Nature.com-এ আসার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি যে ব্রাউজার সংস্করণটি ব্যবহার করছেন তাতে CSS-এর সীমিত সমর্থন রয়েছে। সর্বোত্তম অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি হালনাগাদ ব্রাউজার ব্যবহার করার (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে কম্প্যাটিবিলিটি মোড বন্ধ করার) পরামর্শ দিচ্ছি। আপাতত, নিরবচ্ছিন্ন সমর্থন নিশ্চিত করার জন্য, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই সাইটটি প্রদর্শন করব।
মেরুদণ্ডী প্রাণীদের থেকে ভিন্ন, পোকামাকড়দের মধ্যে পুরুষ-পক্ষপাতী যৌন স্টেরয়েড হরমোনের অভাব রয়েছে বলে ব্যাপকভাবে মনে করা হয়। অ্যানোফিলিস গ্যাম্বি-তে, একডাইসোন ​​স্টেরয়েড ২০-হাইড্রোক্সিএকডাইসোন ​​(20E) স্ত্রী মশা দ্বারা সংশ্লেষিত হলে ডিমের বিকাশ নিয়ন্ত্রণ করতে² এবং পুরুষ মশা দ্বারা যৌন স্থানান্তরের পর সঙ্গম-বিরতিকাল প্ররোচিত করতে³ বিবর্তিত হয়েছে বলে মনে হয়। যেহেতু ডিমের বিকাশ এবং সঙ্গম অপরিহার্য প্রজনন বৈশিষ্ট্য, তাই স্ত্রী অ্যানোফিলিস মশা কীভাবে এই হরমোন সংকেতগুলিকে সমন্বয় করে তা বোঝা নতুন ম্যালেরিয়া নিয়ন্ত্রণ কর্মসূচি প্রণয়নে সহায়তা করতে পারে। এখানে, আমরা প্রকাশ করছি যে এই প্রজনন কার্যাবলী একডাইস্টেরয়েড-সক্রিয়কারী/নিষ্ক্রিয়কারী এনজাইমের একটি জটিল নেটওয়ার্কের মাধ্যমে স্বতন্ত্র যৌন স্টেরয়েড দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়। আমরা একটি পুরুষ-নির্দিষ্ট জারিত একডাইসোন, ৩-ডিহাইড্রো-২০ই (3D20E) শনাক্ত করেছি, যা যৌন স্থানান্তরের পর স্ত্রী মশার যৌন গ্রহণক্ষমতা বন্ধ করে এবং ডিফসফোরাইলেশনের মাধ্যমে সক্রিয় হয়ে বংশ রক্ষা করে। উল্লেখযোগ্যভাবে, 3D20E স্থানান্তর প্লাজমোডিয়ামের সময় ডিমের বিকাশ বজায় রাখে এমন প্রজনন জিনের প্রকাশকেও প্ররোচিত করে। সংক্রমণ, যা সংক্রমিত স্ত্রী মশার স্বাস্থ্য নিশ্চিত করে। স্ত্রী মশা থেকে নিঃসৃত 20E কোনো যৌন প্রতিক্রিয়া সৃষ্টি করে না, কিন্তু 20E-ইনহিবিটিং কাইনেজ নিষ্ক্রিয় হওয়ার পর এটি সঙ্গমরত মশাকে ডিম পাড়তে সাহায্য করে। এই পুরুষ-নির্দিষ্ট পতঙ্গ স্টেরয়েড হরমোনের শনাক্তকরণ এবং স্ত্রী মশার যৌন গ্রহণক্ষমতা, উর্বরতা নিয়ন্ত্রণ ও প্লাজমোডিয়ামের সাথে এর মিথস্ক্রিয়া ম্যালেরিয়া-সংক্রমণকারী মশার প্রজনন সাফল্য হ্রাস করার সম্ভাবনা নির্দেশ করে।
মানুষের ম্যালেরিয়া পরজীবীর একমাত্র বাহক অ্যানোফিলিস মশার মধ্যে ব্যাপক কীটনাশক প্রতিরোধ ক্ষমতার কারণে ম্যালেরিয়ায় আক্রান্তের সংখ্যা ও মৃত্যুর হার আবার বাড়ছে⁴। এই মশাগুলোর প্রজনন জীববিদ্যা নতুন ম্যালেরিয়া নিয়ন্ত্রণ পদ্ধতির জন্য একটি বিশেষভাবে আকর্ষণীয় লক্ষ্য, কারণ স্ত্রী মশা মাত্র একবারই সঙ্গম করে⁵; এই একক সঙ্গমকে বন্ধ্যা করে দিলে মাঠ পর্যায়ে মশার সংখ্যা কমানোর ব্যাপক সম্ভাবনা তৈরি হবে।
পুরুষদের কাছ থেকে উচ্চ মাত্রার স্টেরয়েড হরমোন গ্রহণ করার পর স্ত্রী মশা যৌনভাবে অক্ষম হয়ে পড়ে। গবেষণায় দেখা গেছে যে, পরবর্তী সঙ্গমে অসুবিধার কারণ হলো ২০-হাইড্রোক্সিএকডাইসোন ​​(২০ই), যা একটি স্টেরয়েড হরমোন এবং লার্ভা পর্যায়ে খোলস বদলানোর চক্রের নিয়ন্ত্রক হিসেবে বেশি পরিচিত। পুরুষদের ২০ই সংশ্লেষণ এবং স্থানান্তরের ক্ষমতা বিশেষভাবে অ্যানোফিলিস প্রজাতির মধ্যে বিকশিত হয়েছে, যা সেলিয়া৭ উপবংশের অন্তর্গত। এই উপবংশটি আফ্রিকায় বিস্তৃত এবং এর মধ্যে ম্যালেরিয়ার সবচেয়ে বিপজ্জনক বাহক, যেমন অ্যানোফিলিস গ্যাম্বি অন্তর্ভুক্ত। এটি বিশেষভাবে উল্লেখযোগ্য কারণ এই প্রজাতিগুলিতে স্ত্রী মশাও প্রতিটি রক্তপানের পর ২০ই উৎপাদন করে এবং ২০ই ডিম্বোৎপাদন চক্রকে চালিত করে (দেখুন তথ্যসূত্র ৮)। তবে, স্ত্রী মশা কীভাবে তাদের নিজেদের সঙ্গম ক্ষমতাকে প্রভাবিত না করে একডাইসোনের দুটি ভিন্ন উৎস (পুরুষের স্থানান্তর এবং রক্তপানের প্ররোচনা) থেকে প্রাপ্ত সংকেতগুলিকে সমন্বিত করে, সে সম্পর্কে খুব কমই জানা যায়। প্রকৃতপক্ষে, যদি স্ত্রী মশা দ্বারা উৎপাদিত ২০ই যৌন অসহিষ্ণুতা সৃষ্টি করে, তবে এটি... কুমারী অবস্থায় রক্তপানকারী মশাগুলোর বন্ধ্যাত্ব, যা এই মশাগুলোর মধ্যে একটি খুবই সাধারণ আচরণ৫।
একটি সম্ভাব্য ব্যাখ্যা হলো, A. gambiae-এর পুরুষরা একটি পরিবর্তিত পুরুষ-নির্দিষ্ট একডাইসোন ​​স্থানান্তর করে, যা স্ত্রী প্রজননতন্ত্রে একটি সংকেত শৃঙ্খল সক্রিয় করে, যার ফলে সঙ্গমে অস্থিরতা দেখা দেয়। তবে, যদিও মেরুদণ্ডী প্রাণীদের ইস্ট্রোজেন এবং অ্যান্ড্রোজেনের মতো একাধিক স্টেরয়েড হরমোন রয়েছে (রেফ. ৯-এ পর্যালোচনা করা হয়েছে), আমাদের জানামতে, পোকামাকড়ের মধ্যে অ্যান্ড্রোজেন-প্রবণ স্টেরয়েড শনাক্ত করা যায়নি।
সম্ভাব্য পরিবর্তনকারী স্টেরয়েডের সন্ধানে, আমরা যৌন পরিপক্ক A. gambiae-এর পুরুষ অ্যাক্সেসরি গ্রন্থিতে (MAG) স্টেরয়েড হরমোনের সম্ভার নির্ধারণ করতে উদ্যোগী হয়েছিলাম। পূর্বে ব্যবহৃত কম সুনির্দিষ্ট পদ্ধতির পরিবর্তে, হাই পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি ও ট্যান্ডেম মাস স্পেকট্রোমেট্রি (HPLC-MS/MS) ব্যবহার করে আমরা এই কলায় একডাইসোন ​​(E) এবং 20E শনাক্ত করেছি, যা পূর্ববর্তী ফলাফলকে নিশ্চিত করে। তবে, নমুনাটিতে জারিত ফসফোরাইলেটেড স্টেরয়েডের প্রাধান্য ছিল, যা 3-ডিহাইড্রো-20E-22-ফসফেট (3D20E22P) সূত্রের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ (চিত্র 1)। অন্যান্য রূপগুলির মধ্যে রয়েছে 3-ডিহাইড্রো-20E (3D20E) এবং 20E-22-ফসফেট (20E22P)। 3D20E22P-এর HPLC-MS/MS সংকেতের তীব্রতা এর ডিফসফোরাইলেটেড রূপ, 3D20E-এর চেয়ে দুই মাত্রা বেশি এবং E ও 20E-এর চেয়ে তিন মাত্রা বেশি ছিল। ২০ই (চিত্র ১)। যদিও দেহের অন্যান্য অংশে এবং নিম্ন প্রজননতন্ত্রে (এলআরটি; বর্ধিত তথ্য চিত্র ১ক) এটি পাওয়া যায়। আমরা সদ্য বন্ধ হওয়া (<১ দিন বয়সী) পুরুষ ও স্ত্রী পতঙ্গের দেহেও একডাইস্টেরয়েড বিশ্লেষণ করেছি এবং শুধুমাত্র এমএজি-তে ৩ডি২০ই এবং ৩ডি২০ই২২পি শনাক্ত করেছি; ই, ২০ই এবং ২০ই২২পি উভয় লিঙ্গেই উপস্থিত ছিল (বর্ধিত তথ্য চিত্র ১খ)। এই তথ্য থেকে বোঝা যায় যে, এ. গ্যাম্বিআই-এর পূর্ণাঙ্গ পুরুষরা তাদের এমএজি-তে উচ্চ মাত্রায় পরিবর্তনকারী হরমোন উৎপাদন করে, যা স্ত্রী পতঙ্গদের দ্বারা সংশ্লেষিত হয় না।
৪-দিন বয়সী কুমারী পুরুষ এবং কুমারী ও সঙ্গম করা স্ত্রী (০.৫, ৩, এবং ১২ ঘণ্টা) থেকে MAG এবং স্ত্রী LRT (অ্যাট্রিয়া, সেমিনাল ভেসিকল, এবং প্যারোভারিয়াম সহ) ব্যবচ্ছেদ করা হয়েছিল। এই টিস্যুগুলিতে একডাইসোন ​​HPLC-MS/MS দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল (গড় ± সেম; আনপেয়ার্ড টি-টেস্ট, দ্বি-পার্শ্বযুক্ত, ফলস ডিসকভারি রেট (FDR) সংশোধিত; NS, তাৎপর্যপূর্ণ নয়; *P < ০.০৫, **P < ০.০১। 3D20E: ৩ ঘণ্টা বনাম ০.৫ ঘণ্টা, P = ০.০৩৫; ১২ ঘণ্টা বনাম ৩ ঘণ্টা, P = ০.০০১৫; ১২ ঘণ্টা বনাম ০.৫ ঘণ্টা, P = ০.০৩০। 3D20E22P: ৩ ঘণ্টা বনাম ০.৫ ঘণ্টা, P = ০.২৫; ১২ ঘণ্টা বনাম ৩ ঘণ্টা, P = ০.০২)। = ০.০০৩২; ১২ ঘণ্টা বনাম ০.৫ ঘণ্টা, পি = ০.০১৫)। উপাত্ত তিনটি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেট থেকে নেওয়া হয়েছে। প্রতিটি কাঙ্ক্ষিত একডাইসোনের জন্য পিক এরিয়া গণনা করা হয়েছে এবং মশার সংখ্যা দ্বারা স্বাভাবিকীকরণ করা হয়েছে। একডাইসোনকে নিম্নলিখিতভাবে রঙ দ্বারা উপস্থাপন করা হয়েছে: E, সবুজ; 20E, কমলা; 20E22P, বেগুনি; 3D20E, নীল; 3D20E22P, গোলাপী। ইনসেটটি নিম্ন একডাইসোন ​​স্তর দেখানোর জন্য y-অক্ষের স্কেল বৃদ্ধি করে।
সঙ্গমের সময় 3D20E22P এবং 3D20E স্থানান্তরিত হয় কিনা তা তদন্ত করার জন্য, আমরা সঙ্গমের বিভিন্ন সময়ে স্ত্রী LRT ব্যবচ্ছেদ করেছি। যদিও কুমারীদের মধ্যে একডাইসোন ​​পাওয়া যায়নি, আমরা সঙ্গমের ঠিক পরেই (সঙ্গমের ০.৫ ঘণ্টা পরে) LRT-তে যথেষ্ট পরিমাণে 3D20E22P লক্ষ্য করেছি, যা সময়ের সাথে সাথে হ্রাস পেয়েছে, যেখানে 3D20E-এর মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র ১)। রাসায়নিকভাবে সংশ্লেষিত 3D20E-কে একটি স্ট্যান্ডার্ড হিসাবে ব্যবহার করে, আমরা নির্ধারণ করেছি যে সঙ্গমরত LRT-তে এই স্টেরয়েড হরমোনের মাত্রা 20E-এর তুলনায় কমপক্ষে ১০০ গুণ বেশি ছিল (বর্ধিত ডেটা সারণি ১)। সুতরাং, 3D20E22P হলো প্রধান পুরুষ একডাইসোন ​​যা সঙ্গমের সময় স্ত্রী LRT-তে স্থানান্তরিত হয়, এবং এর ডিফসফরিলেটেড রূপ, 3D20E, সঙ্গমের অল্প সময়ের মধ্যেই প্রচুর পরিমাণে তৈরি হয়। এটি স্ত্রী প্রাণীর সঙ্গম-পরবর্তী জীববিজ্ঞানে পরবর্তী একডাইসোনটির একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকার ইঙ্গিত দেয়।
একটি বিশেষভাবে নির্মিত বায়োইনফরমেটিক্স পাইপলাইন ব্যবহার করে একটি নতুন আরএনএ সিকোয়েন্সিং (আরএনএ-সিক) ডেটাসেট (চিত্র ২ক) তৈরি করার পর, আমরা একডাইসোন ​​কাইনেজ (EcK), একডাইসোন ​​অক্সিডেজ (EO), এবং একডাইসোন ​​এনকোডিং ২০ই-মডিফায়েড ফসফাটেজ জিন (EPP) অনুসন্ধান করেছি। EPP প্রজনন টিস্যুতে প্রকাশিত হয়। আমরা একটি সম্ভাব্য EPP জিন এবং দুটি সম্ভাব্য EcK জিন (EcK1 এবং EcK2) শনাক্ত করেছি, কিন্তু একটি ভালো সম্ভাব্য EO জিন খুঁজে পেতে পারিনি। উল্লেখযোগ্যভাবে, আমাদের প্রত্যাশার বিপরীতে, গাম্বিয়ান MAG-গুলিতে প্রতিটি EPP জিন উচ্চ মাত্রায় (৯৮.৯তম পার্সেন্টাইল) প্রকাশিত হয়েছিল, কিন্তু স্ত্রী LRT-তে নয় (চিত্র ২খ), কারণ এই স্ত্রী টিস্যুতে 3D20E22P-এর ডিফসফোরিলেশন ঘটেছিল। অতএব, আমরা বিশ্বাস করি যে সঙ্গমের সময় পুরুষ EPP স্থানান্তরিত হতে পারে। প্রকৃতপক্ষে, সঙ্গমের পরে স্ত্রী প্রোটিনকে আড়াল করার জন্য আমরা ইন ভিভো স্টেবল আইসোটোপ লেবেলিং ব্যবহার করেছি, যা একটি এনজাইম এবং MS দ্বারা স্ত্রী অ্যাট্রিয়ামে শনাক্ত করা হয়েছে (চিত্র ২গ)। এবং পরিপূরক সারণি ১)। নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে MAG এবং সঙ্গম করা (কিন্তু কুমারী নয়) স্ত্রী LRT-তে EPP-এর উপস্থিতি নিশ্চিত করা হয়েছিল (চিত্র ২d)।
ক, প্রতিটি লিঙ্গের প্রজনন কলায় EcK, EO, এবং EPP এনকোডকারী জিন অনুসন্ধানের জন্য একটি বিশেষভাবে নির্মিত বায়োইনফরমেটিক্স পাইপলাইন। তীরচিহ্নের পাশের সংখ্যাগুলো প্রতিটি ধাপে পুরুষ ও মহিলা প্রার্থীর সংখ্যা নির্দেশ করে। এই বিশ্লেষণে একটি EPP জিন (EPP) এবং একটি EcK জিন (EcK1) শনাক্ত করা হয়েছে যা পুরুষদের মধ্যে প্রকাশিত হয়, এবং একটি EcK জিন (EcK2) শনাক্ত করা হয়েছে যা উভয় লিঙ্গেই প্রকাশিত হয় কিন্তু কোনো প্রার্থী EO জিন প্রদান করে না। খ, কুমারী (V) এবং সঙ্গমরত (M) Anopheles gambiae এবং Anopheles albicans কলায় প্রার্থী জিনের প্রকাশের তুলনা করে একটি হিটম্যাপ। Spca, নিষেক; MAGs, পুরুষদের আনুষঙ্গিক গ্রন্থি; শরীরের অন্যান্য অংশ, যার মধ্যে রয়েছে স্তন, ডানা, পা, ফ্যাট বডি এবং উভয় লিঙ্গের অভ্যন্তরীণ অঙ্গ, এবং স্ত্রী প্রাণীর ডিম্বাশয়। EcK2 গাম্বিয়ার MAG এবং অ্যাট্রিয়া উভয় স্থানেই উচ্চ মাত্রায় প্রকাশিত হয়, যেখানে EPP শুধুমাত্র MAG-এ পাওয়া যায়। গ, ৩, ১২ এবং ২৪ ঘণ্টায় স্ত্রী প্রাণীর অ্যাট্রিয়াতে পুরুষ প্রাণীর বীর্য গ্রুপের স্থানান্তরের প্রোটিওমিক বিশ্লেষণ, যা ৬৭টি সর্বাধিক পরিমাণে থাকা প্রোটিন দেখাচ্ছে। সমস্ত প্রোটিনকে লেবেল (এবং মাস্ক) করার জন্য স্ত্রী প্রাণীদের 15N যুক্ত খাদ্যে প্রতিপালন করা হয়েছিল। ট্যাগবিহীন পুরুষদের ট্যাগযুক্ত স্ত্রী প্রাণীদের সাথে সঙ্গম করানো হয়েছিল, এবং প্রোটিওমিক বিশ্লেষণের জন্য ৩, ১২ এবং ২৪ ঘণ্টায় স্ত্রী প্রাণীর LRT ব্যবচ্ছেদ করা হয়েছিল (বীর্যপাতকারী প্রোটিনের সম্পূর্ণ তালিকার জন্য পরিপূরক সারণী ১ দেখুন)। ইনসেট, এই টিস্যুগুলির প্রোটিওমিক বিশ্লেষণের মাধ্যমে কুমারী পুরুষদের MAG-এ EPP, Eck1 এবং EcK2 সনাক্ত করা হয়েছিল। ঘ, ওয়েস্টার্ন ব্লটের মাধ্যমে সঙ্গম করা স্ত্রী প্রাণীর MAG এবং LRT-তে EPP সনাক্ত করা হয়েছিল, কিন্তু অন্য কোনো অংশে নয়। কুমারী স্ত্রী অথবা পুরুষ অথবা স্ত্রীদেহের বাকি অংশ। ঝিল্লিগুলোকে একই সাথে অ্যান্টি-অ্যাকটিন (লোডিং কন্ট্রোল) এবং অ্যান্টি-ইপিপি অ্যান্টিবডি দিয়ে পরীক্ষা করা হয়েছিল। সকল পুরুষই কুমার। জেলের উৎস তথ্যের জন্য পরিপূরক চিত্র ১ দেখুন। ওয়েস্টার্ন ব্লট দুইবার করা হয়েছিল এবং ফলাফল একই রকম ছিল।
MAG থেকে বিচ্ছিন্ন 3D20E22P-এর সাথে HPLC-MS/MS দ্বারা ইনকিউবেশনের পর EPP-এর একডাইস্টেরয়েড ফসফোফসফাটেজ কার্যকলাপ যাচাই করা হয়েছিল (এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র 2a)। অধিকন্তু, যখন আমরা RNA-মিডিয়েটেড ইন্টারফেরেন্স (RNAi) দ্বারা EPP-কে সাইলেন্স করেছিলাম, তখন আমরা এই পুরুষ মশাগুলোর প্রজনন কলায় ফসফাটেজ কার্যকলাপের একটি তীব্র হ্রাস সনাক্ত করেছিলাম (চিত্র 3a), এবং EPP-সাইলেন্সড পুরুষ মশাগুলোর সাথে সঙ্গম করা স্ত্রী মশাগুলোতে আংশিক জিন সাইলেন্সিং সত্ত্বেও ডিফসফোরাইলেটেড 3D20E-এর অনুপাত উল্লেখযোগ্যভাবে কম ছিল (চিত্র 3b) (এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র 2b,c)। বিপরীতে, আমরা একই মশাগুলোতে 20E22P/20E অনুপাতে কোনো উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন সনাক্ত করিনি, যা থেকে বোঝা যেতে পারে যে এনজাইমটি 3D20E22P-এর জন্য নির্দিষ্ট (চিত্র 3b)।
ক, দ্বিসূত্রক EPP RNA (dsEPP) বা দ্বিসূত্রক GFP RNA (dsGFP) কন্ট্রোল ব্যবহার করে EPP সাইলেন্সিং-এর কারণে MAG-তে ফসফাটেজ অ্যাক্টিভিটি হ্রাস পেয়েছে। প্রতিটি রেপ্লিকেটে কুড়িটি MAG পুল ব্যবহার করা হয়েছে (P = ০.০০৪৬, পেয়ার্ড টি-টেস্ট, দ্বি-পার্শ্বীয়), যা পৃথক ডট দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছে। খ, EPP-সাইলেন্সড পুরুষদের সাথে সঙ্গম করা স্ত্রী পোকাদের ক্ষেত্রে ৩ ঘণ্টা পর ডিফসফরিলেটেড 3D20E-এর অনুপাত উল্লেখযোগ্যভাবে কম ছিল (P = ০.০০৪৩, আনপেয়ার্ড টি-টেস্ট, দ্বি-পার্শ্বীয়), যেখানে 20E-এর মাত্রা অপরিবর্তিত ছিল (P = ০.০৬৩, আনপেয়ার্ড)। টি-টেস্ট, দ্বি-পার্শ্বীয়)। ১৩, ১৬ এবং ১৯টি করে স্ত্রী প্রাণীর তিনটি পুল থেকে প্রাপ্ত ডেটা গড় ± সেম (sem) হিসাবে উপস্থাপন করা হয়েছে। গ, EPP-নিষ্ক্রিয় পুরুষদের সাথে সঙ্গম করা স্ত্রী প্রাণীদের পুনঃসঙ্গমের হার উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল (পি = ০.০০০২, ফিশারের যথার্থ পরীক্ষা, দ্বি-পার্শ্বীয়)। স্ত্রী প্রাণীদের সঙ্গম অবস্থা নিশ্চিত করার জন্য প্রথমে তাদের সঙ্গমে বাধ্য করা হয়েছিল; ২ দিন পর, ট্রান্সজিনের কোয়ান্টিটেটিভ পিসিআর (quantitative PCR) সনাক্তকরণের মাধ্যমে পুনঃমিলনের হার নির্ণয়ের জন্য তাদেরকে ট্রান্সজেনিক শুক্রাণু বহনকারী অন্যান্য পুরুষ মশার সংস্পর্শে আনা হয়। রক্তপানকারী স্ত্রী মশা যারা ইপিপি-সাইলেন্সড (EPP-silenced) পুরুষ মশার সাথে মিলিত হয়েছিল, তাদের প্রজনন ক্ষমতা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছিল (পি < ০.০০০১; ম্যান-হুইটনি পরীক্ষা, দ্বি-পার্শ্বীয়) এবং ডিমের সংখ্যা সামান্য কমে গিয়েছিল (পি = ০.০৮৮, ম্যান-হুইটনি পরীক্ষা, দ্বি-পার্শ্বীয়), যদিও ডিম ছাড়ার হার প্রভাবিত হয়নি (পি = ০.৯৪, ফিশারের যথার্থ পরীক্ষা, দ্বি-পার্শ্বীয়)। সমস্ত প্যানেলে, n জৈবিকভাবে স্বাধীন মশার নমুনার সংখ্যা নির্দেশ করে। NS, তাৎপর্যপূর্ণ নয়। *পি < ০.০৫, **পি < ০.০১, ***পি < ০.০০১, ****পি < ০.০০১।
এরপর, আমরা মূল্যায়ন করেছি যে স্ত্রী পোকাদের মধ্যে সঙ্গম প্রতিরোধ ক্ষমতা তৈরিতে একডাইসোন ​​ডিফসফোরিলেশন গুরুত্বপূর্ণ কিনা। লক্ষণীয়ভাবে, অতিরিক্ত (ট্রান্সজেনিক) পুরুষ পোকার সংস্পর্শে এলে, EPP-শূন্য পুরুষ পোকার সাথে সঙ্গম করা স্ত্রী পোকারা নিয়ন্ত্রণাধীন স্ত্রী পোকাদের (১০.৪%) তুলনায় অনেক বেশি হারে (৪৪.৯%) পুনরায় সঙ্গম করে (চিত্র ৩গ)। আমরা এই স্ত্রী পোকাদের প্রজনন ক্ষমতায় একটি উল্লেখযোগ্য হ্রাস (চিত্র ৩ঘ, বাম) এবং তাদের দ্বারা পাড়া ডিমের সংখ্যায় সামান্য হ্রাসও (চিত্র ৩ঘ, মধ্য) লক্ষ্য করেছি, যদিও স্ত্রী পোকাদের দ্বারা পাড়া ডিমের শতাংশ (সঙ্গমের ফলে স্ত্রী পোকাদের মধ্যে উদ্ভূত আরেকটি প্রতিক্রিয়া) প্রভাবিত হয়নি (চিত্র ৩ঘ, ডান)। 3D20E22P-এর প্রতি EPP-এর পর্যবেক্ষণকৃত নির্দিষ্টতার পরিপ্রেক্ষিতে, এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে সঙ্গমের সময় স্থানান্তরিত EPP দ্বারা 3D20E-এর সক্রিয়করণ পরবর্তী সঙ্গমের জন্য স্ত্রী পোকাদের গ্রহণক্ষমতা বন্ধ করে দেওয়ার ক্ষেত্রে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করতে পারে, যে আচরণটি পূর্বে 20E-এর যৌন স্থানান্তরের জন্য দায়ী করা হতো। অতএব, এই পুরুষ-নির্দিষ্ট হরমোনটি স্ত্রী পোকাদের উপরও প্রবলভাবে প্রভাব ফেলে। উর্বরতা।
এরপর, আমরা রাসায়নিকভাবে সংশ্লেষিত 3D20E (চিত্র 4a–c) এবং বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ 20E ব্যবহার করে যৌন পরিপক্ক কুমারী মৌমাছির উপর ইনজেকশন পরীক্ষার মাধ্যমে 20E এবং 3D20E-এর কার্যকলাপের তুলনা করেছি। আমরা লক্ষ্য করেছি যে উভয় ঘনত্বেই 3D20E, 20E-এর তুলনায় সঙ্গমের প্রতি স্ত্রী মৌমাছির সংবেদনশীলতা বন্ধ করার ক্ষেত্রে উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি কার্যকর ছিল (চিত্র 4d)। বিশেষভাবে উল্লেখ্য যে, সর্বোচ্চ ঘনত্বে (সঙ্গমের ১৮ পিজি পরে) ইনজেকশনের ২৪ ঘণ্টা পর, LRT-তে 3D20E-এর অর্ধেক শারীরবৃত্তীয় মাত্রা (ইনজেকশনের পর ১,০৬৬ পিজি বনাম সঙ্গমের পর ২,০২২ পিজি) এমন এক অনমনীয় স্ত্রী মৌমাছির অনুপাত তৈরি করেছিল যা 20E-এর শারীরবৃত্তীয় মাত্রার (ইনজেকশনের পর ৩৬১ পিজি) তুলনায় ২০ গুণ বেশি ছিল; বর্ধিত ডেটা সারণি ১)। এই ফলাফলটি এই ধারণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যে 20E-এর যৌন স্থানান্তর সঙ্গম-প্রতিরোধকাল সৃষ্টি করে না, এবং এটি পিতা-মাতা-সন্তান সম্পর্ক নিশ্চিত করার ক্ষেত্রে 3D20E-কে একটি প্রধান নিয়ামক হিসেবে নির্দেশ করে। কুমারী স্ত্রী পতঙ্গের ডিম পাড়ার পরীক্ষায়ও 3D20E, 20E-এর চেয়ে উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি সক্রিয় ছিল (চিত্র ৪e), যা থেকে বোঝা যায় যে আংশিক EPP নিষ্ক্রিয়করণের পর আমরা যে স্বাভাবিক ডিম পাড়ার হার পর্যবেক্ষণ করেছি, তা সঙ্গম-প্ররোচিত স্ত্রী ফ্যাক্টর দ্বারা উৎপাদিত অবশিষ্ট 3D20E সক্রিয়তার উপস্থিতির কারণেই ঘটেছিল।
(ক, খ) 20E (ক) থেকে রাসায়নিকভাবে সংশ্লেষিত 3D20E, যার রূপান্তর/দক্ষতা অত্যন্ত বেশি (তিনটি স্বাধীন সংশ্লেষণ বিক্রিয়া থেকে প্রাপ্ত ডেটা গড় ± সেম হিসাবে উপস্থাপন করা হয়েছে) (খ)। গ, ভর বর্ণালী (নীচের অর্ধেক) সঙ্গম করা স্ত্রী LRT-তে পাওয়া একডাইসোনের (উপরের অর্ধেক) সাথে হুবহু মিলে যায়। ঘ, 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; ফিশারের এক্সাক্ট টেস্ট, দ্বি-পার্শ্বযুক্ত) এবং 10% ইথানলের (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; ফিশারের এক্সাক্ট টেস্ট, দ্বি-পার্শ্বযুক্ত) সাথে তুলনা করলে, 20E শুধুমাত্র উচ্চ মাত্রায় কন্ট্রোলের চেয়ে উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; ফিশারের এক্সাক্ট টেস্ট, দ্বি-পার্শ্বীয়)।e, 3D20E ইনজেকশন ১০% ইথানল কন্ট্রোলের তুলনায় কুমারী স্ত্রী মশার মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ডিম পাড়ার হার প্ররোচিত করেছে (০.২১ µg, P < ০.০০০১; ০.১৩ µg, P = ০.০০০৩; ফিশারের এক্সাক্ট টেস্ট, দ্বি-পার্শ্বীয়), যেখানে 20E কন্ট্রোলের তুলনায় শুধুমাত্র উচ্চ মাত্রায় (০.২১ µg, P = ০.০২২; ০.১৩ µg, P = ০.০৮২৩; ফিশারের এক্সাক্ট টেস্ট, দ্বি-পার্শ্বীয়)।3D20E উচ্চ মাত্রায় 20E-এর তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ডিম পাড়ার হার প্ররোচিত করেছে (০.২১ µg, P = ০.০০১৯; ০.১৩ µg, P = ০.০৭৫; ফিশারের এক্সাক্ট টেস্ট, দ্বি-পার্শ্বীয়)।সমস্ত প্যানেলে, n জৈবিকভাবে স্বাধীন মশার নমুনার সংখ্যাকে প্রতিনিধিত্ব করে।NS, তাৎপর্যপূর্ণ নয়।*P < ০.০৫, **পি < ০.০১, ***পি < ০.০০১, ****পি < ০.০০১। উপাত্ত তিনটি পুনরাবৃত্তি থেকে সংগৃহীত।
পূর্ববর্তী গবেষণায় আমরা নির্ধারণ করেছিলাম যে স্টেরয়েড হরমোনের যৌন স্থানান্তর MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) নামক একটি স্ত্রী প্রজনন জিনের প্রকাশকে প্ররোচিত করে, যা মানুষের সবচেয়ে মারাত্মক ম্যালেরিয়া পরজীবী P. falciparum 13 দ্বারা সৃষ্ট স্বাস্থ্যগত ক্ষতি থেকে A. gambiae স্ত্রী মশাকে রক্ষা করে। ম্যালেরিয়া-প্রবণ এলাকায় অ্যানোফেলিসের প্রজনন সক্ষমতার জন্য MISO-এর গুরুত্ব বিবেচনা করে, আমরা নির্ধারণ করার সিদ্ধান্ত নিয়েছিলাম যে 3D20E বা 20E—কোন হরমোনটি এই জিনের প্রকাশকে উদ্দীপিত করে। আমরা দেখতে পেয়েছি যে, যেখানে 20E ইনজেকশন বিশেষভাবে বা আরও শক্তিশালীভাবে কিছু নিউক্লিয়ার হরমোন রিসেপ্টর (HR), যেমন HR3 এবং HR4, এবং সাধারণ ডাউনস্ট্রিম স্টেরয়েড টার্গেট, যেমন ইয়োকোজেনিক জিন Vg14, 15, 16-কে প্ররোচিত করেছিল, সেখানে MISO আরও জোরালোভাবে 3D20E দ্বারা প্ররোচিত হয়েছিল (এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র ৩)। সুতরাং, এই অ্যান্ড্রোজেনিক স্টেরয়েড হরমোনের যৌন স্থানান্তর এমন প্রক্রিয়াকে প্ররোচিত করে বলে মনে হয় যা স্ত্রী মশাকে পরজীবী দ্বারা সৃষ্ট ক্ষতি থেকে রক্ষা করে। সংক্রমণ। অধিকন্তু, 3D20E ই রিসেপ্টর EcR-এর উভয় আইসোফর্মকে ভিন্নভাবে প্রভাবিত করে, EcR-A-কে প্ররোচিত করে এবং EcR-B-কে দমন করে, এবং HPX15 সহ অন্যান্য সঙ্গম-প্ররোচনাকারী জিনগুলিকে আরও জোরালোভাবে সক্রিয় করে, যা স্ত্রী প্রজনন ক্ষমতাকে প্রভাবিত করে। এটি EPP-নিষ্ক্রিয় পুরুষদের সাথে সঙ্গম করা স্ত্রীদের মধ্যে পরিলক্ষিত উল্লেখযোগ্য বন্ধ্যাত্বের ব্যাখ্যা দিতে পারে (বর্ধিত ডেটা চিত্র ৩)। এই ডেটা দুটি একডাইসোন ​​হরমোন দ্বারা অগ্রাধিকারমূলকভাবে সক্রিয় ডাউনস্ট্রিম পথগুলির অস্তিত্বের ইঙ্গিত দেয় যা লিঙ্গ-নির্দিষ্ট কার্যকারিতার অন্তর্নিহিত কারণ হতে পারে।
এরপর, আমরা আমাদের বায়োইনফরমেটিক্স পাইপলাইনে শনাক্ত করা দুটি EcK জিনের কার্যকারিতা পরীক্ষা করেছি। EcK1 বা EcK2-কে নিষ্ক্রিয় করার ফলে পুরুষদের মধ্যে উল্লেখযোগ্য মৃত্যুহার দেখা যায় (এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র 4a), যা থেকে বোঝা যায় যে বেঁচে থাকার জন্য একডাইসোন ​​ফসফোরাইলেশন এবং ফলস্বরূপ নিষ্ক্রিয়করণ গুরুত্বপূর্ণ। যেহেতু EcK1-এর তুলনায় EcK2 উচ্চতর মাত্রায় প্রকাশিত হয়েছিল এবং প্রোটিওমিক্সের মাধ্যমে MAG-গুলিতে এটি শনাক্ত করা হয়েছিল (চিত্র 2b,c এবং পরিপূরক সারণি 2), আমরা 20E-এর সাথে ইনকিউবেট করে এর একডাইস্টেরয়েড কাইনেজ কার্যকলাপ যাচাই করেছি, যার ফলে 20E22P ফসফোরাইলেশন ঘটে (এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র 24b)। যখন 3D20E-কে সাবস্ট্রেট হিসাবে ব্যবহার করা হয়, তখন আমরা ফসফোরাইলেটেড প্রোডাক্ট 3D20E22P শনাক্ত করতে পারিনি (এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র 4c), যা থেকে বোঝা যায় যে 3D20E-এর পরিবর্তে 20E-ই সম্ভবত EcK2-এর পছন্দের টার্গেট।
আমাদের RNA-seq বিশ্লেষণ অনুসারে, কুমারী স্ত্রী পোকাদের LRT-তেও EcK2 উচ্চ মাত্রায় প্রকাশিত হয়েছিল, যেখানে সঙ্গমের পর এটি নিষ্ক্রিয় হয়ে যায় (চিত্র 2b)। আমরা এই তথ্যগুলো নিশ্চিত করেছি এবং নির্ধারণ করেছি যে রক্তপানের দ্বারা EcK2-এর প্রকাশ প্রভাবিত হয় না (বর্ধিত ডেটা চিত্র 5a)। আমাদের প্রাথমিক MS পরীক্ষাগুলোকে সম্প্রসারিত করে আমরা নির্ধারণ করেছি যে 20E22P-এর সর্বোচ্চ মাত্রা 20E-এর সর্বোচ্চ মাত্রার সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত ছিল (রক্তপানের ২২-২৬ ঘণ্টা পর; বর্ধিত ডেটা চিত্র 5b)। কুমারী স্ত্রী পোকাদের মধ্যে EcK2-কে নিষ্ক্রিয় করার ফলে রক্তপানের ২৬ ঘণ্টা পর 20E এবং 20E22P-এর আপেক্ষিক অনুপাত ৩-গুণ বৃদ্ধি পায় (বর্ধিত ডেটা চিত্র 2c এবং 5c), যা নিশ্চিত করে যে EcK2 স্ত্রী পোকাদের মধ্যে 20E-কেও ফসফোরাইলেট করে। উল্লেখযোগ্যভাবে, EcK2-বঞ্চিত কুমারী পোকারা সম্পূর্ণ যৌন গ্রহণক্ষমতা বজায় রেখেছিল (বর্ধিত ডেটা চিত্র 5d,e), যা আরও ইঙ্গিত দেয় যে স্ত্রী পোকাদের 20E উৎপাদন প্রজননকে প্ররোচিত করে না। প্রজননে বাধাদানকারী সময়কাল। যাইহোক, নিয়ন্ত্রিত নমুনার তুলনায় এই স্ত্রী মাছগুলোর ডিম পাড়ার হার উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছিল, যেখানে ৩০% এরও বেশি কুমারী মাছ ডিম পেড়েছিল (বর্ধিত ডেটা চিত্র ৫চ)। রক্তপানের পরে যদি দ্বিসূত্রক Eck2 RNA (dsEcK2) ইনজেকশন দেওয়া হতো, তাহলে ডিম পাড়া ঘটত না, এবং সেই সময়ে রক্তপানের কারণে সৃষ্ট 20E-এর সর্বোচ্চ মাত্রা হ্রাস পেয়েছিল। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলো এমন একটি মডেলকে সমর্থন করে যে রক্তচোষার পরে উৎপাদিত 20E ডিম পাড়তে প্ররোচিত করতে পারে, কিন্তু শুধুমাত্র তখনই যখন প্রজননে বাধাদানকারী উপাদান (EcK2 এবং সম্ভবত অন্যান্য উপাদান) প্রজননের মাধ্যমে বন্ধ হয়ে যায়। 20E বা 3D20E কোনো ইনজেকশনই কুমারী মাছের মধ্যে EcK2-এর প্রকাশকে বাধা দেয়নি (বর্ধিত ডেটা চিত্র ৫ছ), যা থেকে বোঝা যায় যে অন্যান্য উপাদান এই কাইনেজের বাধাদানে মধ্যস্থতা করে। যাইহোক, রক্তপানের পরে 20E-এর মাত্রা প্রজননে অস্বস্তি সৃষ্টি করার জন্য যথেষ্ট ছিল না, কিন্তু যৌনভাবে স্থানান্তরিত 3D20E-এর উচ্চ মাত্রা দ্বারা এটি কার্যকরভাবে উদ্দীপ্ত হয়েছিল।
আমাদের ফলাফল A. gambiae-এর প্রজননগত সাফল্য নিয়ন্ত্রণকারী প্রক্রিয়াগুলো সম্পর্কে গুরুত্বপূর্ণ অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে। একটি মডেল আবির্ভূত হয়েছে যেখানে পুরুষরা উচ্চ মাত্রায় 3D20E সংশ্লেষণ করতে বিবর্তিত হয়েছে, যা একটি পুরুষ-নির্দিষ্ট পরিবর্তিত একডাইসোন ​​এবং এটি স্ত্রী পতঙ্গকে পরবর্তী সঙ্গমের প্রতি সংবেদনহীন করে পিতৃত্ব নিশ্চিত করে। একই সময়ে, এই ম্যালেরিয়া বাহকগুলো পুরুষ-নির্দিষ্ট EPP-এর যৌন স্থানান্তরের প্রতিক্রিয়ায় স্ত্রী পতঙ্গের মধ্যে 3D20E সক্রিয় করার জন্য একটি কার্যকর ব্যবস্থাও বিকশিত করেছে। আমাদের জ্ঞানমতে, এটিই পতঙ্গের মধ্যে একটি পুরুষ- এবং স্ত্রী-প্রধান স্টেরয়েড হরমোন ব্যবস্থার প্রথম উদাহরণ যা একটি অনন্য এবং গুরুত্বপূর্ণ কার্য সম্পাদন করে। পুরুষ-নির্দিষ্ট একডাইসোনের কার্যকারিতা অনুমান করা হয়েছে কিন্তু চূড়ান্তভাবে প্রমাণিত হয়নি। উদাহরণস্বরূপ, একটি বহুলাংশে ভুল প্রমাণিত অনুমান ১৮ হলো যে এই কাজগুলো 20E-এর পূর্বসূরী E1 দ্বারা সম্পাদিত হতে পারে। এটি সুপরিচিত যে ড্রসোফিলাতে, একগামীতা ছোট যৌন পেপটাইডের যৌন স্থানান্তরের মাধ্যমে সক্রিয় হয় ১৯,২০ যা নির্দিষ্ট যৌন পেপটাইডের মাধ্যমে স্ত্রী প্রজননতন্ত্রে স্নায়ু সরবরাহকারী নিউরনের সাথে মিথস্ক্রিয়া করে। রিসেপ্টর২১,২২। A. gambiae স্ত্রী পতঙ্গের মধ্যে 3D20E দ্বারা নিয়ন্ত্রিত নিম্নধারার সংকেত ক্যাসকেডগুলো নির্ধারণ করতে এবং এই ক্যাসকেডগুলো মশা ও ড্রোসোফিলার মধ্যে সংরক্ষিত হতে পারে কিনা তা নির্ধারণ করতে আরও গবেষণার প্রয়োজন।
আমাদের গবেষণায় স্ত্রী মশার প্রজনন ক্ষমতা এবং আচরণের উপর 3D20E-এর গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা চিহ্নিত হওয়ায়, 3D20E সংশ্লেষণ এবং সক্রিয়করণের পথগুলি ভবিষ্যতের মশা নিয়ন্ত্রণ কৌশলের জন্য নতুন সুযোগ তৈরি করে, যেমন বন্ধ্যা পতঙ্গ প্রযুক্তি কৌশলে প্রতিযোগিতামূলক বন্ধ্যা পুরুষ মশা তৈরি করে সেগুলোকে বন্য পরিবেশে ছেড়ে দেওয়া অথবা কুমারী সঙ্গমে 3D20E-এর অনুকরণ করা। 3D20E-এর পুরুষ-নির্দিষ্ট কার্যকারিতা সম্ভবত তখন বিকশিত হয়েছিল যখন A. gambiae এবং অন্যান্য Cellia প্রজাতি তাদের বীর্যকে জমাট বাঁধিয়ে সঙ্গম প্লাগ তৈরি করার ক্ষমতা অর্জন করেছিল, কারণ এটি বিপুল সংখ্যক হরমোন এবং হরমোন-সক্রিয়কারী এনজাইমের কার্যকর স্থানান্তরের সুযোগ করে দেয়। ফলস্বরূপ, একগামীতা বাস্তবায়নকারী 3D20E-এর বিবর্তন স্ত্রী মশাদের (MISO-এর উচ্চ প্রকাশের মাধ্যমে) উচ্চ ম্যালেরিয়া প্রাদুর্ভাবযুক্ত অঞ্চলে তাদের প্রজনন সক্ষমতা বাড়ানোর একটি প্রক্রিয়া প্রদান করে, যা পরোক্ষভাবে প্লাজমোডিয়াম সংক্রমণে অবদান রাখে। যেহেতু স্ত্রী Anopheles মশার মধ্যে P. falciparum-এর বেঁচে থাকা এবং বৃদ্ধির উপর স্ত্রী 20E-এর গভীর প্রভাব দেখানো হয়েছে, তাই পুরুষ এবং স্ত্রী উভয় স্টেরয়েড হরমোন পথই এখন মশা ও পরজীবীর পারস্পরিক ক্রিয়ার মূল দিকগুলো।
A. gambiae G3 স্ট্রেইনগুলোকে আদর্শ কীট পরিবেশে (২৬-২৮ °C, ৬৫-৮০% আপেক্ষিক আর্দ্রতা, ১২:১২ ঘণ্টা আলো/অন্ধকার আলোকচক্র) প্রতিপালন করা হয়েছিল। লার্ভাগুলোকে গুঁড়ো মাছের খাবার (টেট্রামিন ট্রপিক্যাল ফ্লেক্স, কোই পেলেটস এবং টেট্রা পন্ড স্টিকস ৭:৭:২ অনুপাতে) খাওয়ানো হয়েছিল। পূর্ণাঙ্গ মশাগুলোকে ইচ্ছামতো ১০% ডেক্সট্রোজ দ্রবণ এবং সাপ্তাহিক মানব রক্ত ​​(গবেষণার রক্তের উপাদান) খাওয়ানো হয়েছিল। পিউপা পর্যায়ে অণুবীক্ষণ যন্ত্রের সাহায্যে প্রান্তভাগ পরীক্ষা করে লিঙ্গ পৃথকীকরণের মাধ্যমে কুমারী মশা সংগ্রহ করা হয়েছিল। DsRed ট্রান্সজিন বহনকারী পুরুষ মশাগুলোর বর্ণনা পূর্বে দেওয়া হয়েছে।
পূর্বে বর্ণিত প্রোটোকল অনুসারে বলপূর্বক প্রজনন পরীক্ষা সম্পন্ন করা হয়েছিল। স্বাভাবিক প্রজননের জন্য, ৪-দিন বয়সী কুমারী স্ত্রী মাকড়সাদের দুই রাতের জন্য যৌন পরিপক্ক কুমারী পুরুষ মাকড়সার সাথে ১:৩ অনুপাতে রাখা হয়েছিল। যে পরীক্ষাগুলিতে পুরুষ মাকড়সাদের dsEPP ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল, সেগুলিতে ইনজেকশনের ৩-৪ দিন পর তাদের একসাথে খাঁচায় রাখা হয়েছিল, যখন ফসফাটেজ কার্যকলাপ সর্বাধিক পরিমাণে নিষ্ক্রিয় ছিল (বর্ধিত ডেটা চিত্র ২খ)।
মশার টিস্যু, অবশিষ্ট মৃতদেহ (শরীরের বাকি অংশ), বা সম্পূর্ণ দেহকে ১০০% মিথানলে বিচ্ছিন্ন করে একটি বিডার (২ মিমি কাঁচের পুঁতি, ২,৪০০ আরপিএম, ৯০ সেকেন্ড) দিয়ে সমজাতীয় করা হয়েছিল। টিস্যুর পরিমাণ এবং মিথানলের আয়তন নিম্নরূপ ছিল: শরীরের বাকি অংশ, ১,০০০ µl-এ ৫০টি; এমএজি, ৮০ µl-এ ৫০–১০০টি; স্ত্রী এলআরটি, ৮০ µl-এ ২৫–৫০টি। অধঃক্ষেপটিকে একই পরিমাণ মিথানল দিয়ে দ্বিতীয়বার নিষ্কাশন করা হয়েছিল। সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে কোষের ধ্বংসাবশেষ অপসারণ করা হয়েছিল। উভয় নিষ্কাশন থেকে প্রাপ্ত মিথানল একত্রিত করে নাইট্রোজেন প্রবাহের অধীনে শুকানো হয়েছিল, তারপর জলে ৮০% মিথানলের নিম্নলিখিত আয়তনে পুনরায় দ্রবীভূত করা হয়েছিল: শরীরের বাকি অংশ, ৫০ µl; এমএজি এবং স্ত্রী এলআরটি, ৩০ µl।
একটি এলসি যন্ত্রের (ভ্যানকুইশ, থার্মো ফিশার) সাথে সংযুক্ত একটি ভর বর্ণালিবীক্ষণ যন্ত্রে (আইডি-এক্স, থার্মো ফিশার) নমুনাগুলো বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ২৫ °C তাপমাত্রায় রাখা একটি ৩ µm, ১০০ × ৪.৬ মিমি কলামে (ইন্সপায়ার সি৮, ডিকমা) ৫ µl নমুনা ইনজেক্ট করা হয়েছিল। এলসি-এর জন্য সচল দশাগুলো ছিল এ (পানি, ০.১% ফরমিক অ্যাসিড) এবং বি (অ্যাসিটোনাইট্রাইল, ০.১% ফরমিক অ্যাসিড)। এলসি গ্রেডিয়েন্টটি ছিল নিম্নরূপ: ১ মিনিটের জন্য ৫% বি, তারপর ১১ মিনিটে বাড়িয়ে ১০০% বি করা হয়। ১০০% এ ৮ মিনিট থাকার পর, কলামটিকে ৪ মিনিটের জন্য ৫% বি-তে পুনরায় সাম্যাবস্থায় আনা হয়। প্রবাহের হার ছিল ০.৩ মিলি/মিনিট। এমএস উৎসে আয়নীকরণ ধনাত্মক এবং ঋণাত্মক মোডে উত্তপ্ত ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়নীকরণের মাধ্যমে সম্পন্ন করা হয়।
ম্যাস স্পেকট্রোমিটার ফুল এমএস মোডে 60,000 রেজোলিউশনে 350 থেকে 680 m/z পরিসরে ডেটা পরিমাপ করে। [M + H]+ (সমস্ত টার্গেট), [M - H2O + H]+ (সমস্ত টার্গেট), এবং [M - H]- (ফসফোরাইলেটেড টার্গেট)-এর উপর MS/MS ডেটা সংগ্রহ করা হয়েছিল। যে সমস্ত টার্গেটের জন্য কোনো স্ট্যান্ডার্ড উপলব্ধ ছিল না, তাদের একডাইসোন ​​বৈশিষ্ট্য নিশ্চিত করতে MS/MS ডেটা ব্যবহার করা হয়েছিল। নন-টার্গেটেড একডাইস্টেরয়েড শনাক্ত করার জন্য, 15%-এর বেশি আপেক্ষিক প্রাচুর্য সহ সমস্ত HPLC পিকের MS/MS ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। বিশুদ্ধ স্ট্যান্ডার্ড (20E, 3D20E) থেকে তৈরি স্ট্যান্ডার্ড কার্ভ ব্যবহার করে পরম পরিমাণ গণনা করা হয়েছিল, অথবা একটি নির্দিষ্ট নমুনার (অন্যান্য সমস্ত টার্গেট) লঘুকরণ ব্যবহার করে একজন পুরুষের মধ্যে প্রাপ্ত পরিমাণের সাথে তাদের সমতুল্যতা গণনা করা হয়েছিল। 3D20E-এর জন্য, নিম্নলিখিত অ্যাডাক্টগুলির যোগফল ব্যবহার করে পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + ট্রেসফাইন্ডার (সংস্করণ ৪.১) ব্যবহার করে ডেটা নিষ্কাশন এবং পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল। এক্সক্যালিবার (সংস্করণ ৪.৪) ব্যবহার করে MS/MS ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। E, 20E এবং 3D20E-এর MS স্পেকট্রা নিজ নিজ স্ট্যান্ডার্ডের সাথে তুলনা করা হয়েছিল। জিরার্ডের রিএজেন্ট দিয়ে ডেরিভেটাইজেশনের মাধ্যমে 3D20E22P বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। m/z অনুপাতের মাধ্যমে 20E22P বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
MAG থেকে 3D20E22P বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। HPLC-MS/MS বিশ্লেষণের মতো একই LC শর্তাধীনে, একটি কোয়াড্রপোল ভর-ভিত্তিক ডিটেক্টর (QDa, Acquity, Waters) সহ একটি আল্ট্রা-পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফ (Acquity, Waters) ব্যবহার করে বিশ্লেষণাত্মক স্কেলে বিশুদ্ধকরণ করা হয়েছিল। পূর্বে নির্ধারিত একই রিটেনশন টাইমে 3D20E22P-এর সাথে সঙ্গতিপূর্ণ m/z শনাক্ত হলে ফ্র্যাকশন সংগ্রহ শুরু করা হয়েছিল। এরপর উপরে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে HPLC-MS/MS দ্বারা নিষ্কাশিত যৌগগুলির বিশুদ্ধতা পরীক্ষা করা হয়েছিল।
প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুসরণ করে TRI রিএজেন্ট (থার্মো ফিশার) ব্যবহার করে ১০-১২টি প্রজনন টিস্যু বা শরীরের অন্যান্য অংশ (মাথাবিহীন) থেকে মোট RNA নিষ্কাশন করা হয়েছিল। RNA-কে TURBO DNase (থার্মো ফিশার) দিয়ে ট্রিট করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুসরণ করে মোলনি মুরিন লিউকেমিয়া ভাইরাস রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ (M-MLV RT; থার্মো ফিশার) ব্যবহার করে cDNA সংশ্লেষণ করা হয়েছিল। রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন কোয়ান্টিটেটিভ পিসিআর (RT-qPCR; এক্সটেন্ডেড ডেটা টেবিল ২)-এর জন্য প্রাইমারগুলো পূর্বে প্রকাশিত²⁴ অথবা প্রাইমার-ব্লাস্ট²⁶ ব্যবহার করে ডিজাইন করা হয়েছিল, যেখানে ৭০-১৫০ bp আকারের এবং এক্সন-এক্সন জংশন জুড়ে থাকা প্রোডাক্ট অথবা পৃথক এক্সনগুলোকে অন্তর্ভুক্ত করে এমন প্রাইমার পেয়ার প্রাইমারকে অগ্রাধিকার দেওয়া হয়েছিল। RT-qPCR-এর জন্য তিন থেকে চারটি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেট থেকে প্রাপ্ত cDNA নমুনাগুলোকে পানিতে চারগুণ পাতলা করা হয়েছিল। পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল ১৫ µl রেপ্লিকেট রিঅ্যাকশনে, যেখানে ছিল ১× PowerUp SYBR Green Master Mix (থার্মো ফিশার), প্রাইমার এবং ৫ µl পাতলা করা cDNA। রিঅ্যাকশনগুলো একটি মেশিনে চালানো হয়েছিল। QuantStudio 6 Pro রিয়েল-টাইম পিসিআর সিস্টেম (থার্মো ফিশার) ব্যবহার করে এবং ডিজাইন অ্যান্ড অ্যানালাইসিস (সংস্করণ 2.4.3) ব্যবহার করে ডেটা সংগ্রহ ও বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। এই গবেষণায় যেমন দেখানো হয়েছে, আপেক্ষিক পরিমাণগুলিকে রাইবোসোমাল জিন RpL19 (AGAP004422)-এর সাথে স্বাভাবিক করা হয়েছিল, যার প্রকাশ রক্ত ​​​​খাওয়া 27 বা সঙ্গম 3-এর সাথে উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হয়নি।
একটি অ্যাজিলেন্ট বায়োঅ্যানালাইজার ২১০০ বায়োঅ্যানালাইজার (অ্যাজিলেন্ট) ব্যবহার করে আরএনএ-এর গুণমান পরীক্ষা করা হয়েছিল। এমআইটি এবং হার্ভার্ডের ব্রড ইনস্টিটিউটে ইলুমিনা পেয়ার্ড-এন্ড লাইব্রেরি প্রস্তুত ও রান করা হয়েছিল। ডিফল্ট প্যারামিটারসহ HISAT2 (সংস্করণ ২.০.৫) ব্যবহার করে সিকোয়েন্সিং রিডগুলোকে এ. গ্যাম্বিআই জিনোমের (PEST স্ট্রেইন, সংস্করণ ৪.১২) সাথে অ্যালাইন করা হয়েছিল। Samtools (সংস্করণ ১.৩.১) ব্যবহার করে ম্যাপিং কোয়ালিটি (MAPQ) স্কোর <৩০ যুক্ত রিডগুলো অপসারণ করা হয়েছিল। ডিফল্ট প্যারামিটারসহ htseq-count (সংস্করণ ০.৯.১) ব্যবহার করে জিনে ম্যাপ করা রিডের সংখ্যা গণনা করা হয়েছিল। R (সংস্করণ ৪.০.৩)-এ DESeq2 প্যাকেজ (সংস্করণ ১.২৮.১) ব্যবহার করে নরমালাইজড রিড কাউন্ট গণনা করা হয়েছিল এবং ডিফারেনশিয়াল জিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
প্রথমে PSI-BLAST অ্যালগরিদম (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) ব্যবহার করে A. gambiae জিনোমে অনুসন্ধান করে একডাইসোন-সংশোধনকারী জিনের সম্ভাব্য প্রার্থী শনাক্ত করা হয়েছিল। এর জন্য ডিফল্ট প্যারামিটার মান এবং নিম্নলিখিত কোয়েরি প্রোটিন সিকোয়েন্সগুলো ব্যবহার করা হয়েছিল: Bombyx mori (অ্যাকসেশন নং NP_001038956.1), Musca domestica (অ্যাকসেশন নং XP_005182020.1, XP_005175332.1 এবং XP_011294434.1) এবং Microplitis demolitor (অ্যাকসেশন নং XP_008552646.1 এবং XP_008552645.1) থেকে প্রাপ্ত EcK, B. mori (অ্যাকসেশন নং NP_001036900) এবং Drosophila melanogaster (অ্যাকসেশন নং NP_001036900) থেকে প্রাপ্ত EcK। NP_651202), Apis mellifera (অ্যাকসেশন নং XP_394838) এবং Acyrthosiphon pisum (অ্যাকসেশন নং XP_001947166); এবং B. mori থেকে EPP (অ্যাকসেশন নং XP_001947166) NP_001177919.1 এবং NP_001243996.1) এবং D. melanogaster-এর EO (অ্যাকসেশন নং NP_572986.1) (ধাপ ১)। এরপর, গাম্বিয়ার প্রজনন কলায় (স্ত্রী LRT বা MAG) উচ্চ mRNA এক্সপ্রেশনের (>১০০ ফ্র্যাগমেন্ট/কিলোবেস এক্সন প্রতি মিলিয়ন ম্যাপড রিড (FPKM) বা >৮৫%) উপর ভিত্তি করে হিটগুলো ফিল্টার করুন (ধাপ ২)। সুনির্দিষ্টতা উন্নত করার জন্য, আমরা এমন প্রার্থী এনজাইম নির্বাচন করেছি যা A. albimanus-এর প্রজনন কলায়ও প্রকাশিত হয়। A. albimanus হলো এমন এক অ্যানোফিলিস প্রজাতি যা সঙ্গমের সময় একডাইসোন ​​সংশ্লেষণ বা স্থানান্তর করে না। A. albimanus-এর প্রজনন কলায় কম প্রকাশের (<100 FPKM বা <85তম পার্সেন্টাইল) উপর ভিত্তি করে প্রার্থী জিনগুলোকে ফিল্টার করা হয়েছিল (ধাপ ৩)। চূড়ান্ত ফিল্টার হিসেবে (ধাপ ৪), প্রার্থী জিনগুলোকে নিম্নলিখিতগুলির মধ্যে অন্তত একটি পূরণ করতে হবে: (১) ডিফারেনশিয়ালি এক্সপ্রেসড জিনের বিশ্লেষণ অনুসারে সঙ্গমের পরে উল্লেখযোগ্যভাবে আপ-রেগুলেটেড (P < 0.05) এবং (২) অ-প্রজনন কলায় (<85% বা <100 FPKM)।
সম্পূর্ণ জীবদেহের আইসোটোপিক লেবেলিং অর্জনের জন্য আমরা পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতি 28,29,30 পরিবর্তন করেছি। সংক্ষেপে, ওয়াইল্ড-টাইপ Saccharomyces cerevisiae টাইপ II (YSC2, Sigma) কে ইস্ট নাইট্রোজেন বেস (BD Difco, DF0335) কালচার মিডিয়ামে পরীক্ষা করা হয়েছিল, যেখানে (ওজন/আয়তন) ২% গ্লুকোজ (G7528, Sigma), ১.৭% অ্যামিনো অ্যাসিড-মুক্ত অ্যামোনিয়াম সালফেট এবং নাইট্রোজেনের একমাত্র উৎস হিসেবে ৫% 15N অ্যামোনিয়াম সালফেট (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) ছিল। সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে ইস্ট পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল এবং পিউপেশনে পরিণত হওয়া পর্যন্ত মশার লার্ভাকে ইচ্ছামতো খেতে দেওয়া হয়েছিল। চতুর্থ ইনস্টারের মৃত্যুহার রোধ করার জন্য ফিশমিল (প্রতি ৩০০ লার্ভার জন্য ০.৫ মিলিগ্রাম) যোগ করা হয়েছিল। এরপর শুধুমাত্র স্ত্রী মশাগুলোকে লেবেলবিহীন পুরুষ মশার সাথে মিলন পরীক্ষায় ব্যবহার করা হয়েছিল, যাতে মিলনের সময় স্থানান্তরিত পুরুষ প্রোটিওম বিশ্লেষণ করা যায়।
৪-৬ দিন বয়সী 15N-ট্যাগযুক্ত কুমারী স্ত্রী মাকড়সাদের সমবয়সী ট্যাগবিহীন কুমারী পুরুষ মাকড়সার সাথে সঙ্গমে বাধ্য করা হয়েছিল। এপিফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের নিচে মেটিং প্লাগ শনাক্ত করার মাধ্যমে সফল সঙ্গম যাচাই করা হয়েছিল। সঙ্গমের ৩, ১২ এবং ২৪ ঘন্টা পর, ৪৫-৫৫টি সঙ্গম করা স্ত্রী মাকড়সার অ্যাট্রিয়া ৫০ µl অ্যামোনিয়াম বাইকার্বোনেট বাফারে (pH ৭.৮) বিচ্ছিন্ন করে একটি পেস্টল দিয়ে পিষে সমজাতীয় করা হয়েছিল। সমজাতীয় মিশ্রণটি সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং সুপারন্যাট্যান্টটি ৫০ mM অ্যামোনিয়াম বাইকার্বোনেটে ০.১% র‍্যাপিজেস্ট (186001860, ওয়াটার্স)-এর ৫০ µl-এর সাথে মেশানো হয়েছিল। প্রতিটি নমুনার সুপারন্যাট্যান্ট এবং পেললেট ড্রাই আইসে দ্রুত হিমায়িত করা হয়েছিল এবং ওয়াশিংটন বিশ্ববিদ্যালয়ের ম্যাককস ল্যাবরেটরিতে রাতারাতি পাঠানো হয়েছিল, যেখানে LC-MS/MS-এর জন্য নমুনা প্রস্তুতির কাজ সম্পন্ন করা হয়েছিল। পেললেটটি ৫০ µl ০.১% দ্রবণে পুনরায় সাসপেন্ড করুন। র‍্যাপিজেস্টকে ৫০ mM অ্যামোনিয়াম বাইকার্বোনেটে দ্রবীভূত করে ওয়াটার বাথে সনিকেট করা হয়েছিল। পেললেট এবং সুপারন্যাট্যান্টের প্রোটিন ঘনত্ব বিসিএ অ্যাসে (BCA assay) দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল। নমুনাগুলিকে ৫ mM ডাইথিওথ্রিটল (DTT; সিগমা) দিয়ে রিডিউস করা হয়েছিল, ১৫ mM আয়োডোঅ্যাসিটামাইড (সিগমা) দিয়ে অ্যালকাইলেটেড করা হয়েছিল এবং ৩৭ °C তাপমাত্রায় (১:০:৫০ অনুপাতে ট্রিপসিনাইজেশন: ট্রিপসিন: সাবস্ট্রেট) ১ ঘন্টা ধরে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। ২০০ mM HCl যোগ করে র‍্যাপিজেস্টকে লাইস করা হয়েছিল, এরপর ৩৭ °C তাপমাত্রায় ৪৫ মিনিট ইনকিউবেট করা হয়েছিল এবং ডেব্রিস অপসারণের জন্য ৪ °C তাপমাত্রায় ১৪,০০০ rpm গতিতে ১০ মিনিট সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। নমুনাগুলিকে ডুয়াল-মোড সলিড-ফেজ এক্সট্র্যাকশন (Oasis MCX কার্টিজ, ওয়াটার্স) দ্বারা ধৌত করা হয়েছিল এবং ০.১% ফরমিক অ্যাসিডে পুনরায় সাসপেন্ড করে চূড়ান্ত প্রোটিনের ঘনত্ব ০.৩৩ µg µl-1 করা হয়েছিল। একইভাবে কুমারী পুরুষদের প্রোটিওম বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। প্রতিটি নমুনার জন্য দুটি বিশ্লেষণাত্মক প্রতিলিপি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। এরপর, প্রতিটির ১ µg পরিমাণ নমুনা, জুপিটার C12 রিভার্সড-ফেজ রেজিন (ফেনোমেনেক্স) দ্বারা প্যাক করা একটি ৪-সেমি ফিউজড সিলিকা ক্যাসিল১ (PQ) ফ্রিট ট্র্যাপসহ একটি ২৫-সেমি ফিউজড সিলিকা ৭৫-μm কলাম এবং ১৮০-মিনিটের লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। নমুনা ডাইজেস্ট – MS/MS একটি Q-Exactive HF মাস স্পেকট্রোমিটার (থার্মো ফিশার) এবং একটি nanoACQUITY UPLC সিস্টেম (ওয়াটার্স) ব্যবহার করে চালানো হয়েছিল। প্রতিটি রানের জন্য উৎপন্ন ডেটা-সম্পর্কিত অ্যাকুইজিশন ডেটা Proteowizard (সংস্করণ 3.0.20287) এবং Comet31 (সংস্করণ 3.2) ব্যবহার করে mzML ফরম্যাটে রূপান্তরিত করা হয়েছিল। এই রূপান্তরটি Anopheles gambiae (VectorBase সংস্করণ 54), Anopheles coluzzi-এর প্রোটিন সিকোয়েন্স ধারণকারী FASTA ডেটাবেসের বিপরীতে করা হয়েছিল। Mali-NIH (VectorBase সংস্করণ 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, মার্চ 2021), A. gambiae RNA-seq, এবং পরিচিত মানব দূষকের থ্রি-ফ্রেম ট্রান্সলেশনের উপর অনুসন্ধান চালানো হয়েছিল। পেপটাইড ম্যাপের সাথে মিলে যাওয়া FDR-গুলি Percolator32 (সংস্করণ 3.05) ব্যবহার করে 0.01-এর থ্রেশহোল্ডে নির্ধারণ করা হয়েছিল, এবং পেপটাইডগুলিকে প্রোটিন পার্সিমনি ব্যবহার করে প্রোটিন শনাক্তকরণে একত্রিত করা হয়েছিল। লাইমলাইট৩৩ (সংস্করণ ২.২.০)। পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে প্রতিটি রানে প্রতিটি প্রোটিনের জন্য গণনা করা নর্মালাইজড স্পেকট্রাল অ্যাবানডেন্স ফ্যাক্টর (NSAF) ব্যবহার করে আপেক্ষিক প্রোটিন প্রাচুর্য অনুমান করা হয়েছিল। দুটি ভিন্ন বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেটের নমুনাগুলো থেকে প্রতিটি প্রোটিনের সাপেক্ষে NSAF-এর গড় নেওয়া হয়েছিল। 15N লেবেলিং সফলভাবে স্ত্রী প্রোটিওমকে মাস্ক করেছিল, যদিও লেবেলযুক্ত কুমারী নমুনাগুলো থেকে অল্প পরিমাণে লেবেলবিহীন প্রোটিন শনাক্ত করা সম্ভব হয়েছিল। আমরা শুধুমাত্র টেকনিক্যাল রানগুলোতে স্ত্রী কাঁচা নমুনায় পুরুষ প্রোটিনের হ্রাস (১-৫ স্পেকট্রা) শনাক্ত করেছি, যেখানে HPLC “ক্যারি ওভার”-এর ফলে পুরুষ/মিলন নমুনার পরে কাঁচা নমুনাগুলো চালানো হয়েছিল। লেবেলযুক্ত কুমারী নমুনাগুলো থেকে 'দূষক' হিসেবে মাঝে মাঝে পাওয়া প্রোটিনগুলো সাপ্লিমেন্টারি টেবিল ১-এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে।
জেনস্ক্রিপ্টে দুটি অ্যান্টিজেনিক পেপটাইড, QTTDRVAPAPDQQQ (আইসোটাইপ PA-এর মধ্যে) এবং MESDGTTPSGDSEQ (আইসোটাইপ PA এবং PB-এর মধ্যে) ছিল। পেপটাইড দুটিকে একত্রিত করে, তারপর বাহক প্রোটিন KLH-এর সাথে সংযুক্ত করা হয় এবং নিউজিল্যান্ডের খরগোশের দেহে ইনজেকশন দেওয়া হয়। চতুর্থ ইনজেকশনের পর খরগোশগুলোকে বলি দেওয়া হয় এবং অ্যাফিনিটি পিউরিফিকেশনের মাধ্যমে মোট IgG পৃথক করা হয়। সবচেয়ে বেশি EPP-নির্দিষ্ট খরগোশ থেকে প্রাপ্ত IgG পরবর্তী ওয়েস্টার্ন ব্লটিংয়ের জন্য ব্যবহার করা হয়।
ওয়েস্টার্ন ব্লটের জন্য, ৪-দিন বয়সী কুমারী পুরুষ মশা এবং কুমারী বা জোরপূর্বক সঙ্গম করানো স্ত্রী মশা (<১০ সঙ্গম-পরবর্তী) থেকে সংগৃহীত MAG (n = ১০, যেখানে n জৈবিকভাবে স্বাধীন মশার নমুনার সংখ্যা নির্দেশ করে) এবং স্ত্রী LRT (n = ৩০) নমুনা আলাদাভাবে যোগ করা হয়েছিল। এরপর প্রোটিন নিষ্কাশন বাফার (৫০ mM ট্রিস, pH ৮.০; ১% NP-৪০; ০.২৫% সোডিয়াম ডিঅক্সিকোলেট; ১৫০ mM NaCl; ১ mM EDTA; ১× প্রোটিয়েজ ইনহিবিটর ককটেল (রোশ)) যোগ করা হয়েছিল। নমুনাগুলো ব্যবচ্ছেদের পরপরই একটি বিডার (২ মিমি কাচের পুঁতি, ২,৪০০ rpm, ৯০ সেকেন্ড) দিয়ে সমজাতীয় করা হয়েছিল। ৪ °C তাপমাত্রায় ২০,০০০ g-তে সেন্ট্রিফিউগেশন করে অদ্রবণীয় আবর্জনা অপসারণ করা হয়েছিল। ব্র্যাডফোর্ড অ্যাসে (বায়ো-র‍্যাড) দ্বারা প্রোটিনের পরিমাণ নির্ণয় করা হয়েছিল। তারপর, ২০ µg MAG প্রোটিন, ৪০ µg LRT প্রোটিন এবং ২০ µg LRT প্রোটিন সংগ্রহ করা হয়েছিল। µg পরিমাণ অবশিষ্ট বাল্ক প্রোটিনকে ডিন্যাচার করা হয়েছিল এবং MOPS বাফার ব্যবহার করে 10% Bis-Tris NuPAGE দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল। iBlot2 ট্রান্সফার সিস্টেম (থার্মো ফিশার) ব্যবহার করে প্রোটিনগুলিকে পলিভিনাইলিডিন ফ্লোরাইড মেমব্রেনে স্থানান্তর করা হয়েছিল। মেমব্রেনগুলিকে 1× PBS-T (PBS-এ 0.1% Tween-20) দিয়ে দুইবার ধোয়া হয়েছিল এবং তারপর 22°C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য Odyssey ব্লকিং বাফার (Li-Cor) দিয়ে ব্লক করা হয়েছিল। মেমব্রেনগুলিকে 4 °C তাপমাত্রায় সারারাত ধরে কাস্টম র‍্যাবিট অ্যান্টি-EPP পলিক্লোনাল প্রাইমারি অ্যান্টিবডি (ব্লকিং বাফারে 1:700) এবং র‍্যাট অ্যান্টি-অ্যাকটিন মনোক্লোনাল প্রাইমারি অ্যান্টিবডি MAC237 (Abeam; 1:4,000) দিয়ে ঝাঁকানো হয়েছিল। মেমব্রেনগুলিকে PBS-T দিয়ে ধোয়া হয়েছিল এবং তারপর সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (ডঙ্কি অ্যান্টি-র‍্যাবিট 800CW এবং গোট অ্যান্টি-র‍্যাট 680LT (Li-Cor), উভয়ই 1:20,000) সহ ব্লকিং বাফারে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। ২২ ডিগ্রি সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ১ ঘন্টার জন্য ০.০১% এসডিএস এবং ০.২% টুইন-২০ ব্যবহার করা হয়েছিল। মেমব্রেনগুলো পিবিএস-টি দিয়ে ধুয়ে একটি ওডিসি সিএলএক্স স্ক্যানার দিয়ে ছবি তোলা হয়েছিল। ছবিগুলো ইমেজ স্টুডিও (সংস্করণ ৫.২)-এ সংগ্রহ ও প্রক্রিয়াজাত করা হয়েছিল। ইপিপি-আরএ আইসোফর্মের (৮২ কেডিএ) সাথে সঙ্গতিপূর্ণ একটি নির্দিষ্ট ব্যান্ড শনাক্ত করা যায়নি।
EPP (হিস্টিডিন ফসফাটেজ ডোমেন ধারণকারী আইসোফর্ম AGAP002463-RB হিসেবে, NCBI সংরক্ষিত ডোমেন অনুসন্ধান ৩৪) এবং EcK2 (AGAP002181)-এর কোডিং অঞ্চলসমূহ pET-21a(+) প্লাজমিডে (Novagen Millipore Sigma) ক্লোন করা হয়েছিল; প্রাইমারগুলো এক্সটেন্ডেড ডেটা টেবিল ২-এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। pET-21a(+)-EcK2 কনস্ট্রাক্টের C-টার্মিনাল 6xHis ট্যাগের আগে আটটি GS4 লিঙ্কার (ট্যান্ডেমভাবে) সন্নিবেশিত করা হয়েছিল। NEBExpress সেল-ফ্রি ই. কোলাই প্রোটিন সিন্থেসিস রিঅ্যাকশন (নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস) ব্যবহার করে রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিনগুলো উৎপাদিত হয়েছিল। NEBExpress Ni স্পিন কলাম (নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস) ব্যবহার করে রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিনগুলো বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। NEBExpress সেল-ফ্রি ই. কোলাই প্রোটিন সিন্থেসিস কিট থেকে প্রাপ্ত ডিএনএ টেমপ্লেট ব্যবহার করে ডাইহাইড্রফোলেট রিডাক্টেজ (DHFR) কন্ট্রোল প্রোটিনটি উৎপাদিত হয়েছিল। প্রোটিনগুলো PBS-এ ৫০% গ্লিসারলে -২০ °C তাপমাত্রায় ৩ মাস পর্যন্ত সংরক্ষণ করা হয়েছিল।
৪-নাইট্রোফেনাইল ফসফেট (পিএনপিপি; সিগমা-অলড্রিচ) ব্যবহার করে ইপিপি এবং টিস্যু নির্যাসের ফসফাটেজ সক্রিয়তা পরিমাপ করা হয়েছিল। বিক্রিয়া বাফারে ছিল ২৫ mM ট্রিস, ৫০ mM অ্যাসিটিক অ্যাসিড, ২৫ mM বিস-ট্রিস, ১৫০ mM NaCl, ০.১ mM EDTA, এবং ১ mM DTT। বিক্রিয়া বাফারে টিস্যুকে সমজাতীয় করা হয়েছিল এবং সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে কোষের ধ্বংসাবশেষ অপসারণ করা হয়েছিল। ২.৫ mg ml-1 পিএনপিপি যুক্ত বিক্রিয়া বাফারে এনজাইম বা টিস্যু নির্যাস যোগ করে বিক্রিয়া শুরু করা হয়েছিল। বিক্রিয়া মিশ্রণটিকে ঘরের তাপমাত্রায় অন্ধকারে ইনকিউবেট করা হয়েছিল এবং বিভিন্ন সময়ে ৪০৫ nm-এ শোষণ পরিমাপ করে পিএনপিপি থেকে রূপান্তরিত পিএনপি-র পরিমাণ নির্ণয় করা হয়েছিল।
ইন ভিট্রো EcK অ্যাক্টিভিটির জন্য, প্রোটিনটিকে 0.2 mg 20E বা 3D20E-এর সাথে 200 µl বাফারে (pH 7.5) ইনকিউবেট করা হয়েছিল, যেটিতে 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP এবং 10 mM MgCl2 ছিল। এই ইনকিউবেশনটি 27 °C তাপমাত্রায় 2 ঘন্টা ধরে করা হয়েছিল। 800 µl মিথানল যোগ করে বিক্রিয়াটি বন্ধ করা হয়েছিল, তারপর -20 °C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টা ধরে ঠান্ডা করা হয়েছিল, এবং সবশেষে 4 °C তাপমাত্রায় 20,000 g-তে 10 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। এরপর সুপারন্যাট্যান্টটি HPLC-MS/MS দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। কন্ট্রোল গ্রুপে ব্যবহৃত প্রোটিনগুলিকে তাপ-নিষ্ক্রিয় করার জন্য, প্রোটিনগুলিকে PBS-এ 50% গ্লিসারলে 95°C তাপমাত্রায় 20 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল।
ইন ভিট্রো EPP অ্যাক্টিভিটির জন্য, প্রোটিনটিকে 3D20E22P (যা HPLC-MS/MS দ্বারা বিশুদ্ধকৃত ১৮ জোড়া MAG-তে প্রাপ্ত পরিমাণের সমতুল্য) এর সাথে 100 µl বাফারে (pH 7.5) 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, এবং 1 mM DTT সহ 27 °C তাপমাত্রায় ৩ ঘন্টা ধরে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। 400 µl মিথানল যোগ করে বিক্রিয়াটি বন্ধ করা হয় এবং -20 °C তাপমাত্রায় ১ ঘন্টার জন্য ঠান্ডা করা হয়, তারপর 4 °C তাপমাত্রায় 20,000 g-তে ১০ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়। সুপারন্যাট্যান্টটি HPLC-MS/MS দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
মিশ্র-লিঙ্গের মাথাবিহীন মশার মৃতদেহ থেকে প্রস্তুতকৃত সিডিএনএ থেকে EPP (৩৬২ বিপি), EcK1 (AGAP004574, ৩৬৫ বিপি) এবং EcK2 (৫৫৬ বিপি)-এর জন্য পিসিআর খণ্ডগুলি বিবর্ধিত করা হয়েছিল। পূর্বে বর্ণিত pCR2.1-eGFP থেকে eGFP কন্ট্রোলের (৪৯৫ বিপি) পিসিআর খণ্ডটি বিবর্ধিত করা হয়েছিল। PCR প্রাইমারগুলো এক্সটেন্ডেড ডেটা টেবিল ২-এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। PCR খণ্ডটি pL4440 প্লাজমিডের ইনভার্টেড T7 প্রোমোটারের মধ্যে প্রবেশ করানো হয়েছিল। প্লাজমিড কনস্ট্রাক্টগুলো NEB 5-α কম্পিটেন্ট E. coli (নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস) থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং ব্যবহারের আগে ডিএনএ সিকোয়েন্সিং দ্বারা যাচাই করা হয়েছিল (ইনসার্ট সিকোয়েন্সের জন্য সাপ্লিমেন্টারি ডেটা ১ দেখুন)। pL4440-ভিত্তিক প্লাজমিড থেকে ইনসার্টটি অ্যামপ্লিফাই করার জন্য T7 প্রোমোটারের সাথে মিলে যাওয়া প্রাইমারগুলো (এক্সটেন্ডেড ডেটা টেবিল ২) ব্যবহার করা হয়েছিল। PCR প্রোডাক্টের আকার অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল। dsRNA, Megascript T7 Transcription Kit (থার্মো ফিশার) ব্যবহার করে PCR টেমপ্লেট থেকে ট্রান্সক্রাইব করা হয়েছিল এবং পূর্বে বর্ণিত পরিবর্তনসহ প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুসারে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল।
dsRNA ইনজেকশনের জন্য, ডিম ফুটে বের হওয়ার ১ দিনের মধ্যে প্রাপ্তবয়স্ক পুরুষ বা স্ত্রী মাকড়সার বক্ষে (ন্যানোজেক্ট III, ড্রামন্ড) ১০ ng nl-1 ঘনত্বে ১,৩৮০ ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ইনজেক্ট করা হয়েছিল। RNA নিষ্কাশন, cDNA সংশ্লেষণ এবং RT-qPCR-এর মাধ্যমে কমপক্ষে তিনটি বায়োলজিক্যাল রেপ্লিকেটে জিন নকডাউনের মাত্রা নির্ধারণ করা হয়েছিল। একডাইসোন ​​ইনজেকশনের জন্য, ৪-দিন বয়সী কুমারী অথবা ৬-দিন বয়সী কুমারী রক্ত-খাওয়ানো স্ত্রী মাকড়সাকে ​​পরীক্ষামূলক নকশার উপর নির্ভর করে যথাক্রমে ১.৩, ২.১, অথবা ৬.৩ ng nl-1 ঘনত্বে ০.১৩, ০.২১, বা ০.৬৩ µg 20E বা 3D20E (ন্যানোজেক্ট III, ড্রামন্ড) ইনজেক্ট করা হয়েছিল। ১০০ nl ১০% (vol/vol) ইথানল ইনজেক্ট করুন। জল; ১০% ইথানলে ১০০ এনএল 3D20E22P (যা একজোড়া MAG-এ প্রাপ্ত পরিমাণের ৭৫%-এর সমতুল্য)। মশাগুলোকে দৈবচয়নের ভিত্তিতে ইনজেকশন গ্রুপে অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল।
প্রজনন পরীক্ষার জন্য, ৩ দিন বয়সী স্ত্রী মশাদের ইচ্ছামতো মানুষের রক্ত ​​খাওয়ানো হয়েছিল। আংশিকভাবে খাওয়া বা না-খাওয়া মশাগুলোকে সরিয়ে ফেলুন। পরীক্ষার ধরনের ওপর নির্ভর করে, রক্ত ​​খাওয়ার অন্তত ৪৮ ঘণ্টা পর স্ত্রী মশাগুলোকে চার রাতের জন্য আলাদা আলাদা প্রজনন পাত্রে রাখা হয়েছিল। একটি স্টেরিওস্কোপের (Stemi 508, Zeiss) নিচে ডিম গণনা করা হয়েছিল; সঙ্গম করা স্ত্রী মশার ক্ষেত্রে, যে ডিম ফুটে লার্ভা হয়েছিল সেগুলোকে উর্বর বলে গণ্য করা হয়েছিল।
প্রজনন পরীক্ষার জন্য, ট্রিটমেন্টের উপর নির্ভর করে স্ত্রী পোকাদের প্রজননের বিরুদ্ধে প্রতিরোধ ক্ষমতা গড়ে তোলার জন্য কমপক্ষে ২ দিন সময় দেওয়া হয়েছিল এবং পরবর্তীতে একই বয়সের ওয়াইল্ড-টাইপ পুরুষ পোকাদের একই খাঁচায় প্রবেশ করানো হয়েছিল। দুই রাত পরে, স্ত্রী পোকার নিষিক্ত ভেসিকলগুলো ব্যবচ্ছেদ করা হয়েছিল এবং ১০ mM ট্রিস-এইচসিএল, ১ mM ইডিটিএ, এবং ২৫ mM NaCl (pH ৮.২) যুক্ত একটি বাফারে ফ্রিজ-থ এবং সনিকেশনের মাধ্যমে জিনোমিক ডিএনএ মুক্ত করা হয়েছিল। নমুনাগুলোকে ৫৫ °C তাপমাত্রায় ১৫ মিনিটের জন্য প্রোটিয়েজ কে (০.৮৬ µg µl-1) দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল, এরপর ৯৫ °C তাপমাত্রায় ১০ মিনিট রাখা হয়েছিল। অপরিশোধিত জিনোমিক ডিএনএ প্রস্তুতিগুলোকে ১০-গুণ পাতলা করা হয়েছিল এবং Y ক্রোমোজোম সিকোয়েন্সের qPCR সনাক্তকরণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল; প্রাইমারগুলো এক্সটেন্ডেড ডেটা টেবিল ২-এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। Y ক্রোমোজোম সিকোয়েন্সের অনুপস্থিতি কোনো প্রজনন না হওয়াকে নির্দেশ করে।
পুনঃমিলন পরীক্ষার জন্য, জোরপূর্বক মিলন করানো স্ত্রী মাকড়সাদের মিলন অবস্থা নিশ্চিত করতে মিলন প্লাগের উপস্থিতি পরীক্ষা করা হয়েছিল এবং পুরুষ মাকড়সার অনুপস্থিতিতে মিলনে অনীহা তৈরি হওয়ার জন্য ২ দিন সময় দেওয়া হয়েছিল, যেমনটি পূর্বে বর্ণিত হয়েছে 36। এরপর DsRed ট্রান্সজেনিক শুক্রাণু বহনকারী পুরুষ মাকড়সাদের স্ত্রী মাকড়সার খাঁচায় প্রবেশ করানো হয়েছিল। দুই রাত পরে, স্ত্রী মাকড়সাদের থেকে নিষেক থলিগুলো বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল, এবং উপরে বর্ণিত পদ্ধতিতে জিনোমিক ডিএনএ প্রস্তুত করে DsRed ট্রান্সজিনের qPCR সনাক্তকরণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল; প্রাইমারগুলো এক্সটেন্ডেড ডেটা টেবিল 2-এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। DsRed ট্রান্সজিনের অনুপস্থিতি নির্দেশ করে যে কোনো পুনঃমিলন ঘটেনি।
3D20E পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে সংশ্লেষিত করা হয়েছিল 37। সংক্ষেপে, 10 মিলিগ্রাম 20E (সিগমা-অলড্রিচ) 10 মিলি জলে দ্রবীভূত করা হয়েছিল, এরপর 30 মিলিগ্রাম প্লাটিনাম ব্ল্যাক (গুঁড়ো আকারে, সিগমা-অলড্রিচ) যোগ করা হয়েছিল। বিক্রিয়া মিশ্রণে ক্রমাগত O2 এর একটি মৃদু প্রবাহ চালনা করা হয়েছিল, যা ঘরের তাপমাত্রায় নাড়ানো হচ্ছিল। 6 ঘন্টা পরে, বিক্রিয়া বন্ধ করার জন্য 30 মিলি মিথানল যোগ করা হয়েছিল। অনুঘটক কণা অপসারণের জন্য মিশ্রণটি সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। সুপারন্যাট্যান্ট ঘরের তাপমাত্রায় ভ্যাকুয়ামে শুকিয়ে ফেলা হয়েছিল। শুকনো বিক্রিয়া পণ্যটি HPLC-MS/MS বিশ্লেষণের জন্য ইনজেকশনের জন্য 10% ইথানল এবং মিথানলে দ্রবীভূত করা হয়েছিল। রূপান্তরের হার (20E থেকে 3D20E) ছিল প্রায় 97% (চিত্র 4b), এবং সংশ্লেষিত 3D20E এর MS স্পেকট্রাম সঙ্গম করা স্ত্রী পোকাদের মধ্যে পাওয়া স্পেকট্রামের সাথে মিলে গিয়েছিল (চিত্র 4c)।
লেজেন্ডে সম্পাদিত পরিসংখ্যানগত পরীক্ষাগুলোর সুনির্দিষ্ট বিবরণ রয়েছে। ফিশারের এক্সাক্ট টেস্ট, ম্যানটেল-কক্স টেস্ট এবং স্টুডেন্ট'স টি-টেস্ট সম্পাদনের জন্য গ্রাফপ্যাড (সংস্করণ ৯.০) ব্যবহার করা হয়েছিল। একটি কাস্টম আর স্ক্রিপ্ট (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test-এ উপলব্ধ) ব্যবহার করে ককরেন-ম্যানটেল-হ্যানজেল টেস্টগুলো সম্পাদন করা হয়েছিল। ০.০৫-এর তাৎপর্য থ্রেশহোল্ড সহ শাপিরো-উইল্ক টেস্ট ব্যবহার করে ডেটা ডিস্ট্রিবিউশনের নর্মালিটি পরীক্ষা করা হয়েছিল। যখন ডেটা নর্মালিটি পরীক্ষায় উত্তীর্ণ হতে পারেনি, তখন ম্যান-হুইটনি টেস্ট সম্পাদন করা হয়েছিল। ম্যানটেল-কক্স টেস্ট ব্যবহার করে সারভাইভাল ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। আরএনএ-সিক জিন-স্তরের ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ সম্পাদনের জন্য DESeq2 প্যাকেজ (সংস্করণ ১.২৮.১) ব্যবহার করা হয়েছিল। গ্রাফের হরাইজন্টাল বারটি মিডিয়ানকে প্রতিনিধিত্ব করে। সমস্ত পরীক্ষার জন্য থ্রেশহোল্ড হিসাবে P = ০.০৫-এর একটি তাৎপর্য মান ব্যবহার করা হয়েছিল।
গবেষণাটির নকশা সম্পর্কে আরও তথ্যের জন্য, এই নিবন্ধের সাথে সংযুক্ত নেচার রিসার্চ রিপোর্টের সারসংক্ষেপটি দেখুন।
MS প্রোটিওমিক ডেটা PRIDE পার্টনার রিপোজিটরি (https://www.ebi.ac.uk/pride/) এর মাধ্যমে ProteomeXchange কনসোর্টিয়ামে (http://proteomecentral.proteomexchange.org) PXD032157 ডেটাসেট আইডেন্টিফায়ার সহ জমা দেওয়া হয়েছে।
আরএনএ-সিক ডেটাসেটটি জিন এক্সপ্রেশন কম্প্রিহেনসিভ লাইব্রেরিতে (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) GSE198665 ক্রমিক রেকর্ডের অধীনে জমা করা হয়েছে।
বর্তমান গবেষণাকালে তৈরি এবং/অথবা বিশ্লেষণ করা অতিরিক্ত ডেটাসেট যুক্তিসঙ্গত অনুরোধের ভিত্তিতে সংশ্লিষ্ট লেখকদের কাছ থেকে সংগ্রহ করা যেতে পারে। এই নিবন্ধটি তথ্যের উৎস প্রদান করে।
ডি লুফ, এ. একডাইস্টেরয়েড: উপেক্ষিত পতঙ্গ যৌন স্টেরয়েড? পুরুষ: ব্ল্যাক বক্স। পতঙ্গ বিজ্ঞান। ১৩, ৩২৫–৩৩৮ (২০০৬)।
রেডফার্ন, সিপিএফ ২০-হাইড্রোক্সিএকডাইসোন ​​এবং অ্যানোফিলিস স্টিফেনস-এর ডিম্বাশয়ের বিকাশ। জে. ইনসেক্ট ফিজিওলজি। ২৮, ৯৭–১০৯ (১৯৮২)।