনের সাথে ER ত্যাগ করার জন্য পুনঃনির্দেশিত হয় (চিত্র ৩ এবং ৪)।
যদিও GPI-AP ER থেকে বের হওয়ার জন্য একটি বিশেষায়িত প্রোটিন কৌশল ব্যবহার করে, আমরা দেখেছি যে C26 সেরামাইড-নির্ভর পৃথকীকরণ এমন কোনো ভিন্নধর্মী প্রোটিন মিথস্ক্রিয়ার উপর নির্ভর করে না যা ERES-এর বিশেষায়নের দিকে পরিচালিত করতে পারে (চিত্র S4 এবং S5)। পরিবর্তে, আমাদের পর্যবেক্ষণগুলো লিপিড-ভিত্তিক প্রোটিন ক্লাস্টারিং এবং পরবর্তীকালে অন্যান্য কার্গোকে বাদ দেওয়ার মাধ্যমে চালিত একটি বিকল্প শ্রেণিবিন্যাস কৌশলকে সমর্থন করে। আমাদের পর্যবেক্ষণগুলো ইঙ্গিত দেয় যে একটি নির্দিষ্ট ERES-এর সাথে যুক্ত Gas1-GFP অঞ্চল বা ক্লাস্টারে ট্রান্সমেমব্রেন সিক্রেটেড প্রোটিন Mid2-iRFP অনুপস্থিত থাকে, যা নির্দেশ করে যে C26 সেরামাইড-নির্ভর GPI-AP ক্লাস্টারটি সংশ্লিষ্ট ERES-এ তাদের প্রবেশকে সহজতর করবে এবং একই সাথে, ট্রান্সমেমব্রেন সিক্রেশনগুলোকে এই নির্দিষ্ট ERES-এ প্রবেশ করতে বাধা দেবে (চিত্র 1 এবং 2)। এর বিপরীতে, ER মেমব্রেনে C18-C16 সেরামাইডের উপস্থিতি GPI-AP-কে কোনো অঞ্চল বা ক্লাস্টার তৈরি করতে দেয় না, তাই তারা একই ERES-এ ট্রান্সমেমব্রেন সিক্রেটেড প্রোটিনগুলোকে বাদ দেয় না বা প্রতিস্থাপন করে না (চিত্র 3 এবং 4)। অতএব, আমরা প্রস্তাব করছি যে C26 সেরামাইড নির্দিষ্ট ERES-এর সাথে যুক্ত প্রোটিনগুলির গুচ্ছবদ্ধকরণকে সহজতর করার মাধ্যমে পৃথকীকরণ এবং শ্রেণিবিন্যাসকে চালিত করে।
কীভাবে একটি নির্দিষ্ট ER এলাকায় এই C26 সেরামাইড-নির্ভর ক্লাস্টারিং অর্জন করা যায়? মেমব্রেন সেরামাইডের পার্শ্বীয়ভাবে পৃথক হওয়ার প্রবণতার কারণে, GPI-AP এবং C26 সেরামাইড ছোট এবং তাৎক্ষণিকভাবে সুশৃঙ্খল লিপিড তৈরি করতে পারে, যা ER মেমব্রেনের আরও অনিয়মিত লিপিড পরিবেশে ঘটে যেখানে ছোট এবং অসম্পৃক্ত গ্লিসারোলিপিড থাকে। গুণগত মানের ক্লাস্টার (17, 18)। এই ছোট অস্থায়ী ক্লাস্টারগুলি p24 কমপ্লেক্সের সাথে সংযুক্ত হওয়ার পরে আরও বড়, আরও স্থিতিশীল ক্লাস্টারে একীভূত হতে পারে (34)। এর সাথে সামঞ্জস্য রেখে, আমরা দেখিয়েছি যে বড় দৃশ্যমান ক্লাস্টার তৈরি করার জন্য C26 Gas1-GFP-কে p24 কমপ্লেক্সের সাথে মিথস্ক্রিয়া করতে হবে (চিত্র 3)। p24 কমপ্লেক্স হল ইস্টে চারটি ভিন্ন p24 ট্রান্সমেমব্রেন প্রোটিন দ্বারা গঠিত একটি হেটেরোজাইগাস অলিগোমার (35), যা বহুযোজী বন্ধন প্রদান করে, যা ছোট GPI-AP ক্লাস্টারগুলির ক্রস-লিঙ্কিং ঘটাতে পারে, যার ফলে বড় স্থিতিশীল ক্লাস্টার তৈরি হয় (34)। GPI-AP-এর প্রোটিন এক্টোডোমেনগুলির মধ্যে মিথস্ক্রিয়া তাদের একত্রীকরণেও অবদান রাখতে পারে, যেমনটি স্তন্যপায়ী পোলারাইজড এপিথেলিয়াল কোষগুলিতে তাদের গলজি পরিবহনের সময় দেখা যায় (36)। যাইহোক, যখন ER ঝিল্লিতে C18-C16 সেরামাইড উপস্থিত থাকে, তখন p24 জটিল Gas1-GFP-এর সাথে আবদ্ধ হলে, বড় পৃথক ক্লাস্টার তৈরি হবে না। অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়াটি দীর্ঘ অ্যাসাইল চেইন সেরামাইডের নির্দিষ্ট ভৌত এবং রাসায়নিক বৈশিষ্ট্যের উপর নির্ভর করতে পারে। কৃত্রিম ঝিল্লির জৈব-ভৌত গবেষণায় দেখা গেছে যে যদিও দীর্ঘ (C24) এবং ছোট (C18-C16) উভয় অ্যাসাইল চেইন সেরামাইডই ফেজ পৃথকীকরণ ঘটাতে পারে, শুধুমাত্র দীর্ঘ অ্যাসাইল চেইন সেরামাইড (C24) উচ্চ বক্রতা এবং ফিল্ম বাঁকানোকে উৎসাহিত করে ফিল্মকে নতুন আকার দিতে পারে। পারস্পরিক রেফারেন্সের মাধ্যমে (17, 37, 38)। দেখা গেছে যে Emp24-এর মানব সমরূপ TMED2-এর ট্রান্সমেমব্রেন হেলিক্স সাইটোপ্লাজমিক লোবিউলগুলিতে C18 সেরামাইড-ভিত্তিক স্ফিঙ্গোমাইলিনের সাথে নির্বাচনীভাবে মিথস্ক্রিয়া করে (39)। আণবিক গতিবিদ্যা (MD) সিমুলেশন ব্যবহার করে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে C18 এবং C26 উভয় সেরামাইডই Emp24 ট্রান্সমেমব্রেন হেলিক্সের সাইটোপ্লাজমিক লোবিউলগুলির চারপাশে জমা হয় এবং তাদের পছন্দ একই রকম (চিত্র S6)। এটি লক্ষণীয় যে এটি ইঙ্গিত দেয় যে Emp24-এর ট্রান্সমেমব্রেন হেলিক্স ঝিল্লিতে লিপিডের অপ্রতিসম বিতরণের দিকে পরিচালিত করতে পারে। এটি স্তন্যপায়ী কোষের উপর ভিত্তি করে একটি সাম্প্রতিক ফলাফল। অনুরূপ MD সিমুলেশনগুলি ইথার লিপিডের উপস্থিতিও দেখায় (40)। অতএব, আমরা অনুমান করি যে ER26-এর দুটি লোবিউলে C26 সেরামাইড স্থানীয়ভাবে সমৃদ্ধ হয়। যখন লুমিনাল লোবিউলগুলিতে থাকা GPI-AP সরাসরি বহুযোজী p24-এর সাথে আবদ্ধ হয় এবং সাইটোপ্লাজমিক লোবিউলগুলিতে p24-এর চারপাশে C26 সেরামাইড জমা হয়, তখন এটি আঙ্গুলের (41) মাধ্যমে প্রোটিন একত্রীকরণ এবং ঝিল্লির বক্রতা তৈরি করতে পারে, যার ফলে GPI-AP ERES-এর সংলগ্ন বিচ্ছিন্ন অঞ্চলে বিভক্ত হয়, যা ER ঝিল্লির অত্যন্ত বাঁকানো অঞ্চলগুলির জন্যও সহায়ক (42)। পূর্ববর্তী প্রতিবেদনগুলি প্রস্তাবিত প্রক্রিয়াটিকে সমর্থন করেছে (43, 44)। প্লাজমা ঝিল্লিতে সেরামাইড-ভিত্তিক গ্লাইকোস্ফিংগোলিপিড (GSL)-এর সাথে অলিগোলেকটিন, রোগজীবাণু বা অ্যান্টিবডির বহুযোজী বন্ধন বৃহৎ GSL একত্রীকরণকে উদ্দীপ্ত করে, দশা পৃথকীকরণকে উন্নত করে এবং ঝিল্লির বিকৃতি ও অভ্যন্তরীণকরণের কারণ হয় (44)। ইওয়াবুচি প্রমুখ (43) দেখা গেছে যে দীর্ঘ (C24) অ্যাসাইল চেইনের উপস্থিতিতে, কিন্তু ছোট (C16) অ্যাসাইল চেইনের উপস্থিতিতে নয়, GSL ল্যাকটোসিলসেরামাইডের সাথে আবদ্ধ বহুযোজী লিগ্যান্ড বড় ক্লাস্টার এবং ঝিল্লি অন্তঃপ্রবেশ গঠনে প্ররোচিত করে, এবং সংযুক্ত নিউট্রোফিলগুলিতে লিফলেটগুলিতে সাইটোপ্লাজম লিন-মধ্যস্থ সংকেত সঞ্চালন অ্যাসাইল চেইন দ্বারা আন্তঃসংযুক্ত হয়।
স্তন্যপায়ী প্রাণীর পোলারাইজড এপিথেলিয়াল কোষে, অ্যাপিকাল প্লাজমা মেমব্রেনের স্তরে অ্যান্টি-গলজি নেটওয়ার্ক (TGN)-এর ঘনত্ব GPI-AP-এর পৃথকীকরণ এবং সর্টিং নিয়ন্ত্রণ করে (10, 45)। এই একত্রীকরণ GPI-AP অলিগোমারাইজেশন দ্বারা চালিত হয় (36), তবে এটি ইস্টে পাওয়া সেরামাইড চেইনের দৈর্ঘ্যের উপরও নির্ভর করতে পারে। যদিও স্তন্যপায়ী প্রাণীর GPI-AP-এর একটি ইথার লিপিড-ভিত্তিক অ্যাঙ্কর রয়েছে এবং এর রাসায়নিক গঠন খুব দীর্ঘ অ্যাসাইল চেইন সেরামাইড থেকে অনেক আলাদা, একটি সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে উভয় লিপিডের বিবর্তনীয়ভাবে একই রকম ভৌত ও রাসায়নিক বৈশিষ্ট্য এবং কার্যকারিতা রয়েছে (40)। অতএব, স্তন্যপায়ী কোষের ইথার লিপিড অংশটি ইস্টের C26 সেরামাইডের মতো হতে পারে এবং এর ভূমিকা হলো মেমব্রেনে দীর্ঘ-চেইন সেরামাইডের সাথে যুক্ত হয়ে GPI-AP একত্রীকরণ এবং সর্টিংকে উৎসাহিত করা। যদিও এই সম্ভাবনাটি এখনও সরাসরি পরীক্ষা করা প্রয়োজন, পূর্ববর্তী গবেষণালব্ধ ফলাফল সমর্থন করে যে দীর্ঘ অ্যাসাইল চেইন সেরামাইডের গলজি বডিতে পরিবহন সাইটোপ্লাজমিক ট্রান্সফার প্রোটিন দ্বারা সম্পন্ন হয় না, বরং ইস্টের মতো GPI অ্যাঙ্করের সংশ্লেষণের উপর নির্ভর করে। অতএব, বিবর্তনীয়ভাবে সংরক্ষিত প্রক্রিয়াটি একই পরিবহন ভেসিকলে খুব দীর্ঘ অ্যাসাইল চেইন সেরামাইড এবং GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) কে নির্বাচনীভাবে সহ-পরিবহন করতে সক্ষম বলে মনে হয়।
ইস্ট এবং স্তন্যপায়ী পোলারাইজড এপিথেলিয়াল কোষ সিস্টেমে, GPI-AP একত্রিতকরণ এবং অন্যান্য প্লাজমা মেমব্রেন প্রোটিন থেকে পৃথকীকরণ, উভয়ই কোষ পৃষ্ঠে পৌঁছানোর আগেই ঘটে। প্যালাডিনো এট আল. (48) দেখেছেন যে স্তন্যপায়ী পোলারাইজড এপিথেলিয়াল কোষের TGN-এ, GPI-AP ক্লাস্টারিং শুধুমাত্র অ্যাপিকাল প্লাজমা মেমব্রেনে GPI-AP-এর নির্বাচনী শ্রেণিবিন্যাসের জন্যই প্রয়োজনীয় নয়, বরং এটি GPI-AP-এর ক্লাস্টারিং সংগঠন এবং এর জৈবিক কার্যকলাপকেও নিয়ন্ত্রণ করে। কোষ পৃষ্ঠ। ইস্টে, এই গবেষণায় দেখা গেছে যে ER-এর উপর C26 সেরামাইড-নির্ভর GPI-AP ক্লাস্টার প্লাজমা মেমব্রেনে GPI-AP-এর ক্লাস্টার সংগঠন এবং কার্যকরী কার্যকলাপ নিয়ন্ত্রণ করতে পারে (24, 49)। এই মডেলের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণভাবে, GhLag1 কোষগুলি GPI ইনহিবিটর বা কোষ প্রাচীরের অখণ্ডতাকে প্রভাবিত করে এমন ওষুধের প্রতি সংবেদনশীল (28), এবং ইস্ট কোষের মিলনের সময় টিপ সেরামাইডের কার্যকরী Gas1-GFP ক্লাস্টারের (49) প্রয়োজনীয়তা GhLag1 কোষের সম্ভাব্য শারীরবৃত্তীয় পরিণতি নির্দেশ করে। জিপিআই-এপি ত্রুটি। তবে, লিপিডের দৈর্ঘ্যের উপর ভিত্তি করে কোনো বাছাই পদ্ধতির মাধ্যমে ইআর থেকে কোষপৃষ্ঠের কার্যকরী বিন্যাস প্রোগ্রাম করা হয়েছে কিনা, তা আরও পরীক্ষা করা আমাদের ভবিষ্যৎ গবেষণার বিষয় হবে।
এই কাজে ব্যবহৃত Saccharomyces cerevisiae স্ট্রেইনগুলো সারণি S1-এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। জীবন্ত কোষের ইমেজিংয়ের জন্য SCLIM-এর MMY1583 এবং MMY1635 স্ট্রেইনগুলো W303-এর পটভূমিতে তৈরি করা হয়েছিল। ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন ট্যাগসহ Sec13-mCherry প্রকাশকারী এই স্ট্রেইনগুলো pFA6a প্লাজমিডকে টেমপ্লেট হিসেবে ব্যবহার করে পলিমারেজ চেইন রিঅ্যাকশন (PCR)-ভিত্তিক পদ্ধতিতে তৈরি করা হয়েছিল (23)। GAL1 প্রোমোটারের নিয়ন্ত্রণে ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন দ্বারা লেবেলযুক্ত Mid2-iRFP প্রকাশকারী স্ট্রেইনটি নিম্নরূপে তৈরি করা হয়েছিল। pKTiRFP-KAN ভেক্টর (E. O'Shea-এর উপহার, Addgene প্লাজমিড নম্বর 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; গবেষণা সম্পদ শনাক্তকারী (RRID): Addgene_64687) থেকে iRFP-KanMx সিকোয়েন্সের PCR অ্যামপ্লিফিকেশন করে এটিকে এন্ডোজেনাস Mid2-এর C-টার্মিনাসে প্রবেশ করানো হয়। Mid2-iRFP জিনোম সিকোয়েন্সটি অ্যামপ্লিফাই করে GAL1 প্রোমোটারে ক্লোন করার পর, এটিকে ইন্টিগ্রেশন প্লাজমিড pRS306-এর Not I-Sac I সাইটে ইন্টিগ্রেট করা হয়েছিল। ফলস্বরূপ প্রাপ্ত প্লাজমিড pRGS7-কে URA3 লোকাসে ইন্টিগ্রেট করার জন্য Pst I দ্বারা লিনিয়ারাইজ করা হয়েছিল।
Gas1-GFP ফিউশন জিনটি সেন্ট্রোমিয়ার (CEN) প্লাজমিডে GAL1 প্রোমোটারের নিয়ন্ত্রণে প্রকাশিত হয়, যা নিম্নরূপে নির্মিত। Gas1-GFP সিকোয়েন্সটি pRS416-GAS1-GFP প্লাজমিড (24) (এল. পোপোলোর উপহার) থেকে PCR দ্বারা বিবর্ধিত করা হয়েছিল এবং CEN প্লাজমিড pBEVY-GL LEU2 (সি. মিলারের উপহার; Addgene প্লাজমিড নম্বর 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225)-এর Xma I–Xho I সাইটে ক্লোন করা হয়েছিল। ফলস্বরূপ প্লাজমিডটির নাম দেওয়া হয়েছিল pRGS6। Axl2-GFP ফিউশন জিনটিও pBEVY-GL LEU2 ভেক্টরের GAL1 প্রোমোটারের নিয়ন্ত্রণে প্রকাশিত হয়, এবং এর নির্মাণ নিম্নরূপ। pRS304-p2HSE-Axl2-GFP প্লাজমিড (23) থেকে PCR এর মাধ্যমে Axl2-GFP ক্রমটি বিবর্ধিত করা হয়েছিল এবং pBEVY-GL LEU2 ভেক্টরের Bam HI-Pst I সাইটে ক্লোন করা হয়েছিল। ফলস্বরূপ প্লাজমিডটির নাম দেওয়া হয়েছিল pRGS12। এই গবেষণায় ব্যবহৃত অলিগোনিউক্লিওটাইডগুলির ক্রম সারণী S2 তে তালিকাভুক্ত করা হয়েছে।
পুষ্টির জন্য প্রয়োজনীয় উপযুক্ত অ্যামিনো অ্যাসিড ও ক্ষার সরবরাহ করার জন্য স্ট্রেইনটিকে কার্বন উৎস হিসেবে ০.২% অ্যাডেনিন ও ২% গ্লুকোজ [YP-ডেক্সট্রোজ (YPD)], ২% র‍্যাফিনোজ [YP-র‍্যাফিনোজ] সমৃদ্ধ ইস্ট এক্সট্র্যাক্ট প্রোটিন পি (YP) মিডিয়াম (১% ইস্ট এক্সট্র্যাক্ট এবং ২% প্রোটিন ইপ্ট (YPR)] বা ২% গ্যালাকটোজ [YP-গ্যালাকটোজ (YPG)] অথবা একটি সিন্থেটিক মিনিমাল মিডিয়ামে (০.১৫% ইস্ট নাইট্রোজেন বেস এবং ০.৫% অ্যামোনিয়াম সালফেট) এবং কার্বন উৎস হিসেবে ২% গ্লুকোজ (সিন্থেটিক গ্লুকোজ মিনিমাল মিডিয়াম) বা ২% গ্যালাকটোজ (সিন্থেটিক গ্যালাকটোজ মিনিমাল মিডিয়াম) দিয়ে সম্পূরক করা হয়েছিল।
রিয়েল-টাইম ইমেজিংয়ের জন্য, GAL1 প্রোমোটারের অধীনে কনস্ট্রাক্ট প্রকাশকারী তাপমাত্রা-সংবেদনশীল sec31-1 মিউট্যান্ট কোষগুলোকে YPR মাধ্যমে ২৪°C তাপমাত্রায় সারারাত ধরে মিড-লগ ফেজ পর্যন্ত কালচার করা হয়েছিল। ২৪°C তাপমাত্রায় ১ ঘণ্টা ধরে YPG মাধ্যমে ইন্ডাকশনের পর, কোষগুলোকে ৩৭°C তাপমাত্রায় ৩০ মিনিটের জন্য SG মাধ্যমে ইনকিউবেট করা হয় এবং তারপর সিক্রেশন ব্লক থেকে মুক্ত করার জন্য ২৪°C তাপমাত্রায় স্থানান্তর করা হয়। একটি গ্লাস স্লাইডে কোষগুলোকে ফিক্স করার জন্য কনকানাভালিন এ ব্যবহার করা হয়েছিল এবং SCLIM দ্বারা ইমেজিং করা হয়েছিল। SCLIM হল Olympus IX-71 ইনভার্টেড ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ এবং UPlanSApo 100×1.4 নিউমেরিক্যাল অ্যাপারচার অয়েল লেন্স (Olympus), উচ্চ-গতি এবং উচ্চ-সিগন্যাল-টু-নয়েজ অনুপাতের ঘূর্ণায়মান ডিস্ক কনফোকাল স্ক্যানার (Yokogawa Electric), কাস্টম স্পেকট্রোমিটার, এবং কাস্টম কুলিং সিস্টেমের একটি সংমিশ্রণ। সিস্টেমের ইমেজ ইনটেনসিফায়ার (Hamamatsu Photonics) ×266.7 চূড়ান্ত বিবর্ধন সহ একটি ম্যাগনিফাইং লেন্স সিস্টেম এবং একটি চার্জ-কাপলড ডিভাইস ক্যামেরা যা ইলেকট্রন গুণন করে (Hamamatsu Photonics) (21) সরবরাহ করতে পারে। ইমেজ অধিগ্রহণ কাস্টম সফটওয়্যার (Yokogawa Electric) দ্বারা সম্পাদিত হয়। 3D ইমেজের জন্য, আমরা অবজেক্টিভ লেন্সকে উল্লম্বভাবে কম্পন করার জন্য একটি কাস্টম-মেড পিজোইলেকট্রিক অ্যাকচুয়েটর ব্যবহার করেছি, এবং অপটিক্যাল অংশগুলিকে 100 nm দূরত্বে একটি স্ট্যাকে সংগ্রহ করেছি। জেড-স্ট্যাক চিত্রটিকে ৩ডি ভক্সেল ডেটাতে রূপান্তরিত করা হয় এবং ঘূর্ণায়মান ডিস্ক কনফোকাল মাইক্রোস্কোপের জন্য ব্যবহৃত তাত্ত্বিক পয়েন্ট স্প্রেড ফাংশনটি ভলোসিটি সফটওয়্যার (পার্কিনএলমার) দ্বারা ডিকনভোলিউশন প্রক্রিয়াকরণের জন্য ব্যবহার করা হয়। সহ-অবস্থান বিশ্লেষণের জন্য ভলোসিটি সফটওয়্যার ব্যবহার করে স্বয়ংক্রিয়ভাবে থ্রেশহোল্ড করার মাধ্যমে কার্গো সহ ইআরইএস পরিমাপ করা হয়েছিল। মেটামর্ফ সফটওয়্যার (মলিকিউলার ডিভাইসেস) ব্যবহার করে লাইন স্ক্যান বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
পরিসংখ্যানগত তাৎপর্য নির্ধারণ করতে GraphPad Prism সফটওয়্যার ব্যবহার করুন। দ্বি-পুচ্ছ স্টুডেন্ট'স টি-টেস্ট এবং সাধারণ একমুখী বিশ্লেষণ অফ ভ্যারিয়েন্স (ANOVA) পরীক্ষার ক্ষেত্রে, গ্রুপগুলির মধ্যে পার্থক্যকে P <0.05 (*) এ তাৎপর্যপূর্ণ প্রভাব রয়েছে বলে বিবেচনা করা হয়।
Gas1-GFP-এর ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির জন্য, লগ ফেজ কোষগুলিকে YPD-তে সারারাত ধরে বৃদ্ধি করা হয়েছিল এবং সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে সংগ্রহ করা হয়েছিল, ফসফেট বাফার্ড স্যালাইন দিয়ে দুবার ধোয়া হয়েছিল এবং কমপক্ষে 15 মিনিটের জন্য বরফের উপর ইনকিউবেট করা হয়েছিল, এবং তারপরে পূর্বে বর্ণিত চেক (24) অনুযায়ী মাইক্রোস্কোপের নীচে কাজ করা হয়েছিল। অধিগ্রহণের জন্য একটি অবজেক্টিভ লেন্স, L5 (GFP) ফিল্টার, হামামাৎসু ক্যামেরা এবং অ্যাপ্লিকেশন স্যুট X (LAS X) সফ্টওয়্যার সহ সজ্জিত লাইকা DMi8 মাইক্রোস্কোপ (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) ব্যবহার করা হয়েছিল।
নমুনাগুলোকে ৬৫°C তাপমাত্রায় ১০ মিনিটের জন্য SDS স্যাম্পল বাফার দিয়ে ডিন্যাচার করা হয়েছিল এবং তারপর SDS-পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস (PAGE) দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল। ইমিউনোব্লটিং বিশ্লেষণের জন্য, প্রতি লেনে ১০ μl নমুনা লোড করা হয়েছিল। প্রাইমারি অ্যান্টিবডি: ১:৩০০০ ডাইলুশনে র‍্যাবিট পলিক্লোনাল অ্যান্টি-Gas1, ১:৫০০ ডাইলুশনে র‍্যাবিট পলিক্লোনাল অ্যান্টি-Emp24, এবং ১:৩০০০ ডাইলুশনে র‍্যাবিট পলিক্লোনাল অ্যান্টি-GFP (এইচ. রিজম্যানের উপহারস্বরূপ) ব্যবহার করা হয়েছিল। মাউস মনোক্লোনাল অ্যান্টি-Pgk1 অ্যান্টিবডিটি ১:৫০০০ ডাইলুশনে ব্যবহার করা হয়েছিল (জে. ডি লা ক্রুজের উপহারস্বরূপ)। সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি: হর্সরেডিশ পারঅক্সিডেজ (HRP) কনজুগেটেড গোট অ্যান্টি-র‍্যাবিট ইমিউনোগ্লোবুলিন জি (IgG) ১:৩০০০ ডাইলুশনে ব্যবহার করা হয়েছিল (পিয়ার্স)। এইচআরপি-সংযুক্ত ছাগলের অ্যান্টি-মাউস আইজিজি (HRP-conjugated goat anti-mouse IgG) ১:৩০০০ অনুপাতে (পিয়ার্স) ব্যবহার করা হয়েছিল। সুপারসিগন্যাল ওয়েস্ট পিকো রিএজেন্ট (SuperSignal West Pico reagent) (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) এর কেমিলুমিনেসেন্স পদ্ধতির মাধ্যমে ইমিউন প্রতিক্রিয়া অঞ্চলটি পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।
(31) এ বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে, সমৃদ্ধ ER ভগ্নাংশের উপর একটি প্রাকৃতিক ইমিউনোপ্রেসিপিটেশন পরীক্ষা করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, ইস্ট কোষগুলিকে TNE বাফার [50 mM ট্রিস-এইচসিএল (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM ফিনাইলমিথাইলসালফোনাইল ফ্লোরাইড এবং প্রোটিয়েজ ইনহিবিটর মিশ্রণ] দিয়ে 600 nm (OD600) এ 100 অপটিক্যাল ডেনসিটিতে দুইবার ধৌত করা হয়েছিল। এটিকে গ্লাস বিডস দিয়ে ভাঙা হয়েছিল, এবং তারপরে সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে কোষের ধ্বংসাবশেষ এবং গ্লাস বিডস অপসারণ করা হয়েছিল। এরপর সুপারন্যাট্যান্টকে 4°C তাপমাত্রায় 17,000 g তে 15 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। পেললেটটিকে TNE তে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং ডিজিটালিস স্যাপোনিন 1% চূড়ান্ত ঘনত্বে যোগ করা হয়েছিল। সাসপেনশনটিকে 4°C তাপমাত্রায় ঘূর্ণনের সাথে 1 ঘন্টা ইনকিউবেট করা হয়েছিল, এবং তারপরে 4°C তাপমাত্রায় 13,000 g তে 60 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করে অদ্রবণীয় উপাদানগুলি অপসারণ করা হয়েছিল। Gas1-GFP ইমিউনোপ্রেসিপিটেশনের জন্য, প্রথমে নমুনাটিকে খালি অ্যাগারোজ বিডস (ক্রোমোটেক)-এর সাথে ৪°C তাপমাত্রায় ১ ঘণ্টা ধরে প্রি-ইনকিউবেট করুন এবং তারপর GFP-Trap_A (ক্রোমোটেক)-এর সাথে ৪°C তাপমাত্রায় ৩ ঘণ্টা ধরে ইনকিউবেট করুন। ইমিউনোপ্রেসিপিটেটেড বিডসগুলোকে ০.২% ডিগোক্সিজেনিনযুক্ত TNE দিয়ে পাঁচবার ধুয়ে, SDS স্যাম্পল বাফার দিয়ে এল্যুট করে, SDS-PAGE-তে পৃথক করা হয় এবং ইমিউনোব্লটিংয়ের মাধ্যমে বিশ্লেষণ করা হয়।
(31) এ বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে, সমৃদ্ধ ER ভগ্নাংশের উপর ক্রস-লিঙ্কিং নির্ধারণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, সমৃদ্ধ ER ভগ্নাংশটিকে 0.5 mM ডাইথিওবিস(সাক্সিনিমিডিল প্রোপিওনেট) (পিয়ার্স, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, রকফোর্ড, আইএল, ইউএসএ; 20°C, 20 মিনিট) এর সাথে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। গ্লাইসিন (50 mM চূড়ান্ত ঘনত্ব, 5 মিনিট, 20°C) যোগ করে ক্রসলিঙ্কিং বিক্রিয়াটি প্রশমিত করা হয়েছিল।
পূর্বে বর্ণিত (50) অনুসারে, ওয়াইল্ড-টাইপ এবং GhLag1 স্ট্রেইনে সেরামাইডের MS বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, কোষগুলিকে 30°C তাপমাত্রায় YPD-তে এক্সপোনেনশিয়াল ফেজ (3 থেকে 4 OD600 ইউনিট/মিলি) পর্যন্ত বৃদ্ধি করা হয়েছিল এবং 25×107 কোষ সংগ্রহ করা হয়েছিল। ট্রাইক্লোরোঅ্যাসিটিক অ্যাসিড দিয়ে তাদের বিপাক প্রশমিত করা হয়। নিষ্কাশন দ্রাবক [ইথানল, জল, ইথার, পাইরিডিন এবং 4.2 N অ্যামোনিয়াম হাইড্রোক্সাইড (15:15:5:1:0.018 v/v)] এবং 1.2 nmol অভ্যন্তরীণ স্ট্যান্ডার্ড C17 সেরামাইড (860517, অ্যাভান্তি পোলার লিপিড) ব্যবহার করা হয়। নিষ্কাশিত পদার্থের মৃদু ক্ষারীয় হাইড্রোলাইসিস করার জন্য মনোমিথাইলঅ্যামাইন বিকারক [মিথানল, জল, এন-বিউটানল এবং মিথাইলঅ্যামাইন দ্রবণ (4:3:1:5 v/v)] ব্যবহার করা হয় এবং তারপরে লবণ অপসারণের জন্য জল-সম্পৃক্ত এন-বিউটানল ব্যবহার করা হয়। অবশেষে, নির্যাসটিকে একটি পজিটিভ মোড দ্রাবকে [ক্লোরোফর্ম/মিথানল/জল (২:৭:১) + ৫ mM অ্যামোনিয়াম অ্যাসিটেট] পুনরায় সাসপেন্ড করে ভর বর্ণালিবীক্ষণ যন্ত্রে ইনজেক্ট করা হয়েছিল। স্ফিঙ্গোলিপিড অণুর শনাক্তকরণ এবং পরিমাণ নির্ধারণের জন্য মাল্টি-রিঅ্যাকশন মনিটরিং (MRM) করা হয়েছিল। লিপিড বিশ্লেষণের জন্য TSQ Vantage টারশিয়ারি কোয়াড্রপোল ভর বর্ণালিবীক্ষণ যন্ত্রটি (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) একটি রোবোটিক ন্যানোফ্লো আয়ন উৎস Nanomate HD (অ্যাডভিয়ন বায়োসায়েন্সেস, ইথাকা, এনওয়াই) দ্বারা সজ্জিত। প্রতিটি সেরামাইড বিভাগের জন্য সংঘর্ষ শক্তি অপ্টিমাইজ করা হয়। MS ডেটা পজিটিভ মোডে সংগ্রহ করা হয়েছিল। প্রতিটি জৈবিক প্রতিলিপির জন্য, লিপিড সংকেত হলো তিনটি স্বাধীন পরিমাপের মধ্যক।
(31) এ বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে, Gas1-GFP প্রকাশকারী কোষগুলিকে (800×107) প্রাকৃতিক ইমিউনোপ্রেসিপিটেশন করা হয়েছিল। বিশুদ্ধ Gas1-GFP কে SDS-PAGE দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল এবং একটি পলিভিনাইলিডিন ফ্লোরাইড (PVDF) মেমব্রেনে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল। অ্যামাইড ব্ল্যাক দিয়ে PVDF স্টেইন করে প্রোটিনটিকে দৃশ্যমান করা হয়েছিল। Gas1-GFP ব্যান্ডটি PVDF থেকে কেটে নেওয়া হয়েছিল এবং মিথানল দিয়ে 5 বার এবং লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি-এমএস (LC-MS) গ্রেড জল দিয়ে একবার ধোয়া হয়েছিল। মেমব্রেন স্ট্রিপটিকে 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0) বাফার এবং 500μl সদ্য দ্রবীভূত 1 M সোডিয়াম নাইট্রাইট মিশ্রণের সাথে 37°C তাপমাত্রায় 3 ঘন্টা ইনকিউবেট করার মাধ্যমে, লিপিড অংশটি Gas1-GFP থেকে মুক্ত হয় এবং গ্লুকোসামিন এবং ইনোসিটলের মধ্যে ইনোসিন ফসফেট সেরামাইডের লাইসড রিলিজ ঘটে (51)। এরপর, মেমব্রেন স্ট্রিপটি LC-MS গ্রেড জল দিয়ে চারবার ধুয়ে, ঘরের তাপমাত্রায় শুকানো হয়েছিল এবং বিশ্লেষণের আগ পর্যন্ত -80°C তাপমাত্রায় নাইট্রোজেন পরিবেশে সংরক্ষণ করা হয়েছিল। নিয়ন্ত্রণ হিসেবে, প্রতিটি পরীক্ষার জন্য PVDF মেমব্রেনের একটি ফাঁকা নমুনা ব্যবহার করা হয়েছিল। Gas1-GFP থেকে নিষ্কাশিত লিপিড তারপর (50) এ বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে MS দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, GPI-লিপিড ধারণকারী PVDF স্ট্রিপগুলিকে 75μl নেগেটিভ মোল্ড দ্রাবক [ক্লোরোফর্ম/মিথানল (1:2) + 5 mM অ্যামোনিয়াম অ্যাসিটেট] এ পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং স্ফিঙ্গোলিপিড প্রজাতির ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়নাইজেশন (ESI)-MRM/MS বিশ্লেষণ (TSQ Vantage) করা হয়েছিল। এক্ষেত্রে, MS ডেটা নেগেটিভ আয়ন মোডে প্রাপ্ত হয়েছিল।
পূর্বে যেমন উল্লেখ করা হয়েছে, GPI অ্যাঙ্করের লিপিড অংশটি [3H]-inositol-লেবেলযুক্ত GPI-AP (16) থেকে পৃথক করা হয়েছিল। লিপিডগুলিকে একটি দ্রাবক সিস্টেম (55:45:10 ক্লোরোফর্ম-মিথানল-0.25% KCl) ব্যবহার করে থিন-লেয়ার ক্রোমাটোগ্রাফি দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল এবং FLA-7000 (ফুজিফিল্ম) ব্যবহার করে দৃশ্যমান করা হয়েছিল।
Gas1-GFP প্রকাশকারী কোষগুলোকে (600×107) TNE বাফার দিয়ে দুইবার ধৌত করা হয়েছিল, এবং গ্লাস বিডস দিয়ে ভাঙা হয়েছিল, এবং তারপর কোষের ধ্বংসাবশেষ ও গ্লাস বিডস অপসারণের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। এরপর সুপারন্যাট্যান্টকে 4°C তাপমাত্রায় 17,000 g-তে 1 ঘন্টার জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। পেললেটটিকে TNE-তে ধৌত করা হয়েছিল এবং 37°C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য 0.2% ডিজিট্যালিস স্যাপোনিনযুক্ত TNE-তে 1 U PI-PLC (Invitrogen)-এর সাথে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। এনজাইম ট্রিটমেন্টের পর, 4°C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য 17,000 g-তে সেন্ট্রিফিউজ করে মেমব্রেনটি অপসারণ করা হয়েছিল। Gas1-GFP-কে ইমিউনোপ্রেসিপিটেট করার জন্য, সুপারন্যাট্যান্টকে 4°C তাপমাত্রায় সারারাতের জন্য GFP-Trap_A (ChromoTek)-এর সাথে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। SDS-PAGE দ্বারা পৃথক করা বিশুদ্ধ Gas1-GFP-কে কুমাশি ব্রিলিয়ান্ট ব্লু দিয়ে স্টেইন করা হয়েছিল। অ্যাকুইডাক্টের চারপাশের ধূসর অংশ থেকে Gas1-GFP স্টেইনিং ব্যান্ডটি কেটে নেওয়া হয়, এবং তারপর আয়োডোঅ্যাসিটামাইড দিয়ে অ্যালকাইলেশন ও ডাইথিওথ্রিটল দিয়ে রিডাকশনের পর, ট্রিপসিন দিয়ে ইন-জেল ডাইজেশন করা হয়। ট্রিপটিক পেপটাইড এবং GPI-গ্লাইক্যানযুক্ত পেপটাইডগুলো নিষ্কাশন করে শুকানো হয়। শুকনো পেপটাইডটি ২০ μl জলে দ্রবীভূত করা হয়। এর একটি অংশ (৮μl) LC-তে ইনজেক্ট করা হয়। নির্দিষ্ট গ্রেডিয়েন্ট শর্তাধীনে পেপটাইড পৃথক করার জন্য একটি অক্টাডেসিলসিলেন (ODS) কলাম (ডেভেলোসিল 300ODS-HG-5; অভ্যন্তরীণ ব্যাস ১৫০ মিমি × ১.০ মিমি; নোমুরা কেমিক্যাল, আইচি প্রিফেকচার, জাপান) ব্যবহার করা হয়। মোবাইল ফেজটি হলো সলভেন্ট A (০.০৮% ফরমিক অ্যাসিড) এবং সলভেন্ট B (৮০% অ্যাসিটোনাইট্রাইলে ০.১৫% ফরমিক অ্যাসিড)। একটি অ্যাক্সেলা এইচপিএলসি সিস্টেম (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, বস্টন, ম্যাসাচুসেটস) ব্যবহার করে কলামটিকে সলভেন্ট A দিয়ে ৫৫ মিনিটের মধ্যে ৫০ μl min-1 প্রবাহ হারে ৫ মিনিটের জন্য এলুশন করা হয়েছিল, এবং তারপর সলভেন্ট B-এর ঘনত্ব ৪০% পর্যন্ত বাড়ানো হয়েছিল। এলুয়েটটি অবিচ্ছিন্নভাবে ESI আয়ন সোর্সে প্রবেশ করানো হয়েছিল, এবং ট্রিপটিক পেপটাইড ও GPI-গ্লাইক্যানযুক্ত পেপটাইডগুলিকে LTQ অরবিটরাপ এক্সএল (হাইব্রিড লিনিয়ার আয়ন ট্র্যাপ-অরবিটরাপ মাস স্পেকট্রোমিটার; থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। MS সেটআপে, ক্যাপিলারি সোর্সের ভোল্টেজ ৪.৫ kV-তে সেট করা হয়েছিল এবং ট্রান্সফার ক্যাপিলারির তাপমাত্রা ৩০০°C-তে রাখা হয়েছিল। ক্যাপিলারি ভোল্টেজ এবং টিউব লেন্স ভোল্টেজ যথাক্রমে ১৫ V এবং ৫০ V-তে সেট করা হয়েছিল। MS ডেটা পজিটিভ আয়ন মোডে (রেজোলিউশন ৬০,০০০; ভরের নির্ভুলতা ১০ পার্টস পার মিলিয়ন) ৩০০/m/z ভর/চার্জ অনুপাত (m/z) ৩০০০ এর ভর পরিসরে সংগ্রহ করা হয়েছিল। MS/MS ডেটা LTQ Orbitrap XL-এর আয়ন ট্র্যাপের মাধ্যমে সংগ্রহ করা হয় [প্রথম ৩টি ডিজিট যার উপর ডেটা নির্ভর করে, কলিশন ইনডিউসড ডিসোসিয়েশন (CID)]।
GROMACS (52) সফটওয়্যার এবং MARTINI 2 ফোর্স ফিল্ড (53-55) ব্যবহার করে MD সিমুলেশন করা হয়েছিল। এরপর ডাইওলিওইলফসফ্যাটিডাইলকোলিন (DOPC) এবং Cer C18 অথবা DOPC এবং Cer C26 ধারণকারী একটি বাইলেয়ার তৈরি করার জন্য CHARMM GUI মেমব্রেন বিল্ডার (56, 57) ব্যবহার করা হয়েছিল। স্ফিঙ্গোসিন লেজ থেকে অতিরিক্ত বিডগুলি সরিয়ে DXCE থেকে Cer C26-এর টপোলজি এবং স্থানাঙ্কগুলি বের করা হয়েছে। ডাবল লেয়ারকে ভারসাম্যপূর্ণ করতে এবং এটি চালানোর জন্য নীচে বর্ণিত প্রক্রিয়াটি ব্যবহার করুন, তারপর Emp24 ধারণকারী একটি সিস্টেম তৈরি করতে সিস্টেমের শেষ স্থানাঙ্কগুলি ব্যবহার করুন। ইস্ট Emp24-এর ট্রান্সমেমব্রেন ডোমেন (অবশিষ্ট 173 থেকে 193) ভিজ্যুয়াল MD (VMD) টুল মলিকুলার স্ট্রাকচার (58) ব্যবহার করে একটি α-হেলিক্স হিসাবে তৈরি করা হয়েছিল। তারপর, ওভারল্যাপিং লিপিডগুলি সরানোর পরে, প্রোটিনটিকে মোটা দানায় পরিণত করা হয়েছিল এবং CHARMM GUI ব্যবহার করে বাইলেয়ারে প্রবেশ করানো হয়েছিল। চূড়ান্ত সিস্টেমটিতে ১২০২টি DOPC ও ৩০২টি Cer C26 অথবা ১১৯৭টি DOPC ও ২৯৫টি Cer C18 এবং Emp24 রয়েছে। সিস্টেমটিকে ০.১৫০M ঘনত্বে আয়নিত করুন। দুটি বাইলেয়ার গঠনের জন্য চারটি স্বাধীন প্রতিলিপি তৈরি করা হয়েছিল।
CHARMM GUI প্রসেস ব্যবহার করে লিপিড বাইলেয়ারকে ব্যালেন্স করা হয়, যার মধ্যে ৪,০৫,০০০ ধাপ মিনিমাইজ এবং তারপর ব্যালেন্স করা অন্তর্ভুক্ত। এই ধাপে পজিশন কনস্ট্রেইন্টগুলো ক্রমান্বয়ে কমানো ও বাদ দেওয়া হয় এবং টাইম স্টেপ ০.০০৫ পিকোসেকেন্ড থেকে বাড়িয়ে ০.০২ পিকোসেকেন্ড করা হয়। ইকুলিব্রেশনের পর, এটি ০.০২ পিকোসেকেন্ড টাইম স্টেপে ৬ মাইক্রোসেকেন্ডের প্রোডাকশন সম্পন্ন করে। Emp24 ইনসার্ট করার পর, সিস্টেমটিকে মিনিমাইজ ও ব্যালেন্স করার জন্য একই CHARMM GUI প্রসেস ব্যবহার করুন এবং তারপর প্রোডাকশনে ৮ সেকেন্ডের জন্য রান করুন।
সমস্ত সিস্টেমের জন্য, ব্যালান্সিং প্রক্রিয়ার সময়, চাপ বেরেন্ডসেন ব্যারোস্ট্যাট (59) দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়, এবং উৎপাদন প্রক্রিয়ার সময়, চাপ প্যারিনেলো-রাহমান ব্যারোস্ট্যাট (60) দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়। সব ক্ষেত্রে, গড় চাপ 1 বার এবং একটি সেমি-আইসোট্রপিক প্রেসার কাপলিং স্কিম ব্যবহার করা হয়। ব্যালান্স এবং উৎপাদন প্রক্রিয়ায়, যথাক্রমে প্রোটিন, লিপিড এবং দ্রাবক কণার তাপমাত্রা সংযুক্ত করার জন্য স্পিড রিক্যালিব্রেশন সহ একটি থার্মোস্ট্যাট (61) ব্যবহার করা হয়। পুরো অপারেশন জুড়ে, লক্ষ্য তাপমাত্রা 310K। নন-বন্ডিং ইন্টারঅ্যাকশন 0.005 বাফার টলারেন্স সহ ভারলেট স্কিম ব্যবহার করে একটি পেয়ারিং তালিকা তৈরি করে গণনা করা হয়। কুলম্ব টার্মটি রিঅ্যাকশন ফিল্ড এবং 1.1 nm এর একটি কাট-অফ দূরত্ব ব্যবহার করে গণনা করা হয়। ভ্যান্ডার ওয়ালস টার্মটি 1.1 nm এর একটি কাট-অফ দূরত্ব সহ একটি কাট-অফ স্কিম ব্যবহার করে, এবং পটেনশিয়াল ড্রিফটের জন্য ভারলেট কাট-অফ স্কিম ব্যবহার করা হয় (62)।
VMD ব্যবহার করে, DOPC ফসফেট বিডস বা সেরামাইড AM1 বিডস এবং প্রোটিনের মধ্যে কাটঅফ তরঙ্গদৈর্ঘ্য হল 0.7 nm, এবং প্রোটিনের সাথে মিথস্ক্রিয়া করে এমন লিপিডের সংখ্যা গণনা করা হয়। নিম্নলিখিত সূত্র অনুসারে, (63) অনুযায়ী ডিপ্লেশন-এনরিচমেন্ট (DE) ফ্যাক্টর গণনা করুন: DE ফ্যাক্টর = (প্রোটিনে মোট লিপিডের পরিমাণ 0.7) প্রোটিনে মোট লিপিডের পরিমাণ 0.7 (মোট লিপিডে Cer এর পরিমাণ)
প্রতিবেদিত মানটি গড় হিসাবে পাওয়া যায় এবং এরর বারগুলি হলো SE-এর চারটি স্বাধীন অনুলিপি। DE ফ্যাক্টরের পরিসংখ্যানগত তাৎপর্য t পরীক্ষা [(গড়DE-ফ্যাক্টর-1)/SE] দ্বারা গণনা করা হয়। এক-পুচ্ছ বিন্যাস থেকে P মান গণনা করুন।
ট্রেসের শেষ ২৫০ ন্যানোসেকেন্ডের মধ্যে Emp24 ধারণকারী সিস্টেমটির দ্বি-মাত্রিক পার্শ্বীয় ঘনত্ব মানচিত্র গণনা করার জন্য GROMACS টুলটি ব্যবহার করা হয়েছিল। সেরামাইডের সমৃদ্ধি/হ্রাস মানচিত্র পাওয়ার জন্য, Cer-এর ঘনত্ব মানচিত্রকে Cer এবং DOPC-এর মানচিত্রের যোগফল দ্বারা ভাগ করা হয় এবং তারপরে শরীরে Cer-এর ঘনত্ব দ্বারা ভাগ করা হয়। একই রঙের মানচিত্র স্কেল ব্যবহার করা হয়।
এই প্রবন্ধের সম্পূরক উপকরণের জন্য, অনুগ্রহ করে http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 দেখুন।
এটি ক্রিয়েটিভ কমন্স অ্যাট্রিবিউশন-নন-কমার্শিয়াল লাইসেন্সের শর্তাবলীর অধীনে বিতরণ করা একটি উন্মুক্ত প্রবেশাধিকার নিবন্ধ, যা যেকোনো মাধ্যমে এর ব্যবহার, বিতরণ এবং পুনরুৎপাদনের অনুমতি দেয়, যতক্ষণ পর্যন্ত চূড়ান্ত ব্যবহারটি বাণিজ্যিক লাভের জন্য না হয় এবং মূল কাজটি সঠিক থাকার শর্ত থাকে। তথ্যসূত্র।
দ্রষ্টব্য: আমরা শুধুমাত্র আপনার ইমেল ঠিকানাটি এই কারণে প্রদান করতে অনুরোধ করছি, যাতে আপনি যাকে এই পেজটি সুপারিশ করছেন, তিনি যেন জানতে পারেন যে আপনি চান তিনি ইমেলটি দেখুন এবং এটি কোনো স্প্যাম নয়। আমরা কোনো ইমেল ঠিকানা সংগ্রহ করব না।
আপনি একজন পরিদর্শক কিনা তা যাচাই করতে এবং স্বয়ংক্রিয় স্প্যাম জমা হওয়া রোধ করতে এই প্রশ্নটি ব্যবহার করা হয়।
সোফিয়া রদ্রিগেজ-গ্যালার্দো, কাজুও কুরোকাওয়া, সুজানা সাবিদো-বোজো, আলেজান্দ্রো কর্টেজ · গোমেজ (আলেজান্দ্রো কর্টেস-গোমেজ), আতসুকো ইকেদা (আতসুকো ইকেদা), ভ্যালেরিয়া জোনি (ভ্যালেরিয়া জোনি), অক্সিলিয়াডোরা আগুইলেরা-রোমেরো, অ্যানা লোজিও (আনা লোজিও)। লোপেজ), মিহো ওয়াগা (মিহো ওয়াগা), মিসাকো আরমান (মিসাকো আরমান), মিয়াকো রিমান (মিয়াকো রিমান), প্রো আকিরা, স্টেফানো ফ্যানি, আকিহিকো নাকানো, ম্যানুয়েল মুনিজ
ত্রিমাত্রিক উচ্চ-রেজোলিউশন রিয়েল-টাইম ইমেজিং, নির্বাচনী আউটপুট সাইটগুলিতে প্রোটিন বাছাইয়ের জন্য সেরামাইড চেইনের দৈর্ঘ্যের গুরুত্ব প্রকাশ করে।
সোফিয়া রদ্রিগেজ-গ্যালার্দো, কাজুও কুরোকাওয়া, সুজানা সাবিদো-বোজো, আলেজান্দ্রো কর্টেজ · গোমেজ (আলেজান্দ্রো কর্টেস-গোমেজ), আতসুকো ইকেদা (আতসুকো ইকেদা), ভ্যালেরিয়া জোনি (ভ্যালেরিয়া জোনি), অক্সিলিয়াডোরা আগুইলেরা-রোমেরো, অ্যানা লোজিও (আনা লোজিও)। লোপেজ), মিহো ওয়াগা (মিহো ওয়াগা), মিসাকো আরমান (মিসাকো আরমান), মিয়াকো রিমান (মিয়াকো রিমান), প্রো আকিরা, স্টেফানো ফ্যানি, আকিহিকো নাকানো, ম্যানুয়েল মুনিজ
ত্রিমাত্রিক উচ্চ-রেজোলিউশন রিয়েল-টাইম ইমেজিং, নির্বাচনী আউটপুট সাইটগুলিতে প্রোটিন বাছাইয়ের জন্য সেরামাইড চেইনের দৈর্ঘ্যের গুরুত্ব প্রকাশ করে।
©2020 আমেরিকান অ্যাসোসিয়েশন ফর দ্য অ্যাডভান্সমেন্ট অফ সায়েন্স। সমস্ত অধিকার সংরক্ষিত AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef এবং COUNTER এর অংশীদার। Science Advances ISSN 2375-2548.