Nature.com পরিদর্শন করার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি যে ব্রাউজার সংস্করণটি ব্যবহার করছেন তাতে CSS-এর জন্য সীমিত সমর্থন রয়েছে। সেরা অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি আপডেট করা ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিচ্ছি (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্যতা মোড বন্ধ করুন)। ইতিমধ্যে, অব্যাহত সমর্থন নিশ্চিত করার জন্য, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই সাইটটি প্রদর্শন করব।
মেরুদণ্ডী প্রাণীদের বিপরীতে, পোকামাকড়ের পুরুষ-পক্ষপাতদুষ্ট যৌন স্টেরয়েড হরমোনের অভাব রয়েছে বলে ব্যাপকভাবে ধারণা করা হয়। অ্যানোফিলিস গাম্বিয়াতে, একডিসোন স্টেরয়েড 20-হাইড্রোক্সাইকডাইসোন ​​(20E) বিবর্তিত হয়েছে বলে মনে হয় যখন স্ত্রী দ্বারা সংশ্লেষিত হয় তখন ডিমের বিকাশ নিয়ন্ত্রণ করে এবং পুরুষ দ্বারা যৌন স্থানান্তরের সময় একটি মিলন অবাধ্য সময়কাল প্ররোচিত করে। যেহেতু ডিমের বিকাশ এবং মিলন অপরিহার্য প্রজনন বৈশিষ্ট্য, তাই স্ত্রী অ্যানোফিলিস মশা কীভাবে এই হরমোন সংকেতগুলিকে একীভূত করে তা বোঝা নতুন ম্যালেরিয়া নিয়ন্ত্রণ প্রোগ্রামের নকশাকে সহজতর করতে পারে। এখানে, আমরা প্রকাশ করি যে এই প্রজনন ফাংশনগুলি একডিস্টেরয়েড-সক্রিয়/নিষ্ক্রিয় এনজাইমের একটি জটিল নেটওয়ার্কের মাধ্যমে স্বতন্ত্র যৌন স্টেরয়েড দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়। আমরা একটি পুরুষ-নির্দিষ্ট অক্সিডাইজড একডিসোন, 3-ডিহাইড্রো-20E (3D20E) সনাক্ত করেছি, যা যৌন স্থানান্তরের পরে মহিলাদের যৌন গ্রহণযোগ্যতা বন্ধ করে পিতৃত্ব রক্ষা করে এবং ডিফসফোরাইলেশন দ্বারা সক্রিয়করণ করে। উল্লেখযোগ্যভাবে, 3D20E স্থানান্তর প্লাজমোডিয়াম সংক্রমণের সময় ডিমের বিকাশ বজায় রাখে এমন প্রজনন জিনের প্রকাশকেও প্ররোচিত করে, সংক্রামিত মহিলাদের স্বাস্থ্য নিশ্চিত করে। মহিলা-প্রাপ্ত 20E যৌন প্রতিক্রিয়া সৃষ্টি করে না, তবে 20E-ইনহিবিটিং কাইনেস বাধাপ্রাপ্ত হওয়ার পরে সঙ্গমকারী ব্যক্তিদের ডিম পাড়ার অনুমতি দেয়। এই পুরুষ-নির্দিষ্ট পোকামাকড়ের স্টেরয়েড হরমোনের সনাক্তকরণ এবং মহিলাদের যৌন গ্রহণযোগ্যতা, উর্বরতা এবং প্লাজমোডিয়ামের সাথে মিথস্ক্রিয়া নিয়ন্ত্রণে এর ভূমিকা ম্যালেরিয়া-সংক্রমণকারী মশার প্রজনন সাফল্য হ্রাস করার সম্ভাবনার ইঙ্গিত দেয়।
মানুষের ম্যালেরিয়া পরজীবীর একমাত্র বাহক অ্যানোফিলিস মশার ব্যাপক কীটনাশক প্রতিরোধের কারণে ম্যালেরিয়ার ঘটনা এবং মৃত্যু আবারও বৃদ্ধি পাচ্ছে। এই মশার মিলন জীববিজ্ঞান নতুন ম্যালেরিয়া নিয়ন্ত্রণ হস্তক্ষেপের জন্য একটি বিশেষ আকর্ষণীয় লক্ষ্য কারণ স্ত্রী মশারা কেবল একবারই মিলিত হয়; এই একক মিলন প্রক্রিয়াটি জীবাণুমুক্ত করার ফলে মাঠে মশার সংখ্যা হ্রাস করার সম্ভাবনা অনেক বেশি।
পুরুষদের কাছ থেকে উচ্চ-টাইটার স্টেরয়েড হরমোন গ্রহণের পর মহিলারা যৌন অক্ষম হয়ে পড়েন। গবেষণায় দেখা গেছে যে আরও মিলনে অসুবিধার কারণ হল 20-হাইড্রোক্সাইকডাইসোন ​​(20E), একটি স্টেরয়েড হরমোন যা লার্ভা পর্যায়ে গলন চক্রের নিয়ন্ত্রক হিসাবে বেশি পরিচিত। পুরুষদের 20E সংশ্লেষণ এবং স্থানান্তর করার ক্ষমতা বিশেষভাবে অ্যানোফিলিস প্রজাতির মধ্যে বিকশিত হয়েছে যারা সাবজেনাস সেলিয়া7 এর অংশ, যা আফ্রিকায় বিতরণ করা হয় এবং ম্যালেরিয়ার সবচেয়ে বিপজ্জনক বাহক অন্তর্ভুক্ত করে, যার মধ্যে অ্যানোফিলিস গাম্বিয়াও রয়েছে। এটি বিশেষভাবে উল্লেখযোগ্য কারণ এই প্রজাতির মহিলারাও প্রতিটি রক্ত ​​খাওয়ার পরে 20E উৎপন্ন করে এবং 20E ওজেনেসিস চক্রকে চালিত করে (রেফারেন্স 8 দেখুন)। তবে, কীভাবে মহিলারা তাদের নিজস্ব সঙ্গমের ক্ষমতার সাথে আপস না করে একডিসোনের দুটি ভিন্ন উৎস (পুরুষ স্থানান্তর এবং রক্ত ​​খাওয়ানোর প্রবর্তন) থেকে সংকেতগুলিকে একীভূত করে সে সম্পর্কে খুব কমই জানা যায়। প্রকৃতপক্ষে, যদি মহিলাদের দ্বারা উৎপাদিত 20E যৌন অসহিষ্ণুতা সৃষ্টি করে, তবে এটি কুমারী-খাওয়ানো ব্যক্তিদের মধ্যে বন্ধ্যাত্বের দিকে পরিচালিত করবে, এই মশার ক্ষেত্রে একটি খুব সাধারণ আচরণ।
একটি সম্ভাব্য ব্যাখ্যা হল যে A. gambiae পুরুষরা একটি পরিবর্তিত পুরুষ-নির্দিষ্ট একডাইসোন ​​স্থানান্তর করে, যা স্ত্রী প্রজনন নালীতে একটি সংকেত ক্যাসকেড সক্রিয় করে, যার ফলে মিলন অস্থিরতা দেখা দেয়। যাইহোক, যদিও মেরুদণ্ডী প্রাণীদের একাধিক স্টেরয়েড হরমোন থাকে, যেমন ইস্ট্রোজেন এবং অ্যান্ড্রোজেন (রেফারেন্স 9 এ পর্যালোচনা করা হয়েছে), আমাদের জ্ঞান অনুসারে, পোকামাকড়ের মধ্যে অ্যান্ড্রোজেনিক-পক্ষপাতদুষ্ট স্টেরয়েড সনাক্ত করা যায়নি।
আমরা সম্ভাব্য পরিবর্তনশীল স্টেরয়েডের সন্ধানে যৌনভাবে পরিণত A. gambiae-এর পুরুষ আনুষঙ্গিক গ্রন্থিতে (MAG) স্টেরয়েড হরমোনের ভাণ্ডার নির্ধারণের জন্য বেরিয়েছিলাম। পূর্বে ব্যবহৃত কম নির্দিষ্ট পদ্ধতির পরিবর্তে উচ্চ কার্যকারিতার তরল ক্রোমাটোগ্রাফি এবং ট্যান্ডেম ভর স্পেকট্রোমেট্রি (HPLC-MS/MS) ব্যবহার করে, আমরা এই টিস্যুতে ecdysone (E) এবং 20E সনাক্ত করেছি, যা পূর্ববর্তী ফলাফল নিশ্চিত করে। যাইহোক, নমুনাটিতে অক্সিডাইজড ফসফোরাইলেটেড স্টেরয়েডের প্রাধান্য ছিল, যা সূত্র 3-ডিহাইড্রো-20E-22-ফসফেট (3D20E22P)12 (চিত্র 1) এর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। অন্যান্য ফর্মগুলির মধ্যে রয়েছে 3-ডিহাইড্রো-20E (3D20E) এবং 20E-22-ফসফেট (20E22P)। 3D20E22P-এর HPLC-MS/MS সংকেত তীব্রতা তার ডিফসফোরাইলেটেড ফর্ম, 3D20E-এর চেয়ে দুই ক্রম বেশি এবং E এবং 20E-এর চেয়ে তিন ক্রম বেশি ছিল (চিত্র ১)। যদিও শরীরের অন্যান্য অংশে এবং নিম্ন প্রজনন ট্র্যাক্টে (LRT; বর্ধিত তথ্য চিত্র ১ক)। আমরা নতুন বন্ধ (<১ দিন বয়সী) পুরুষ এবং মহিলাদের মধ্যে একডিস্টেরয়েড বিশ্লেষণ করেছি এবং শুধুমাত্র MAG-তে 3D20E এবং 3D20E22P সনাক্ত করেছি; E, 20E এবং 20E22P উভয় লিঙ্গের মধ্যেই উপস্থিত ছিল (বর্ধিত তথ্য চিত্র ১খ)। এই তথ্য থেকে বোঝা যায় যে A. gambiae প্রাপ্তবয়স্ক পুরুষরা তাদের MAG-তে উচ্চ মাত্রার পরিবর্তনকারী হরমোন তৈরি করে যা মহিলাদের দ্বারা সংশ্লেষিত হয় না।
MAG এবং মহিলা LRT (অ্যাট্রিয়া, সেমিনাল ভেসিকেল এবং প্যারোভারিয়াম সহ) 4-দিন বয়সী (4-দিন বয়সী) কুমারী পুরুষ এবং কুমারী এবং মিলিত মহিলাদের (0.5, 3, এবং 12 hpm) থেকে ব্যবচ্ছেদ করা হয়েছিল। এই টিস্যুগুলিতে Ecdysone HPLC-MS/MS দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল (গড় ± sem; জোড়াবিহীন টি-পরীক্ষা, দ্বি-পার্শ্বযুক্ত, মিথ্যা আবিষ্কারের হার (FDR) সংশোধন করা হয়েছে; NS, উল্লেখযোগ্য নয়; *P < 0.05, **P < 0.01। 3D20E: 3 ঘন্টা বনাম 0.5 ঘন্টা, P = 0.035; 12 ঘন্টা বনাম 3 ঘন্টা, P = 0.0015; 12 ঘন্টা বনাম 0.5 ঘন্টা, P = 0.030। 3D20E22P: 3 ঘন্টা বনাম 0.5 ঘন্টা, P = 0.25; 12 ঘন্টা বনাম 3 ঘন্টা, P = 0.0032; 12 ঘন্টা বনাম 0.5 ঘন্টা, P = 0.015)। তথ্য তিনটি জৈবিক প্রতিলিপি থেকে নেওয়া হয়েছে। প্রতিটি আগ্রহের একডিসোনের শীর্ষ ক্ষেত্রফল মশার সংখ্যা দ্বারা গণনা করা হয়েছিল এবং স্বাভাবিক করা হয়েছিল। একডিসোনকে নিম্নরূপ রঙ দ্বারা প্রতিনিধিত্ব করা হয়েছে: E, সবুজ; 20E, কমলা; 20E22P, বেগুনি; 3D20E, নীল; 3D20E22P, গোলাপী। ইনসেটটি নিম্ন একডিসোনের মাত্রা দেখানোর জন্য y-অক্ষের স্কেল বৃদ্ধি করে।
মিলনের সময় 3D20E22P এবং 3D20E স্থানান্তরিত হয় কিনা তা তদন্ত করার জন্য, আমরা মিলনের পরে বিভিন্ন সময়ে স্ত্রী LRT গুলি ব্যবচ্ছেদ করেছি। যদিও কুমারীদের মধ্যে ecdysone পাওয়া যায়নি, আমরা মিলনের পরপরই LRT তে 3D20E22P এর উল্লেখযোগ্য পরিমাণে লক্ষ্য করেছি (মিলনের পর 0.5 ঘন্টা, hpm), যা সময়ের সাথে সাথে হ্রাস পাচ্ছে, অন্যদিকে 3D20E এর মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 1)। রাসায়নিকভাবে সংশ্লেষিত 3D20E কে একটি মান হিসাবে ব্যবহার করে, আমরা নির্ধারণ করেছি যে মিলনের LRT গুলিতে এই স্টেরয়েড হরমোনের মাত্রা 20E এর চেয়ে কমপক্ষে 100 গুণ বেশি ছিল (বর্ধিত ডেটা টেবিল 1)। সুতরাং, 3D20E22P হল প্রধান পুরুষ ecdysone যা মিলনের সময় মহিলা LRT তে স্থানান্তরিত হয় এবং এর ডিফসফোরাইলেটেড রূপ, 3D20E, মিলনের পরপরই অত্যন্ত প্রচুর পরিমাণে পরিণত হয়। এটি মহিলাদের মিলনের পরের জীববিজ্ঞানে পরবর্তী ecdysone এর জন্য একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকার ইঙ্গিত দেয়।
একটি নতুন RNA সিকোয়েন্সিং (RNA-seq) ডেটাসেট (চিত্র 2a) তৈরি করার পর, একটি কাস্টম-বিল্ট বায়োইনফরমেটিক্স পাইপলাইন ব্যবহার করে, আমরা ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO) এবং ecdysone এনকোডিং 20E-সংশোধিত ফসফেটেজ জিন অনুসন্ধান করেছি। EPP) প্রজনন টিস্যুতে প্রকাশিত হয়। আমরা একটি প্রার্থী EPP জিন এবং দুটি সম্ভাব্য EcK জিন (EcK1 এবং EcK2) সনাক্ত করেছি, কিন্তু একটি ভাল প্রার্থী EO জিন খুঁজে পাইনি। উল্লেখযোগ্যভাবে, গাম্বিয়ান MAG-তে পৃথক EPP জিন উচ্চ স্তরে (98.9 তম শতাংশ) প্রকাশিত হয়েছিল কিন্তু মহিলা LRT-তে নয় (চিত্র 2b), আমাদের প্রত্যাশার বিপরীতে যেহেতু এই মহিলা টিস্যুতে 3D20E22P এর ডিফসফোরাইলেশন ঘটেছে। অতএব, আমরা বিশ্বাস করি যে মিলনের সময় পুরুষ EPP স্থানান্তরিত হতে পারে। প্রকৃতপক্ষে, আমরা মিলনের পরে মহিলা প্রোটিনকে মাস্ক করার জন্য ভিভো স্থিতিশীল আইসোটোপ লেবেলিং ব্যবহার করেছি, মহিলা অ্যাট্রিয়ামে MS দ্বারা চিহ্নিত একটি এনজাইম (চিত্র 2c এবং পরিপূরক সারণী)। ১)। MAG এবং মিলিত (কিন্তু কুমারী নয়) মহিলা LRT-তে EPP-এর উপস্থিতি নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে নিশ্চিত করা হয়েছিল (চিত্র ২d)।
a, EcKs, EOs এবং EPPs এনকোডিং জিনের জন্য প্রতিটি লিঙ্গের প্রজনন টিস্যু অনুসন্ধান করার জন্য একটি কাস্টম-নির্মিত বায়োইনফরমেটিক্স পাইপলাইন। তীরের পাশের সংখ্যাগুলি প্রতিটি ধাপে পুরুষ এবং মহিলা প্রার্থীর সংখ্যা নির্দেশ করে। এই বিশ্লেষণে একটি EPP জিন (EPP) এবং একটি EcK জিন (EcK1) চিহ্নিত করা হয়েছে যা পুরুষদের মধ্যে প্রকাশিত হয়, এবং একটি EcK জিন (EcK2) যা উভয় লিঙ্গের মধ্যে প্রকাশিত হয় কিন্তু প্রার্থী EO জিন দেয় না। b, হিটম্যাপ কুমারী (V) এবং সঙ্গম (M) অ্যানোফিলিস গাম্বিয়া এবং অ্যানোফিলিস অ্যালবিকান্স টিস্যুতে প্রার্থী জিনের প্রকাশের তুলনা করে। Spca, নিষেক; MAGs, পুরুষদের মধ্যে আনুষঙ্গিক গ্রন্থি; শরীরের অন্যান্য অংশ, যেমন স্তন, ডানা, পা, চর্বিযুক্ত দেহ এবং উভয় লিঙ্গের অভ্যন্তরীণ অঙ্গ এবং মহিলাদের ডিম্বাশয়। EcK2 গাম্বিয়ার MAG এবং atria উভয় ক্ষেত্রেই অত্যন্ত প্রকাশিত হয়, যেখানে EPP শুধুমাত্র MAG.c তে পাওয়া যায়, পুরুষ বীর্যপাত গ্রুপের মহিলা atria-তে স্থানান্তরের প্রোটিওমিক বিশ্লেষণ 3, 12 এবং 24 hpm, যা 67টি সর্বাধিক প্রচুর প্রোটিন দেখায়। মহিলাদের 15N ধারণকারী খাদ্যে লালন-পালন করা হয়েছিল যাতে সমস্ত প্রোটিন লেবেল করা যায় (এবং মুখোশ করা যায়)। ট্যাগবিহীন পুরুষদের ট্যাগবিহীন মহিলাদের সাথে মিলিত করা হয়েছিল, এবং প্রোটিওমিক বিশ্লেষণের জন্য মহিলা LRT গুলি 3, 12 এবং 24 hpm-এ ব্যবচ্ছেদ করা হয়েছিল (বীর্যপাতকারী প্রোটিনের সম্পূর্ণ তালিকার জন্য পরিপূরক সারণী 1 দেখুন)। এই টিস্যুগুলির প্রোটিওমিক বিশ্লেষণ দ্বারা কুমারী পুরুষদের MAG-তে ইনসেট, EPP, Eck1 এবং EcK2 সনাক্ত করা হয়েছিল। d, MAG-তে ওয়েস্টার্ন ব্লট এবং মিলিত মহিলাদের LRT দ্বারা EPP সনাক্ত করা হয়েছিল, কিন্তু কুমারী মহিলা বা পুরুষ বা বাকি মহিলাদের ক্ষেত্রে নয়। শরীর। ঝিল্লিগুলিকে একই সাথে অ্যান্টি-অ্যাক্টিন (লোডিং নিয়ন্ত্রণ) এবং অ্যান্টি-ইপিপি অ্যান্টিবডি দিয়ে পরীক্ষা করা হয়েছিল। সমস্ত পুরুষ কুমারী। জেল উৎস তথ্যের জন্য পরিপূরক চিত্র 1 দেখুন। একই ফলাফল সহ দুবার ওয়েস্টার্ন ব্লট করা হয়েছিল।
MAG থেকে বিচ্ছিন্ন 3D20E22P ব্যবহার করে HPLC-MS/MS দ্বারা ইনকিউবেশনের পর EPP-এর একডিস্টেরয়েড ফসফোফসফেটেজ কার্যকলাপ যাচাই করা হয়েছিল (বর্ধিত ডেটা চিত্র 2a)। অধিকন্তু, যখন আমরা RNA-মধ্যস্থ হস্তক্ষেপ (RNAi) দ্বারা EPP নীরব করেছিলাম, তখন আমরা এই পুরুষদের প্রজনন টিস্যুতে ফসফেটেজ কার্যকলাপে একটি শক্তিশালী হ্রাস লক্ষ্য করেছি (চিত্র 3a), এবং EPP-নীরব পুরুষদের সাথে মিলিত মহিলারা আংশিক জিন নীরব থাকা সত্ত্বেও ডিফসফোরিলেটেড 3D20E (চিত্র 3b) এর উল্লেখযোগ্য কম অনুপাত দেখিয়েছিলেন (বর্ধিত ডেটা চিত্র 2b,c)। বিপরীতে, আমরা একই মশায় 20E22P/20E অনুপাতের উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন সনাক্ত করতে পারিনি, যা ইঙ্গিত দিতে পারে যে এনজাইমটি 3D20E22P (চিত্র 3b) এর জন্য নির্দিষ্ট।
a, ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড EPP RNA (dsEPP) অথবা ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড GFP RNA (dsGFP) নিয়ন্ত্রণ ব্যবহার করে EPP সাইলেন্স করার ফলে MAG-তে ফসফেটেজ কার্যকলাপ হ্রাস পেয়েছে। প্রতিটি প্রতিলিপিতে (P = 0.0046, জোড়াযুক্ত t-পরীক্ষা, দ্বি-পার্শ্বযুক্ত) বিশটি MAG পুল ব্যবহার করা হয়েছিল, যা পৃথক বিন্দু দ্বারা প্রতিনিধিত্ব করা হয়েছিল। b, EPP-নীরব পুরুষদের সাথে মিলিত মহিলাদের 3 hpm (P = 0.0043, জোড়াবিহীন t-পরীক্ষা, দ্বি-পার্শ্বযুক্ত) এ ডিফসফোরিলেটেড 3D20E এর অনুপাত উল্লেখযোগ্যভাবে কম ছিল, যেখানে 20E স্তরগুলি প্রভাবিত হয়নি (P = 0.063, জোড়াবিহীন)। t-পরীক্ষা, দ্বি-পার্শ্বিক)। ১৩, ১৬ এবং ১৯ জন মহিলার তিনটি পুল থেকে তথ্য গড় ± সেমি হিসাবে উপস্থাপন করা হয়েছে। c, EPP-নীরব পুরুষদের সাথে সঙ্গম করা মহিলাদের পুনঃসঙ্গমের হার উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল (P = 0.0002, ফিশারের সঠিক পরীক্ষা, দ্বি-পার্শ্বিক)। তাদের সঙ্গমের অবস্থা নিশ্চিত করার জন্য প্রথমে মহিলাদের সঙ্গম করতে বাধ্য করা হয়েছিল; ২ দিন পরে, ট্রান্সজেনিক শুক্রাণু বহনকারী অন্যান্য পুরুষদের সাথে তাদের যোগাযোগ করা হয়েছিল যাতে ট্রান্সজিনের পরিমাণগত পিসিআর সনাক্তকরণের মাধ্যমে পুনঃসম্পর্কের হার মূল্যায়ন করা যায়। d, EPP-নীরব পুরুষদের সাথে মিলিত রক্ত-খাওয়ানো মহিলাদের উর্বরতা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে (P < 0.0001; মান-হুইটনি পরীক্ষা, দ্বি-পার্শ্বযুক্ত) এবং ডিমের সংখ্যা সামান্য হ্রাস পেয়েছে (P = 0.088, মান-হুইটনি পরীক্ষা, দ্বি-পার্শ্বযুক্ত), যদিও প্রজনন হার প্রভাবিত হয়নি (P = 0.94, ফিশারের সঠিক পরীক্ষা, দ্বি-পার্শ্বযুক্ত)। সমস্ত প্যানেলে, n জৈবিকভাবে স্বাধীন মশার নমুনার সংখ্যা প্রতিনিধিত্ব করে। NS, উল্লেখযোগ্য নয়।*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001।
এরপর, আমরা মূল্যায়ন করেছি যে মহিলাদের মধ্যে মিলন প্রতিরোধ ক্ষমতা বৃদ্ধির জন্য একডিসোন ডিফসফোরিলেশন গুরুত্বপূর্ণ কিনা। উল্লেখযোগ্যভাবে, EPP-হ্রাসপ্রাপ্ত পুরুষদের সাথে মিলিত মহিলারা অতিরিক্ত (ট্রান্সজেনিক) পুরুষদের সংস্পর্শে আসার সময় নিয়ন্ত্রণ মহিলাদের (10.4%) তুলনায় অনেক বেশি ফ্রিকোয়েন্সি (44.9%) এ পুনরায় মিলিত হয় (চিত্র 3c)। আমরা উর্বরতা (চিত্র 3d, বামে) এবং এই মহিলাদের দ্বারা পাড়া ডিমের সংখ্যায় সামান্য হ্রাস লক্ষ্য করেছি (চিত্র 3d, মাঝখানে), যদিও মহিলাদের দ্বারা পাড়া ডিমের শতাংশ (মিলনের মাধ্যমে মহিলাদের মধ্যে আরেকটি প্রতিক্রিয়া) প্রভাবিত হয়নি (চিত্র 3d, ডানে)। 3D20E22P এর জন্য EPP এর পর্যবেক্ষণকৃত নির্দিষ্টতা বিবেচনা করে, এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে মিলনের সময় স্থানান্তরিত EPP দ্বারা 3D20E এর সক্রিয়করণ আরও মিলনের জন্য মহিলাদের গ্রহণযোগ্যতা বন্ধ করতে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করতে পারে, যা পূর্বে 20E এর যৌন স্থানান্তরের জন্য দায়ী ছিল। অতএব, এই পুরুষ-নির্দিষ্ট হরমোনটি মহিলাদের উর্বরতাকেও দৃঢ়ভাবে প্রভাবিত করে।
এরপর, আমরা রাসায়নিকভাবে সংশ্লেষিত 3D20E (চিত্র 4a–c) এবং বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ 20E ব্যবহার করে যৌনভাবে পরিণত কুমারীদের উপর ইনজেকশন পরীক্ষায় 20E এবং 3D20E এর কার্যকলাপ তুলনা করেছি। আমরা লক্ষ্য করেছি যে 3D20E উভয় ঘনত্বেই (চিত্র 4d) মিলনের প্রতি মহিলাদের সংবেদনশীলতা বন্ধ করার ক্ষেত্রে 20E এর তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি কার্যকর ছিল। উল্লেখযোগ্যভাবে, LRT-তে 3D20E এর অর্ধেক শারীরবৃত্তীয় স্তর (ইনজেকশন-পরবর্তী 1,066 পৃষ্ঠা বনাম 2,022 পৃষ্ঠা সঙ্গম-পরবর্তী) অবাধ্য মহিলাদের একটি অনুপাতকে প্ররোচিত করেছিল যা সর্বোচ্চ 18 পৃষ্ঠা সঙ্গম-পরবর্তী ঘনত্বে ইনজেকশনের 24 ঘন্টা পরে 20E (ইনজেকশন-পরবর্তী 361 পৃষ্ঠা) এর শারীরবৃত্তীয় স্তরের চেয়ে 20 গুণ বেশি ছিল; বর্ধিত তথ্য সারণী ১)। এই ফলাফলটি এই ধারণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যে 20E এর যৌন স্থানান্তর সঙ্গমের অবাধ্য সময়কাল সৃষ্টি করে না, এবং আরও 3D20E কে পিতামাতা-সন্তানের সম্পর্ক নিশ্চিত করার ক্ষেত্রে একটি প্রধান কারণ হিসাবে নির্দেশ করে। কুমারী মহিলাদের ডিম পাড়ার পরীক্ষায় 3D20E 20E এর তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি সক্রিয় ছিল (চিত্র 4e), যা ইঙ্গিত করে যে আংশিক EPP নীরবতার পরে আমরা যে স্বাভাবিক ডিম পাড়ার হার লক্ষ্য করেছি তা সঙ্গম-প্ররোচিত মহিলা কারণগুলির দ্বারা উত্পাদিত অবশিষ্ট 3D20E কার্যকলাপের উপস্থিতির কারণে হয়েছিল।
(a,b) 20E (a) থেকে রাসায়নিকভাবে সংশ্লেষিত 3D20E অত্যন্ত উচ্চ রূপান্তর/দক্ষতা সহ (তিনটি স্বাধীন সংশ্লেষণ বিক্রিয়ার গড় ± sem হিসাবে উপস্থাপিত তথ্য) (b).c, ভর বর্ণালী (নীচের অর্ধেক) মিলিত মহিলা LRT (উপরের অর্ধেক) তে পাওয়া ecdysone-এর সাথে হুবহু মিলে যায়।d, 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; ফিশারের সঠিক পরীক্ষা, দ্বি-পার্শ্বযুক্ত) এবং 10% ইথানলের সাথে তুলনা করা হয়েছে (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; ফিশারের সঠিক পরীক্ষা, 2-পার্শ্বযুক্ত), যেখানে 20E শুধুমাত্র উচ্চ মাত্রায় নিয়ন্ত্রণের চেয়ে উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; ফিশারের সঠিক পরীক্ষা, 2-পার্শ্বযুক্ত)। অর্থাৎ, 3D20E ইনজেকশন 10% ইথানল নিয়ন্ত্রণের তুলনায় কুমারী মহিলাদের মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ডিম ছাড়ার হার তৈরি করেছে (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; ফিশারের সঠিক পরীক্ষা, দ্বি-পার্শ্বযুক্ত), যখন 20E নিয়ন্ত্রণের তুলনায় শুধুমাত্র উচ্চ মাত্রায় (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; ফিশারের সঠিক পরীক্ষা, দ্বি-পার্শ্বযুক্ত)। 3D20E উচ্চ মাত্রায় 20E এর তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ডিম ছাড়ার হার তৈরি করেছে (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; ফিশারের সঠিক পরীক্ষা, দ্বি-পার্শ্বযুক্ত)। সমস্ত প্যানেলে, n জৈবিকভাবে স্বাধীন মশার নমুনার সংখ্যা প্রতিনিধিত্ব করে। NS, উল্লেখযোগ্য নয়।*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. ডেটা তিনটি প্রতিলিপি থেকে নেওয়া হয়েছে।
পূর্ববর্তী গবেষণায়, আমরা নির্ধারণ করেছি যে স্টেরয়েড হরমোনের যৌন স্থানান্তর MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) এর প্রকাশকে প্ররোচিত করে, একটি মহিলা প্রজনন জিন যা A. gambiae মহিলাদের P. falciparum সংক্রমণ থেকে রক্ষা করে। স্বাস্থ্যের জন্য ক্ষতিকর, যা সবচেয়ে মারাত্মক মানব ম্যালেরিয়া পরজীবী 13 দ্বারা সৃষ্ট। ম্যালেরিয়া-স্থানীয় অঞ্চলে অ্যানোফিলিসের প্রজনন সুস্থতার জন্য MISO-এর গুরুত্ব বিবেচনা করে, আমরা নির্ধারণ করার সিদ্ধান্ত নিয়েছি যে কোন হরমোন 3D20E বা 20E এই জিনের প্রকাশকে ট্রিগার করে। আমরা দেখেছি যে 20E ইনজেকশন নির্দিষ্টভাবে বা আরও শক্তিশালীভাবে কিছু নিউক্লিয়ার হরমোন রিসেপ্টর (HR), যেমন HR3 এবং HR4, এবং সাধারণ ডাউনস্ট্রিম স্টেরয়েড লক্ষ্য, যেমন yolkogenic জিন Vg14, 15, 16, MISO আরও জোরালোভাবে 3D20E দ্বারা প্ররোচিত হয়েছিল (বর্ধিত ডেটা চিত্র 3)। সুতরাং, এই অ্যান্ড্রোজেনিক স্টেরয়েড হরমোনের যৌন স্থানান্তর এমন প্রক্রিয়াগুলিকে প্ররোচিত করে যা পরজীবী সংক্রমণের ফলে সৃষ্ট খরচ থেকে মহিলাদের রক্ষা করে। অধিকন্তু, 3D20E E রিসেপ্টর EcR-এর উভয় আইসোফর্মকেই আলাদাভাবে প্রভাবিত করে, EcR-A প্ররোচিত করে এবং EcR-B দমন করে, এবং HPX15 সহ অন্যান্য মিলন-প্ররোচিত জিনকে আরও জোরালোভাবে ট্রিগার করে, যা মহিলাদের উর্বরতাকে প্রভাবিত করে। এটি EPP-নীরব পুরুষদের সাথে মিলিত মহিলাদের মধ্যে পরিলক্ষিত উল্লেখযোগ্য বন্ধ্যাত্ব ব্যাখ্যা করতে পারে (বর্ধিত তথ্য চিত্র 3)। এই তথ্যগুলি দুটি একডিসোন হরমোন দ্বারা অগ্রাধিকারমূলকভাবে সক্রিয় ডাউনস্ট্রিম পথের অস্তিত্বের ইঙ্গিত দেয় যা লিঙ্গ-নির্দিষ্ট কার্যকারিতার ভিত্তি হতে পারে।
এরপর, আমরা আমাদের বায়োইনফরমেটিক্স পাইপলাইনে চিহ্নিত দুটি EcK জিনের কার্যকারিতা পরীক্ষা করেছি। EcK1 বা EcK2 নীরব করার ফলে পুরুষদের মধ্যে উল্লেখযোগ্য মৃত্যুহার দেখা দেয় (এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র 4a), যা পরামর্শ দেয় যে ecdysone ফসফোরাইলেশন, এবং এইভাবে নিষ্ক্রিয়তা, বেঁচে থাকার জন্য গুরুত্বপূর্ণ। যেহেতু EcK2 EcK1 এর চেয়ে উচ্চ স্তরে প্রকাশিত হয়েছিল এবং প্রোটিওমিক্স দ্বারা MAG-তে সনাক্ত করা হয়েছিল (চিত্র 2b,c এবং পরিপূরক সারণি 2), আমরা 20E দিয়ে ইনকিউবেট করে এর ecdysteroid kinase কার্যকলাপ যাচাই করেছি, যার ফলে ফসফোরাইলেশন 20E22P (এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র 2).4b)। 3D20E কে সাবস্ট্রেট হিসাবে ব্যবহার করার সময়, আমরা ফসফোরাইলেটেড পণ্য 3D20E22P (এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র 4c) সনাক্ত করতে পারিনি, যা পরামর্শ দেয় যে 3D20E এর পরিবর্তে 20E EcK2 এর পছন্দের লক্ষ্য হতে পারে।
আমাদের RNA-seq বিশ্লেষণ অনুসারে, কুমারী মহিলাদের LRT-তে EcK2 অত্যন্ত উচ্চ মাত্রায় প্রকাশিত হয়েছিল, যেখানে মিলনের পরে এটি বন্ধ হয়ে গিয়েছিল (চিত্র 2b)। আমরা এই তথ্যগুলি নিশ্চিত করেছি এবং নির্ধারণ করেছি যে EcK2 প্রকাশ রক্ত ​​খাওয়ানোর দ্বারা প্রভাবিত হয়নি (বর্ধিত তথ্য চিত্র 5a)। আমাদের প্রাথমিক MS পরীক্ষাগুলি প্রসারিত করে, আমরা নির্ধারণ করেছি যে 20E22P-এর সর্বোচ্চ 20E-এর সর্বোচ্চের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত ছিল (রক্ত খাওয়ার 22-26 ঘন্টা পরে; বর্ধিত তথ্য চিত্র 5b)। কুমারী মহিলাদের মধ্যে EcK2-এর নীরবতা রক্ত ​​খাওয়ার 26 ঘন্টা পরে 20E থেকে 20E22P-এর আপেক্ষিক অনুপাত 3 গুণ বৃদ্ধি করে (বর্ধিত তথ্য চিত্র 2c এবং 5c), নিশ্চিত করে যে EcK2 মহিলাদের মধ্যে 20E-কেও ফসফোরিলেট করে। উল্লেখযোগ্যভাবে, EcK2-হ্রাসপ্রাপ্ত কুমারীরা পূর্ণ যৌন গ্রহণযোগ্যতা বজায় রাখে (বর্ধিত তথ্য চিত্র 5d,e), আরও পরামর্শ দেয় যে 20E-এর মহিলা উৎপাদন সঙ্গমের অবাধ্যতাকে প্ররোচিত করে না পিরিয়ড। তবে, নিয়ন্ত্রণের তুলনায় এই মহিলাদের ডিম পাড়ার হার উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে, যেখানে ৩০% এরও বেশি কুমারী ডিম পাড়ায় (এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র ৫f)। যদি রক্ত ​​খাওয়ার পরে ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড Eck2 RNA (dsEcK2) ইনজেকশন দেওয়া হয়, তাহলে স্পনিং ঘটেনি, সেই সময়ে রক্ত ​​খাওয়ার কারণে 20E পিক হ্রাস পেয়েছিল। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলি এমন একটি মডেলকে সমর্থন করে যে রক্ত ​​চোষার পরে উৎপাদিত 20E স্পনিংকে প্ররোচিত করতে পারে, তবে কেবল তখনই যখন সঙ্গমের মাধ্যমে স্পনিং ব্লক (EcK2 এবং সম্ভবত অন্যান্য কারণ) বন্ধ করা হয়। 20E বা 3D20E ইনজেকশন কুমারীদের মধ্যে EcK2 প্রকাশকে বাধা দেয়নি (এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র ৫g), যা পরামর্শ দেয় যে অন্যান্য কারণগুলি এই কাইনেসের বাধাদানে মধ্যস্থতা করে। যাইহোক, রক্ত ​​খাওয়ার পরে 20E স্তর সঙ্গমের অস্বস্তি সৃষ্টি করার জন্য যথেষ্ট ছিল না, তবে যৌনভাবে স্থানান্তরিত 3D20E এর উচ্চ টাইটার দ্বারা কার্যকরভাবে ট্রিগার হয়েছিল।
আমাদের ফলাফল A. gambiae-এর প্রজনন সাফল্য নিয়ন্ত্রণকারী প্রক্রিয়া সম্পর্কে গুরুত্বপূর্ণ অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে। একটি মডেল আবির্ভূত হয়েছে যেখানে পুরুষরা 3D20E-এর উচ্চ টাইটার সংশ্লেষণ করতে বিবর্তিত হয়েছে, একটি পুরুষ-নির্দিষ্ট পরিবর্তিত ecdysone যা আরও মিলনের জন্য মহিলাদের সংবেদনশীলতা হ্রাস করে পিতামাতা নিশ্চিত করে। একই সময়ে, এই ম্যালেরিয়া ভেক্টরগুলি পুরুষ-নির্দিষ্ট EPP-এর যৌন স্থানান্তরের প্রতিক্রিয়ায় মহিলাদের মধ্যে 3D20E সক্রিয় করার জন্য একটি দক্ষ সিস্টেমও বিকশিত করেছে। আমাদের জ্ঞান অনুসারে, এটি একটি পুরুষ- এবং মহিলা-প্রধান স্টেরয়েড হরমোন সিস্টেমের প্রথম উদাহরণ যা পোকামাকড়ের মধ্যে একটি অনন্য এবং গুরুত্বপূর্ণ কার্য সম্পাদন করে। পুরুষ-নির্দিষ্ট ecdysone ফাংশনটি অনুমান করা হয়েছে কিন্তু নির্দিষ্টভাবে প্রদর্শিত হয়নি। উদাহরণস্বরূপ, একটি মূলত অপ্রমাণিত অনুমান 18 হল যে এই ফাংশনগুলি 20E পূর্বসূরী E1 দ্বারা সঞ্চালিত হতে পারে। এটি সুপরিচিত যে ড্রোসোফিলায়, ছোট লিঙ্গ পেপটাইড 19,20 এর যৌন স্থানান্তর দ্বারা মোনান্ড্রি ট্রিগার হয় যা নির্দিষ্ট লিঙ্গ পেপটাইড রিসেপ্টর 21,22 এর মাধ্যমে মহিলা প্রজনন ট্র্যাক্টকে উদ্দীপিত করে নিউরনের সাথে যোগাযোগ করে। আরও কাজ হল A. gambiae নারীদের মধ্যে 3D20E দ্বারা নিয়ন্ত্রিত ডাউনস্ট্রিম সিগন্যালিং ক্যাসকেডগুলি নির্ধারণ করতে এবং মশা এবং ড্রোসোফিলার মধ্যে এই ক্যাসকেডগুলি সংরক্ষণ করা যেতে পারে কিনা তা নির্ধারণ করতে প্রয়োজন।
আমাদের গবেষণায় চিহ্নিত নারীর উর্বরতা এবং আচরণের উপর 3D20E এর গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা বিবেচনা করে, 3D20E সংশ্লেষণ এবং সক্রিয়করণের দিকে পরিচালিত পথগুলি ভবিষ্যতের মশা নিয়ন্ত্রণ কৌশলগুলির জন্য নতুন সুযোগ প্রদান করে, যেমন জীবাণুমুক্ত পোকামাকড় প্রযুক্তি কৌশলগুলিতে প্রতিযোগিতামূলক জীবাণুমুক্ত পুরুষদের প্রজন্ম বন্য মুক্তির জন্য ব্যবহার করা বা কুমারী খেলায় 3D20E অনুকরণ করা। 3D20E এর পুরুষ-নির্দিষ্ট কার্যকারিতা বিকশিত হতে পারে যখন A. gambiae এবং অন্যান্য Cellia প্রজাতি তাদের বীর্যকে মিলন প্লাগে জমাট বাঁধার ক্ষমতা অর্জন করে, কারণ এটি প্রচুর পরিমাণে হরমোন এবং হরমোন-সক্রিয়কারী এনজাইমগুলির দক্ষ স্থানান্তরের অনুমতি দেয়। পরিবর্তে, 3D20E বিবর্তন বাস্তবায়নকারী monandry উচ্চ ম্যালেরিয়া প্রাদুর্ভাবের এলাকায় তাদের প্রজনন ক্ষমতার পক্ষে মহিলাদের জন্য (MISO এর উচ্চ প্রকাশের মাধ্যমে) একটি প্রক্রিয়া প্রদান করে, যা পরোক্ষভাবে প্লাজমোডিয়াম সংক্রমণে অবদান রাখে। মহিলা 20E-এর স্ত্রী অ্যানোফিলিস মশার মধ্যে P. ফ্যালসিপেরামের বেঁচে থাকা এবং বৃদ্ধির উপর গভীর প্রভাব রয়েছে বলে দেখানো হয়েছে, 24 পুরুষ এবং মহিলা উভয় স্টেরয়েড হরমোন পথই এখন মশা-পরজীবীর মূল দিক। মিথস্ক্রিয়া।
A. gambiae G3 প্রজাতির পোকামাকড়ের আদর্শ পরিবেশে (২৬-২৮ °C, ৬৫-৮০% আপেক্ষিক আর্দ্রতা, ১২:১২ ঘন্টা আলো/অন্ধকার আলোককালীন তাপমাত্রা) লালন-পালন করা হয়েছিল। লার্ভাকে গুঁড়ো মাছের খাবার খাওয়ানো হয়েছিল (টেট্রামিন ট্রপিক্যাল ফ্লেক্স, কোই পেলেট এবং টেট্রা পন্ড স্টিকস ৭:৭:২ অনুপাতে)। প্রাপ্তবয়স্ক মশাদের অ্যাড লিবিটাম ১০% ডেক্সট্রোজ দ্রবণ এবং সাপ্তাহিক মানুষের রক্ত ​​খাওয়ানো হয়েছিল (রক্তের উপাদানগুলি অধ্যয়ন করুন)। মাইক্রোস্কোপি দ্বারা প্রান্ত পরীক্ষা করার পর পিউপাল পর্যায়ে লিঙ্গ পৃথক করে ভার্জিন মশা পাওয়া গিয়েছিল। DsRed ট্রান্সজিন বহনকারী পুরুষদের আগে বর্ণনা করা হয়েছে।
পূর্বে বর্ণিত প্রোটোকল অনুসারে জোরপূর্বক সঙ্গমের পরীক্ষা করা হয়েছিল। প্রাকৃতিক সঙ্গমের জন্য, 4 দিন বয়সী কুমারী স্ত্রীদের যৌনভাবে পরিণত কুমারী পুরুষদের সাথে 1:3 অনুপাতে দুই রাত ধরে রাখা হয়েছিল। যেসব পরীক্ষায় পুরুষদের dsEPP ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল, সেখানে ইনজেকশনের 3-4 দিনের সাথে সহ-খাঁচা তৈরি করা হয়েছিল, যখন ফসফেটেজ কার্যকলাপ সর্বাধিক নীরব করা হয়েছিল (বর্ধিত তথ্য চিত্র 2b)।
মশার টিস্যু, অবশিষ্ট মৃতদেহ (শরীরের বাকি অংশ), অথবা পুরো শরীর ১০০% মিথানলে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং একটি বিডার (২ মিমি কাচের পুঁতি, ২,৪০০ আরপিএম, ৯০ সেকেন্ড) দিয়ে একজাত করা হয়েছিল। টিস্যুর পরিমাণ এবং মিথানলের পরিমাণ নিম্নরূপ ছিল: শরীরের বাকি অংশ, ১,০০০ µl-এ ৫০; MAG, ৫০–১০০ ৮০ µl; মহিলা LRT, ২৫–৫০ ৮০ µl। একই পরিমাণ মিথানল দিয়ে অবক্ষেপটি দ্বিতীয়বার মিথানল নিষ্কাশনের শিকার হয়েছিল। কোষের ধ্বংসাবশেষ সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে অপসারণ করা হয়েছিল। উভয় নিষ্কাশন থেকে মিথানল একত্রিত করা হয়েছিল এবং নাইট্রোজেন প্রবাহের অধীনে শুকানো হয়েছিল, তারপর জলে ৮০% মিথানলের নিম্নলিখিত পরিমাণে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল: শরীরের বাকি অংশ, ৫০ µl; MAG এবং মহিলা LRT, ৩০ µl।
নমুনাগুলি একটি ভর স্পেকট্রোমিটার (ID-X, থার্মো ফিশার) ব্যবহার করে একটি LC যন্ত্রের সাথে সংযুক্ত করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল (Vanquish, থার্মো ফিশার)। 5 µl নমুনা 3 µm, 100 × 4.6 মিমি কলামে (Inspire C8, Dikma) 25 °C তাপমাত্রায় ইনজেক্ট করা হয়েছিল। LC-এর জন্য মোবাইল পর্যায়গুলি ছিল A (জল, 0.1% ফর্মিক অ্যাসিড) এবং B (অ্যাসিটোনাইট্রাইল, 0.1% ফর্মিক অ্যাসিড)। LC গ্রেডিয়েন্টটি নিম্নরূপ ছিল: 1 মিনিটের জন্য 5% B, তারপর 11 মিনিটের মধ্যে 100% B তে বৃদ্ধি করা হয়েছিল। 100% তাপমাত্রায় 8 মিনিট পরে, 4 মিনিটের জন্য 5% B তে কলামটি পুনরায় ভারসাম্য করুন। প্রবাহ হার ছিল 0.3 মিলি ন্যূনতম-1। MS উৎসে আয়নীকরণ ধনাত্মক এবং ঋণাত্মক মোডে উত্তপ্ত ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়নীকরণ দ্বারা সম্পন্ন হয়।
ভর স্পেকট্রোমিটারটি পূর্ণ MS মোডে 60,000 রেজোলিউশনে 350 থেকে 680 পর্যন্ত m/z রেঞ্জে ডেটা পরিমাপ করে। [M + H]+ (সমস্ত লক্ষ্য), [M - H2O + H]+ (সমস্ত লক্ষ্য), এবং [M - H]- (ফসফোরাইলেটেড লক্ষ্য) -এ MS/MS ডেটা সংগ্রহ করা হয়েছিল। MS/MS ডেটা এমন লক্ষ্যবস্তুর ecdysone বৈশিষ্ট্য নিশ্চিত করতে ব্যবহার করা হয়েছিল যার জন্য কোনও মান উপলব্ধ ছিল না। অ-লক্ষ্যবস্তুযুক্ত ecdysteroids সনাক্ত করতে, 15% থেকে বেশি আপেক্ষিক প্রাচুর্য সহ সমস্ত HPLC শিখরের MS/MS ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। একটি নির্দিষ্ট নমুনার (অন্যান্য সমস্ত লক্ষ্যবস্তু) পরম পরিমাণ বা তরলীকরণ গণনা করার জন্য বিশুদ্ধ মান (20E, 3D20E) থেকে তৈরি স্ট্যান্ডার্ড কার্ভ ব্যবহার করে পরিমাপ করুন যাতে একটি পুরুষে পাওয়া পরিমাণের সাথে তাদের সমতুল্যতা গণনা করা যায়। 3D20E-এর জন্য, নিম্নলিখিত অ্যাডাক্টগুলির যোগফল ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-। ট্রেসফাইন্ডার (সংস্করণ 4.1) ব্যবহার করে ডেটা বের করে পরিমাপ করা হয়েছিল। Xcalibur (সংস্করণ 4.4) ব্যবহার করে MS/MS ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। E, 20E এবং 3D20E এর MS বর্ণালী সংশ্লিষ্ট মানের সাথে তুলনা করা হয়েছিল। 3D20E22P জিরার্ডের রিএজেন্ট দিয়ে ডেরিভেটাইজেশন দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। 20E22P m/z অনুপাত দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
3D20E22P কে MAG থেকে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। HPLC-MS/MS বিশ্লেষণের মতো একই LC অবস্থার অধীনে একটি অতি-পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফ (Acquity, Waters) ব্যবহার করে একটি বিশ্লেষণাত্মক স্কেলে একটি কোয়াড্রপোল ভর-ভিত্তিক ডিটেক্টর (QDa, Acquity, Waters) ব্যবহার করে বিশুদ্ধকরণ করা হয়েছিল। পূর্বে নির্ধারিত একই ধারণ সময়ে 3D20E22P এর সাথে সম্পর্কিত m/z সনাক্ত করা হলে ভগ্নাংশ সংগ্রহ ট্রিগার করা হয়েছিল। তারপর উপরে বর্ণিত HPLC-MS/MS দ্বারা নিষ্কাশিত যৌগগুলির বিশুদ্ধতা পরীক্ষা করা হয়েছিল।
প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসরণ করে TRI রিএজেন্ট (থার্মো ফিশার) ব্যবহার করে 10-12টি প্রজনন টিস্যু বা শরীরের অন্যান্য অংশ (হেডলেস) থেকে মোট RNA বের করা হয়েছিল। TURBO DNase (থার্মো ফিশার) দিয়ে RNA চিকিত্সা করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসরণ করে Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) ব্যবহার করে cDNA সংশ্লেষিত করা হয়েছিল। বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন পরিমাণগত PCR (RT-qPCR; বর্ধিত ডেটা টেবিল 2) এর জন্য প্রাইমারগুলি পূর্বে প্রকাশিত হয়েছিল24 অথবা Primer-BLAST26 ব্যবহার করে ডিজাইন করা হয়েছিল, 70-150 bp আকারের এবং এক্সন-এক্সন জংশন বা প্রাইমার পেয়ার প্রাইমার পৃথক এক্সনগুলির পণ্যগুলিকে অগ্রাধিকার দেওয়া হয়েছিল। তিন থেকে চারটি জৈবিক প্রতিলিপি থেকে cDNA নমুনা RT-qPCR এর জন্য চারগুণ জলে মিশ্রিত করা হয়েছিল। 1× PowerUp SYBR গ্রিন মাস্টার মিক্স (থার্মো ফিশার), প্রাইমার এবং 5 µl মিশ্রিত cDNA ধারণকারী 15 µl প্রতিলিপি বিক্রিয়ায় কোয়ান্টিফিকেশন করা হয়েছিল। প্রতিক্রিয়াগুলি একটিতে চালানো হয়েছিল QuantStudio 6 Pro রিয়েল-টাইম পিসিআর সিস্টেম (থার্মো ফিশার) এবং ডেটা ডিজাইন এবং বিশ্লেষণ (সংস্করণ 2.4.3) ব্যবহার করে সংগ্রহ এবং বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। এই গবেষণায় দেখানো হয়েছে যে, আপেক্ষিক পরিমাণগুলি রাইবোসোমাল জিন RpL19 (AGAP004422) এর সাথে স্বাভাবিক করা হয়েছিল, যার প্রকাশ রক্ত ​​খাওয়ানো 27 বা মিলন 3 এর সাথে উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হয়নি।
Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) ব্যবহার করে RNA গুণমান পরীক্ষা করা হয়েছিল। MIT এবং হার্ভার্ডের ব্রড ইনস্টিটিউটে Illumina পেয়ারড-এন্ড লাইব্রেরি প্রস্তুত এবং পরিচালিত হয়েছিল। HISAT2 (সংস্করণ 2.0.5) ব্যবহার করে ডিফল্ট প্যারামিটার সহ A. gambiae জিনোম (PEST স্ট্রেন, সংস্করণ 4.12) এর সাথে সিকোয়েন্সিং রিডগুলি সারিবদ্ধ করা হয়েছিল। ম্যাপিং মানের (MAPQ) স্কোর সহ রিডগুলি <30 স্যামটুলস (সংস্করণ 1.3.1) ব্যবহার করে সরানো হয়েছিল। ডিফল্ট প্যারামিটার সহ htseq-count (সংস্করণ 0.9.1) ব্যবহার করে জিনে ম্যাপ করা রিডের সংখ্যা গণনা করা হয়েছিল। R (সংস্করণ 4.0.3) এ DESeq2 প্যাকেজ (সংস্করণ 1.28.1) ব্যবহার করে সাধারণ পঠন গণনা গণনা করা হয়েছিল এবং ডিফারেনশিয়াল জিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
Ecdysone-সংশোধনকারী জিন প্রার্থীদের প্রথমে PSI-BLAST অ্যালগরিদম (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) ব্যবহার করে A. gambiae জিনোম অনুসন্ধান করে সনাক্ত করা হয়েছিল, ডিফল্ট মান ব্যবহার করে নিম্নলিখিত কোয়েরি প্রোটিন সিকোয়েন্স সহ প্যারামিটার: Bombyx mori (Accession No. NP_001038956.1), Musca domestica (Accession No. XP_005182020.1, XP_005175332.1 এবং XP_011294434.1) এবং Microplitis demolitor (Accession No. XP_008552646.1 এবং XP_008552645.1) থেকে EcK B. mori (Accession No. NP_001036900), Drosophila melanogaster (Accession No. NP_651202) থেকে EcK, Apis mellifera (Accession No. XP_394838) এবং Acyrthosiphon pisum (Accession No. XP_001947166); এবং B. mori (Accession No. XP_001177919.1 এবং NP_001243996.1) থেকে EPP এবং D. melanogaster (Accession No. NP_572986.1) এর EO (ধাপ ১)। এরপর, গাম্বিয়াতে (মহিলা LRT বা MAG) প্রজনন টিস্যুতে (পদক্ষেপ ২) উচ্চ mRNA এক্সপ্রেশন (> প্রতি মিলিয়ন ম্যাপড রিড (FPKM) বা >85%) এর উপর ভিত্তি করে ফিল্টার হিট করে। নির্দিষ্টতা উন্নত করার জন্য, আমরা প্রার্থী এনজাইম নির্বাচন করেছি যা A. albimanus এর প্রজনন টিস্যুতেও প্রকাশিত হয়, একটি অ্যানোফিলিস প্রজাতি যা মিলনের সময় একডিসোন সংশ্লেষণ বা স্থানান্তর করে না। প্রার্থী জিনগুলি A. albimanus প্রজনন টিস্যুতে (ধাপ 3) কম প্রকাশের (<100 FPKM বা <85th percentile) উপর ভিত্তি করে ফিল্টার করা হয়েছিল। চূড়ান্ত ফিল্টার হিসাবে (ধাপ 4), প্রার্থী জিনগুলিকে নিম্নলিখিতগুলির মধ্যে কমপক্ষে একটি পূরণ করতে হবে: (1) মিলনের পরে উল্লেখযোগ্যভাবে আপ-রেগুলেটেড (P < 0.05) ডিফারেনশিয়ালভাবে প্রকাশিত জিনের বিশ্লেষণ অনুসারে এবং (2) অ-প্রজনন টিস্যুতে (<85% বা <100 FPKM)।
আমরা পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতি 28,29,30 পরিবর্তন করে সম্পূর্ণ জীবের আইসোটোপিক লেবেলিং অর্জন করেছি। সংক্ষেপে, বন্য-প্রকারের Saccharomyces cerevisiae টাইপ II (YSC2, Sigma) ইস্ট নাইট্রোজেন বেস (BD Difco, DF0335) এ পরীক্ষা করা হয়েছিল (wt/vol) 2% গ্লুকোজ (G7528, Sigma), 1.7% অ্যামিনো অ্যাসিড-মুক্ত এবং অ্যামোনিয়াম সালফেট। কালচার মিডিয়াম) এবং 5% 15N অ্যামোনিয়াম সালফেট (NLM-713, >99%, ক্যামব্রিজ আইসোটোপ ল্যাবরেটরিজ) নাইট্রোজেনের একমাত্র উৎস হিসেবে। সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে ইস্ট পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল এবং মশার লার্ভাকে পিউপেশন না হওয়া পর্যন্ত অ্যাড লিবিটাম খাওয়ানো হয়েছিল। চতুর্থ ইনস্টার মৃত্যু রোধ করতে ফিশমিল (প্রতি 300 লার্ভাতে 0.5 মিলিগ্রাম) এর সাথে পরিপূরক। মিলনের সময় স্থানান্তরিত পুরুষ প্রোটিওম বিশ্লেষণ করার জন্য লেবেলবিহীন পুরুষদের সাথে মিলন পরীক্ষায় শুধুমাত্র মহিলাদের ব্যবহার করা হয়েছিল।
৪-৬ দিন বয়সী ১৫N-ট্যাগযুক্ত কুমারী নারীদের বয়সের সাথে মিলে যাওয়া ট্যাগবিহীন কুমারী পুরুষদের সাথে সঙ্গম করতে বাধ্য করা হয়েছিল। এপিফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির অধীনে সঙ্গম প্লাগ সনাক্ত করে সফল সঙ্গম যাচাই করা হয়েছিল। ৩, ১২ এবং ২৪ hpm-এ, ৪৫-৫৫ জন সঙ্গমকারী নারীর অ্যাট্রিয়াকে ৫০ µl অ্যামোনিয়াম বাইকার্বোনেট বাফারে (pH ৭.৮) বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং একটি পেস্টেল দিয়ে একজাত করা হয়েছিল। হোমোজেনেটটি সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং সুপারনেট্যান্টকে ৫০ µl ০.১% র‍্যাপীগেস্ট (১৮৬০০১৮৬০, ওয়াটার্স) এর সাথে ৫০ µl ৫০ মিলিমিটার অ্যামোনিয়াম বাইকার্বোনেটে মিশ্রিত করা হয়েছিল। প্রতিটি নমুনা থেকে সুপারনেট্যান্ট এবং পেলেট শুষ্ক বরফে স্ন্যাপ হিমায়িত করা হয়েছিল এবং রাতারাতি ওয়াশিংটন বিশ্ববিদ্যালয়ের ম্যাককস পরীক্ষাগারে পাঠানো হয়েছিল, যেখানে LC-MS/MS-এর জন্য নমুনা প্রস্তুতি সম্পন্ন হয়েছিল। ৫০ µl ০.১% র‍্যাপীগেস্টের ৫০ µl ৫০ মিলিমিটারে পেলেটটি পুনরায় সাসপেন্ড করুন। অ্যামোনিয়াম বাইকার্বোনেট এবং সোনিকেট একটি জল স্নানে। পেলেট এবং সুপারনাট্যান্টের প্রোটিন ঘনত্ব BCA অ্যাস দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল, নমুনাগুলিকে 5 mM ডাইথিওথ্রেইটল (DTT; সিগমা) দিয়ে হ্রাস করা হয়েছিল, 15 mM আয়োডোএসিটামাইড (সিগমা) দিয়ে অ্যালকাইলেটেড করা হয়েছিল এবং ট্রিপসিনাইজেশন: ট্রিপসিন: সাবস্ট্রেট অনুপাত সহ 37 °C (1:0 50) তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেশন করা হয়েছিল। RapiGest 200 mM HCl যোগ করে লিজ করা হয়েছিল, তারপরে 37 °C তাপমাত্রায় 45 মিনিটের জন্য ইনকিউবেশন করা হয়েছিল এবং ধ্বংসাবশেষ অপসারণের জন্য 4 °C তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য 14,000 rpm এ সেন্ট্রিফিউগেশন করা হয়েছিল। নমুনাগুলি ডুয়াল-মোড সলিড-ফেজ এক্সট্রাকশন (Oasis MCX কার্তুজ, ওয়াটার) দ্বারা ধুয়ে 0.1% ফর্মিক অ্যাসিডে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল 0.33 µg µl-1 এর চূড়ান্ত প্রোটিন ঘনত্বের জন্য। লেবেলবিহীন MAG প্রোটিওমগুলি একইভাবে কুমারী পুরুষদের থেকে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। দুটি প্রতিটি নমুনার জন্য বিশ্লেষণাত্মক প্রতিলিপি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। এরপর, প্রতিটি নমুনার 1 µg বিশ্লেষণ করা হয়েছিল একটি 25-সেমি ফিউজড সিলিকা 75-μm কলাম ব্যবহার করে যার একটি 4-সেমি ফিউজড সিলিকা Kasil1 (PQ) ফ্রিট ট্র্যাপ জুপিটার C12 রিভার্সড-ফেজ রেজিন (ফেনোমেনেক্স) এবং 180-মিনিটের তরল ক্রোমাটোগ্রাফি দিয়ে প্যাক করা হয়েছিল। নমুনা ডাইজেস্ট - MS/MS একটি Q-Exactive HF ভর স্পেকট্রোমিটার (থার্মো ফিশার) ব্যবহার করে একটি ন্যানোACQUITY UPLC সিস্টেম (ওয়াটারস) ব্যবহার করে চালানো হয়েছিল। প্রতিটি রানের জন্য তৈরি ডেটা-সম্পর্কিত অধিগ্রহণ ডেটা প্রোটিওইজার্ড (সংস্করণ 3.0.20287) ব্যবহার করে এবং Comet31 (সংস্করণ 3.2) ব্যবহার করে FASTA ডাটাবেসের বিপরীতে রূপান্তরিত করা হয়েছিল, যেখানে Anopheles gambiae (VectorBase সংস্করণ 54), Anopheles coluzzi থেকে প্রোটিন সিকোয়েন্স রয়েছে। Mali-NIH (VectorBase সংস্করণ 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, মার্চ 2021), A. gambiae RNA-seq, এবং পরিচিত মানব দূষণকারীদের তিন-ফ্রেম অনুবাদের উপর একটি অনুসন্ধান করা হয়েছিল। পেপটাইড মানচিত্র-মিলিত FDR গুলি Percolator32 (সংস্করণ 3.05) ব্যবহার করে 0.01 থ্রেশহোল্ড সহ নির্ধারণ করা হয়েছিল, এবং Limelight33-এ প্রোটিন পার্সিমনি ব্যবহার করে পেপটাইডগুলি প্রোটিন সনাক্তকরণে একত্রিত করা হয়েছিল। (সংস্করণ 2.2.0)। পূর্বে বর্ণিত প্রতিটি ধাপে প্রতিটি প্রোটিনের জন্য গণনা করা নরমালাইজড স্পেকট্রাল অ্যাভিডিটি ফ্যাক্টর (NSAF) ব্যবহার করে আপেক্ষিক প্রোটিন প্রাচুর্য অনুমান করা হয়েছিল। দুটি ভিন্ন জৈবিক প্রতিলিপি থেকে নমুনা জুড়ে প্রতিটি প্রোটিনের সাপেক্ষে NSAF গড় করা হয়েছিল। 15N লেবেলিং সফলভাবে মহিলা প্রোটিওমকে মাস্ক করেছে, যদিও লেবেলযুক্ত কুমারীদের থেকে অল্প পরিমাণে লেবেলবিহীন প্রোটিন সনাক্ত করা যেতে পারে। আমরা শুধুমাত্র প্রযুক্তিগত ধাপে মহিলা কাঁচা নমুনায় পুরুষ প্রোটিন হ্রাস (1-5 স্পেকট্রা) সনাক্তকরণ রেকর্ড করেছি, যেখানে HPLC "ক্যারি ওভার" এর ফলে পুরুষ/সঙ্গম নমুনার পরে কাঁচা নমুনা চালানো হয়েছিল। লেবেলযুক্ত কুমারীদের থেকে 'দূষক' হিসাবে পাওয়া মাঝে মাঝে প্রোটিনগুলি পরিপূরক সারণি 1 এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে।
জেনস্ক্রিপ্টে দুটি অ্যান্টিজেনিক পেপটাইড, QTTDRVAPAPDQQQ (আইসোটাইপ PA এর মধ্যে) এবং MESDGTTPSGDSEQ (আইসোটাইপ PA এবং PB এর মধ্যে)। দুটি পেপটাইড একত্রিত করা হয়েছিল, তারপর ক্যারিয়ার প্রোটিন KLH এর সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল এবং নিউজিল্যান্ডের খরগোশের মধ্যে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। চতুর্থ ইনজেকশনের পরে খরগোশগুলিকে বলি দেওয়া হয়েছিল, এবং অ্যাফিনিটি পরিশোধন দ্বারা মোট IgG আলাদা করা হয়েছিল। আরও পশ্চিমা ব্লটিং এর জন্য সবচেয়ে EPP-নির্দিষ্ট খরগোশের IgG ব্যবহার করা হয়েছিল।
পশ্চিমা দাগের জন্য, MAG (n = 10, যেখানে n জৈবিকভাবে স্বাধীন মশার নমুনার সংখ্যা প্রতিনিধিত্ব করে) এবং 4 দিন বয়সী কুমারী পুরুষ এবং কুমারী বা জোরপূর্বক মিলিত স্ত্রী (<10 মিলনের পরে), প্রোটিন নিষ্কাশন বাফার (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% সোডিয়াম ডিঅক্সিকোলেট; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× প্রোটিজ ইনহিবিটর ককটেল (রোশে)) থেকে স্ত্রী LRT (n = 30) আলাদাভাবে যোগ করা হয়েছিল। নমুনাগুলি একটি বিডার (2 মিমি কাচের পুঁতি, 2,400 rpm, 90 সেকেন্ড) দিয়ে ব্যবচ্ছেদের পরপরই একজাত করা হয়েছিল। 4 °C তাপমাত্রায় 20,000 গ্রাম সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে অদ্রবণীয় ধ্বংসাবশেষ অপসারণ করা হয়েছিল। ব্র্যাডফোর্ড অ্যাসে (বায়ো-রেড) দ্বারা প্রোটিনের পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল। তারপর, 20 µg MAG প্রোটিন, 40 µg LRT প্রোটিন, এবং 20 MOPS বাফার ব্যবহার করে µg অবশিষ্ট বাল্ক প্রোটিনকে বিকৃত করে 10% Bis-Tris NuPAGE দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল। iBlot2 ট্রান্সফার সিস্টেম (থার্মো ফিশার) ব্যবহার করে প্রোটিনগুলিকে পলিভিনাইলিডিন ফ্লোরাইড ঝিল্লিতে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল। ঝিল্লিগুলিকে 1× PBS-T (PBS-এ 0.1% Tween-20) এ দুবার ধোয়া হয়েছিল এবং তারপর 22°C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য Odyssey ব্লকিং বাফারে (Li-Cor) ব্লক করা হয়েছিল। কাস্টম খরগোশ-বিরোধী EPP পলিক্লোনাল প্রাথমিক অ্যান্টিবডি (ব্লকিং বাফারে 1:700) এবং ইঁদুর-বিরোধী অ্যাক্টিন মনোক্লোনাল প্রাথমিক অ্যান্টিবডি MAC237 (Abeam; 1:4,000) দিয়ে 4 °C তাপমাত্রায় ঝিল্লিগুলিকে রাতারাতি ঝাঁকানো হয়েছিল। ঝিল্লিগুলিকে PBS-T দিয়ে ধুয়ে সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (গাধা-বিরোধী খরগোশ 800CW এবং ছাগল-বিরোধী ইঁদুর 680LT (Li-Cor), উভয়ই 1:20,000) ব্লকিং বাফারে 0.01% SDS এবং ২২ ডিগ্রি সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ১ ঘন্টার জন্য ০.২% টুইন -২০। পিবিএস-টি দিয়ে ঝিল্লি ধুয়ে একটি ওডিসি সিএলএক্স স্ক্যানার দিয়ে ছবি তোলা হয়েছিল। ইমেজ স্টুডিওতে (সংস্করণ ৫.২) ছবি সংগ্রহ এবং প্রক্রিয়াজাত করা হয়েছিল। ইপিপি-আরএ আইসোফর্ম (৮২ কেডিএ) এর সাথে সম্পর্কিত একটি নির্দিষ্ট ব্যান্ড সনাক্ত করা যায়নি।
EPP-এর কোডিং অঞ্চলগুলি (হিস্টিডিন ফসফেটেজ ডোমেন ধারণকারী আইসোফর্ম AGAP002463-RB হিসাবে, NCBI সংরক্ষিত ডোমেন অনুসন্ধান 34) এবং EcK2 (AGAP002181) pET-21a(+) প্লাজমিড (নোভাজেন মিলিপোর সিগমা) তে ক্লোন করা হয়েছিল; প্রাইমারগুলি বর্ধিত ডেটা টেবিল 2-এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। pET-21a(+)-EcK2 কনস্ট্রাক্টের C-টার্মিনাল 6xHis ট্যাগের আগে আটটি GS4 লিঙ্কার (ট্যান্ডেমে) ঢোকানো হয়েছিল। NEBExpress কোষ-মুক্ত E. coli প্রোটিন সংশ্লেষণ বিক্রিয়া (New England BioLabs) ব্যবহার করে রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিন তৈরি করা হয়েছিল। NEBExpress Ni স্পিন কলাম (New England BioLabs) ব্যবহার করে রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিন বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। NEBExpress কোষ-মুক্ত E. coli প্রোটিন সংশ্লেষণ কিট থেকে DNA টেমপ্লেট ব্যবহার করে ডাইহাইড্রোফোলেট রিডাক্টেস (DHFR) নিয়ন্ত্রণ প্রোটিন তৈরি করা হয়েছিল। প্রোটিনগুলি PBS-এ -20 °C তাপমাত্রায় 3 মাস পর্যন্ত 50% গ্লিসারলে সংরক্ষণ করা হয়েছিল।
EPP এবং টিস্যু নির্যাসের ফসফেটেজ কার্যকলাপ 4-নাইট্রোফেনাইল ফসফেট (pNPP; সিগমা-অ্যালড্রিচ) ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল। বিক্রিয়া বাফারে 25 mM Tris, 50 mM অ্যাসিটিক অ্যাসিড, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, এবং 1 mM DTT ছিল। বিক্রিয়া বাফারে টিস্যুকে একজাত করা হয়েছিল এবং সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে কোষের ধ্বংসাবশেষ অপসারণ করা হয়েছিল। 2.5 mg ml-1 pNPP ধারণকারী বিক্রিয়া বাফারে এনজাইম বা টিস্যু নির্যাস যোগ করে বিক্রিয়া শুরু করুন। বিক্রিয়া মিশ্রণটি অন্ধকারে ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল এবং pNPP থেকে রূপান্তরিত pNP এর পরিমাণ বিভিন্ন সময়ে 405 nm শোষণ পরিমাপ করে পরিমাপ করা হয়েছিল।
ইন ভিট্রো EcK কার্যকলাপের জন্য, প্রোটিনটিকে 0.2 mg 20E বা 3D20E দিয়ে 200 µl বাফারে (pH 7.5) 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP এবং 10 mM MgCl2 ধারণ করে 27 °C তাপমাত্রায় 2 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল। 800 µl মিথানল যোগ করে বিক্রিয়া বন্ধ করা হয়েছিল, তারপর -20 °C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য ঠান্ডা করা হয়েছিল, তারপর 4 °C তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য 20,000 গ্রাম সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। এরপর HPLC-MS/MS দ্বারা সুপারনাট্যান্ট বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীতে ব্যবহৃত প্রোটিনগুলিকে তাপ-নিষ্ক্রিয় করার জন্য, প্রোটিনগুলিকে 95°C তাপমাত্রায় 20 মিনিটের জন্য PBS-এ 50% গ্লিসারলে ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল।
ইন ভিট্রো EPP কার্যকলাপের জন্য, প্রোটিনটিকে 3D20E22P (HPLC-MS/MS দ্বারা পরিশোধিত 18 জোড়া MAG-তে পাওয়া পরিমাণের সমতুল্য) দিয়ে 100 µl বাফারে (pH 7.5) ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল যাতে 25 mM Tris, 50 mM অ্যাসিটিক অ্যাসিড, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, এবং 1 mM DTT ছিল 27 °C তাপমাত্রায় 3 ঘন্টার জন্য। 400 µl মিথানল যোগ করে বিক্রিয়া বন্ধ করা হয়েছিল এবং -20 °C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য ঠান্ডা করা হয়েছিল, তারপর 4 °C তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য 20,000 গ্রাম সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। HPLC-MS/MS দ্বারা সুপারনেট্যান্ট বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) এবং EcK2 (556 bp) এর জন্য PCR খণ্ডগুলি মিশ্র-লিঙ্গের মাথাবিহীন মশার মৃতদেহ থেকে প্রস্তুত cDNA থেকে প্রশস্ত করা হয়েছিল। eGFP নিয়ন্ত্রণের PCR খণ্ড (495 bp) পূর্বে বর্ণিত pCR2.1-eGFP থেকে প্রশস্ত করা হয়েছিল; PCR প্রাইমারগুলি বর্ধিত ডেটা টেবিল 2-এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। PCR খণ্ডটি pL4440 প্লাজমিডের উল্টানো T7 প্রোমোটারগুলির মধ্যে ঢোকানো হয়েছিল। NEB 5-α সক্ষম E. coli (নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস) থেকে প্লাজমিড গঠনগুলি উদ্ধার করা হয়েছিল এবং ব্যবহারের আগে DNA সিকোয়েন্সিং দ্বারা যাচাই করা হয়েছিল (সন্নিবেশ ক্রম জন্য পরিপূরক ডেটা 1 দেখুন)। T7 প্রোমোটারের সাথে মিলিত প্রাইমারগুলি (বর্ধিত ডেটা টেবিল 2) pL4440-ভিত্তিক প্লাজমিড থেকে ইনসার্টকে প্রশস্ত করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। PCR পণ্যের আকার অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল। dsRNA মেগাস্ক্রিপ্ট T7 ট্রান্সক্রিপশন কিট (থার্মো ফিশার) ব্যবহার করে PCR টেমপ্লেট থেকে প্রতিলিপি করা হয়েছিল এবং পূর্বে বর্ণিত পরিবর্তনগুলি সহ প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুসারে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল।
dsRNA ইনজেকশনের জন্য, 1,380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) 10 ng nl-1 ঘনত্বে প্রাপ্তবয়স্ক পুরুষ বা মহিলাদের (Nanoject III, Drummond) বক্ষদেশে ইক্লোশনের 1 দিনের মধ্যে ইনজেকশন করা হয়েছিল। RNA নিষ্কাশন, cDNA সংশ্লেষণ এবং RT-qPCR দ্বারা কমপক্ষে তিনটি জৈবিক প্রতিলিপিতে জিন নকডাউন স্তর নির্ধারণ করা হয়েছিল। ecdysone ইনজেকশনের জন্য, 4 দিন বয়সী কুমারী বা 6 দিন বয়সী কুমারী রক্ত-খাওয়া মহিলাদের যথাক্রমে 1.3, 2.1 ঘনত্বে 0.13, 0.21, অথবা 0.63 µg 20E বা 3D20E (Nanoject III, Drummond) ইনজেকশন করা হয়েছিল, পরীক্ষামূলক নকশা বা 6.3 ng nl-1 এর উপর নির্ভর করে। 100 nl 10% (vol/vol) ইথানল ইনজেকশন করুন। পানিতে; ১০% ইথানলে ১০০ nl 3D20E22P (এক জোড়া MAG-তে পাওয়া পরিমাণের ৭৫% এর সমতুল্য)। মশাগুলিকে এলোমেলোভাবে ইনজেকশন গ্রুপে বরাদ্দ করা হয়েছিল।
ডিম ছাড়ার পরীক্ষার জন্য, ৩ দিন বয়সী মাদী মশাদের মানুষের রক্ত ​​খাওয়ানো হত। আংশিকভাবে খাওয়ানো বা না খাওয়ানো মশাদের সরিয়ে ফেলা হত। চিকিৎসার উপর নির্ভর করে, মাদী মশাদের রক্ত ​​খাওয়ার কমপক্ষে ৪৮ ঘন্টা পর চার রাত আলাদা আলাদা মাদী মশাদের স্পাউনিং কাপে রাখা হত। একটি স্টেরিওস্কোপের অধীনে ডিম গণনা করা হত (স্টেমি ৫০৮, জেইস); মিলিত মাদী মশাদের ক্ষেত্রে, লার্ভাতে ফুটে ওঠা ডিমগুলিকে উর্বর বলে বিবেচনা করা হত।
সঙ্গমের পরীক্ষার জন্য, চিকিৎসার উপর নির্ভর করে স্ত্রীদের কমপক্ষে 2 দিন সময় দেওয়া হয়েছিল যাতে তারা সঙ্গমের প্রতিরোধ গড়ে তুলতে পারে এবং বন্য-প্রজাতির বয়সের সাথে মিলে যাওয়া পুরুষদের একই খাঁচায় প্রবেশ করানো হয়েছিল। দুই রাত পরে, স্ত্রী নিষিক্ত ভেসিকলগুলি ব্যবচ্ছেদ করা হয়েছিল এবং 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, এবং 25 mM NaCl (pH 8.2) ধারণকারী একটি বাফারে ফ্রিজ-থ এবং সোনিকেশনের মাধ্যমে জিনোমিক ডিএনএ মুক্তি দেওয়া হয়েছিল। নমুনাগুলিকে 55 °C তাপমাত্রায় 15 মিনিটের জন্য প্রোটিনেজ K (0.86 µg µl-1) দিয়ে ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল, তারপরে 95 °C তাপমাত্রায় 10 মিনিট। অপরিশোধিত জিনোমিক ডিএনএ প্রস্তুতি 10-গুণ পাতলা করা হয়েছিল এবং Y ক্রোমোজোম সিকোয়েন্সের qPCR সনাক্তকরণের শিকার করা হয়েছিল; প্রাইমারগুলি বর্ধিত ডেটা টেবিল 2-এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। Y ক্রোমোজোম সিকোয়েন্সের অনুপস্থিতি কোনও মিলনের ইঙ্গিত দেয় না।
পুনঃসঙ্গম পরীক্ষা করার জন্য, জোরপূর্বক মিলিত মহিলাদের মিলনের অবস্থা নিশ্চিত করার জন্য মিলনের প্লাগের উপস্থিতি পরীক্ষা করা হয়েছিল এবং পুরুষদের অনুপস্থিতিতে মিলনের জন্য অবাধ্যতা বিকাশের জন্য 2 দিন সময় দেওয়া হয়েছিল, যেমনটি পূর্বে বর্ণিত 36। DsRed ট্রান্সজেনিক শুক্রাণু বহনকারী পুরুষদের তারপর স্ত্রী খাঁচায় প্রবেশ করানো হয়েছিল। দুই রাত পরে, স্ত্রীদের থেকে নিষিক্ত ভেসিকেলগুলি বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল, এবং উপরে বর্ণিত হিসাবে জিনোমিক ডিএনএ প্রস্তুত করা হয়েছিল এবং DsRed ট্রান্সজিনের qPCR সনাক্তকরণের জন্য নিযুক্ত করা হয়েছিল; প্রাইমারগুলি বর্ধিত ডেটা টেবিল 2-এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। DsRed ট্রান্সজিনের অনুপস্থিতি ইঙ্গিত দেয় যে কোনও পুনঃসঙ্গম ঘটেনি।
3D20E পূর্বে বর্ণিত 37 পদ্ধতিতে সংশ্লেষিত করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, 10 মিলিগ্রাম 20E (সিগমা-অ্যালড্রিচ) 10 মিলি জলে দ্রবীভূত করা হয়েছিল, তারপরে 30 মিলিগ্রাম প্ল্যাটিনাম ব্ল্যাক (পাউডার আকারে, সিগমা-অ্যালড্রিচ) যোগ করা হয়েছিল। বিক্রিয়ার মিশ্রণে O2 এর একটি মৃদু প্রবাহ ক্রমাগত বুদবুদ করা হয়েছিল, যা ঘরের তাপমাত্রায় আলোড়িত করা হয়েছিল। 6 ঘন্টা পরে, বিক্রিয়ার থামাতে 30 মিলি মিথানল যোগ করা হয়েছিল। অনুঘটক কণা অপসারণের জন্য মিশ্রণটি সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। ঘরের তাপমাত্রায় ভ্যাকুওতে শুষ্ক অবস্থায় সুপারনাট্যান্ট বাষ্পীভূত করা হয়েছিল। HPLC-MS/MS বিশ্লেষণের জন্য ইনজেকশনের জন্য শুকনো বিক্রিয়ার পণ্যটি 10% ইথানল এবং মিথানলে দ্রবীভূত করা হয়েছিল। রূপান্তর হার (20E থেকে 3D20E পর্যন্ত) প্রায় 97% (চিত্র 4b), এবং সংশ্লেষিত 3D20E এর MS বর্ণালী মিলিত মহিলাদের (চিত্র 4c) সাথে মিলে যায়।
এই কিংবদন্তিতে সম্পাদিত পরিসংখ্যানগত পরীক্ষার নির্দিষ্ট বিবরণ রয়েছে। ফিশারের সঠিক পরীক্ষা, ম্যান্টেল-কক্স পরীক্ষা এবং স্টুডেন্টের টি-টেস্ট সম্পাদনের জন্য গ্রাফপ্যাড (সংস্করণ 9.0) ব্যবহার করা হয়েছিল। কোচরান-ম্যান্টেল-হেন্সজেল পরীক্ষাগুলি একটি কাস্টম R স্ক্রিপ্ট ব্যবহার করে করা হয়েছিল (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test এ উপলব্ধ)। 0.05 এর তাৎপর্য থ্রেশহোল্ড সহ শাপিরো-উইল্ক পরীক্ষা ব্যবহার করে ডেটা বিতরণ স্বাভাবিকতার জন্য পরীক্ষা করা হয়েছিল। যখন ডেটা স্বাভাবিকতা পরীক্ষায় ব্যর্থ হয়, তখন মান-হুইটনি পরীক্ষা করা হয়েছিল। ম্যান্টেল-কক্স পরীক্ষা ব্যবহার করে বেঁচে থাকার ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। RNA-seq জিন-স্তরের ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ সম্পাদনের জন্য DESeq2 প্যাকেজ (সংস্করণ 1.28.1) ব্যবহার করা হয়েছিল। গ্রাফের অনুভূমিক বারটি মধ্যমাকে প্রতিনিধিত্ব করে। সমস্ত পরীক্ষার জন্য P = 0.05 এর একটি তাৎপর্য মান থ্রেশহোল্ড হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল।
গবেষণা নকশা সম্পর্কে আরও তথ্যের জন্য, এই নিবন্ধের সাথে লিঙ্ক করা প্রকৃতি গবেষণা প্রতিবেদনের সারাংশ দেখুন।
MS প্রোটিওমিক ডেটা PRIDE পার্টনার রিপোজিটরি (https://www.ebi.ac.uk/pride/) এর মাধ্যমে ডেটাসেট শনাক্তকারী PXD032157 সহ ProteomeXchange কনসোর্টিয়ামে (http://proteomecentral.proteomexchange.org) জমা করা হয়েছিল।
RNA-seq ডেটাসেটটি GSE198665 সিরিয়াল রেকর্ডের অধীনে জিন এক্সপ্রেশন কম্প্রিহেনসিভ লাইব্রেরিতে (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) জমা করা হয়েছে।
বর্তমান গবেষণার সময় তৈরি এবং/অথবা বিশ্লেষণ করা অতিরিক্ত ডেটাসেটগুলি যুক্তিসঙ্গত অনুরোধের ভিত্তিতে সংশ্লিষ্ট লেখকদের কাছ থেকে পাওয়া যেতে পারে। এই নিবন্ধটি উৎস তথ্য প্রদান করে।
ডি লুফ, এ. একডিস্টেরয়েডস: অবহেলিত পোকামাকড়ের যৌন স্টেরয়েড? পুরুষ: ব্ল্যাক বক্স। পোকামাকড় বিজ্ঞান।১৩, ৩২৫–৩৩৮ (২০০৬)।
রেডফার্ন, সিপিএফ ২০-হাইড্রোক্সাইকডাইসোন ​​এবং অ্যানোফিলিস স্টিফেনসে ডিম্বাশয়ের বিকাশ। জে. ইনসেক্ট ফিজিওলজি।২৮, ৯৭–১০৯ (১৯৮২)।