কোষের কম্পার্টমেন্টালাইজেশন এবং হোমিওস্ট্যাসিস বজায় রাখার জন্য সিক্রেটরি পাথওয়েতে প্রোটিন বাছাই অপরিহার্য। শেল-মধ্যস্থতা বাছাই ছাড়াও, সিক্রেটরি পরিবহন প্রক্রিয়ায় কাইনসিন বাছাইয়ে লিপিডের ভূমিকা একটি দীর্ঘস্থায়ী মৌলিক প্রশ্ন যার উত্তর এখনও পাওয়া যায়নি। এখানে, আমরা 3D যুগপত মাল্টিকালার হাই-রেজোলিউশন রিয়েল-টাইম ইমেজিং করি যাতে প্রমাণ করা যায় যে খুব দীর্ঘ সিরামাইড লিপিড মোয়েট সহ নতুন সংশ্লেষিত গ্লাইকোসিলফসফ্যাটিডিলিনোসিটল-অচল প্রোটিনগুলিকে ক্লাস্টার করা হয় এবং বিশেষায়িত এন্ডোপ্লাজম নেট এক্সিট সাইটে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়, যা ট্রান্সমেমব্রেন প্রোটিন দ্বারা ব্যবহৃত থেকে আলাদা। এছাড়াও, আমরা দেখাই যে এন্ডোপ্লাজমিক রেটিকুলাম মেমব্রেনে সিরামাইডের চেইন দৈর্ঘ্য এই বাছাই নির্বাচনের জন্য অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ। আমাদের গবেষণাটি লিপিড চেইন দৈর্ঘ্যের উপর ভিত্তি করে প্রোটিন কার্গোগুলিকে সিক্রেটরি পাথওয়েতে নির্বাচনী রপ্তানি সাইটগুলিতে শ্রেণীবদ্ধ করার জন্য প্রথম সরাসরি ইন ভিভো প্রমাণ সরবরাহ করে।
ইউক্যারিওটিক কোষে, এন্ডোপ্লাজমিক রেটিকুলাম (ER) তে সংশ্লেষিত প্রোটিনগুলিকে পরিবহনের সময় তাদের যথাযথ কোষীয় গন্তব্যে পৌঁছে দেওয়ার জন্য সিক্রেটরি পথের মাধ্যমে বাছাই করা হয় (1)। আবরণ-মধ্যস্থতা বাছাই ছাড়াও, দীর্ঘদিন ধরে অনুমান করা হয়েছিল যে নির্দিষ্ট লিপিডগুলি নির্দিষ্ট প্রোটিনের (2-5) নির্দিষ্ট ঝিল্লি ডোমেনে ক্লাস্টার করে নির্বাচনী প্রস্থান বিন্দু হিসাবেও কাজ করতে পারে। যাইহোক, এই সম্ভাব্য লিপিড-ভিত্তিক প্রক্রিয়াটি প্রমাণ করার জন্য এখনও সরাসরি ইন ভিভো প্রমাণের অভাব রয়েছে। এই মৌলিক সমস্যা সমাধানের জন্য, আমরা ইস্টে অধ্যয়ন করেছি কিভাবে গ্লাইকোসিলফসফ্যাটিডিলিনোসিটল (GPI) অ্যাঙ্করড প্রোটিন (GPI-APs) ER থেকে আলাদাভাবে রপ্তানি করা হয়। GPI-APs হল বিভিন্ন ধরণের লিপিড-সংযুক্ত কোষ পৃষ্ঠের প্রোটিন (6, 7)। GPI-AP হল গ্লাইকোলিপিড মোইটি (GPI অ্যাঙ্কর) এর মাধ্যমে প্লাজমা ঝিল্লির বাইরের লিফলেটের সাথে সংযুক্ত একটি নিঃসৃত প্রোটিন। তারা ER লুমেনে রক্ষণশীল পোস্ট-ট্রান্সলেশনাল পরিবর্তন হিসাবে GPI অ্যাঙ্কর গ্রহণ করে (8)। সংযুক্তির পর, GPI-AP গলগি যন্ত্রপাতি (5, 9) এর মধ্য দিয়ে ER থেকে প্লাজমা ঝিল্লিতে যায়। GPI অ্যাঙ্করের উপস্থিতির ফলে GPI-AP কে ট্রান্সমেমব্রেন নিঃসৃত প্রোটিন (অন্যান্য প্লাজমা ঝিল্লি প্রোটিন সহ) থেকে আলাদাভাবে সিক্রেটরি পথ ধরে পরিবহন করা হয় (5, 9, 10)। ইস্ট কোষে, GPI-AP গুলিকে এন্ডোপ্লাজমিক রেটিকুলামের অন্যান্য নিঃসৃত প্রোটিন থেকে আলাদা করা হয় এবং তারপর কোট প্রোটিন কমপ্লেক্স II (COPII) (6, 7) দ্বারা মোড়ানো অনন্য ভেসিকেলে প্যাকেজ করা হয়। ER রপ্তানি প্রক্রিয়ায় এই শ্রেণিবিন্যাস প্রক্রিয়ার নির্ধারকগুলি অস্পষ্ট, তবে অনুমান করা হয় যে এই প্রক্রিয়াটির জন্য লিপিডের প্রয়োজন হতে পারে, বিশেষ করে GPI অ্যাঙ্করের লিপিড অংশের কাঠামোগত পুনর্নির্মাণ (5, 8)। ইস্টে, GPI লিপিড পুনর্নির্মাণ GPI সংযুক্ত হওয়ার পরপরই শুরু হয় এবং অনেক ক্ষেত্রে, এটি সিরামাইডকে 26-কার্বন লং-চেইন স্যাচুরেটেড ফ্যাটি অ্যাসিড (C26:0) (11, 12) এর সাথে আবদ্ধ করে। C26 সিরামাইড হল এখন পর্যন্ত ইস্ট কোষ দ্বারা উৎপাদিত প্রধান সিরামাইড। এটি ER-তে সংশ্লেষিত হয় এবং এর বেশিরভাগই COPII ভেসিকেলের মাধ্যমে গোলগি যন্ত্রপাতিতে রপ্তানি করা হয় (13)। GPI-AP-এর ER রপ্তানির জন্য বিশেষভাবে চলমান সিরামাইড সংশ্লেষণ প্রয়োজন (14, 15), এবং ফলস্বরূপ, গোলগি যন্ত্রপাতিতে সিরামাইডকে ইনোসিটল ফসফেট সিরামাইডে (IPC) রূপান্তর করা GPI অ্যাঙ্কর সংশ্লেষণের উপর নির্ভর করে (16)। কৃত্রিম ঝিল্লির সাথে জৈবিক গবেষণায় দেখা গেছে যে খুব দীর্ঘ অ্যাসাইল চেইন সিরামাইডগুলি অনন্য ভৌত বৈশিষ্ট্য সহ ক্রমযুক্ত ডোমেন তৈরি করতে একত্রিত হতে পারে (17, 18)। এই তথ্যগুলি এই অনুমানের দিকে পরিচালিত করে যে C26 সিরামাইড এবং C26 সিরামাইড সহ GPI-AP তাদের ভৌত বৈশিষ্ট্যগুলি ব্যবহার করে তুলনামূলকভাবে অগোছালো ER ঝিল্লি লিপিড পরিবেশে সুশৃঙ্খল অঞ্চল বা অঞ্চলে একত্রিত হয়। এটি মূলত সংক্ষিপ্ত এবং অসম্পৃক্ত গ্লিসারোলিপিড (C16:1 এবং C18:1) (19, 20) দ্বারা গঠিত। এই অঞ্চলগুলি নির্দিষ্ট ER এক্সিট সাইট (ERES) এর উপর নির্বাচনীভাবে কেন্দ্রীভূত করা হবে, যেখানে সিরামাইড এবং সিরামাইড-ভিত্তিক GPI-AP একই ডেডিকেটেড COPII ভেসিকেলে (5) গোলগিতে সহ-পরিবহন করা যেতে পারে।
এই গবেষণায়, আমরা সুপার-রেজোলিউশন কনফোকল রিয়েল-টাইম ইমেজিং মাইক্রোস্কোপি (SCLIM) ব্যবহার করে এই লিপিড-ভিত্তিক প্রক্রিয়াটি সরাসরি পরীক্ষা করেছি, যা একটি অত্যাধুনিক মাইক্রোস্কোপি কৌশল যা একই সাথে ফ্লুরোসেন্ট লেবেলযুক্ত প্রোটিন পর্যবেক্ষণ করতে পারে। ত্রি-বর্ণ এবং ত্রি-মাত্রিক (3D) চিত্রগুলিতে জীবন্ত কোষগুলিতে অত্যন্ত উচ্চ রেজোলিউশন এবং গতি থাকে (21, 22)।
আমরা প্রথমে SCLIM প্রযুক্তি প্রয়োগ করে S. cerevisiae-তে ER ত্যাগ করার পর ট্রান্সমেমব্রেন নিঃসৃত প্রোটিন থেকে C26 সিরামাইড গ্রুপ সহ স্বাভাবিক GPI-AP কীভাবে স্ক্রিন করা হয়েছিল তা আরও সংজ্ঞায়িত করেছি। ER-এর শ্রেণীবিভাগ পরীক্ষা করার জন্য, আমরা একটি জেনেটিক সিস্টেম ব্যবহার করেছি যা সরাসরি ERES-এ প্রবেশকারী নতুন সংশ্লেষিত কার্গো কল্পনা করতে পারে (7, 23)। কার্গো হিসাবে, আমরা সবুজ ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন (GFP) দিয়ে লেবেলযুক্ত C26 সিরামাইড-ভিত্তিক GPI-AP Gas1 এবং কাছাকাছি-ইনফ্রারেড ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন (iRFP) দিয়ে লেবেলযুক্ত ট্রান্সমেমব্রেন নিঃসৃত প্রোটিন Mid2 বেছে নিয়েছি, উভয়ই প্লাজমা ঝিল্লিকে লক্ষ্য করে (24-26)। sec31-1 তাপমাত্রা-সংবেদনশীল মিউট্যান্টে, এই দুটি কার্গো একটি গ্যালাকটোজ-ইনডুসিবল প্রোমোটার এবং একটি গঠনমূলক ERES মার্কার দ্বারা প্রকাশ করা হয়। চরম তাপমাত্রায় (37°C), কারণ sec31-1 মিউটেশন COPII অঙ্কুরোদগম এবং ER রপ্তানিকে বাধা দেওয়ার জন্য COPII কোট উপাদান Sec31 এর কার্যকারিতাকে প্রভাবিত করে, নতুন সংশ্লেষিত কার্গো ER-তে জমা হয় (23)। কম তাপমাত্রায় (২৪°C) ঠান্ডা হওয়ার পর, sec31-1 মিউট্যান্ট কোষগুলি সিক্রেটরি এলাকা থেকে পুনরুদ্ধার করা হয় এবং জমে থাকা নতুন সিন্থেটিক কার্গো ER থেকে রপ্তানি করা শুরু হয়। CLIM ভিজ্যুয়ালাইজেশনে দেখা গেছে যে নতুন সংশ্লেষিত Gas1-GFP এবং Mid2-iRFP-এর বেশিরভাগই 37°C তাপমাত্রায় ইনকিউবেশনের পরেও sec31-1 মিউট্যান্ট কোষের ER-তে জমা হয় এবং তারপর 5 মিনিটের জন্য 24°C তাপমাত্রায় ছেড়ে দেওয়া হয় (চিত্র 1)। যেহেতু Mid2-iRFP সমগ্র ER ঝিল্লিতে বিতরণ করা হয়, এবং Gas1-GFP ঘনীভূত হয় এবং বিচ্ছিন্ন ER ঝিল্লি এলাকায় সংগ্রহ করা হয়, তাই তাদের বিতরণ সম্পূর্ণ ভিন্ন (চিত্র 1, A থেকে C এবং মুভি S1)। এছাড়াও, চিত্র 1D-তে দেখানো হয়েছে, Gas1-GFP ক্লাস্টারে Mid2-iRFP নেই। এই ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে GPI-AP এবং ট্রান্সমেমব্রেন প্রোটিনগুলি প্রথম দিকে বিভিন্ন ER ঝিল্লি অঞ্চলে বিভক্ত ছিল। Gas1-GFP ক্লাস্টারটি mCherry's COPII কোট প্রোটিন Sec13 (চিত্র 1, E এবং F, এবং মুভি S1) (23) দিয়ে লেবেলযুক্ত একটি নির্দিষ্ট ERES এর সংলগ্ন।
sec31-1 কোষগুলি গ্যালাকটোজ-প্ররোচিত নিঃসরণ, একটি দীর্ঘ অ্যাসিল চেইন (C26) সিরামাইড GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, সবুজ) এবং ট্রান্সমেমব্রেন প্রোটিন Mid2-iRFP (TMP, নীল) প্রকাশ করে এবং এই গঠনমূলক ERES লেবেলিং Sec13-mCherry (ERES, ম্যাজেন্টা) 30 মিনিটের জন্য 37°C তাপমাত্রায় ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল, 24°C তাপমাত্রায় স্থানান্তরিত হয়েছিল এবং 5 মিনিট পরে SCLIM দ্বারা চিত্রিত করা হয়েছিল। (A থেকে C) একটি সমতলের (A) একটি প্রতিনিধিত্বমূলক একত্রিত বা একক 2D চিত্র, 10 z-সেকশন (B) এর একটি 2D প্রক্ষেপণ চিত্র বা কার্গো এবং ERES মার্কার (C) এর একটি 3D কোষ গোলার্ধের চিত্র দেখায়। স্কেল বার 1μm (A এবং B)। স্কেল ইউনিট হল 0.551μm (C)। Gas1-GFP বিচ্ছিন্ন ER অঞ্চল বা ক্লাস্টারে সনাক্ত করা হয়েছিল, যখন Mid2-iRFP সনাক্ত করা হয়েছিল এবং ER ঝিল্লি (C) জুড়ে বিতরণ করা হয়েছিল। (D) গ্রাফটি সাদা তীর রেখা (বামে) বরাবর Gas1-GFP ক্লাস্টারে Gas1-GFP এবং Mid2-iRFP-এর আপেক্ষিক প্রতিপ্রভ তীব্রতা দেখায়। AU, স্বেচ্ছাসেবক একক। (E এবং F) পণ্য এবং ERES চিহ্নকে একত্রিত করে এমন 3D চিত্র উপস্থাপন করে। নির্দিষ্ট ERES-এর কাছে Gas1-GFP ক্লাস্টার সনাক্ত করা হয়েছিল। স্কেল ইউনিট হল 0.551μm। (F) সাদা কঠিন তীরটি ERES-এর সাথে যুক্ত Gas1-GFP ক্লাস্টারকে চিহ্নিত করে। মাঝখানের এবং ডান প্যানেলগুলি একত্রিত বর্ধিত 3D চিত্র এবং নির্বাচিত Gas1-GFP ক্লাস্টারের একটি ঘূর্ণিত দৃশ্য দেখায়।
Gas1-GFP ক্লাস্টার এবং একটি নির্দিষ্ট ERES এর মধ্যে ঘনিষ্ঠ স্থানিক সম্পর্ক ইঙ্গিত দেয় যে Gas1-GFP নির্বাচনী ERES এ প্রবেশ করতে পারে, যা ER ছেড়ে যাওয়ার জন্য Mid2-iRFP দ্বারা ব্যবহৃত নির্বাচনীতা থেকে আলাদা। এই সম্ভাবনা মোকাবেলা করার জন্য, আমরা শুধুমাত্র এক বা দুটি পণ্যের জন্য ERES অনুপাত পরিমাপ করেছি (চিত্র 2, A থেকে C)। আমরা দেখেছি যে বেশিরভাগ ERES (70%) তে শুধুমাত্র এক ধরণের পণ্যসম্ভার থাকে। চিত্র 2C এর নীচের চিত্রটি শুধুমাত্র Gas1-GFP (চিত্র 1) বা শুধুমাত্র Mid2-iRFP (চিত্র 2) সহ ERES এর দুটি সাধারণ উদাহরণ দেখায়। বিপরীতে, প্রায় 20% ERES তে দুটি কার্গো রয়েছে যা একই এলাকায় ওভারল্যাপ করে। দেখা গেছে যে কিছু ERES (10%) দুটি ধরণের পণ্যসম্ভার ধারণ করে, কিন্তু সেগুলি স্পষ্টভাবে ভিন্ন এলাকায় বিচ্ছিন্ন ছিল। অতএব, এই পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ দেখায় যে ER রপ্তানি করার পরে, GPI-AP Gas1-GFP এবং ট্রান্সমেমব্রেন কার্গো Mid2-iRFP বিভিন্ন ERES (চিত্র 2D) এ বিভক্ত। এই বাছাই দক্ষতা পূর্ববর্তী জৈব রাসায়নিক বিশ্লেষণ (6) এবং রূপগত নির্ধারণ (7) এর সাথে খুবই সামঞ্জস্যপূর্ণ। আমরা ERES-এ প্রবেশকারী কোয়ারেন্টাইন করা কার্গোর আচরণও পর্যবেক্ষণ করতে পারি (চিত্র 2E এবং মুভি S2)। চিত্র 2E দেখায় যে Gas1-GFP (প্যানেল 3) বা Mid2-iRFP (প্যানেল 4) এর একটি ছোট অংশই একপাশ থেকে ERES-এ প্রবেশ করে এবং একটি বিচ্ছিন্ন এলাকায় আবদ্ধ থাকে। চিত্র 2E এর প্যানেল 5 দেখায় যে Gas1-GFP এবং Mid2-iRFP কখনও কখনও একই ERES-এ পাওয়া যায়, কিন্তু তারা বিভিন্ন দিক থেকে প্রবেশ করে এবং পৃথক অঞ্চলে ঘনীভূত হয় যা বিভিন্ন COPII ভেসিকেলের প্রতিনিধিত্ব করতে পারে। আমরা আরও নিশ্চিত করেছি যে C26 সিরামাইড-ভিত্তিক GPI-AP Gas1-এর নির্বাচনী ERES হিসাবে পর্যবেক্ষণ করা পৃথকীকরণ এবং শ্রেণীবিভাগ নির্দিষ্ট কারণ আরেকটি ট্রান্সমেমব্রেন নিঃসরণ কার্গো, GFP-ট্যাগযুক্ত প্লাজমা মেমব্রেন প্রোটিন Axl2 (27), Mid2-iRFP-এর অনুরূপ আচরণ দেখায়। (চিত্র S1 এবং মুভি S3)। নতুন সংশ্লেষিত Axl2-GFP Mid2-iRFP (চিত্র S1, A এবং B) এর মতো ER ঝিল্লির মাধ্যমে বিতরণ করা হয় এবং বেশিরভাগ ERES-তে Mid2-iRFP-এর সাথে সহ-স্থানীয় হয় (চিত্র S1, B থেকে D)। চিত্র 1-এর প্যানেল 1 এবং 2। S1C ERES-এর দুটি সাধারণ উদাহরণ দেখায় যেখানে দুটি ট্রান্সমেমব্রেন কার্গো ওভারল্যাপ করে। এই ক্ষেত্রে, উভয় পণ্য একসাথে ERES-এ প্রবেশ করে (চিত্র S1E, প্যানেল 3 এবং মুভি S3)।
গ্যালাকটোজ ইনডিউসিবল নিঃসরণ প্রকাশকারী sec31-1 কোষ, Gas1-GFP (GPI-AP, সবুজ) এবং Mid2-iRFP (TMP, নীল) এবং Sec13-mCherry (ERES, ম্যাজেন্টা) লেবেলযুক্ত গঠনমূলক ERES 37 এ স্থাপন করা হয়েছিল। °C তাপমাত্রায় 30 মিনিট ইনকিউবেট করার পর, 24 °C তাপমাত্রায় সরান যাতে নিঃসরণ ব্লকটি মুক্ত হয় এবং 20 মিনিট পরে SCLIM দিয়ে ছবি তোলা হয়। (A থেকে C) প্রতিনিধিত্বমূলক 2D প্রক্ষেপণ চিত্র (A; স্কেল বার, 1μm) অথবা 3D কোষের গোলার্ধের চিত্র (B এবং C; স্কেল ইউনিট, 0.456μm) কার্গো এবং ERES দ্বারা চিহ্নিত 10টি z-বিভাগ। (B) এর নীচের প্যানেল এবং (C) এর প্যানেল প্রক্রিয়াকৃত চিত্র প্রদর্শন করে যাতে শুধুমাত্র ERES (ম্যাজেন্টা) [Gas1-GFP (ধূসর) এবং Mid2-iRFP (হালকা নীল)] তে উপস্থিত পণ্যগুলি প্রদর্শিত হয়। (C) খোলা তীর: ERES শুধুমাত্র এক টুকরো পণ্য বহন করে (1 থেকে 4)। ধূসর তীর: ERES পৃথকীকৃত পণ্যসম্ভার ধারণ করে (5)। সাদা কঠিন তীর: সহ-অবস্থিত পণ্যসম্ভার ধারণকারী ERES। নীচে: নির্বাচিত একক ERES-তে কেবল Gas1-GFP (1) বা Mid2-iRFP (2) রয়েছে। স্কেল বার, 100 nm। (D) (C) তে বর্ণিত ফটোমাইক্রোগ্রাফের পরিমাণ নির্ধারণ। ERES-এর গড় শতাংশ যেখানে কেবল একটি পণ্যসম্ভার (Gas1-GFP বা Mid2-iRFP), পৃথকীকৃত পণ্যসম্ভার এবং ওভারল্যাপিং পণ্যসম্ভার রয়েছে। তিনটি স্বাধীন পরীক্ষায়, 54টি কোষে n=432। ত্রুটি বার = SD। দুই-লেজবিহীন টি পরীক্ষা। *** P = 0.0002। (E) (C) চিহ্নিত কোয়ারেন্টাইন করা পণ্যসম্ভারের নির্বাচিত ERES-এর 3D চিত্র। Gas1-GFP (সবুজ) (3) বা Mid2-iRFP (নীল) (4) একপাশ থেকে ERES (ম্যাজেন্টা) এ প্রবেশ করে এবং ERES-এর মধ্যে একটি ছোট এলাকায় সীমাবদ্ধ থাকে। কখনও কখনও, উভয় ধরণের পণ্য একই দিক থেকে একই ERES (5) এ প্রবেশ করে এবং ERES এর মধ্যে একটি বিচ্ছিন্ন এলাকায় সীমাবদ্ধ থাকে। স্কেল বার, 100 nm।
এরপর, আমরা একটি অনুমান পরীক্ষা করেছিলাম যে ER ঝিল্লিতে উপস্থিত দীর্ঘ অ্যাসিল চেইন সিরামাইড (C26) Gas1 এর নির্দিষ্ট ক্লাস্টারিং এবং বাছাইকে নির্বাচনী ERES-এ চালিত করে। এই লক্ষ্যে, আমরা একটি পরিবর্তিত ইস্ট স্ট্রেন GhLag1 ব্যবহার করেছি, যেখানে দুটি অন্তঃসত্ত্বা সিরামাইড সংশ্লেষণ Lag1 এবং Lac1 কে GhLag1 (তুলার Lag1 হোমোলজ) দ্বারা প্রতিস্থাপিত করা হয়েছিল, যার ফলে একটি ইস্ট স্ট্রেন তৈরি হয়েছিল যার কোষ ঝিল্লি সিরামাইড স্ট্রেন বন্য ধরণের চেয়ে ছোট ছিল (চিত্র 3A) (28)। ভর স্পেকট্রোমেট্রি (MS) বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে বন্য ধরণের স্ট্রেনে, মোট সিরামাইডের 95% খুব দীর্ঘ (C26) চেইন সিরামাইড, যেখানে GhLag1-এ, 85% সিরামাইড খুব দীর্ঘ (C18 এবং C16)। ), সিরামাইডের মাত্র 2% খুব দীর্ঘ (C26) চেইন সিরামাইড। যদিও এখন পর্যন্ত GhLag1 ঝিল্লিতে C18 এবং C16 সিরামাইড সনাক্ত করা প্রধান সিরামাইড, MS বিশ্লেষণও নিশ্চিত করেছে যে GhLag1 স্ট্রেনে প্রকাশিত Gas1-GFP-এর GPI অ্যাঙ্করে C26 সিরামাইড রয়েছে, যা বন্য-প্রকারের লিপিডের সাথে তুলনীয়। গুণমান একই (চিত্র 3A) (26)। অতএব, এর অর্থ হল সিরামাইড পুনর্নির্মাণ এনজাইম Cwh43 C26 সিরামাইডের জন্য অত্যন্ত নির্বাচনী, যেমন চিত্র 26-তে দেখানো হয়েছে, এটি GhLag1 স্ট্রেনে অল্প পরিমাণে C26 সিরামাইড থেকে GPI অ্যাঙ্করকে অগ্রাধিকারমূলকভাবে অন্তর্ভুক্ত করে। S2 (29)। তবুও, GhLag1-এর কোষ ঝিল্লিতে মূলত শুধুমাত্র C18-C16 সিরামাইড থাকে, যখন Gas1-GFP-তে এখনও C26 সিরামাইড থাকে। এই সত্যটি এই স্ট্রেনটিকে ER-তে ঝিল্লি সিরামাইডের অ্যাসিল চেইন দৈর্ঘ্যের সমস্যা সমাধানের জন্য একটি আদর্শ হাতিয়ার করে তোলে। শ্রেণী এবং বাছাইয়ের কাল্পনিক ভূমিকা। তারপর, আমরা প্রথমে প্রচলিত ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির মাধ্যমে sec31-1 এর তাপমাত্রা-সংবেদনশীল মিউট্যান্ট অ্যালিল ব্যবহার করে GhLag1-এ C26 Gas1-GFP-এর ক্লাস্টারে জমা হওয়ার ক্ষমতা অধ্যয়ন করি, যেখানে শুধুমাত্র দীর্ঘ (C18-C16) শৃঙ্খল ER ঝিল্লি Ceramide-এ বিদ্যমান (চিত্র 3)। আমরা লক্ষ্য করেছি যে sec31-1-এ, বেশিরভাগ Gas1-GFP ক্লাস্টারে ঘনীভূত ছিল, যেখানে sec31-1 GhLag1-এ দীর্ঘ (C18-C16) দীর্ঘ সিরামাইড ER ঝিল্লি সহ Gas1-GFP মূলত সমগ্র ER ঝিল্লিতে ক্লাস্টার এবং বিতরণ করা হয়নি। সুনির্দিষ্টভাবে বলতে গেলে, যেহেতু C26 সিরামাইড-ভিত্তিক ক্লাস্টারিং নির্দিষ্ট ERES (চিত্র 1) এর সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত, তাই আমরা পরবর্তীতে তদন্ত করেছি যে এই প্রক্রিয়াটি ER রপ্তানি প্রোটিন প্রক্রিয়ার কার্যকারিতাও জড়িত কিনা। GPI-AP ER রপ্তানির জন্য একটি বিশেষ COPII সিস্টেম ব্যবহার করে, যা GPI অ্যাঙ্করের গ্লাইকান অংশের Ted1-এর কাঠামোগত পুনর্নির্মাণ দ্বারা সক্রিয়ভাবে নিয়ন্ত্রিত হয় (30, 31)। রিকম্বিন্যান্ট GPI-গ্লাইক্যান তারপর ট্রান্সমেমব্রেন কার্গো রিসেপ্টর p24 কমপ্লেক্স দ্বারা স্বীকৃত হয়, যা পরবর্তীতে Lst1 কে বেছে বেছে নিয়োগ করে, যা প্রধান COPII কার্গো বাইন্ডিং সাবইউনিট Sec24 এর একটি নির্দিষ্ট আইসোফর্ম, যা GPI-AP-সমৃদ্ধ COPII ভেসিকেল তৈরি করে (31-33)। অতএব, আমরা একটি ডাবল মিউট্যান্ট তৈরি করেছি যা এই একক প্রোটিন (p24 জটিল উপাদান Emp24, GPI-গ্লাইক্যান পুনর্নির্মাণ এনজাইম Ted1 এবং নির্দিষ্ট COPII সাবইউনিট Lst1) কে sec31-1 মিউট্যান্ট স্ট্রেনের সাথে মুছে ফেলার সাথে একত্রিত করে এবং তাদের অধ্যয়ন করেছি যে Gas1-ক্লাস্টার GFP গঠন করা সম্ভব কিনা (চিত্র 3)। আমরা লক্ষ্য করেছি যে sec31-1emp24Δ এবং sec31-1ted1Δ তে, Gas1-GFP মূলত ক্লাস্টারবিহীন এবং ER ঝিল্লি জুড়ে বিতরণ করা হয়, যেমনটি পূর্বে sec31-1 GhLag1 তে দেখা গেছে, যখন sec31-1lst1Δ তে, Gas1-GFP sec31-1 এর মতো। এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে ER ঝিল্লিতে C26 সিরামাইডের উপস্থিতি ছাড়াও, Gas1-GFP-এর ক্লাস্টারিংকে p24 কমপ্লেক্সের সাথে আবদ্ধ হতে হবে এবং এর জন্য নির্দিষ্ট Lst1 নিয়োগের প্রয়োজন হবে না। তারপর, আমরা ER ঝিল্লিতে সিরামাইডের চেইন দৈর্ঘ্য Gas1-GFP-এর p24-এর সাথে বাঁধন নিয়ন্ত্রণ করতে পারে এমন সম্ভাবনাটি অনুসন্ধান করেছি। যাইহোক, আমরা দেখতে পেয়েছি যে ঝিল্লিতে C18-C16 সিরামাইডের উপস্থিতি p24 কমপ্লেক্স (চিত্র S3 এবং S4, A এবং B) দ্বারা পুনর্গঠিত GPI-গ্লাইক্যানগুলিকে বা GPI-AP-এর সাথে আবদ্ধ হওয়া এবং GPI-AP রপ্তানি করার ক্ষমতাকে প্রভাবিত করে না। COPII সাবটাইপ Lst1 (চিত্র S4C) নিয়োগ করুন। অতএব, C26 সিরামাইড-নির্ভর ক্লাস্টারিংয়ের জন্য বিভিন্ন ER রপ্তানি প্রোটিন প্রক্রিয়ার সাথে প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া প্রয়োজন হয় না, তবে লিপিড দৈর্ঘ্য দ্বারা চালিত একটি বিকল্প বাছাই প্রক্রিয়া সমর্থন করে। তারপর, আমরা বিশ্লেষণ করেছি যে ER ঝিল্লিতে সিরামাইড অ্যাসিল চেইন দৈর্ঘ্য Gas1-GFP-এর নির্বাচনী ERES হিসাবে কার্যকর শ্রেণীবিভাগের জন্য গুরুত্বপূর্ণ কিনা। যেহেতু শর্ট-চেইন সিরামাইড সহ GhLag1 স্ট্রেনের Gas1 ER ত্যাগ করে প্লাজমা ঝিল্লিতে প্রবেশ করে (চিত্র S5), আমরা বিশ্বাস করি যে যদি সিরামাইড অ্যাসিল শৃঙ্খলের দৈর্ঘ্য দ্বারা বাছাই করা হয়, তাহলে GhLag1 স্ট্রেনের Gas1 পুনঃনির্দেশিত এবং অতিক্রম করা যেতে পারে। একই ঝিল্লি সহ ERES পণ্য।
(A) GhLag1 এর কোষ পর্দায় মূলত ছোট C18-C16 সিরামাইড থাকে, যেখানে Gas1-GFP এর GPI অ্যাঙ্করে এখনও বন্য-প্রকার কোষের মতো একই C26 IPC থাকে। উপরে: ভর স্পেকট্রোমেট্রি (MS) দ্বারা বন্য-প্রকার (Wt) এবং GhLag1p স্ট্রেনের কোষ পর্দায় সিরামাইডের অ্যাসিল চেইন দৈর্ঘ্য বিশ্লেষণ। তথ্যটি মোট সিরামাইডের শতাংশ উপস্থাপন করে। তিনটি স্বাধীন পরীক্ষার গড়। ত্রুটি বার = SD। দুই-লেজযুক্ত আনপেয়ারড টি পরীক্ষা। **** P ＜0.0001। নীচের প্যানেল: বন্য-প্রকার এবং GhLag1p স্ট্রেনে প্রকাশিত Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI অ্যাঙ্করে উপস্থিত IPC এর অ্যাসিল চেইন দৈর্ঘ্যের MS বিশ্লেষণ। তথ্যটি মোট IPC সংকেতের শতাংশ উপস্থাপন করে। পাঁচটি স্বাধীন পরীক্ষার গড়। ত্রুটি বার = SD। দুই-লেজযুক্ত আনপেয়ারড টি পরীক্ষা। ns, গুরুত্বপূর্ণ নয়। P = 0.9134। (B) গ্যালাকটোজ-প্ররোচিত Gas1-GFP প্রকাশকারী sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ এবং sec31-1lst1Δ কোষের ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফগুলি 30 মিনিটের জন্য 37°C তাপমাত্রায় ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল এবং 24°C এর পরে রুটিন ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপিতে স্থানান্তরিত হয়েছিল। সাদা তীর: ER Gas1-GFP ক্লাস্টার। খোলা তীর: আনক্লাস্টারড গ্যাস1-GFP সম্পূর্ণ ER ঝিল্লিতে বিতরণ করা হয়েছে, যা ER বৈশিষ্ট্যযুক্ত নিউক্লিয়ার রিং স্টেইনিং দেখায়। স্কেল বার, 5μm। (C) (B) বর্ণিত ফটোমাইক্রোগ্রাফের পরিমাণ নির্ধারণ। Punctate Gas1-GFP কাঠামো সহ কোষের গড় শতাংশ। তিনটি স্বাধীন পরীক্ষায়, n≥300 কোষ। ত্রুটি বার = SD। দুই-লেজবিহীন t পরীক্ষা। **** P ＜0.0001।
এই সমস্যাটি সরাসরি সমাধানের জন্য, আমরা sec31-1 তাপমাত্রা-সংবেদনশীল মিউট্যান্ট অ্যালিল (চিত্র 4 এবং মুভি S4) ব্যবহার করে GhLag1-এ Gas1-GFP এবং Mid2-iRFP-এর SCLIM ভিজ্যুয়ালাইজেশন করেছি। ER কে 37°C তাপমাত্রায় ধরে রাখার পর এবং পরবর্তীতে 24°C তাপমাত্রায় ছেড়ে দেওয়ার পর, প্রচলিত মাইক্রোস্কোপ দ্বারা পর্যবেক্ষণ করা হয়েছে (চিত্র 4, A এবং B) অনুসারে, নতুন সংশ্লেষিত Gas1-GFP-এর বেশিরভাগই ক্লাস্টার করা হয়নি এবং ER ঝিল্লি জুড়ে বিতরণ করা হয়নি। এছাড়াও, ERES-এর একটি বৃহৎ শতাংশ (67%) এর মধ্যে দুটি ধরণের কার্গো রয়েছে যা এতে সহ-অবস্থিত (চিত্র 4D)। চিত্র 4C-এর প্যানেল 1 এবং 2 Gas1-GFP এবং Mid2-GFP-এর ওভারল্যাপিং সহ ERES-এর দুটি সাধারণ উদাহরণ দেখায়। এছাড়াও, উভয় পণ্য একই ERES-এ নিয়োগ করা হয়েছিল (চিত্র 4E, প্যানেল 3 এবং মুভি S4)। অতএব, আমাদের ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে ER ঝিল্লিতে সিরামাইড অ্যাসিল চেইনের দৈর্ঘ্য ER প্রোটিন সমষ্টি এবং শ্রেণীবিভাগের একটি গুরুত্বপূর্ণ নির্ধারক।
Sec31-1 GhLag1 কোষগুলি গ্যালাকটোজ-প্ররোচিত নিঃসরণ প্রকাশ করে, Gas1-GFP (GPI-AP, সবুজ) এবং Mid2-iRFP (TMP, নীল) এবং গঠনমূলক ERES-লেবেলযুক্ত Sec13-mCherry (ERES, ম্যাজেন্টা) 37°C তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করে। 30 মিনিট ধরে চালিয়ে যান, নিঃসরণ নির্গত করার জন্য 24°C তাপমাত্রায় নামিয়ে দিন এবং 20 মিনিট পরে SCLIM দিয়ে ছবি তুলুন। (A থেকে C) কার্গো এবং ERES দ্বারা চিহ্নিত 10 z-সেকশনের প্রতিনিধি 2D প্রক্ষেপণ চিত্র (A; স্কেল বার, 1μm) বা 3D কোষ গোলার্ধের চিত্র (B এবং C; স্কেল ইউনিট, 0.45μm)। (B) এর নীচের প্যানেল এবং (C) এর প্যানেলে প্রক্রিয়াকৃত চিত্রগুলি প্রদর্শন করা হয় যাতে শুধুমাত্র ERES (ম্যাজেন্টা) [Gas1-GFP (ধূসর) এবং Mid2-iRFP (হালকা নীল)] তে উপস্থিত পণ্যগুলি প্রদর্শিত হয়। (C) সাদা ভরা তীর: ERES, পণ্য ওভারল্যাপ। খোলা তীর: ERES-এ শুধুমাত্র একটি আইটেম রয়েছে। নীচের প্যানেল: নির্বাচিত ERES-এ (C) চিহ্নিত ওভারল্যাপিং পণ্য (1 এবং 2) রয়েছে। স্কেল বার, 100 nm। (D) (C) তে বর্ণিত ফটোমাইক্রোগ্রাফের পরিমাণ নির্ধারণ। sec31-1 এবং sec31-1 GhLag1 ইউনিটে, শুধুমাত্র একটি কার্গো (Gas1-GFP বা Mid2-iRFP) অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছে, এবং বিচ্ছিন্ন কার্গো এবং ওভারল্যাপিং কার্গোর জন্য ERES-এর গড় শতাংশ। তিনটি স্বাধীন পরীক্ষায়, 54টি কোষে n = 432 (sec31-1) এবং 47টি কোষে n = 430 (sec31-1 GhLag1)। ত্রুটি বার = SD। দুই-লেজবিহীন t পরীক্ষা। *** P = 0.0002 (sec31-1) এবং ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1)। (E) (C) চিহ্নিত ওভারল্যাপিং কার্গো (3) সহ নির্বাচিত ERES-এর 3D চিত্র। Gas1-GFP (সবুজ) এবং Mid2-iRFP (নীল) একই দিক থেকে ERES (ম্যাজেন্টা) এর দিকে এগিয়ে যায় এবং একই ERES সীমাবদ্ধ এলাকায় থাকে। স্কেল বার, 100 nm।
এই গবেষণাটি প্রত্যক্ষভাবে প্রমাণ করে যে লিপিড-ভিত্তিক প্রোটিন কার্গোগুলিকে সিক্রেটরি পাথওয়েতে নির্বাচনী রপ্তানি স্থানে শ্রেণীবদ্ধ করা হয় এবং শ্রেণীবিভাগ নির্বাচনীতার জন্য অ্যাসিল চেইন দৈর্ঘ্যের গুরুত্ব প্রকাশ করে। SCLIM নামক একটি শক্তিশালী এবং অত্যাধুনিক মাইক্রোস্কোপি কৌশল ব্যবহার করে, আমরা ইস্টে নতুন সংশ্লেষিত Gas1-GFP (খুব দীর্ঘ অ্যাসিল চেইন (C26) সিরামাইড লিপিড অংশ সহ একটি প্রধান প্লাজমা ঝিল্লি GPI-AP) প্রদর্শন করেছি। বিচ্ছিন্ন ER-তে ক্লাস্টার করা অঞ্চলগুলি নির্দিষ্ট ERES-এর সাথে যুক্ত, যখন ট্রান্সমেমব্রেন নিঃসৃত প্রোটিনগুলি ER ঝিল্লি জুড়ে বিতরণ করা হয় (চিত্র 1)। এছাড়াও, এই দুই ধরণের পণ্য নির্বাচনীভাবে বিভিন্ন ERES-এ প্রবেশ করে (চিত্র 2)। ঝিল্লিতে সেলুলার সিরামাইডের অ্যাসিল চেইন দৈর্ঘ্য C26 থেকে C18-C16-এ হ্রাস করা হয়, Gas1-GFP ক্লাস্টারটি বিচ্ছিন্ন ER অঞ্চলে ব্যাহত হয় এবং Gas1-GFP একই ERES (চিত্র 3 এবং চিত্র 3) এর মাধ্যমে ট্রান্সমেমব্রেন প্রোটিনের সাথে ER ছেড়ে যাওয়ার জন্য পুনরায় রুট করা হয়। 4)।
যদিও GPI-AP ER থেকে বেরিয়ে আসার জন্য একটি বিশেষ প্রোটিন প্রক্রিয়া ব্যবহার করে, আমরা দেখেছি যে C26 সিরামাইড-নির্ভর বিচ্ছেদ ডিফারেনশিয়াল প্রোটিন মিথস্ক্রিয়ার উপর নির্ভর করে না যা ERES বিশেষীকরণের দিকে পরিচালিত করতে পারে (চিত্র S4 এবং S5)। পরিবর্তে, আমাদের অনুসন্ধানগুলি লিপিড-ভিত্তিক প্রোটিন ক্লাস্টারিং এবং পরবর্তীকালে অন্যান্য কার্গো বাদ দেওয়ার দ্বারা চালিত একটি বিকল্প শ্রেণিবিন্যাস প্রক্রিয়া সমর্থন করে। আমাদের পর্যবেক্ষণগুলি ইঙ্গিত করে যে একটি নির্দিষ্ট ERES-এর সাথে যুক্ত Gas1-GFP অঞ্চল বা ক্লাস্টারে ট্রান্সমেমব্রেন নিঃসৃত প্রোটিন Mid2-iRFP এর অভাব রয়েছে, যা ইঙ্গিত করে যে C26 সিরামাইড-নির্ভর GPI-AP ক্লাস্টার প্রাসঙ্গিক ERES-এ তাদের প্রবেশকে সহজতর করবে এবং একই সাথে, ট্রান্সমেমব্রেন বাদ দেবে। স্রাবগুলি এই নির্দিষ্ট ERES-এ প্রবেশ করে (চিত্র 1 এবং 2)। বিপরীতে, ER ঝিল্লিতে C18-C16 সিরামাইডের উপস্থিতি GPI-AP-কে অঞ্চল বা ক্লাস্টার তৈরি করতে বাধ্য করে না, তাই তারা ট্রান্সমেমব্রেন নিঃসৃত প্রোটিনগুলিকে একই ERES-এ বাদ দেয় না বা প্রতিস্থাপন করে না (চিত্র 3 এবং 4)। অতএব, আমরা প্রস্তাব করছি যে C26 সিরামাইড নির্দিষ্ট ERES-এর সাথে সংযুক্ত প্রোটিনের ক্লাস্টারিংকে সহজতর করে পৃথকীকরণ এবং শ্রেণীবিভাগ চালায়।
একটি নির্দিষ্ট ER অঞ্চলে C26 সিরামাইড-নির্ভর ক্লাস্টারিং কীভাবে অর্জন করা যায়? ঝিল্লি সিরামাইডের পার্শ্বীয়ভাবে পৃথক হওয়ার প্রবণতা GPI-AP এবং C26 সিরামাইডকে ER ঝিল্লির আরও অনিয়মিত লিপিড পরিবেশে ছোট এবং তাৎক্ষণিকভাবে ক্রমযুক্ত লিপিড তৈরি করতে পারে যেখানে ছোট এবং অসম্পৃক্ত গ্লিসারোলিপিড থাকে। গুণমান ক্লাস্টার (17, 18)। p24 কমপ্লেক্সের সাথে আবদ্ধ হওয়ার পরে এই ছোট অস্থায়ী ক্লাস্টারগুলিকে আরও বৃহত্তর, আরও স্থিতিশীল ক্লাস্টারে মিশ্রিত করা যেতে পারে (34)। এর সাথে সামঞ্জস্য রেখে, আমরা দেখিয়েছি যে C26 Gas1-GFP কে বৃহত্তর দৃশ্যমান ক্লাস্টার তৈরি করতে p24 কমপ্লেক্সের সাথে যোগাযোগ করতে হবে (চিত্র 3)। p24 কমপ্লেক্স হল একটি হেটেরোজাইগাস অলিগোমার যা ইস্টে (35) চারটি ভিন্ন p24 ট্রান্সমেমব্রেন প্রোটিন দ্বারা গঠিত, যা মাল্টিভ্যালেন্ট বাইন্ডিং প্রদান করে, যা ছোট GPI-AP ক্লাস্টারগুলির ক্রস-লিঙ্কিং করতে পারে, যার ফলে বৃহত্তর স্থিতিশীল ক্লাস্টার তৈরি হতে পারে (34)। স্তন্যপায়ী পোলারাইজড এপিথেলিয়াল কোষে তাদের গোলগি পরিবহনের সময় দেখানো হয়েছে যে GPI-AP-এর প্রোটিন ইক্টোডোমেনের মধ্যে মিথস্ক্রিয়াও তাদের একত্রিতকরণে অবদান রাখতে পারে (36)। তবে, যখন C18-C16 সিরামাইড ER ঝিল্লিতে উপস্থিত থাকে, যখন p24 জটিল Gas1-GFP-এর সাথে আবদ্ধ হয়, তখন বৃহৎ পৃথক ক্লাস্টার তৈরি হবে না। অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়াটি দীর্ঘ অ্যাসাইল চেইন সিরামাইডের নির্দিষ্ট ভৌত এবং রাসায়নিক বৈশিষ্ট্যের উপর নির্ভর করতে পারে। কৃত্রিম ঝিল্লির জৈব-ভৌত গবেষণা দেখায় যে যদিও দীর্ঘ (C24) এবং সংক্ষিপ্ত (C18-C16) অ্যাসাইল চেইন সিরামাইড উভয়ই ফেজ বিচ্ছেদ ঘটাতে পারে, শুধুমাত্র দীর্ঘ অ্যাসাইল চেইন সিরামাইড (C24) ফিল্মটিকে পুনরায় আকার দেওয়ার জন্য উচ্চ বক্রতা এবং ফিল্ম বাঁককে উৎসাহিত করতে পারে। পারস্পরিক রেফারেন্সের মাধ্যমে (17, 37, 38)। এটি দেখানো হয়েছে যে TMED2 এর ট্রান্সমেমব্রেন হেলিক্স, Emp24 এর মানব সমরূপ, সাইটোপ্লাজমিক লোবিউলে C18 সিরামাইড-ভিত্তিক স্ফিংগোমাইলিনের সাথে নির্বাচনীভাবে মিথস্ক্রিয়া করে (39)। আণবিক গতিবিদ্যা (MD) সিমুলেশন ব্যবহার করে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে C18 এবং C26 উভয় সিরামাইডই Emp24 ট্রান্সমেমব্রেন হেলিক্সের সাইটোপ্লাজমিক লোবিউলের চারপাশে জমা হয় এবং তাদের একই রকম পছন্দ রয়েছে (চিত্র S6)। এটি লক্ষণীয় যে এটি ইঙ্গিত দেয় যে Emp24 এর ট্রান্সমেমব্রেন হেলিক্স ঝিল্লিতে লিপিডের অসমমিত বন্টন ঘটাতে পারে। এটি স্তন্যপায়ী কোষের উপর ভিত্তি করে একটি সাম্প্রতিক ফলাফল। অনুরূপ MD সিমুলেশনগুলি ইথার লিপিডের উপস্থিতিও দেখায় (40)। অতএব, আমরা অনুমান করি যে ER26 এর দুটি লোবিউলে C26 সিরামাইড স্থানীয়ভাবে সমৃদ্ধ। যখন লুমিনাল লোবিউলে থাকা GPI-AP সরাসরি মাল্টিভ্যালেন্ট p24 এর সাথে আবদ্ধ হয় এবং সাইটোপ্লাজমিক লোবিউলে p24 এর আশেপাশে C26 সিরামাইড জমা হয়, তখন এটি আঙ্গুলের মাধ্যমে প্রোটিন একত্রিতকরণ এবং ঝিল্লির বক্রতা তৈরি করতে সাহায্য করে (41), যার ফলে GPI-AP ERES সংলগ্ন বিচ্ছিন্ন অঞ্চলে বিভক্ত হয়, যা ER ঝিল্লির অত্যন্ত বাঁকা অঞ্চলগুলিকেও সমর্থন করে (42)। পূর্ববর্তী প্রতিবেদনগুলি প্রস্তাবিত প্রক্রিয়াটিকে সমর্থন করে (43, 44)। প্লাজমা ঝিল্লিতে সিরামাইড-ভিত্তিক গ্লাইকোসফিংগোলিপিড (GSL) এর সাথে অলিগোলেক্টিন, প্যাথোজেন বা অ্যান্টিবডিগুলির মাল্টিভ্যালেন্ট বাঁধাই বৃহৎ GSL একত্রিতকরণকে ট্রিগার করে, ফেজ বিচ্ছেদ বৃদ্ধি করে এবং ঝিল্লির বিকৃতি এবং অভ্যন্তরীণকরণ ঘটায় (44)। ইওয়াবুচি ইত্যাদি (43) দেখা গেছে যে দীর্ঘ (C24) কিন্তু ছোট নয় (C16) অ্যাসিল শৃঙ্খলের উপস্থিতিতে, GSL ল্যাকটোসিলসেরামাইডের সাথে আবদ্ধ মাল্টিভ্যালেন্ট লিগ্যান্ড বৃহৎ ক্লাস্টার এবং মেমব্রেন ইনভ্যাজিনেশন তৈরি করে এবং লিফলেটগুলিতে সাইটোপ্লাজম লিন-মধ্যস্থতা সংকেত ট্রান্সডাকশন সংযুক্ত নিউট্রোফিলগুলিতে অ্যাসিল শৃঙ্খল দ্বারা আন্তঃডিজিটেটেড হয়।
স্তন্যপায়ী প্রাণীর পোলারাইজড এপিথেলিয়াল কোষগুলিতে, অ্যান্টি-গলজি নেটওয়ার্ক (TGN) এর ঘনত্ব অ্যাপিকাল প্লাজমা মেমব্রেনের স্তরে GPI-AP এর বিচ্ছেদ এবং বাছাই নিয়ন্ত্রণ করে (10, 45)। এই সমষ্টি GPI-AP অলিগোমারাইজেশন (36) দ্বারা চালিত হয়, তবে এটি ইস্টে আমরা যে সিরামাইড চেইনের দৈর্ঘ্য পাই তার উপরও নির্ভর করতে পারে। যদিও স্তন্যপায়ী প্রাণীর GPI-AP-তে একটি ইথার লিপিড-ভিত্তিক অ্যাঙ্কর রয়েছে এবং এর রাসায়নিক গঠন খুব দীর্ঘ অ্যাসিল চেইন সিরামাইড থেকে খুব আলাদা, সাম্প্রতিক একটি গবেষণায় দেখা গেছে যে উভয় লিপিডেরই বিবর্তনীয়ভাবে একই রকম ভৌত এবং রাসায়নিক বৈশিষ্ট্য এবং কার্যকারিতা রয়েছে (40)। অতএব, স্তন্যপায়ী কোষগুলিতে ইথার লিপিড অংশটি ইস্টে C26 সিরামাইডের মতো হতে পারে এবং এর ভূমিকা হল ঝিল্লিতে দীর্ঘ-চেইন সিরামাইডের সাথে সংযুক্ত হয়ে GPI-AP একত্রীকরণ এবং বাছাইকে উৎসাহিত করা। যদিও এই সম্ভাবনাটি এখনও সরাসরি পরীক্ষা করা প্রয়োজন, পূর্ববর্তী গবেষণাগুলি সমর্থন করে যে গোলগি বডিতে লম্বা অ্যাসাইল চেইন সিরামাইডের পরিবহন সাইটোপ্লাজমিক ট্রান্সফার প্রোটিন দ্বারা পরিচালিত হয় না, বরং ইস্টের মতো জিপিআই অ্যাঙ্করের সংশ্লেষণের উপর নির্ভর করে। অতএব, বিবর্তনীয় রক্ষণশীল প্রক্রিয়াটি একই পরিবহন ভেসিকেলে খুব লম্বা অ্যাসাইল চেইন সিরামাইড এবং জিপিআই-এপি (13, 16, 20, 46, 47) নির্বাচনীভাবে সহ-পরিবহন করতে সক্ষম বলে মনে হয়।
ইস্ট এবং স্তন্যপায়ী প্রাণীর পোলারাইজড এপিথেলিয়াল কোষ সিস্টেমে, GPI-AP একত্রিতকরণ এবং অন্যান্য প্লাজমা ঝিল্লি প্রোটিন থেকে পৃথকীকরণ সবই কোষ পৃষ্ঠে পৌঁছানোর আগেই ঘটে। প্যালাডিনো এবং অন্যান্যরা (48) দেখেছেন যে স্তন্যপায়ী প্রাণীর পোলারাইজড এপিথেলিয়াল কোষের TGN-তে, GPI-AP ক্লাস্টারিং কেবল অ্যাপিকাল প্লাজমা ঝিল্লিতে GPI-AP-এর নির্বাচনী শ্রেণীবিভাগের জন্যই প্রয়োজনীয় নয়, বরং GPI-AP-এর ক্লাস্টারিং সংগঠন এবং এর জৈবিক কার্যকলাপকেও নিয়ন্ত্রণ করে। কোষ পৃষ্ঠ। ইস্টে, এই গবেষণায় দেখা গেছে যে ER-তে C26 সিরামাইড-নির্ভর GPI-AP ক্লাস্টার প্লাজমা ঝিল্লিতে GPI-AP-এর ক্লাস্টার সংগঠন এবং কার্যকরী কার্যকলাপ নিয়ন্ত্রণ করতে পারে (24, 49)। এই মডেলের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, GhLag1 কোষগুলি GPI ইনহিবিটর বা ওষুধের প্রতি অ্যালার্জিযুক্ত যা কোষ প্রাচীরের অখণ্ডতাকে প্রভাবিত করে (28), এবং ইস্ট কোষের মিলনে প্রক্ষিপ্ত টিপ সিরামাইডের কার্যকরী Gas1-GFP ক্লাস্টার (49) এর প্রয়োজনীয়তা HLag1 কোষের সম্ভাব্য শারীরবৃত্তীয় পরিণতি নির্দেশ করে। GPI-AP ত্রুটি। তবে, লিপিড দৈর্ঘ্যের উপর ভিত্তি করে বাছাই পদ্ধতির মাধ্যমে ER থেকে কোষ পৃষ্ঠের কার্যকরী সংগঠন প্রোগ্রাম করা হয়েছে কিনা তা আরও পরীক্ষা করা আমাদের ভবিষ্যতের গবেষণার বিষয় হবে।
এই কাজে ব্যবহৃত Saccharomyces cerevisiae স্ট্রেনগুলি সারণি S1-এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। লাইভ সেল ইমেজিংয়ের জন্য SCLIM-এর MMY1583 এবং MMY1635 স্ট্রেনগুলি W303-এর পটভূমিতে তৈরি করা হয়েছিল। ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন ট্যাগ সহ Sec13-mCherry প্রকাশকারী এই স্ট্রেনগুলি একটি পলিমারেজ চেইন রিঅ্যাকশন (PCR)-ভিত্তিক পদ্ধতি ব্যবহার করে pFA6a প্লাজমিডকে টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল (23)। GAL1 প্রোমোটারের নিয়ন্ত্রণে ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন দিয়ে লেবেলযুক্ত Mid2-iRFP প্রকাশকারী স্ট্রেনটি নিম্নরূপ তৈরি করা হয়েছিল। pKTiRFP-KAN ভেক্টর (E. O'Shea-এর উপহার, অ্যাডজিন প্লাজমিড নম্বর 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; গবেষণা সংস্থান শনাক্তকারী (RRID): Addgene_64687) থেকে iRFP-KanMx সিকোয়েন্সের PCR পরিবর্ধন এবং এন্ডোজেনাস Mid2-এর C-টার্মিনাসে প্রবেশ করানো হয়েছে। Mid2-iRFP জিনোম সিকোয়েন্সটি GAL1 প্রোমোটারে প্রশস্ত এবং ক্লোন করার পর, এটি ইন্টিগ্রেশন প্লাজমিড pRS306 এর Not I-Sac I সাইটে সংহত করা হয়েছিল। ফলস্বরূপ প্লাজমিড pRGS7 কে URA3 লোকাসে সংহত করার জন্য Pst I এর সাথে রৈখিক করা হয়েছিল।
Gas1-GFP ফিউশন জিনটি সেন্ট্রোমিয়ার (CEN) প্লাজমিডে GAL1 প্রোমোটারের নিয়ন্ত্রণে প্রকাশ করা হয়, যা নিম্নরূপ তৈরি করা হয়। PRS416-GAS1-GFP প্লাজমিড (24) (L. Popolo এর উপহার) থেকে PCR দ্বারা Gas1-GFP ক্রমটি প্রশস্ত করা হয়েছিল এবং CEN প্লাজমিড pBEVY-GL LEU2 (C এর উপহার) এর Xma I–Xho I সাইটে ক্লোন করা হয়েছিল। মিলার; অ্যাডজিন প্লাজমিড নম্বর 51225; http://n2t.net/adddene: 51225; RRID: অ্যাডজিন_51225)। ফলস্বরূপ প্লাজমিডের নামকরণ করা হয়েছিল pRGS6। Axl2-GFP ফিউশন জিনটি pBEVY-GL LEU2 ভেক্টরের GAL1 প্রোমোটারের নিয়ন্ত্রণে প্রকাশ করা হয় এবং এর গঠন নিম্নরূপ। Axl2-GFP ক্রমটি pRS304-p2HSE-Axl2-GFP প্লাজমিড (23) থেকে PCR দ্বারা প্রশস্ত করা হয়েছিল এবং pBEVY-GL LEU2 ভেক্টরের Bam HI-Pst I সাইটে ক্লোন করা হয়েছিল। ফলস্বরূপ প্লাজমিডটির নামকরণ করা হয়েছিল pRGS12। এই গবেষণায় ব্যবহৃত অলিগোনিউক্লিওটাইডের ক্রমটি সারণি S2-তে তালিকাভুক্ত করা হয়েছে।
স্ট্রেনটিকে ০.২% অ্যাডেনিন এবং ২% গ্লুকোজ [YP-ডেক্সট্রোজ (YPD)], ২% র‍্যাফিনোজ [YP-র‍্যাফিনোজ] সমৃদ্ধ ইস্ট এক্সট্র্যাক্ট প্রোটিন p (YP) মাধ্যম (১% ইস্ট এক্সট্র্যাক্ট এবং ২% প্রোটিন ept) (YPR)] অথবা ২% গ্যালাকটোজ [YP-গ্যালাকটোজ (YPG)] কার্বন উৎস হিসেবে অথবা সিন্থেটিক ন্যূনতম মাধ্যমে (০.১৫% ইস্ট নাইট্রোজেন বেস এবং ০.৫% অ্যামোনিয়াম সালফেট) পুষ্টির জন্য প্রয়োজনীয় উপযুক্ত অ্যামিনো অ্যাসিড এবং বেসের পরিপূরক হিসেবে ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং কার্বন উৎস হিসেবে ২% গ্লুকোজ (সিন্থেটিক গ্লুকোজ ন্যূনতম মাঝারি) বা ২% গ্যালাকটোজ (সিন্থেটিক গ্যালাকটোজ ন্যূনতম মাঝারি) ধারণ করা হয়েছিল।
রিয়েল-টাইম ইমেজিংয়ের জন্য, GAL1 প্রোমোটারের অধীনে গঠন প্রকাশকারী তাপমাত্রা-সংবেদনশীল sec31-1 মিউট্যান্ট কোষগুলিকে YPR মাধ্যমের মধ্যে রাতারাতি 24°C থেকে মিড-লগ পর্যায়ে বৃদ্ধি করা হয়েছিল। YPG-তে 1 ঘন্টার জন্য 24°C তাপমাত্রায় অন্তর্ভুক্ত করার পরে, কোষগুলিকে 30 মিনিটের জন্য SG-তে 37°C তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করা হয়েছিল, এবং তারপর 24°C তাপমাত্রায় স্থানান্তরিত করা হয়েছিল যাতে সেক্রেশন ব্লক থেকে মুক্তি পায়। একটি কাচের স্লাইডে কোষগুলিকে স্থির করার জন্য Concanavalin A ব্যবহার করা হয়েছিল এবং SCLIM দ্বারা চিত্রিত করা হয়েছিল। SCLIM হল Olympus IX-71 ইনভার্টেড ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ এবং UPlanSApo 100×1.4 নিউমেরিক্যাল অ্যাপারচার অয়েল লেন্স (অলিম্পাস), হাই-স্পিড এবং হাই-সিগন্যাল-টু-নয়েজ রেশিও রোটেটিং ডিস্ক কনফোকাল স্ক্যানার (ইয়োকোগাওয়া ইলেকট্রিক), কাস্টম স্পেকট্রোমিটার এবং কাস্টম কুলিং এর সংমিশ্রণ। সিস্টেমের ইমেজ ইনটেনসিফায়ার (হামামাতসু ফোটোনিক্স) ×266.7 এর চূড়ান্ত ম্যাগনিফিকেশন সহ একটি ম্যাগনিফাইং লেন্স সিস্টেম এবং একটি চার্জ-কাপল্ড ডিভাইস ক্যামেরা প্রদান করতে পারে যা ইলেকট্রনকে গুণ করে (হামামাতসু ফোটোনিক্স) (21)। ইমেজ অর্জন কাস্টম সফ্টওয়্যার (ইয়োকোগাওয়া ইলেকট্রিক) দ্বারা সঞ্চালিত হয়। 3D ছবির জন্য, আমরা অবজেক্টিভ লেন্সটিকে উল্লম্বভাবে কম্পন করার জন্য একটি কাস্টম-তৈরি পাইজোইলেকট্রিক অ্যাকচুয়েটর ব্যবহার করেছি এবং একটি স্ট্যাকে 100 nm দূরে অপটিক্যাল অংশ সংগ্রহ করেছি। Z-স্ট্যাক ইমেজটি 3D ভক্সেল ডেটাতে রূপান্তরিত হয় এবং ঘূর্ণায়মান ডিস্ক কনফোকাল মাইক্রোস্কোপের জন্য ব্যবহৃত তাত্ত্বিক পয়েন্ট স্প্রেড ফাংশনটি ভোলোসিটি সফটওয়্যার (পারকিনএলমার) দ্বারা ডিকনভোলিউশন প্রক্রিয়াকরণের জন্য ব্যবহৃত হয়। সহ-অবস্থান বিশ্লেষণের জন্য স্বয়ংক্রিয়ভাবে থ্রেশহোল্ড তৈরির জন্য ভোলোসিটি সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে, কার্গো সহ ERES পরিমাপ করা হয়েছিল। মেটামর্ফ সফ্টওয়্যার (আণবিক ডিভাইস) ব্যবহার করে লাইন স্ক্যান বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
পরিসংখ্যানগত তাৎপর্য নির্ধারণের জন্য গ্রাফপ্যাড প্রিজম সফ্টওয়্যার ব্যবহার করুন। দ্বি-লেজযুক্ত শিক্ষার্থীর টি-পরীক্ষা এবং সাধারণ একমুখী বৈচিত্র্য বিশ্লেষণ (ANOVA) পরীক্ষার জন্য, গ্রুপগুলির মধ্যে পার্থক্যগুলি P <0.05 (*) এর উপর উল্লেখযোগ্য প্রভাব ফেলে বলে বিবেচিত হয়।
Gas1-GFP-এর ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির জন্য, লগ ফেজ কোষগুলিকে YPD-তে রাতারাতি বৃদ্ধি করা হয়েছিল এবং সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে সংগ্রহ করা হয়েছিল, ফসফেট বাফারযুক্ত স্যালাইন দিয়ে দুবার ধুয়ে কমপক্ষে 15 মিনিটের জন্য বরফের উপর ইনকিউবেট করা হয়েছিল, এবং তারপরে পূর্বে বর্ণিত হিসাবে মাইক্রোস্কোপের নীচে এগিয়ে যাওয়া হয়েছিল চেক (24)। Leica DMi8 মাইক্রোস্কোপ (HCX PL APO 1003/1.40 তেল PH3 CS) একটি অবজেক্টিভ লেন্স, L5 (GFP) ফিল্টার, হামামাতসু ক্যামেরা এবং অ্যাপ্লিকেশন স্যুট X (LAS X) সফ্টওয়্যার দিয়ে সজ্জিত অধিগ্রহণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। ।
নমুনাগুলিকে 65°C তাপমাত্রায় SDS নমুনা বাফার দিয়ে 10 মিনিটের জন্য বিকৃত করা হয়েছিল, এবং তারপর SDS-পলিয়াক্রাইমাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস (PAGE) দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল। ইমিউনোব্লটিং বিশ্লেষণের জন্য, প্রতি লেনে 10 μl নমুনা লোড করা হয়েছিল। প্রাথমিক অ্যান্টিবডি: 1:3000 তরলীকরণে খরগোশের পলিক্লোনাল অ্যান্টি-গ্যাস1, 1:500 তরলীকরণে খরগোশের পলিক্লোনাল অ্যান্টি-এমপি24 এবং 1:3000 তরলীকরণে খরগোশের পলিক্লোনাল অ্যান্টি-জিএফপি (এইচ. রিজম্যানের উপহার) ব্যবহার করুন। মাউস মনোক্লোনাল অ্যান্টি-Pgk1 অ্যান্টিবডি 1:5000 তরলীকরণে ব্যবহার করা হয়েছিল (জে. ডি লা ক্রুজের উপহার)। সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি: হর্সরাডিশ পেরোক্সিডেস (HRP) কনজুগেটেড ছাগলের অ্যান্টি-খরগোশ ইমিউনোগ্লোবুলিন G (IgG) 1:3000 তরলীকরণে ব্যবহার করা হয়েছিল (পিয়ার্স)। HRP-কনজুগেটেড ছাগলের ইঁদুর-বিরোধী IgG 1:3000 (পিয়ার্স) এর তরলীকরণে ব্যবহার করা হয়েছিল। সুপারসিগন্যাল ওয়েস্ট পিকো রিএজেন্ট (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) এর কেমিলুমিনেসেন্স পদ্ধতি দ্বারা রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতার অঞ্চল পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।
(31) তে বর্ণিত হিসাবে, সমৃদ্ধ ER ভগ্নাংশের উপর একটি প্রাকৃতিক ইমিউনপ্রিসিপিটেশন পরীক্ষা করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, 100 অপটিক্যাল ঘনত্বে 600 nm (OD600) এ TNE বাফার [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM ফিনাইলমিথাইলসালফোনিল ফ্লোরাইড এবং প্রোটিজ ইনহিবিটর মিশ্রণ) দিয়ে দুবার খামির কোষগুলি ধুয়ে ফেলুন। এটি কাচের পুঁতি দিয়ে ভেঙে ফেলা হয়েছিল, এবং তারপরে কোষের ধ্বংসাবশেষ এবং কাচের পুঁতিগুলি সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা সরানো হয়েছিল। তারপরে সুপারনেট্যান্টকে 4°C তাপমাত্রায় 15 মিনিটের জন্য 17,000 গ্রাম সেন্ট্রিফিউগ করা হয়েছিল। পেলেটটি TNE তে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং ডিজিটালিস স্যাপোনিন 1% এর চূড়ান্ত ঘনত্বে যোগ করা হয়েছিল। সাসপেনশনটি 4°C তাপমাত্রায় ঘূর্ণন সহ 1 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল, এবং তারপরে অদ্রবণীয় উপাদানগুলি 13,000 গ্রাম 4°C তাপমাত্রায় 60 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা সরানো হয়েছিল। Gas1-GFP ইমিউনোপ্রিসিপিটেশনের জন্য, প্রথমে নমুনাটি খালি অ্যাগারোজ পুঁতি (ChromoTek) দিয়ে 4°C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য প্রি-ইনকিউবেট করুন, এবং তারপর GFP-Trap_A (ChromoTek) দিয়ে 4°C তাপমাত্রায় 3 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করুন। ইমিউনোপ্রিসিপিটেটেড পুঁতিগুলি 0.2% ডিগক্সিজেনিনযুক্ত TNE দিয়ে পাঁচবার ধুয়ে, SDS নমুনা বাফার দিয়ে এলিউট করা, SDS-PAGE-তে আলাদা করা এবং ইমিউনব্লটিং দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
(31) তে বর্ণিত হিসাবে, সমৃদ্ধ ER ভগ্নাংশের উপর ক্রস-লিঙ্কিং নির্ধারণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, সমৃদ্ধ ER ভগ্নাংশটি 0.5 mM dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min) দিয়ে ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল। গ্লাইসিন (50 mM চূড়ান্ত ঘনত্ব, 5 মিনিট, 20°C) যোগ করে ক্রসলিঙ্কিং বিক্রিয়াটি নিভিয়ে ফেলা হয়েছিল।
পূর্বে বর্ণিত (50), ওয়াইল্ড-টাইপ এবং GhLag1 স্ট্রেনের সিরামাইডের MS বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, কোষগুলিকে 30°C তাপমাত্রায় YPD-তে সূচকীয় পর্যায়ে (3 থেকে 4 OD600 ইউনিট/মিলি) বৃদ্ধি করা হয়েছিল এবং 25×107 কোষ সংগ্রহ করা হয়েছিল। ট্রাইক্লোরোএসেটিক অ্যাসিড দিয়ে তাদের বিপাক নিবারণ করা হয়। এক্সট্রাকশন দ্রাবক [ইথানল, জল, ইথার, পাইরিডিন এবং 4.2 N অ্যামোনিয়াম হাইড্রোক্সাইড (15:15:5:1:0.018 v/v)] এবং অভ্যন্তরীণ স্ট্যান্ডার্ড C17 সিরামাইড (860517, অ্যাভান্টি পোলার লিপিড) মানের 1.2 nmol ব্যবহার করুন। নির্যাসের হালকা ক্ষারীয় হাইড্রোলাইসিস করতে মনোমিথাইলামাইন রিএজেন্ট [মিথানল, জল, n-বুটানল এবং মিথাইলামাইন দ্রবণ (4:3:1:5 v/v)] ব্যবহার করুন, এবং তারপর ডিসল্ট করার জন্য জল-স্যাচুরেটেড n-বুটানল ব্যবহার করুন। অবশেষে, নির্যাসটিকে একটি পজিটিভ মোড দ্রাবক [ক্লোরোফর্ম/মিথানল/জল (২:৭:১) + ৫ মিলিমিটার অ্যামোনিয়াম অ্যাসিটেট] এ পুনঃস্থাপন করা হয়েছিল এবং ভর স্পেকট্রোমিটারে ইনজেক্ট করা হয়েছিল। স্ফিংগোলিপিড অণু সনাক্তকরণ এবং পরিমাণ নির্ধারণের জন্য মাল্টি-রিঅ্যাকশন মনিটরিং (MRM) করা হয়েছিল। TSQ ভ্যানটেজ টারশিয়ারি কোয়াড্রপোল ভর স্পেকট্রোমিটার (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) লিপিড বিশ্লেষণের জন্য একটি রোবোটিক ন্যানোফ্লো আয়ন উৎস ন্যানোমেট এইচডি (অ্যাডভিয়ন বায়োসায়েন্সেস, ইথাকা, এনওয়াই) দিয়ে সজ্জিত। প্রতিটি সিরামাইড বিভাগের জন্য সংঘর্ষ শক্তি অপ্টিমাইজ করা হয়েছে। MS ডেটা পজিটিভ মোডে প্রাপ্ত হয়েছিল। প্রতিটি জৈবিক প্রতিলিপির জন্য, লিপিড সংকেত তিনটি স্বাধীন পরিমাপের মধ্যমা।
(31) তে বর্ণিত হিসাবে, Gas1-GFP প্রকাশকারী কোষগুলি (800×107) প্রাকৃতিক ইমিউনোপ্রিসিপিটেশনের শিকার হয়েছিল। পরিশোধিত Gas1-GFP কে SDS-PAGE দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল এবং একটি পলিভিনাইলিডিন ফ্লোরাইড (PVDF) ঝিল্লিতে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল। প্রোটিনটি PVDF কে অ্যামাইড কালো দিয়ে দাগ দিয়ে দৃশ্যমান করা হয়েছিল। Gas1-GFP ব্যান্ডটি PVDF থেকে কেটে মিথানল দিয়ে 5 বার এবং একবার তরল ক্রোমাটোগ্রাফি-MS (LC-MS) গ্রেড জল দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), বাফার এবং 500μl সদ্য দ্রবীভূত 1 M সোডিয়াম নাইট্রাইট মিশ্রণ 37°C তাপমাত্রায় 3 ঘন্টা ধরে মেমব্রেন স্ট্রিপটি ইনকিউব করে, লিপিড ভগ্নাংশটি Gas1-GFP থেকে মুক্তি পায় এবং গ্লুকোসামিন এবং ইনোসিটলের মধ্যে ইনোসিন ফসফেট সিরামাইডের মুক্তি (51)। এরপর, মেমব্রেন স্ট্রিপটি LC-MS গ্রেডের জল দিয়ে চারবার ধুয়ে, ঘরের তাপমাত্রায় শুকিয়ে বিশ্লেষণ না করা পর্যন্ত -80°C তাপমাত্রায় নাইট্রোজেন বায়ুমণ্ডলে সংরক্ষণ করা হয়েছিল। নিয়ন্ত্রণ হিসাবে, প্রতিটি পরীক্ষার জন্য PVDF মেমব্রেনের একটি ফাঁকা নমুনা ব্যবহার করা হয়েছিল। Gas1-GFP থেকে নিষ্কাশিত লিপিডটি MS দ্বারা বর্ণিত (50) অনুসারে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, GPI-লিপিড ধারণকারী PVDF স্ট্রিপগুলিকে 75μl নেতিবাচক ছাঁচ দ্রাবক [ক্লোরোফর্ম/মিথানল (1:2) + 5 mM অ্যামোনিয়াম অ্যাসিটেট] এ পুনঃসাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং স্ফিংগোলিপিড প্রজাতির (TSQ Vantage) ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়নাইজেশন (ESI)-MRM/MS বিশ্লেষণ পাস করা হয়েছিল। এই ক্ষেত্রে, MS ডেটা নেতিবাচক আয়ন মোডে প্রাপ্ত হয়েছিল।
আগেই উল্লেখ করা হয়েছে, GPI অ্যাঙ্করের লিপিড অংশটি [3H]-ইনোসিটল-লেবেলযুক্ত GPI-AP (16) থেকে আলাদা করা হয়েছিল। লিপিডগুলিকে একটি দ্রাবক সিস্টেম (55:45:10 ক্লোরোফর্ম-মিথানল-0.25% KCl) ব্যবহার করে পাতলা-স্তর ক্রোমাটোগ্রাফি দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল এবং FLA-7000 (Fujifilm) ব্যবহার করে ভিজ্যুয়ালাইজ করা হয়েছিল।
Gas1-GFP (600×107) প্রকাশকারী কোষগুলিকে TNE বাফার দিয়ে দুবার ধৌত করা হয়েছিল, এবং কাচের পুঁতি দিয়ে ভেঙে ফেলা হয়েছিল, এবং তারপর কোষের ধ্বংসাবশেষ এবং কাচের পুঁতি অপসারণের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। এরপর সুপারন্যাট্যান্টকে 4°C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য 17,000 গ্রাম তাপমাত্রায় সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। পেলেটটি TNE তে ধুয়ে 37°C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য 0.2% ডিজিটালিস স্যাপোনিন ধারণকারী TNE তে 1 U PI-PLC (ইনভিট্রোজেন) দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। এনজাইম চিকিত্সার পরে, 1 ঘন্টার জন্য 4°C তাপমাত্রায় 17,000 গ্রাম তাপমাত্রায় সেন্ট্রিফিউজেশনের মাধ্যমে ঝিল্লিটি অপসারণ করা হয়েছিল। Gas1-GFP প্রতিরোধ ক্ষমতা বৃদ্ধি করার জন্য, সুপারন্যাট্যান্টকে 4°C তাপমাত্রায় GFP-Trap_A (ChromoTek) দিয়ে রাতারাতি ইনকিউব করা হয়েছিল। SDS-PAGE দ্বারা পৃথক করা পরিশোধিত Gas1-GFP কুমাসি উজ্জ্বল নীল দিয়ে রঙ করা হয়েছিল। গ্যাস১-জিএফপি স্টেইনিং ব্যান্ডটি জলনালীকে ঘিরে থাকা ধূসর থেকে কেটে ফেলা হয়েছিল, এবং তারপর আয়োডোএসিটামাইড দিয়ে অ্যালকাইলেশন এবং ডাইথিওথ্রেইটল দিয়ে হ্রাস করার পরে, ট্রাইপসিন দিয়ে ইন-জেল হজম করা হয়েছিল। জিপিআই-গ্লাইক্যান দিয়ে ট্রিপটিক পেপটাইড এবং পেপটাইড নির্যাস করে শুকিয়ে নিন। শুকনো পেপটাইডটি ২০ μl জলে দ্রবীভূত করা হয়েছিল। LC-তে একটি অংশ (8μl) ইনজেক্ট করুন। নির্দিষ্ট গ্রেডিয়েন্ট অবস্থার অধীনে পেপটাইড পৃথক করার জন্য একটি অক্টাডেসিলসিলেন (ODS) কলাম (ডেভেলোসিল ৩০০ODS-HG-৫; অভ্যন্তরীণ ব্যাস ১৫০ মিমি×১.০ মিমি; নোমুরা কেমিক্যাল, আইচি প্রিফেকচার, জাপান) ব্যবহার করা হয়েছিল। মোবাইল ফেজ হল দ্রাবক A (০.০৮% ফর্মিক অ্যাসিড) এবং দ্রাবক B (৮০% অ্যাসিটোনিট্রিলে ০.১৫% ফর্মিক অ্যাসিড)। একটি Accela HPLC সিস্টেম (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, বোস্টন, ম্যাসাচুসেটস) ব্যবহার করে 55 মিনিটের মধ্যে 50 μl min-1 প্রবাহ হারে 5 মিনিটের জন্য দ্রাবক A দিয়ে কলামটি এলুট করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং তারপরে দ্রাবক B এর ঘনত্ব 40% এ বৃদ্ধি করা হয়েছিল। , মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র)। এলুয়েটটি ক্রমাগত ESI আয়ন উৎসে প্রবেশ করানো হয়েছিল, এবং ট্রিপটিক পেপটাইড এবং GPI-গ্লাইক্যান সহ পেপটাইডগুলি LTQ Orbitrap XL (হাইব্রিড লিনিয়ার আয়ন ট্র্যাপ-অরবিট্রাপ ভর স্পেকট্রোমিটার; থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। MS সেটআপে, কৈশিক উৎসের ভোল্টেজ 4.5 kV তে সেট করা হয়েছিল, এবং স্থানান্তর কৈশিকের তাপমাত্রা 300°C রাখা হয়েছিল। কৈশিক ভোল্টেজ এবং টিউব লেন্স ভোল্টেজ যথাক্রমে 15 V এবং 50 V তে সেট করা হয়েছিল। MS ডেটা ধনাত্মক আয়ন মোডে (60,000 রেজোলিউশন; প্রতি মিলিয়নে 10 অংশের ভর নির্ভুলতা) 300/m/z ভর/চার্জ অনুপাত (m/z) 3000 ভর পরিসরে প্রাপ্ত করা হয়েছিল। MS/MS ডেটা LTQ Orbitrap XL [প্রথম 3টি সংখ্যা যার উপর ডেটা নির্ভর করে, সংঘর্ষ-প্ররোচিত বিয়োজন (CID)] এর আয়ন ট্র্যাপের মাধ্যমে প্রাপ্ত করা হয়েছিল।
GROMACS (52) সফটওয়্যার এবং MARTINI 2 ফোর্স ফিল্ড (53-55) ব্যবহার করে MD সিমুলেশনগুলি সম্পাদিত হয়েছিল। এরপর CHARMM GUI মেমব্রেন বিল্ডার (56, 57) ব্যবহার করে একটি দ্বিস্তর তৈরি করা হয়েছিল যেখানে dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) এবং Cer C18 অথবা DOPC এবং Cer C26 রয়েছে। Cer C26 এর টপোলজি এবং স্থানাঙ্কগুলি DXCE থেকে স্ফিংগোসিন লেজ থেকে অতিরিক্ত পুঁতি অপসারণ করে তৈরি করা হয়েছে। ডাবল স্তরের ভারসাম্য বজায় রাখতে এবং এটি চালানোর জন্য নীচে বর্ণিত প্রক্রিয়াটি ব্যবহার করুন, তারপর Emp24 ধারণকারী একটি সিস্টেম তৈরি করতে সিস্টেমের শেষ স্থানাঙ্কগুলি ব্যবহার করুন। ইস্ট Emp24 এর ট্রান্সমেমব্রেন ডোমেন (অবশিষ্টাংশ 173 থেকে 193) ভিজ্যুয়াল MD (VMD) টুল আণবিক কাঠামো (58) ব্যবহার করে α-হেলিক্স হিসাবে তৈরি করা হয়েছিল। তারপর, ওভারল্যাপিং লিপিডগুলি অপসারণের পরে, প্রোটিনটি মোটা দানাদারভাবে দানাদার করা হয়েছিল এবং CHARMM GUI ব্যবহার করে দ্বিস্তরে ঢোকানো হয়েছিল। চূড়ান্ত সিস্টেমটিতে 1202 DOPC এবং 302 Cer C26 অথবা 1197 DOPC এবং 295 Cer C18 এবং Emp24 রয়েছে। সিস্টেমটিকে 0.150M ঘনত্বে আয়নাইজ করুন। দুটি দ্বিস্তর রচনার জন্য চারটি স্বাধীন প্রতিলিপি তৈরি করা হয়েছিল।
লিপিড বাইলেয়ারটি CHARMM GUI প্রক্রিয়া ব্যবহার করে ভারসাম্যপূর্ণ করা হয়, যার মধ্যে 405,000 ধাপ কমানো এবং তারপর ভারসাম্য বজায় রাখা জড়িত, যেখানে অবস্থানের সীমাবদ্ধতাগুলি ধীরে ধীরে হ্রাস এবং নির্মূল করা হয় এবং সময় ধাপ 0.005 ps থেকে 0.02 ps এ বৃদ্ধি করা হয়। ভারসাম্যের পরে, এটি 0.02 ps এর সময় ধাপ সহ 6 µs উত্পাদন করে। Emp24 সন্নিবেশ করার পরে, সিস্টেমটি কমানো এবং ভারসাম্য বজায় রাখতে একই CHARMM GUI প্রক্রিয়া ব্যবহার করুন, এবং তারপর 8 সেকেন্ডের জন্য উৎপাদন চালান।
সকল সিস্টেমের জন্য, ভারসাম্য প্রক্রিয়ার সময়, চাপ বেরেন্ডসেন ব্যারোস্ট্যাট (59) দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়, এবং উৎপাদন প্রক্রিয়ার সময়, চাপ প্যারিনেলো-রহমান ব্যারোস্ট্যাট (60) দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়। সকল ক্ষেত্রে, গড় চাপ 1 বার এবং একটি আধা-আইসোট্রপিক চাপ সংযোগ প্রকল্প ব্যবহার করা হয়। ভারসাম্য এবং উৎপাদন প্রক্রিয়ায়, প্রোটিন, লিপিড এবং দ্রাবক কণার তাপমাত্রা যথাক্রমে জোড়া দেওয়ার জন্য গতি পুনর্ক্যালিব্রেশন সহ একটি থার্মোস্ট্যাট (61) ব্যবহার করা হয়। পুরো অপারেশন চলাকালীন, লক্ষ্য তাপমাত্রা 310K। 0.005 বাফার সহনশীলতা সহ ভার্লেট স্কিম ব্যবহার করে একটি জোড়া তালিকা তৈরি করে নন-বন্ডিং মিথস্ক্রিয়া গণনা করা হয়। কুলম্ব শব্দটি বিক্রিয়া ক্ষেত্র এবং 1.1 nm এর কাট-অফ দূরত্ব ব্যবহার করে গণনা করা হয়। ভ্যান্ডার ওয়ালস শব্দটি 1.1 nm এর কাট-অফ দূরত্ব সহ একটি কাট-অফ স্কিম ব্যবহার করে এবং ভার্লেট কাট-অফ স্কিম সম্ভাব্য প্রবাহের জন্য ব্যবহৃত হয় (62)।
VMD ব্যবহার করে, DOPC ফসফেট বিডস বা সিরামাইড AM1 বিডস এবং প্রোটিনের মধ্যে কাটঅফ তরঙ্গদৈর্ঘ্য 0.7 nm হয় এবং প্রোটিনের সাথে মিথস্ক্রিয়াকারী লিপিডের সংখ্যা গণনা করা হয়। নিম্নলিখিত সূত্র অনুসারে, (63) হিসাবে হ্রাস-সমৃদ্ধকরণ (DE) ফ্যাক্টর গণনা করুন: DE ফ্যাক্টর = (প্রোটিনে মোট লিপিডের পরিমাণ 0.7) প্রোটিন 0.7 (মোট লিপিডে Cer এর পরিমাণ)
রিপোর্ট করা মানটি গড় হিসাবে প্রাপ্ত হয় এবং ত্রুটি বারগুলি SE এর চারটি স্বাধীন অনুলিপি। DE ফ্যাক্টরের পরিসংখ্যানগত তাৎপর্য t পরীক্ষা [(averageDE-factor-1)/SE] দ্বারা গণনা করা হয়। এক-পুচ্ছ বন্টন থেকে P মান গণনা করুন।
GROMACS টুলটি ট্রেসের শেষ 250 ns এর মধ্যে Emp24 ধারণকারী সিস্টেমের 2D পার্শ্বীয় ঘনত্ব মানচিত্র গণনা করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। সিরামাইডের সমৃদ্ধি/ক্ষয় মানচিত্র পেতে, Cer এর ঘনত্ব মানচিত্রকে Cer এবং DOPC এর মানচিত্রের যোগফল দিয়ে ভাগ করা হয়, এবং তারপর শরীরের মধ্যে Cer এর ঘনত্ব দিয়ে ভাগ করা হয়। একই রঙের মানচিত্র স্কেল ব্যবহার করা হয়।
এই প্রবন্ধের জন্য সম্পূরক উপকরণের জন্য, অনুগ্রহ করে http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 দেখুন।
এটি একটি উন্মুক্ত প্রবেশাধিকার নিবন্ধ যা ক্রিয়েটিভ কমন্স অ্যাট্রিবিউশন-নন-কমার্শিয়াল লাইসেন্সের শর্তাবলীর অধীনে বিতরণ করা হয়েছে, যা যেকোনো মাধ্যমে ব্যবহার, বিতরণ এবং পুনরুৎপাদনের অনুমতি দেয়, যতক্ষণ না চূড়ান্ত ব্যবহার বাণিজ্যিক লাভের জন্য না হয় এবং মূল কাজটি সঠিক বলে মনে করা হয়। তথ্যসূত্র।
দ্রষ্টব্য: আমরা আপনাকে কেবল আপনার ইমেল ঠিকানাটি সরবরাহ করতে বলব যাতে আপনি পৃষ্ঠাটিতে যাকে সুপারিশ করবেন তিনি জানেন যে আপনি চান যে তারা ইমেলটি দেখুক এবং এটি স্প্যাম নয়। আমরা কোনও ইমেল ঠিকানা ক্যাপচার করব না।
এই প্রশ্নটি আপনি একজন ভিজিটর কিনা তা পরীক্ষা করতে এবং স্বয়ংক্রিয় স্প্যাম জমা প্রতিরোধ করতে ব্যবহৃত হয়।
সোফিয়া রদ্রিগেজ-গ্যালার্দো, কাজুও কুরোকাওয়া, সুজানা সাবিদো-বোজো, আলেজান্দ্রো কর্টেজ · গোমেজ (আলেজান্দ্রো কর্টেস-গোমেজ), আতসুকো ইকেদা (আতসুকো ইকেদা), ভ্যালেরিয়া জোনি (ভ্যালেরিয়া জোনি), অক্সিলিয়াডোরা আগুইলেরা-রোমেরো, অ্যানা লোজিও (আনা লোজিও)। লোপেজ), মিহো ওয়াগা (মিহো ওয়াগা), মিসাকো আরমান (মিসাকো আরমান), মিয়াকো রিমান (মিয়াকো রিমান), প্রো আকিরা, স্টেফানো ফ্যানি, আকিহিকো নাকানো, ম্যানুয়েল মুনিজ
3D উচ্চ-রেজোলিউশনের রিয়েল-টাইম ইমেজিং নির্বাচিত আউটপুট সাইটগুলিতে প্রোটিন বাছাইয়ের জন্য সিরামাইড চেইন দৈর্ঘ্যের গুরুত্ব প্রকাশ করে।
সোফিয়া রদ্রিগেজ-গ্যালার্দো, কাজুও কুরোকাওয়া, সুজানা সাবিদো-বোজো, আলেজান্দ্রো কর্টেজ · গোমেজ (আলেজান্দ্রো কর্টেস-গোমেজ), আতসুকো ইকেদা (আতসুকো ইকেদা), ভ্যালেরিয়া জোনি (ভ্যালেরিয়া জোনি), অক্সিলিয়াডোরা আগুইলেরা-রোমেরো, অ্যানা লোজিও (আনা লোজিও)। লোপেজ), মিহো ওয়াগা (মিহো ওয়াগা), মিসাকো আরমান (মিসাকো আরমান), মিয়াকো রিমান (মিয়াকো রিমান), প্রো আকিরা, স্টেফানো ফ্যানি, আকিহিকো নাকানো, ম্যানুয়েল মুনিজ
3D উচ্চ-রেজোলিউশনের রিয়েল-টাইম ইমেজিং নির্বাচিত আউটপুট সাইটগুলিতে প্রোটিন বাছাইয়ের জন্য সিরামাইড চেইন দৈর্ঘ্যের গুরুত্ব প্রকাশ করে।
©2020 আমেরিকান অ্যাসোসিয়েশন ফর দ্য অ্যাডভান্সমেন্ট অফ সায়েন্স। সমস্ত অধিকার সংরক্ষিত AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef এবং COUNTER এর অংশীদার। Science Advances ISSN 2375-2548.