প্রোপিওনিক অ্যাসিড (PPA), একটি ছত্রাক-রোধী উপাদান এবং খাদ্যে ব্যবহৃত একটি সাধারণ সংযোজনী, ইঁদুরের মধ্যে অস্বাভাবিক স্নায়ুবিকাশের কারণ হিসেবে দেখা গেছে, যার সাথে পরিপাকতন্ত্রের কর্মহীনতাও দেখা যায়, যা সম্ভবত অন্ত্রের জীবাণুবৈষম্যের (gut dysbiosis) কারণে ঘটে থাকে। খাদ্যের মাধ্যমে PPA-এর সংস্পর্শ এবং অন্ত্রের জীবাণুবৈষম্যের মধ্যে একটি যোগসূত্র থাকার কথা বলা হলেও, তা সরাসরি অনুসন্ধান করা হয়নি। এখানে, আমরা অন্ত্রের জীবাণুবৈষম্যের কারণ হতে পারে এমন PPA-সম্পর্কিত পরিবর্তনগুলো অনুসন্ধান করেছি। জীবাণুর গঠন এবং ব্যাকটেরিয়ার বিপাকীয় পথের পার্থক্য নির্ণয়ের জন্য, অপরিশোধিত খাদ্য (n=9) এবং PPA-সমৃদ্ধ খাদ্য (n=13) খাওয়ানো ইঁদুরের অন্ত্রের জীবাণুসমূহের ক্রম দীর্ঘ-পরিসরের মেটাজিনোমিক সিকোয়েন্সিং (long-range metagenomic sequencing) ব্যবহার করে নির্ণয় করা হয়েছিল। খাদ্যে PPA-এর উপস্থিতি বেশ কিছু গুরুত্বপূর্ণ ট্যাক্সার প্রাচুর্য বৃদ্ধির সাথে সম্পর্কিত ছিল, যার মধ্যে বেশ কয়েকটি ব্যাকটেরয়েডস (Bacteroides), প্রিভোটেলা (Prevotella), এবং রুমিনোকক্কাস (Ruminococcus) প্রজাতি অন্তর্ভুক্ত, যাদের সদস্যদের পূর্বে PPA উৎপাদনে জড়িত বলে মনে করা হয়েছিল। PPA-এর সংস্পর্শে আসা ইঁদুরের জীবাণুবৈষম্যে লিপিড বিপাক এবং স্টেরয়েড হরমোন সংশ্লেষণ সম্পর্কিত পথও বেশি ছিল। আমাদের ফলাফল ইঙ্গিত করে যে PPA অন্ত্রের জীবাণুবৈষম্য এবং এর সাথে সম্পর্কিত বিপাকীয় পথগুলোকে পরিবর্তন করতে পারে। এই পর্যবেক্ষণকৃত পরিবর্তনগুলো থেকে বোঝা যায় যে, খাওয়ার জন্য নিরাপদ হিসেবে শ্রেণীবদ্ধ প্রিজারভেটিভগুলোও অন্ত্রের জীবাণুগোষ্ঠীর গঠন এবং ফলস্বরূপ মানব স্বাস্থ্যকে প্রভাবিত করতে পারে।
মানব মাইক্রোবায়োমকে প্রায়শই "শরীরের শেষ অঙ্গ" হিসাবে উল্লেখ করা হয় এবং এটি মানব স্বাস্থ্যে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে (বাকেরো এবং নোম্বেলা, ২০১২)। বিশেষ করে, অন্ত্রের মাইক্রোবায়োম তার তন্ত্রব্যাপী প্রভাব এবং অনেক অপরিহার্য কার্যকলাপে ভূমিকার জন্য স্বীকৃত। অন্ত্রে সহজীবী ব্যাকটেরিয়া প্রচুর পরিমাণে থাকে, যা একাধিক বাস্তুতান্ত্রিক স্থান দখল করে, পুষ্টি গ্রহণ করে এবং সম্ভাব্য রোগ সৃষ্টিকারী জীবাণুর সাথে প্রতিযোগিতা করে (জান্ধিয়ালা প্রমুখ, ২০১৫)। অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটার বিভিন্ন ব্যাকটেরিয়া উপাদান ভিটামিনের মতো প্রয়োজনীয় পুষ্টি উৎপাদন করতে এবং হজম প্রক্রিয়াকে ত্বরান্বিত করতে সক্ষম (রোল্যান্ড প্রমুখ, ২০১৮)। ব্যাকটেরিয়ার বিপাকীয় পদার্থগুলো টিস্যুর বিকাশকে প্রভাবিত করে এবং বিপাকীয় ও রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতাকে উন্নত করে বলেও দেখা গেছে (হেইজ্টজ প্রমুখ, ২০১১; ইউ প্রমুখ, ২০২২)। মানব অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমের গঠন অত্যন্ত বৈচিত্র্যময় এবং এটি জিনগত ও পরিবেশগত কারণ, যেমন খাদ্যাভ্যাস, লিঙ্গ, ঔষধপত্র এবং স্বাস্থ্যগত অবস্থার উপর নির্ভর করে (কুম্ভারে প্রমুখ, ২০১৯)।
মাতৃকালীন খাদ্য ভ্রূণ ও নবজাতকের বিকাশের একটি অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ উপাদান এবং এটি এমন সব যৌগের একটি সম্ভাব্য উৎস যা বিকাশকে প্রভাবিত করতে পারে (বেজার এট আল., ২০০৪; ইনিস, ২০১৪)। এই ধরনের একটি গুরুত্বপূর্ণ যৌগ হলো প্রোপায়োনিক অ্যাসিড (PPA), যা ব্যাকটেরিয়াঘটিত গাঁজন থেকে প্রাপ্ত একটি স্বল্প-শৃঙ্খল ফ্যাটি অ্যাসিড উপজাত এবং একটি খাদ্য সংযোজক (ডেন বেস্টেন এট আল., ২০১৩)। PPA-এর ব্যাকটেরিয়ারোধী ও ছত্রাকরোধী বৈশিষ্ট্য রয়েছে এবং তাই এটি খাদ্য সংরক্ষক হিসেবে এবং শিল্পক্ষেত্রে ছত্রাক ও ব্যাকটেরিয়ার বৃদ্ধি রোধ করতে ব্যবহৃত হয় (ওয়েমেনহোভ এট আল., ২০১৬)। বিভিন্ন কলায় PPA-এর প্রভাব ভিন্ন ভিন্ন হয়। যকৃতে, ম্যাক্রোফেজে সাইটোকাইন প্রকাশের উপর প্রভাব ফেলে PPA প্রদাহরোধী প্রভাব ফেলে (কাওয়াসো এট আল., ২০২২)। এই নিয়ন্ত্রক প্রভাব অন্যান্য রোগ প্রতিরোধকারী কোষেও পরিলক্ষিত হয়েছে, যা প্রদাহ কমাতে সাহায্য করে (হাসে এট আল., ২০২১)। তবে, মস্তিষ্কে এর বিপরীত প্রভাব দেখা গেছে। পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে পিপিএ-এর সংস্পর্শে ইঁদুরের মধ্যে অটিজম-সদৃশ আচরণ দেখা দেয় (এল-আনসারি এট আল., ২০১২)। অন্যান্য গবেষণায় দেখা গেছে যে পিপিএ মস্তিষ্কে গ্লিওসিস ঘটাতে এবং প্রদাহ-সৃষ্টিকারী পথগুলোকে সক্রিয় করতে পারে (আবদেল্লি এট আল., ২০১৯)। যেহেতু পিপিএ একটি দুর্বল অ্যাসিড, এটি অন্ত্রের এপিথেলিয়াম ভেদ করে রক্তপ্রবাহে প্রবেশ করতে পারে এবং এর ফলে রক্ত-মস্তিষ্ক প্রতিবন্ধক ও প্ল্যাসেন্টাসহ বিভিন্ন প্রতিবন্ধক অতিক্রম করতে পারে (স্টিনসন এট আল., ২০১৯), যা ব্যাকটেরিয়া দ্বারা উৎপাদিত একটি নিয়ন্ত্রক মেটাবোলাইট হিসেবে পিপিএ-এর গুরুত্ব তুলে ধরে। যদিও অটিজমের ঝুঁকি হিসেবে পিপিএ-এর সম্ভাব্য ভূমিকা বর্তমানে তদন্তাধীন, অটিজমে আক্রান্ত ব্যক্তিদের উপর এর প্রভাব নিউরাল ডিফারেন্সিয়েশন ঘটানোর বাইরেও বিস্তৃত হতে পারে।
স্নায়ুবিকাশজনিত রোগে আক্রান্ত রোগীদের মধ্যে ডায়রিয়া এবং কোষ্ঠকাঠিন্যের মতো পরিপাকতন্ত্রের উপসর্গগুলো সাধারণ (কাও এট আল., ২০২১)। পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে অটিজম স্পেকট্রাম ডিসঅর্ডার (ASD)-এ আক্রান্ত রোগীদের মাইক্রোবায়োম সুস্থ ব্যক্তিদের থেকে ভিন্ন হয়, যা অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটার ভারসাম্যহীনতার (gut microbiota dysbiosis) উপস্থিতি নির্দেশ করে (ফাইনগোল্ড এট আল., ২০১০)। একইভাবে, প্রদাহজনিত অন্ত্রের রোগ (inflammatory bowel diseases), স্থূলতা, আলঝেইমার রোগ ইত্যাদিতে আক্রান্ত রোগীদের মাইক্রোবায়োমের বৈশিষ্ট্যও সুস্থ ব্যক্তিদের থেকে ভিন্ন হয় (টার্নবফ এট আল., ২০০৯; ভোগট এট আল., ২০১৭; হেনকে এট আল., ২০১৯)। তবে, আজ পর্যন্ত অন্ত্রের মাইক্রোবায়োম এবং স্নায়বিক রোগ বা উপসর্গের মধ্যে কোনো কার্যকারণ সম্পর্ক প্রতিষ্ঠিত হয়নি (ইয়াপ এট আল., ২০২১), যদিও বেশ কিছু ব্যাকটেরিয়ার প্রজাতি এই রোগাবস্থাগুলোর কয়েকটিতে ভূমিকা রাখে বলে মনে করা হয়। উদাহরণস্বরূপ, অ্যাকেরমানসিয়া, ব্যাকটেরয়েডস, ক্লস্ট্রিডিয়াম, ল্যাকটোব্যাসিলাস, ডেসালফোভিব্রিও এবং অন্যান্য গণ অটিজম রোগীদের মাইক্রোবায়োটায় অধিক পরিমাণে পাওয়া যায় (তোমোভা এট আল., ২০১৫; গোলুবেভা এট আল., ২০১৭; ক্রিস্টিয়ানো এট আল., ২০১৮; জুরিতা এট আল., ২০২০)। উল্লেখযোগ্যভাবে, এই গণগুলির কয়েকটির সদস্য প্রজাতিতে পিপিএ উৎপাদনের সাথে সম্পর্কিত জিন রয়েছে বলে জানা যায় (রাইখার্ড এট আল., ২০১৪; ইউন এবং লি, ২০১৬; ঝাং এট আল., ২০১৯; বাউর এবং ড্যুর, ২০২৩)। পিপিএ-এর জীবাণুনাশক বৈশিষ্ট্যের কারণে, এর প্রাচুর্য বৃদ্ধি পিপিএ-উৎপাদনকারী ব্যাকটেরিয়ার বৃদ্ধির জন্য উপকারী হতে পারে (জ্যাকবসন এট আল., ২০১৮)। সুতরাং, পিএফএ-সমৃদ্ধ পরিবেশ অন্ত্রের জীবাণুগোষ্ঠীতে পরিবর্তন আনতে পারে, যার মধ্যে পরিপাকতন্ত্রের রোগ সৃষ্টিকারী জীবাণুও অন্তর্ভুক্ত, যা পরিপাকতন্ত্রের উপসর্গের সম্ভাব্য কারণ হতে পারে।
মাইক্রোবায়োম গবেষণার একটি কেন্দ্রীয় প্রশ্ন হলো, অণুজীবের গঠনের পার্থক্যগুলো কোনো অন্তর্নিহিত রোগের কারণ, নাকি তার লক্ষণ। খাদ্য, অন্ত্রের মাইক্রোবায়োম এবং স্নায়বিক রোগের মধ্যকার জটিল সম্পর্ক উদ্ঘাটনের প্রথম ধাপ হলো অণুজীবের গঠনের উপর খাদ্যের প্রভাব মূল্যায়ন করা। এই উদ্দেশ্যে, আমরা পিপিএ-সমৃদ্ধ বা পিপিএ-স্বল্প খাদ্য গ্রহণকারী ইঁদুরের শাবকদের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োম তুলনা করার জন্য লং-রিড মেটাজিনোমিক সিকোয়েন্সিং ব্যবহার করেছি। শাবকদের তাদের মায়েদের মতোই একই খাদ্য খাওয়ানো হয়েছিল। আমাদের অনুমান ছিল যে, পিপিএ-সমৃদ্ধ খাদ্য অন্ত্রের অণুজীবের গঠন এবং অণুজীবের কার্যকারী পথগুলোতে পরিবর্তন আনবে, বিশেষ করে যেগুলো পিপিএ বিপাক এবং/অথবা পিপিএ উৎপাদনের সাথে সম্পর্কিত।
এই গবেষণায় FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J ট্রান্সজেনিক ইঁদুর (জ্যাকসন ল্যাবরেটরিজ) ব্যবহার করা হয়েছে, যা ইউনিভার্সিটি অফ সেন্ট্রাল ফ্লোরিডা ইনস্টিটিউশনাল অ্যানিমেল কেয়ার অ্যান্ড ইউজ কমিটি (UCF-IACUC)-এর নির্দেশিকা (প্রাণী ব্যবহারের অনুমতি নম্বর: PROTO202000002) অনুসরণ করে গ্লিয়া-নির্দিষ্ট GFAP প্রোমোটারের নিয়ন্ত্রণে সবুজ প্রতিপ্রভ প্রোটিন (GFP) অতিরিক্তভাবে প্রকাশ করে। স্তন্যপান ছাড়ানোর পর, ইঁদুরগুলোকে প্রতিটি খাঁচায় উভয় লিঙ্গের ১-৫টি করে আলাদাভাবে রাখা হয়েছিল। ইঁদুরগুলোকে ইচ্ছামতো হয় একটি পরিশোধিত নিয়ন্ত্রিত খাদ্য (সংশোধিত ওপেন-লেবেল স্ট্যান্ডার্ড ডায়েট, ১৬ কিলোক্যালরি% চর্বি) অথবা একটি সোডিয়াম প্রোপিওনেট-সম্পূরক খাদ্য (সংশোধিত ওপেন-লেবেল স্ট্যান্ডার্ড ডায়েট, ১৬ কিলোক্যালরি% চর্বি, যাতে ৫,০০০ পিপিএম সোডিয়াম প্রোপিওনেট রয়েছে) খেতে দেওয়া হয়েছিল। ব্যবহৃত সোডিয়াম প্রোপিওনেটের পরিমাণ ছিল প্রতি কেজি মোট খাদ্যের ওজনের জন্য ৫,০০০ মিলিগ্রাম পিএফএ-এর সমতুল্য। খাদ্য সংরক্ষক হিসাবে ব্যবহারের জন্য অনুমোদিত পিপিএ-এর এটিই সর্বোচ্চ ঘনত্ব। এই গবেষণার প্রস্তুতির জন্য, প্রজননের ৪ সপ্তাহ আগে থেকে পিতামাতা ইঁদুরদের উভয় প্রকার খাবারই খাওয়ানো হয়েছিল এবং মায়ের পুরো গর্ভাবস্থা জুড়ে তা অব্যাহত রাখা হয়েছিল। শাবক ইঁদুরদের [২২টি ইঁদুর, ৯টি কন্ট্রোল (৬টি পুরুষ, ৩টি স্ত্রী) এবং ১৩টি পিপিএ (৪টি পুরুষ, ৯টি স্ত্রী)] মায়ের দুধ ছাড়ানোর পর ৫ মাস ধরে তাদের মায়ের মতোই একই খাবার দেওয়া হয়েছিল। ৫ মাস বয়সে শাবক ইঁদুরদের বলি দেওয়া হয় এবং তাদের অন্ত্রের মল সংগ্রহ করে প্রথমে ১.৫ মিলি মাইক্রোসেন্ট্রিফিউজ টিউবে -২০°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয় এবং তারপর পোষক ডিএনএ নিঃশেষিত হওয়া ও অণুজীবের নিউক্লিক অ্যাসিড নিষ্কাশন না হওয়া পর্যন্ত একটি -৮০°C ফ্রিজারে স্থানান্তর করা হয়।
একটি পরিবর্তিত প্রোটোকল (Charalampous et al., 2019) অনুসারে হোস্ট ডিএনএ অপসারণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, মলের উপাদান ৫০০ µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593)-এ স্থানান্তর করে হিমায়িত অবস্থায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল। প্রতিবার নিষ্কাশনের জন্য সর্বোচ্চ ১-২টি মলের পিণ্ড প্রক্রিয়াজাত করুন। এরপর টিউবের ভিতরে একটি প্লাস্টিকের মুষল ব্যবহার করে মলের উপাদানগুলোকে যান্ত্রিকভাবে পিষে একটি স্লারি তৈরি করা হয়েছিল। নমুনাগুলোকে ১০,০০০ RCF গতিতে ৫ মিনিটের জন্য অথবা নমুনাগুলো পিণ্ডাকারে জমাট না বাঁধা পর্যন্ত সেন্ট্রিফিউজ করুন, তারপর উপরের তরল অংশটি তুলে ফেলুন এবং পিণ্ডটিকে ২৫০ µl ১× PBS-এ পুনরায় সাসপেন্ড করুন। ইউক্যারিওটিক কোষের ঝিল্লি আলগা করার জন্য ডিটারজেন্ট হিসেবে নমুনায় ২৫০ µl ৪.৪% স্যাপোনিন দ্রবণ (TCI, প্রোডাক্ট নম্বর S0019) যোগ করুন। নমুনাগুলোকে মসৃণ না হওয়া পর্যন্ত আলতোভাবে মেশানো হয়েছিল এবং ঘরের তাপমাত্রায় ১০ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। এরপর, ইউক্যারিওটিক কোষগুলোকে ভাঙার জন্য, নমুনায় ৩৫০ μl নিউক্লিয়েজ-মুক্ত পানি যোগ করে ৩০ সেকেন্ড ইনকিউবেট করা হয় এবং তারপর ১২ μl ৫ M NaCl যোগ করা হয়। এরপর নমুনাগুলোকে ৬০০০ RCF গতিতে ৫ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়। সুপারন্যাট্যান্টটি অ্যাস্পিরেট করে পেললেটটিকে ১০০ μl ১X PBS-এ পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়। হোস্ট ডিএনএ অপসারণ করার জন্য, ১০০ μl HL-SAN বাফার (১২.৮৫৬৮ গ্রাম NaCl, ৪ ml ১M MgCl2, ৩৬ ml নিউক্লিয়েজ-মুক্ত পানি) এবং ১০ μl HL-SAN এনজাইম (ArticZymes P/N 70910-202) যোগ করা হয়। নমুনাগুলো পিপেটিং-এর মাধ্যমে ভালোভাবে মেশানো হয়েছিল এবং একটি এপেনডর্ফ™ থার্মোমিক্সার সি-তে ৩৭ °C তাপমাত্রায় ৮০০ আরপিএম গতিতে ৩০ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। ইনকিউবেশনের পর, ৬০০০ আরসিএফ গতিতে ৩ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং ৮০০ µl ও ১০০০ µl ১X পিবিএস দিয়ে দুইবার ধোয়া হয়েছিল। সবশেষে, পেললেটটিকে ১০০ µl ১X পিবিএস-এ পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল।
নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস মোনার্ক জেনোমিক ডিএনএ পিউরিফিকেশন কিট (নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস, ইপসউইচ, এমএ, ক্যাট# T3010L) ব্যবহার করে মোট ব্যাকটেরিয়াল ডিএনএ পৃথক করা হয়েছিল। কিটের সাথে প্রদত্ত স্ট্যান্ডার্ড অপারেটিং পদ্ধতিটি সামান্য পরিবর্তিত করা হয়েছে। চূড়ান্ত এলুশনের জন্য অপারেশনের পূর্বে নিউক্লিয়েজ-মুক্ত জল ৬০°C তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করে রাখুন। প্রতিটি নমুনায় ১০ µl প্রোটিয়েজ K এবং ৩ µl আরএনএজ A যোগ করুন। তারপর ১০০ µl সেল লাইসিস বাফার যোগ করে আলতোভাবে মেশান। এরপর নমুনাগুলোকে একটি এপেনডর্ফ™ থার্মোমিক্সার C-তে ৫৬°C তাপমাত্রায় এবং ১৪০০ rpm গতিতে কমপক্ষে ১ ঘন্টা থেকে সর্বোচ্চ ৩ ঘন্টা পর্যন্ত ইনকিউবেট করা হয়েছিল। ইনকিউবেট করা নমুনাগুলোকে ১২,০০০ RCF গতিতে ৩ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং প্রতিটি নমুনার সুপারন্যাট্যান্ট ৪০০ µL বাইন্ডিং সলিউশনযুক্ত একটি পৃথক ১.৫ mL মাইক্রোসেন্ট্রিফিউজ টিউবে স্থানান্তর করা হয়েছিল। এরপর টিউবগুলোকে ১ সেকেন্ডের বিরতিতে ৫-১০ সেকেন্ড ধরে পালস ভর্টেক্স করা হয়েছিল। প্রতিটি নমুনার সম্পূর্ণ তরল উপাদান (প্রায় ৬০০-৭০০ µL) একটি ফ্লো-থ্রু কালেকশন টিউবে রাখা ফিল্টার কার্ট্রিজে স্থানান্তর করুন। প্রাথমিক ডিএনএ বাইন্ডিংয়ের জন্য টিউবগুলোকে ১,০০০ RCF-এ ৩ মিনিট ধরে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং তারপর অবশিষ্ট তরল অপসারণের জন্য ১২,০০০ RCF-এ ১ মিনিট ধরে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। স্যাম্পল কলামটি একটি নতুন কালেকশন টিউবে স্থানান্তর করে দুইবার ধোয়া হয়েছিল। প্রথম ধোয়ার জন্য, প্রতিটি টিউবে ৫০০ µL ওয়াশ বাফার যোগ করুন। টিউবটি ৩-৫ বার উল্টে দিন এবং তারপর ১২,০০০ RCF-এ ১ মিনিট ধরে সেন্ট্রিফিউজ করুন। কালেকশন টিউব থেকে তরল ফেলে দিন এবং ফিল্টার কার্ট্রিজটি আবার একই কালেকশন টিউবে রাখুন। দ্বিতীয় ধোয়ার জন্য, ফিল্টারটি না উল্টে ৫০০ µL ওয়াশ বাফার যোগ করুন। নমুনাগুলোকে ১২,০০০ RCF-এ ১ মিনিট ধরে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। ফিল্টারটি একটি ১.৫ মিলি লোবাইন্ড® টিউবে স্থানান্তর করুন এবং ১০০ মাইক্রোলিটার আগে থেকে গরম করা নিউক্লিয়েজ-মুক্ত পানি যোগ করুন। ফিল্টারগুলোকে ঘরের তাপমাত্রায় ১ মিনিট ইনকিউবেট করা হয় এবং তারপর ১২,০০০ RCF গতিতে ১ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়। নিষ্কাশিত ডিএনএ -৮০°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল।
একটি Qubit™ 4.0 ফ্লুরোমিটার ব্যবহার করে ডিএনএ-এর ঘনত্ব পরিমাপ করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুসারে Qubit™ 1X dsDNA হাই সেনসিটিভিটি কিট (ক্যাট. নং Q33231) ব্যবহার করে ডিএনএ প্রস্তুত করা হয়েছিল। একটি Agilent™ 4150 বা 4200 টেপস্টেশন ব্যবহার করে ডিএনএ খণ্ডের দৈর্ঘ্যের বিন্যাস পরিমাপ করা হয়েছিল। Agilent™ জেনোমিক ডিএনএ রিএজেন্টস (ক্যাট. নং 5067-5366) এবং জেনোমিক ডিএনএ স্ক্রিনটেপ (ক্যাট. নং 5067-5365) ব্যবহার করে ডিএনএ প্রস্তুত করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুসারে অক্সফোর্ড ন্যানোপোর টেকনোলজিস™ (ONT) র‍্যাপিড পিসিআর বারকোডিং কিট (SQK-RPB004) ব্যবহার করে লাইব্রেরি প্রস্তুত করা হয়েছিল। একটি Min106D ফ্লো সেল (R 9.4.1) সহ একটি ONT GridION™ Mk1 সিকোয়েন্সার ব্যবহার করে ডিএনএ-এর সিকোয়েন্সিং করা হয়েছিল। সিকোয়েন্সিং সেটিংসগুলো ছিল: উচ্চ নির্ভুলতা সম্পন্ন বেস কলিং, সর্বনিম্ন q ভ্যালু ৯, বারকোড সেটআপ এবং বারকোড ট্রিম। নমুনাগুলো ৭২ ঘণ্টা ধরে সিকোয়েন্স করা হয়েছিল, যার পরে বেস কল ডেটা পরবর্তী প্রক্রিয়াকরণ ও বিশ্লেষণের জন্য জমা দেওয়া হয়।
পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতি (গ্রিনম্যান এট আল., ২০২৪) ব্যবহার করে বায়োইনফরমেটিক্স প্রক্রিয়াকরণ করা হয়েছিল। সিকোয়েন্সিং থেকে প্রাপ্ত FASTQ ফাইলগুলিকে প্রতিটি নমুনার জন্য ডিরেক্টরিতে ভাগ করা হয়েছিল। বায়োইনফরমেটিক্স বিশ্লেষণের আগে, নিম্নলিখিত পাইপলাইন ব্যবহার করে ডেটা প্রক্রিয়াকরণ করা হয়েছিল: প্রথমে, নমুনাগুলির FASTQ ফাইলগুলিকে একত্রিত করে একটি একক FASTQ ফাইলে পরিণত করা হয়েছিল। তারপর, Filtlong v. 0.2.1 ব্যবহার করে ১০০০ bp-এর চেয়ে ছোট রিডগুলি ফিল্টার করা হয়েছিল, যেখানে শুধুমাত্র –min_length 1000 প্যারামিটারটি পরিবর্তন করা হয়েছিল (উইক, ২০২৪)। আরও ফিল্টারিং করার আগে, NanoPlot v. 1.41.3 ব্যবহার করে নিম্নলিখিত প্যারামিটারগুলির সাহায্যে রিডের গুণমান নিয়ন্ত্রণ করা হয়েছিল: –fastq –plots dot –N50 -o(ডি কস্টার এবং রাডেমাকার্স, ২০২৩)। হোস্ট-দূষিত রিডগুলি অপসারণ করার জন্য নিম্নলিখিত প্যারামিটার ব্যবহার করে মিনিম্যাপ২ ভি. ২.২৪-আর১১২২ দ্বারা রিডগুলিকে মাউস রেফারেন্স জিনোম জিআরসিএম৩৯ (জিসিএফ_০০০০০০১৬৩৫.২৭)-এর সাথে অ্যালাইন করা হয়েছিল: -L -ax map-ont(লি, ২০১৮)। তৈরি করা অ্যালাইনমেন্ট ফাইলগুলোকে samtools v. 1.16.1-এ samtools view -b (ডানেসেক এট আল., ২০২১) ব্যবহার করে BAM ফরম্যাটে রূপান্তর করা হয়েছিল। এরপর samtools view -b -f 4 ব্যবহার করে আনঅ্যালাইনড রিডগুলো শনাক্ত করা হয়েছিল, যা নির্দেশ করে যে এই রিডগুলো হোস্ট জিনোমের অন্তর্গত নয়। আনঅ্যালাইনড রিডগুলোকে ডিফল্ট প্যারামিটারসহ samtools bam2fq ব্যবহার করে পুনরায় FASTQ ফরম্যাটে রূপান্তর করা হয়েছিল। পূর্বে বর্ণিত সেটিংস ব্যবহার করে আরও ফিল্টার করা রিডগুলোর উপর NanoPlot পুনরায় চালানো হয়েছিল। ফিল্টারিংয়ের পর, মেটাফ্লাই v. 2.8.2-b1689 ব্যবহার করে নিম্নলিখিত প্যারামিটারসহ মেটাজিনোমিক ডেটা অ্যাসেম্বল করা হয়েছিল: –nano-raw–মেটা (কলমোগোরভ এট আল., ২০২০)। বাকি প্যারামিটারগুলো তাদের ডিফল্ট মানে রাখুন। অ্যাসেম্বলির পরে, মিনিম্যাপ২ (minimap2) ব্যবহার করে ফিল্টার করা রিডগুলোকে অ্যাসেম্বলিতে ম্যাপ করা হয়েছিল এবং স্যাম (SAM) ফরম্যাটে একটি অ্যালাইনমেন্ট ফাইল তৈরি করতে -ax ম্যাপ-অনট (map-ont) প্যারামিটারটি ব্যবহার করা হয়েছিল। অ্যাসেম্বলিটি প্রথমে র‍্যাকন (racon) সংস্করণ ১.৪.২০ ব্যবহার করে নিম্নলিখিত প্যারামিটারসহ রিফাইন করা হয়েছিল: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (ভ্যাসার এট আল., ২০১৭)। র‍্যাকন সম্পন্ন হওয়ার পরে, এটি মেডাকা (medaka) সংস্করণ ১.৭.২ ব্যবহার করে মেডাকা_কনসেসুস (medaka_consesus) দ্বারা আরও রিফাইন করা হয়েছিল, যেখানে -m প্যারামিটারটি ছাড়া বাকি সব প্যারামিটার তাদের ডিফল্ট মানে রাখা হয়েছিল। আমাদের ডেটার জন্য ব্যবহৃত ফ্লো সেল কেমিস্ট্রি এবং হাই-অ্যাকুরেসি বেস কলিং নির্দিষ্ট করতে -m প্যারামিটারটি r941_min_hac_g507-এ সেট করা হয়েছে (ন্যানোপোরটেক/মেডাকা, ২০২৪)। ফিল্টার করা ডেটা (যা পরবর্তীতে মাইক্রোবিয়াল ডেটা হিসাবে উল্লেখিত) এবং চূড়ান্ত পরিমার্জিত অ্যাসেম্বলি পরবর্তী বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।
ট্যাক্সোনমিক শ্রেণিবিন্যাসের জন্য, রিড এবং অ্যাসেম্বলড কন্টিগগুলোকে Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019) ব্যবহার করে শ্রেণিবদ্ধ করা হয়েছিল। যথাক্রমে রিড এবং অ্যাসেম্বলির জন্য রিপোর্ট এবং আউটপুট ফাইল তৈরি করুন। রিড এবং অ্যাসেম্বলি বিশ্লেষণ করতে –use-names অপশনটি ব্যবহার করুন। রিড সেগমেন্টের জন্য –gzip-compressed এবং –paired অপশনগুলো নির্দিষ্ট করা হয়েছে। মেটাজিনোমে ট্যাক্সার আপেক্ষিক প্রাচুর্য Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017) ব্যবহার করে অনুমান করা হয়েছিল। আমরা প্রথমে নিম্নলিখিত প্যারামিটারসহ bracken-build ব্যবহার করে ১০০০ বেস সম্বলিত একটি kmer ডেটাবেস তৈরি করেছি: -d-k 35 -l 1000 একবার বিল্ড হয়ে গেলে, kraken2 দ্বারা তৈরি রিপোর্টের উপর ভিত্তি করে bracken চলে এবং নিম্নলিখিত অপশনগুলো ব্যবহার করে ডেটা ফিল্টার করে: -d -I -O-p 1000 -l

এদের মধ্যে, বিশ্লেষণাধীন শ্রেণিবিন্যাস স্তরের উপর নির্ভর করে P, G বা S নির্বাচন করা হয়। ফলস পজিটিভ শ্রেণিবিন্যাসের প্রভাব কমানোর জন্য, 1e-4 (1/10,000 রিডস) এর একটি সর্বনিম্ন আপেক্ষিক প্রাচুর্য থ্রেশহোল্ড গ্রহণ করা হয়েছিল। পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণের আগে, ব্র্যাকেন দ্বারা রিপোর্ট করা আপেক্ষিক প্রাচুর্য (fraction_total_reads) সেন্টার্ড লগ-রেশিও (CLR) রূপান্তর (Aitchison, 1982) ব্যবহার করে রূপান্তরিত করা হয়েছিল। ডেটা রূপান্তরের জন্য CLR পদ্ধতিটি বেছে নেওয়া হয়েছিল কারণ এটি স্কেল-ইনভেরিয়েন্ট এবং নন-স্পার্স ডেটাসেটের জন্য যথেষ্ট (Gloor et al., 2017)। CLR রূপান্তর প্রাকৃতিক লগারিদম ব্যবহার করে। ব্র্যাকেন দ্বারা রিপোর্ট করা গণনা ডেটা রিলেটিভ লগ এক্সপ্রেশন (RLE) (Anders and Huber, 2010) ব্যবহার করে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। চিত্রগুলি matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 এবং সিকোয়েনশিয়াল লগারিদম (Gloor et al., 2017) এর সমন্বয়ে তৈরি করা হয়েছিল। ০.১২.২ এবং স্ট্যান্টানোটেশনস ভি. ০.৫.০ (হান্টার, ২০০৭; ওয়াসকম, ২০২১; শার্লিয়ার এট আল., ২০২২)। স্বাভাবিককৃত ব্যাকটেরিয়ার সংখ্যা ব্যবহার করে প্রতিটি নমুনার জন্য ব্যাসিলাস/ব্যাকটেরয়েডিটিস অনুপাত গণনা করা হয়েছিল। সারণিতে উল্লিখিত মানগুলো ৪ দশমিক স্থান পর্যন্ত আসন্ন করা হয়েছে। ক্রাকেনটুলস ভি. ১.২ প্যাকেজে (লু এট আল., ২০২২) প্রদত্ত alpha_diversity.py স্ক্রিপ্ট ব্যবহার করে সিম্পসন ডাইভারসিটি ইনডেক্স গণনা করা হয়েছিল। স্ক্রিপ্টে ব্র্যাকেন রিপোর্ট এবং -an প্যারামিটারের জন্য সিম্পসন ইনডেক্স “Si” প্রদান করা হয়েছে। প্রাচুর্যের উল্লেখযোগ্য পার্থক্যকে গড় CLR পার্থক্য ≥ ১ বা ≤ -১ হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল। ±১ এর গড় CLR পার্থক্য একটি নমুনার প্রাচুর্যে ২.৭-গুণ বৃদ্ধি নির্দেশ করে। চিহ্ন (+/-) নির্দেশ করে যে ট্যাক্সনটি যথাক্রমে পিপিএ নমুনা এবং নিয়ন্ত্রণ নমুনায় বেশি প্রাচুর্যপূর্ণ কিনা। ম্যান-হুইটনি ইউ টেস্ট (ভার্টানেন এট আল., ২০২০) ব্যবহার করে তাৎপর্য নির্ধারণ করা হয়েছিল। স্ট্যাটসমডেলস ভি. ০.১৪ (বেঞ্জামিনি ও হচবার্গ, ১৯৯৫; সিবোল্ড ও পার্কটোল্ড, ২০১০) ব্যবহার করা হয়েছিল এবং একাধিক পরীক্ষার ত্রুটি সংশোধনের জন্য বেঞ্জামিনি-হচবার্গ পদ্ধতি প্রয়োগ করা হয়েছিল। পরিসংখ্যানগত তাৎপর্য নির্ধারণের জন্য থ্রেশহোল্ড হিসেবে একটি অ্যাডজাস্টেড পি-ভ্যালু ≤ ০.০৫ ব্যবহার করা হয়েছিল।
মারাঙ্গা এট আল. (মারাঙ্গা এট আল., ২০২৩) দ্বারা বর্ণিত প্রোটোকলের একটি পরিবর্তিত সংস্করণ ব্যবহার করে জিন অ্যানোটেশন এবং আপেক্ষিক প্রাচুর্য নিরূপণ করা হয়েছিল। প্রথমে, SeqKit v. 2.5.1 (শেন এট আল., ২০১৬) ব্যবহার করে সমস্ত অ্যাসেম্বলি থেকে ৫০০ bp-এর চেয়ে ছোট কন্টিগগুলি সরিয়ে ফেলা হয়েছিল। এরপর নির্বাচিত অ্যাসেম্বলিগুলিকে একত্রিত করে একটি প্যান-মেটাজিনোমে পরিণত করা হয়েছিল। Prodigal v. 1.0.1 (Prodigal v. 2.6.3-এর একটি সমান্তরাল সংস্করণ) ব্যবহার করে নিম্নলিখিত প্যারামিটারগুলির সাহায্যে ওপেন রিডিং ফ্রেম (ORF) শনাক্ত করা হয়েছিল: -d-f gff-i -O-T 24 -p meta -C 10000 (হায়েট এট আল., ২০১২; জেনিক, ২০২৪)। এরপর প্রাপ্ত নিউক্লিওটাইড ফাইলগুলো থেকে সমস্ত অসম্পূর্ণ জিন বাদ দেওয়ার জন্য পাইথন ব্যবহার করে ফিল্টার করা হয়েছিল। তারপর নিম্নলিখিত প্যারামিটারসহ জিনগুলোকে ক্লাস্টার করার জন্য সিডি-হিট ভি. ৪.৮.১ ব্যবহার করা হয়েছিল: cd-hit-est -i -O-c 0.95 -s 0.85 -aS 0.9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (ফু এট আল., ২০১২)। তৈরি করা অপ্রয়োজনীয় জিন ক্যাটালগটি জিনের প্রাচুর্য এবং টীকা অনুমান করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। আপেক্ষিক জিনের প্রাচুর্য KMA v. 1.4.9 (ক্লাউসেন এট আল., ২০১৮) ব্যবহার করে অনুমান করা হয়েছিল। প্রথমে, নিম্নলিখিত প্যারামিটার সহ KMA ইনডেক্স ব্যবহার করে একটি ইনডেক্স ফাইল তৈরি করুন: -i -Oতারপর, বায়োইনফরমেটিক্স পাইপলাইন বিভাগে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে প্রতিটি নমুনার মাইক্রোবিয়াল রিড থেকে প্রাপ্ত ইনডেক্স ব্যবহার করে, নিম্নলিখিত প্যারামিটারসহ KMA চালানো হয়েছিল: -i -O-t_db-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24। এরপর, CLR ব্যবহার করে জিনের সংখ্যা স্বাভাবিক করা হয়েছিল এবং Sci-kit learn-এর প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট অ্যানালাইসিস (PCA) ক্লাস ব্যবহার করা হয়েছিল (Pedregosa et al., 2011)। eggNOG v. 2.1.12-এর emapper.py স্ক্রিপ্ট এবং eggNOG ডাটাবেস সংস্করণ 5.0.2 ব্যবহার করে নিম্নলিখিত প্যারামিটার সহ নন-রিডানড্যান্ট জিন ক্যাটালগে পূর্বাভাসিত জিন অ্যানোটেশন করা হয়েছিল: –itype CDS –cpu 24 -i– ডেটা ক্যাটালগ–go_evidence অ-ইলেকট্রনিক – আউটপুটআউটপুট ডিরেক্টরি–টার্গেট_অর্থোলগস সব –সিড_অর্থোলগ_ইভ্যালু 0.001 –সিড_অর্থোলগ_স্কোর 60 –কোয়েরি_কভার 20 –সাবজেক্ট_কভার 0 –ট্রান্সলেট –ওভাররাইড –টেম্প_ডির(ক্যান্টালাপিয়েদ্রা এট আল., ২০২১)। পর্যাপ্ত টেমপ্লেট কভারেজ ও টেমপ্লেট আইডেন্টিটি (≥ ৯০%) এবং প্রাচুর্য (ডেপথ ≥ ৩) সম্পন্ন জিন নির্বাচন করার জন্য KMA ফলাফলগুলো স্ক্রিন করা হয়েছিল। উপরে বর্ণিত পদ্ধতি অনুযায়ী CLR ব্যবহার করে KMA ডেপথ ফলাফলগুলোকে ট্রান্সফর্ম করা হয়েছিল। এরপর প্রতিটি জিনের কন্টিগ সোর্স ব্যবহার করে ফাংশনাল অ্যানোটেশন এবং ক্লাসিফিকেশন ফলাফল থেকে প্রাপ্ত কন্টিগ আইডিগুলোর সাথে KMA ফলাফলগুলোকে তুলনা করা হয়েছিল। ট্যাক্সার মতোই, জিনের প্রাচুর্যের ক্ষেত্রে তাৎপর্যপূর্ণ পার্থক্যকে সেইসব জিন হিসেবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল যাদের গড় CLR পার্থক্য ≥ ১ বা ≤ -১, যেখানে একটি চিহ্ন (+/-) নির্দেশ করে যে জিনটি যথাক্রমে PPA বা কন্ট্রোল স্যাম্পলে অধিক প্রাচুর্যপূর্ণ ছিল।
জিন পাথওয়ের প্রাচুর্য তুলনা করার জন্য, প্রথমে eggNOG দ্বারা নির্ধারিত কিয়োটো এনসাইক্লোপিডিয়া অফ জিনস অ্যান্ড জিনোমস (KEGG) অর্থোলগ (KO) শনাক্তকারী অনুসারে জিনগুলোকে দলবদ্ধ করা হয়েছিল। বিশ্লেষণের আগে নকআউটবিহীন জিন বা একাধিক নকআউটযুক্ত জিনগুলোকে বাদ দেওয়া হয়েছিল। এরপর প্রতিটি নমুনার জন্য প্রতিটি KO-এর গড় প্রাচুর্য গণনা করা হয়েছিল এবং পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। PPA বিপাক জিনগুলোকে এমন যেকোনো জিন হিসেবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল, যেটিকে KEGG_Pathway কলামে ko00640 সারিটি বরাদ্দ করা হয়েছিল, যা KEGG অনুসারে প্রোপিওনেট বিপাকে এর ভূমিকা নির্দেশ করে। PPA উৎপাদনের সাথে সম্পর্কিত হিসেবে চিহ্নিত জিনগুলো পরিপূরক সারণি ১-এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017)। প্রতিটি নমুনার ধরনে উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি প্রাচুর্যপূর্ণ PPA বিপাক এবং উৎপাদনকারী জিন শনাক্ত করার জন্য পারমুটেশন পরীক্ষা করা হয়েছিল। বিশ্লেষণ করা প্রতিটি জিনের জন্য এক হাজার পারমুটেশন করা হয়েছিল। পরিসংখ্যানগত তাৎপর্য নির্ধারণের জন্য একটি কাটঅফ হিসেবে ০.০৫-এর একটি পি-ভ্যালু ব্যবহার করা হয়েছিল। একটি ক্লাস্টারের অন্তর্গত প্রতিনিধি জিনগুলোর অ্যানোটেশনের উপর ভিত্তি করে সেই ক্লাস্টারের প্রতিটি জিনকে ফাংশনাল অ্যানোটেশন প্রদান করা হয়েছিল। EgNOG ব্যবহার করে ফাংশনাল অ্যানোটেশনের সময় সংরক্ষিত কন্টিগ আইডিগুলোর সাথে Kraken2 আউটপুট ফাইলের কন্টিগ আইডিগুলো মিলিয়ে PPA মেটাবলিজম এবং/অথবা PPA উৎপাদনের সাথে সম্পর্কিত ট্যাক্সনগুলোকে শনাক্ত করা সম্ভব হয়েছিল। পূর্বে বর্ণিত ম্যান-হুইটনি ইউ টেস্ট ব্যবহার করে তাৎপর্য পরীক্ষা করা হয়েছিল। বেনজামিনি-হকবার্গ পদ্ধতি ব্যবহার করে একাধিক পরীক্ষার জন্য সংশোধন করা হয়েছিল। পরিসংখ্যানগত তাৎপর্য নির্ধারণের জন্য p-value ≤ 0.05-কে কাটঅফ হিসেবে ব্যবহার করা হয়েছিল।
সিম্পসন ডাইভারসিটি ইনডেক্স ব্যবহার করে ইঁদুরের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমের বৈচিত্র্য মূল্যায়ন করা হয়েছিল। জেনাস এবং স্পিসিস বৈচিত্র্যের ক্ষেত্রে কন্ট্রোল এবং পিপিএ নমুনার মধ্যে কোনো উল্লেখযোগ্য পার্থক্য পরিলক্ষিত হয়নি (জেনাসের জন্য পি-ভ্যালু: ০.১৮, স্পিসিসের জন্য পি-ভ্যালু: ০.১৬) (চিত্র ১)। এরপর প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট অ্যানালাইসিস (PCA) ব্যবহার করে অণুজীবের গঠন তুলনা করা হয়েছিল। চিত্র ২-এ নমুনাগুলোর ফাইলাম অনুসারে গুচ্ছবদ্ধতা দেখানো হয়েছে, যা নির্দেশ করে যে পিপিএ এবং কন্ট্রোল নমুনার মাইক্রোবায়োমের স্পিসিস গঠনে পার্থক্য ছিল। জেনাস পর্যায়ে এই গুচ্ছবদ্ধতা কম স্পষ্ট ছিল, যা থেকে বোঝা যায় যে পিপিএ নির্দিষ্ট কিছু ব্যাকটেরিয়াকে প্রভাবিত করে (পরিপূরক চিত্র ১)।
চিত্র ১। ইঁদুরের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমের গণ এবং প্রজাতি গঠনের আলফা বৈচিত্র্য। পিপিএ এবং কন্ট্রোল নমুনায় গণ (এ) এবং প্রজাতি (বি)-র সিম্পসন বৈচিত্র্য সূচক দেখানো বক্স প্লট। ম্যান-হুইটনি ইউ পরীক্ষা ব্যবহার করে তাৎপর্য নির্ধারণ করা হয়েছিল এবং বেনজামিনি-হকবার্গ পদ্ধতি ব্যবহার করে একাধিক সংশোধন করা হয়েছিল। ns, পি-মান তাৎপর্যপূর্ণ ছিল না (p>0.05)।
চিত্র ২। প্রজাতি পর্যায়ে ইঁদুরের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োম গঠনের প্রধান উপাদান বিশ্লেষণের ফলাফল। প্রধান উপাদান বিশ্লেষণ প্লটটি নমুনাগুলোর প্রথম দুটি প্রধান উপাদানের সাপেক্ষে তাদের বিন্যাস প্রদর্শন করে। রঙ নমুনার ধরন নির্দেশ করে: পিপিএ-এর সংস্পর্শে আসা ইঁদুর বেগুনি এবং নিয়ন্ত্রিত ইঁদুর হলুদ। প্রধান উপাদান ১ এবং ২ যথাক্রমে এক্স-অক্ষ এবং ওয়াই-অক্ষে প্লট করা হয়েছে এবং তাদের ব্যাখ্যা করা ভেদাঙ্কের অনুপাত হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছে।
RLE রূপান্তরিত গণনা ডেটা ব্যবহার করে, কন্ট্রোল এবং PPA ইঁদুরগুলিতে ব্যাকটেরয়েডিটিস/ব্যাসিলাই অনুপাতের মধ্যমায় একটি উল্লেখযোগ্য হ্রাস পরিলক্ষিত হয়েছে (কন্ট্রোল: ৯.৬৬, PPA: ৩.০২; পি-ভ্যালু = ০.০০১১)। এই পার্থক্যের কারণ ছিল কন্ট্রোলের তুলনায় PPA ইঁদুরগুলিতে ব্যাকটেরয়েডিটিসের প্রাচুর্য বেশি থাকা, যদিও পার্থক্যটি উল্লেখযোগ্য ছিল না (কন্ট্রোল গড় CLR: ৫.৫১, PPA গড় CLR: ৬.৬২; পি-ভ্যালু = ০.০৫৪), যেখানে ব্যাকটেরয়েডিটিসের প্রাচুর্য একই রকম ছিল (কন্ট্রোল গড় CLR: ৭.৭৬, PPA গড় CLR: ৭.৬০; পি-ভ্যালু = ০.১৮)।
অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমের শ্রেণিবিন্যাসগত সদস্যদের প্রাচুর্য বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে, পিপিএ এবং কন্ট্রোল নমুনার মধ্যে ১টি পর্ব এবং ৭৭টি প্রজাতির উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল (পরিশিষ্ট সারণি ২)। পিপিএ নমুনায় ৫৯টি প্রজাতির প্রাচুর্য কন্ট্রোল নমুনার তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল, অপরদিকে কন্ট্রোল নমুনায় মাত্র ১৬টি প্রজাতির প্রাচুর্য পিপিএ নমুনার তুলনায় বেশি ছিল (চিত্র ৩)।
চিত্র ৩। পিপিএ এবং কন্ট্রোল ইঁদুরের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমে ট্যাক্সার প্রাচুর্যের পার্থক্য। ভলকানো প্লট পিপিএ এবং কন্ট্রোল নমুনার মধ্যে জেনাস (A) বা প্রজাতি (B)-র প্রাচুর্যের পার্থক্য প্রদর্শন করে। ধূসর বিন্দুগুলো ট্যাক্সার প্রাচুর্যে কোনো উল্লেখযোগ্য পার্থক্য না থাকাকে নির্দেশ করে। রঙিন বিন্দুগুলো প্রাচুর্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (পি-ভ্যালু ≤ ০.০৫)। নমুনার প্রকারভেদের মধ্যে প্রাচুর্যের সবচেয়ে বড় পার্থক্যযুক্ত শীর্ষ ২০টি ট্যাক্সাকে যথাক্রমে লাল এবং হালকা নীল রঙে (কন্ট্রোল এবং পিপিএ নমুনা) দেখানো হয়েছে। হলুদ এবং বেগুনি বিন্দুগুলো কন্ট্রোল নমুনার তুলনায় কন্ট্রোল বা পিপিএ নমুনায় অন্তত ২.৭ গুণ বেশি প্রাচুর্যপূর্ণ ছিল। কালো বিন্দুগুলো সেইসব ট্যাক্সাকে প্রতিনিধিত্ব করে যাদের প্রাচুর্য উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন, যেখানে গড় CLR পার্থক্য -১ থেকে ১-এর মধ্যে। পি-ভ্যালুগুলো ম্যান-হুইটনি ইউ টেস্ট ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল এবং বেনজামিনি-হকবার্গ পদ্ধতি ব্যবহার করে একাধিক পরীক্ষার জন্য সংশোধন করা হয়েছিল। গাঢ় গড় CLR পার্থক্যগুলো প্রাচুর্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে।
অন্ত্রের অণুজীবীয় গঠন বিশ্লেষণ করার পর, আমরা মাইক্রোবায়োমের একটি কার্যকরী টীকা তৈরি করেছি। নিম্নমানের জিনগুলো বাদ দেওয়ার পর, সমস্ত নমুনা জুড়ে মোট ৩৭৮,৩৫৫টি অনন্য জিন শনাক্ত করা হয়েছে। এই জিনগুলোর রূপান্তরিত প্রাচুর্য প্রধান উপাদান বিশ্লেষণ (PCA)-এর জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং ফলাফলগুলো তাদের কার্যকরী প্রোফাইলের উপর ভিত্তি করে নমুনার প্রকারগুলোর উচ্চ মাত্রার গুচ্ছায়ন দেখিয়েছে (চিত্র ৪)।
চিত্র ৪. ইঁদুরের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমের কার্যকরী প্রোফাইল ব্যবহার করে প্রাপ্ত পিসিএ (PCA) ফলাফল। পিসিএ প্লটটি নমুনাগুলোর প্রথম দুটি প্রধান উপাদানের সাপেক্ষে তাদের বিন্যাস প্রদর্শন করে। রঙ নমুনার ধরন নির্দেশ করে: পিপিএ-এর সংস্পর্শে আসা ইঁদুর বেগুনি এবং নিয়ন্ত্রিত ইঁদুর হলুদ। প্রধান উপাদান ১ এবং ২ যথাক্রমে এক্স-অক্ষ এবং ওয়াই-অক্ষে প্লট করা হয়েছে এবং তাদের ব্যাখ্যা করা ভেদাঙ্কের অনুপাত হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছে।
এরপর আমরা বিভিন্ন ধরনের নমুনায় KEGG নকআউটের প্রাচুর্য পরীক্ষা করে দেখেছি। মোট ৩৬৪৮টি স্বতন্ত্র নকআউট শনাক্ত করা হয়েছে, যার মধ্যে ১৯৬টি কন্ট্রোল নমুনায় এবং ১০৬টি PPA নমুনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি পরিমাণে পাওয়া গেছে (চিত্র ৫)। কন্ট্রোল নমুনায় মোট ১৪৫টি এবং PPA নমুনায় ৬১টি জিন শনাক্ত করা হয়েছে, যেগুলোর প্রাচুর্য উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন ছিল। লিপিড এবং অ্যামিনোসুগার বিপাক সম্পর্কিত পাথওয়েগুলো PPA নমুনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি সমৃদ্ধ ছিল (পরিপূরক সারণি ৩)। নাইট্রোজেন বিপাক এবং সালফার রিলে সিস্টেম সম্পর্কিত পাথওয়েগুলো কন্ট্রোল নমুনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি সমৃদ্ধ ছিল (পরিপূরক সারণি ৩)। অ্যামিনোসুগার/নিউক্লিওটাইড বিপাক (ko:K21279) এবং ইনোসিটল ফসফেট বিপাক (ko:K07291) সম্পর্কিত জিনগুলোর প্রাচুর্য PPA নমুনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল (চিত্র ৫)। কন্ট্রোল নমুনাগুলিতে বেনজোয়েট বিপাক (ko:K22270), নাইট্রোজেন বিপাক (ko:K00368), এবং গ্লাইকোলাইসিস/গ্লুকোনিওজেনেসিস (ko:K00131) সম্পর্কিত জিন উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল (চিত্র 5)।
চিত্র ৫। পিপিএ এবং কন্ট্রোল ইঁদুরের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমে কেও (KO)-এর ডিফারেনশিয়াল অ্যাবানডেন্স। ভলকানো প্লটটি ফাংশনাল গ্রুপ (কেও)-এর প্রাচুর্যের পার্থক্য চিত্রিত করে। ধূসর বিন্দুগুলো সেইসব কেও নির্দেশ করে যাদের প্রাচুর্য নমুনার প্রকারভেদের মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন ছিল না (পি-ভ্যালু > ০.০৫)। রঙিন বিন্দুগুলো প্রাচুর্যের উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (পি-ভ্যালু ≤ ০.০৫)। নমুনার প্রকারভেদের মধ্যে প্রাচুর্যের সবচেয়ে বড় পার্থক্যযুক্ত ২০টি কেও লাল এবং হালকা নীল রঙে দেখানো হয়েছে, যা যথাক্রমে কন্ট্রোল এবং পিপিএ নমুনার সাথে সম্পর্কিত। হলুদ এবং বেগুনি বিন্দুগুলো সেইসব কেও নির্দেশ করে যেগুলো যথাক্রমে কন্ট্রোল এবং পিপিএ নমুনায় কমপক্ষে ২.৭-গুণ বেশি প্রাচুর্যপূর্ণ ছিল। কালো বিন্দুগুলো সেইসব কেও নির্দেশ করে যাদের প্রাচুর্য উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন, যেখানে গড় সিএলআর (CLR) পার্থক্য -১ এবং ১-এর মধ্যে। পি-ভ্যালুগুলো ম্যান-হুইটনি ইউ টেস্ট ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল এবং বেনজামিনি-হকবার্গ পদ্ধতি ব্যবহার করে একাধিক তুলনার জন্য সামঞ্জস্য করা হয়েছিল। NaN নির্দেশ করে যে কেও-টি কেইজিজি (KEGG)-এর কোনো পাথওয়ের অন্তর্গত নয়। গাঢ় অক্ষরে লেখা গড় CLR পার্থক্যের মানগুলো প্রাচুর্যের ক্ষেত্রে তাৎপর্যপূর্ণ পার্থক্য নির্দেশ করে। তালিকাভুক্ত KO-গুলো কোন কোন পাথওয়ের অন্তর্গত, সে সম্পর্কে বিস্তারিত তথ্যের জন্য পরিশিষ্ট সারণি ৩ দেখুন।
চিহ্নিত জিনগুলোর মধ্যে, ১৬০১টি জিনের প্রাচুর্য নমুনার প্রকারভেদের মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন ছিল (p ≤ ০.০৫), যেখানে প্রতিটি জিনের প্রাচুর্য কমপক্ষে ২.৭ গুণ বেশি ছিল। এই জিনগুলোর মধ্যে, ৪টি জিনের প্রাচুর্য কন্ট্রোল নমুনায় এবং ১৫৯৭টি জিনের প্রাচুর্য পিপিএ নমুনায় বেশি ছিল। যেহেতু পিপিএ-এর জীবাণুনাশক বৈশিষ্ট্য রয়েছে, তাই আমরা নমুনার প্রকারভেদের মধ্যে পিপিএ বিপাক এবং উৎপাদনকারী জিনগুলোর প্রাচুর্য পরীক্ষা করেছি। পিপিএ বিপাক-সম্পর্কিত ১৩৩২টি জিনের মধ্যে, ২৭টি জিনের প্রাচুর্য কন্ট্রোল নমুনায় এবং ১২টি জিনের প্রাচুর্য পিপিএ নমুনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল। পিপিএ উৎপাদন-সম্পর্কিত ২২৩টি জিনের মধ্যে, ১টি জিনের প্রাচুর্য পিপিএ নমুনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল। চিত্র ৬এ পিপিএ বিপাকের সাথে জড়িত জিনগুলোর উচ্চতর প্রাচুর্য আরও প্রদর্শন করে, যেখানে কন্ট্রোল নমুনায় প্রাচুর্য উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি এবং প্রভাবের মাত্রা বড়, অন্যদিকে চিত্র ৬বি পিপিএ নমুনায় পরিলক্ষিত উল্লেখযোগ্যভাবে উচ্চতর প্রাচুর্যযুক্ত স্বতন্ত্র জিনগুলোকে তুলে ধরে।
চিত্র ৬। ইঁদুরের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমে পিপিএ-সম্পর্কিত জিনের প্রাচুর্যের পার্থক্য। ভলকানো প্লট পিপিএ বিপাক (A) এবং পিপিএ উৎপাদন (B)-এর সাথে সম্পর্কিত জিনের প্রাচুর্যের পার্থক্য চিত্রিত করে। ধূসর বিন্দুগুলো সেইসব জিনকে নির্দেশ করে যাদের প্রাচুর্য নমুনার প্রকারভেদের মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন ছিল না (পি-ভ্যালু > ০.০৫)। রঙিন বিন্দুগুলো প্রাচুর্যের উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (পি-ভ্যালু ≤ ০.০৫)। প্রাচুর্যের সবচেয়ে বড় পার্থক্যযুক্ত ২০টি জিনকে যথাক্রমে লাল এবং হালকা নীল রঙে (কন্ট্রোল এবং পিপিএ নমুনা) দেখানো হয়েছে। কন্ট্রোল নমুনার তুলনায় কন্ট্রোল এবং পিপিএ নমুনায় হলুদ এবং বেগুনি বিন্দুর প্রাচুর্য কমপক্ষে ২.৭ গুণ বেশি ছিল। কালো বিন্দুগুলো সেইসব জিনকে প্রতিনিধিত্ব করে যাদের প্রাচুর্য উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন, যেখানে গড় CLR পার্থক্য -১ এবং ১-এর মধ্যে। ম্যান-হুইটনি ইউ পরীক্ষা ব্যবহার করে পি-ভ্যালু গণনা করা হয়েছিল এবং বেনজামিনি-হকবার্গ পদ্ধতি ব্যবহার করে একাধিক তুলনার জন্য সংশোধন করা হয়েছিল। জিনগুলো নন-রিডানড্যান্ট জিন ক্যাটালগের প্রতিনিধিত্বকারী জিনের সাথে সঙ্গতিপূর্ণ। জিনের নামগুলিতে KEGG প্রতীক থাকে, যা একটি KO জিনকে নির্দেশ করে। গাঢ় গড় CLR পার্থক্যগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন প্রাচুর্য নির্দেশ করে। একটি ড্যাশ (-) নির্দেশ করে যে KEGG ডেটাবেসে জিনটির জন্য কোনো প্রতীক নেই।
PPA বিপাক এবং/অথবা উৎপাদনের সাথে সম্পর্কিত জিনযুক্ত ট্যাক্সনগুলোকে কন্টিগগুলোর শ্রেণিবিন্যাসগত পরিচয়ের সাথে জিনের কন্টিগ আইডি মিলিয়ে শনাক্ত করা হয়েছিল। গণ পর্যায়ে, ১৩০টি গণে PPA বিপাকের সাথে সম্পর্কিত জিন এবং ৬১টি গণে PPA উৎপাদনের সাথে সম্পর্কিত জিন পাওয়া গেছে (পরিশিষ্ট সারণি ৪)। তবে, কোনো গণের প্রাচুর্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখা যায়নি (p > ০.০৫)।
প্রজাতি পর্যায়ে, ১৪৪টি ব্যাকটেরিয়া প্রজাতির মধ্যে পিপিএ বিপাকের সাথে সম্পর্কিত জিন এবং ৬৮টি ব্যাকটেরিয়া প্রজাতির মধ্যে পিপিএ উৎপাদনের সাথে সম্পর্কিত জিন পাওয়া গেছে (পরিপূরক সারণি ৫)। পিপিএ বিপাককারী ব্যাকটেরিয়াগুলোর মধ্যে, আটটি ব্যাকটেরিয়ার প্রাচুর্য নমুনার প্রকারভেদের মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে এবং সবগুলোই তাদের কার্যকারিতায় উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন দেখিয়েছে (পরিপূরক সারণি ৬)। প্রাচুর্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য থাকা শনাক্তকৃত সকল পিপিএ বিপাককারী ব্যাকটেরিয়া পিপিএ নমুনাগুলোতে অধিক পরিমাণে পাওয়া গেছে। প্রজাতি-স্তরের শ্রেণিবিন্যাসে এমন কিছু গণের প্রতিনিধি পাওয়া গেছে যাদের প্রাচুর্য নমুনার প্রকারভেদের মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন ছিল না; এর মধ্যে রয়েছে বেশ কয়েকটি ব্যাকটেরয়েডস ও রুমিনোকক্কাস প্রজাতি, সেইসাথে ডানকানিয়া ডুবোয়া, মিক্সোব্যাকটেরিয়াম এন্টারিকা, মনোকক্কাস পেকটিনোলাইটিকাস এবং অ্যালকালিজেনেস পলিমরফা। পিপিএ উৎপাদনকারী ব্যাকটেরিয়াগুলোর মধ্যে, চারটি ব্যাকটেরিয়ার প্রাচুর্য নমুনার প্রকারভেদের মধ্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখিয়েছে। প্রাচুর্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য থাকা প্রজাতিগুলোর মধ্যে রয়েছে ব্যাকটেরয়েডস নোভোরোসি, ডানকানিয়া ডুবোয়া, মিক্সোব্যাকটেরিয়াম এন্টারাইটিডিস এবং রুমিনোকক্কাস বোভিস।
এই গবেষণায়, আমরা ইঁদুরের অন্ত্রের অণুজীবগোষ্ঠীর উপর পিপিএ-এর প্রভাব পরীক্ষা করেছি। পিপিএ ব্যাকটেরিয়ার মধ্যে বিভিন্ন প্রতিক্রিয়া সৃষ্টি করতে পারে, কারণ এটি নির্দিষ্ট কিছু প্রজাতি দ্বারা উৎপাদিত হয়, অন্য প্রজাতি দ্বারা খাদ্যের উৎস হিসেবে ব্যবহৃত হয়, অথবা এর জীবাণুনাশক প্রভাব রয়েছে। অতএব, খাদ্যতালিকায় সম্পূরক হিসেবে এর সংযোজন সহনশীলতা, সংবেদনশীলতা এবং পুষ্টির উৎস হিসেবে এটিকে ব্যবহার করার ক্ষমতার উপর নির্ভর করে অন্ত্রের পরিবেশে বিভিন্ন প্রভাব ফেলতে পারে। সংবেদনশীল ব্যাকটেরিয়ার প্রজাতিগুলো নির্মূল হয়ে যেতে পারে এবং তাদের জায়গায় এমন প্রজাতি আসতে পারে যারা পিপিএ-এর প্রতি অধিক প্রতিরোধী অথবা এটিকে খাদ্যের উৎস হিসেবে ব্যবহার করতে সক্ষম, যা অন্ত্রের অণুজীবগোষ্ঠীর গঠনে পরিবর্তন ঘটায়। আমাদের ফলাফল অণুজীবের গঠনে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য প্রকাশ করেছে, কিন্তু সামগ্রিক অণুজীব বৈচিত্র্যের উপর কোনো প্রভাব ফেলেনি। সবচেয়ে বড় প্রভাব প্রজাতি পর্যায়ে পরিলক্ষিত হয়েছে, যেখানে পিপিএ এবং নিয়ন্ত্রিত নমুনার মধ্যে ৭০টিরও বেশি ট্যাক্সার প্রাচুর্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখা গেছে (পরিপূরক সারণি ২)। পিপিএ-এর সংস্পর্শে আসা নমুনাগুলোর গঠন আরও মূল্যায়ন করে দেখা গেছে যে, সংস্পর্শে না আসা নমুনার তুলনায় অণুজীব প্রজাতির মধ্যে অধিক ভিন্নতা রয়েছে, যা থেকে বোঝা যায় যে পিপিএ ব্যাকটেরিয়ার বৃদ্ধির বৈশিষ্ট্যকে ত্বরান্বিত করতে পারে এবং পিপিএ-সমৃদ্ধ পরিবেশে টিকে থাকতে সক্ষম ব্যাকটেরিয়ার সংখ্যাকে সীমিত করতে পারে। সুতরাং, পিপিএ অন্ত্রের অণুজীব বৈচিত্র্যের ব্যাপক ব্যাঘাত ঘটানোর পরিবর্তে নির্বাচনী পরিবর্তন ঘটাতে পারে।
পূর্বে দেখা গেছে যে পিপিএ-এর মতো খাদ্য সংরক্ষক অন্ত্রের মাইক্রোবায়োম উপাদানগুলির প্রাচুর্য পরিবর্তন করে, কিন্তু সামগ্রিক বৈচিত্র্যকে প্রভাবিত করে না (নাগপাল এট আল., ২০২১)। এখানে, আমরা ব্যাকটেরয়েডিটিস ফাইলামের (পূর্বে ব্যাকটেরয়েডিটিস নামে পরিচিত) অন্তর্গত ব্যাকটেরয়েডিটিস প্রজাতিগুলির মধ্যে সবচেয়ে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য লক্ষ্য করেছি, যা পিপিএ-এর সংস্পর্শে আসা ইঁদুরগুলিতে উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ ছিল। ব্যাকটেরয়েডিটিস প্রজাতির বর্ধিত প্রাচুর্য শ্লেষ্মা ক্ষয়ের বৃদ্ধির সাথে সম্পর্কিত, যা সংক্রমণের ঝুঁকি বাড়াতে এবং প্রদাহকে উৎসাহিত করতে পারে (কর্নিক এট আল., ২০১৫; দেসাই এট আল., ২০১৬; পেনজল এট আল., ২০১৯)। একটি গবেষণায় দেখা গেছে যে ব্যাকটেরয়েডিটিস ফ্র্যাজিলিস দ্বারা চিকিৎসাপ্রাপ্ত নবজাতক পুরুষ ইঁদুর অটিজম স্পেকট্রাম ডিসঅর্ডার (এএসডি)-এর অনুরূপ সামাজিক আচরণ প্রদর্শন করেছে (কারমেল এট আল., ২০২৩), এবং অন্যান্য গবেষণায় দেখা গেছে যে ব্যাকটেরয়েডিটিস প্রজাতি রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতাকে পরিবর্তন করতে পারে এবং অটোইমিউন প্রদাহজনিত কার্ডিওমায়োপ্যাথির কারণ হতে পারে (গিল-ক্রুজ এট আল., ২০১৯)। পিপিএ-এর সংস্পর্শে আসা ইঁদুরদের মধ্যে রুমিনোকক্কাস, প্রিভোটেলা এবং প্যারাব্যাকটেরয়েডস গণের অন্তর্ভুক্ত প্রজাতিগুলোর সংখ্যাও উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছিল (কোরেটি এট আল., ২০১৮)। কিছু রুমিনোকক্কাস প্রজাতি প্রোইনফ্ল্যামেটরি সাইটোকাইন উৎপাদনের মাধ্যমে ক্রোন'স ডিজিজের মতো রোগের সাথে সম্পর্কিত (হেনকে এট আল., ২০১৯), অন্যদিকে প্রিভোটেলা হিউম্যানির মতো প্রিভোটেলা প্রজাতিগুলো উচ্চ রক্তচাপ এবং ইনসুলিন সংবেদনশীলতার মতো বিপাকীয় রোগের সাথে সম্পর্কিত (পেডারসেন এট আল., ২০১৬; লি এট আল., ২০১৭)। পরিশেষে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে, ব্যাকটেরয়েডিস প্রজাতির মোট প্রাচুর্য বেশি হওয়ার কারণে, পিপিএ-এর সংস্পর্শে আসা ইঁদুরদের মধ্যে কন্ট্রোল ইঁদুরদের তুলনায় ব্যাকটেরয়েডিস (পূর্বে ফার্মিকিউটিস নামে পরিচিত) এবং ব্যাকটেরয়েডিসের অনুপাত উল্লেখযোগ্যভাবে কম ছিল। এই অনুপাতটি পূর্বে অন্ত্রের হোমিওস্ট্যাসিসের একটি গুরুত্বপূর্ণ সূচক হিসেবে দেখানো হয়েছে, এবং এই অনুপাতের ব্যাঘাত বিভিন্ন রোগের অবস্থার সাথে সম্পর্কিত (টারপিন এট আল., ২০১৬; টেকজাওয়া এট আল., ২০২১; অ্যান এট আল., ২০২৩), যার মধ্যে প্রদাহজনক অন্ত্রের রোগও (স্টোজানভ এট আল., ২০২০) অন্তর্ভুক্ত। সামগ্রিকভাবে, ব্যাকটেরয়েডিটিস পর্বের প্রজাতিগুলো খাদ্যে উচ্চ মাত্রার পিপিএ দ্বারা সবচেয়ে বেশি প্রভাবিত হয় বলে মনে হয়। এর কারণ হতে পারে পিপিএ-এর প্রতি তাদের উচ্চ সহনশীলতা অথবা পিপিএ-কে শক্তির উৎস হিসেবে ব্যবহার করার ক্ষমতা, যা অন্তত একটি প্রজাতি, হয়লেসেলা এনোসিয়ার (Hitch et al., 2022) ক্ষেত্রে সত্য বলে প্রমাণিত হয়েছে। বিকল্পভাবে, মাতৃ পিপিএ-এর সংস্পর্শে আসা ইঁদুরের শাবকের অন্ত্রকে ব্যাকটেরয়েডিটিস উপনিবেশ স্থাপনের জন্য আরও সংবেদনশীল করে তোলার মাধ্যমে ভ্রূণের বিকাশকে ত্বরান্বিত করতে পারে; তবে, আমাদের গবেষণার নকশা এই ধরনের মূল্যায়নের সুযোগ দেয়নি।
মেটাজিনোমিক উপাদানের মূল্যায়নে পিপিএ বিপাক এবং উৎপাদনের সাথে সম্পর্কিত জিনের প্রাচুর্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখা গেছে। পিপিএ-এর সংস্পর্শে আসা ইঁদুরগুলিতে পিপিএ উৎপাদনের জন্য দায়ী জিনের প্রাচুর্য বেশি ছিল, যেখানে পিপিএ-এর সংস্পর্শে না আসা ইঁদুরগুলিতে পিএএ বিপাকের জন্য দায়ী জিনের প্রাচুর্য বেশি ছিল (চিত্র ৬)। এই ফলাফলগুলি থেকে বোঝা যায় যে অণুজীবের গঠনের উপর পিপিএ-এর প্রভাব শুধুমাত্র এর ব্যবহারের কারণে নাও হতে পারে, অন্যথায় পিপিএ-এর সংস্পর্শে আসা ইঁদুরের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমে পিপিএ বিপাকের সাথে সম্পর্কিত জিনের প্রাচুর্য বেশি দেখা যেত। এর একটি ব্যাখ্যা হলো, পিপিএ ব্যাকটেরিয়ার পুষ্টি উপাদান হিসেবে ব্যবহারের মাধ্যমে নয়, বরং প্রধানত এর জীবাণু-প্রতিরোধী প্রভাবের মাধ্যমে ব্যাকটেরিয়ার প্রাচুর্য নিয়ন্ত্রণ করে। পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে পিপিএ মাত্রা-নির্ভর পদ্ধতিতে সালমোনেলা টাইফিমুরিয়ামের বৃদ্ধিকে বাধা দেয় (জ্যাকবসন এট আল., ২০১৮)। পিপিএ-এর উচ্চ ঘনত্বের সংস্পর্শে এলে এমন ব্যাকটেরিয়া নির্বাচিত হতে পারে যা এর জীবাণু-প্রতিরোধী বৈশিষ্ট্যের বিরুদ্ধে প্রতিরোধী এবং এটি বিপাক বা উৎপাদন করতে সক্ষম নাও হতে পারে। উদাহরণস্বরূপ, বেশ কয়েকটি প্যারাব্যাকটেরয়েডস প্রজাতি পিপিএ নমুনাগুলিতে উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি প্রাচুর্য দেখিয়েছে, কিন্তু পিপিএ বিপাক বা উৎপাদনের সাথে সম্পর্কিত কোনও জিন সনাক্ত করা যায়নি (পরিপূরক সারণি ২, ৪, এবং ৫)। অধিকন্তু, গাঁজন উপজাত হিসাবে পিপিএ উৎপাদন বিভিন্ন ব্যাকটেরিয়ার মধ্যে ব্যাপকভাবে বণ্টিত (গোনজালেজ-গার্সিয়া এট আল., ২০১৭)। নিয়ন্ত্রণ নমুনাগুলিতে পিপিএ বিপাক সম্পর্কিত জিনের উচ্চ প্রাচুর্যের কারণ হতে পারে ব্যাকটেরিয়ার উচ্চ বৈচিত্র্য (অ্যাভেরিনা এট আল., ২০২০)। অধিকন্তু, ১৩৩২টি জিনের মধ্যে মাত্র ২৭টি (২.১৪%) জিনকে একচেটিয়াভাবে পিপিএ বিপাকের সাথে সম্পর্কিত জিন হিসাবে ভবিষ্যদ্বাণী করা হয়েছিল। পিপিএ বিপাকের সাথে সম্পর্কিত অনেক জিন অন্যান্য বিপাকীয় পথেও জড়িত। এটি আরও প্রমাণ করে যে নিয়ন্ত্রণ নমুনাগুলিতে পিপিএ বিপাকের সাথে জড়িত জিনের প্রাচুর্য বেশি ছিল; এই জিনগুলি এমন পথে কাজ করতে পারে যা পিপিএ ব্যবহার বা উপজাত হিসাবে গঠনের দিকে পরিচালিত করে না। এক্ষেত্রে, পিপিএ উৎপাদনের সাথে সম্পর্কিত শুধুমাত্র একটি জিন নমুনার প্রকারভেদের মধ্যে প্রাচুর্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখিয়েছে। পিপিএ বিপাকের সাথে সম্পর্কিত জিনের বিপরীতে, পিপিএ উৎপাদনের জন্য মার্কার জিন নির্বাচন করা হয়েছিল কারণ তারা পিপিএ উৎপাদনের জন্য ব্যাকটেরিয়ার কার্যপ্রণালীতে সরাসরি জড়িত। পিপিএ-এর সংস্পর্শে আসা ইঁদুরের ক্ষেত্রে, সমস্ত প্রজাতির প্রাচুর্য এবং পিপিএ উৎপাদনের ক্ষমতা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে বলে দেখা গেছে। এটি এই ভবিষ্যদ্বাণীকে সমর্থন করে যে পিপিএ, পিপিএ উৎপাদকদের নির্বাচন করবে এবং তাই পিপিএ উৎপাদন ক্ষমতা বৃদ্ধি পাবে। তবে, জিনের প্রাচুর্য জিন এক্সপ্রেশনের সাথে অগত্যা সম্পর্কিত নয়; সুতরাং, যদিও নিয়ন্ত্রণ নমুনায় পিপিএ বিপাকের সাথে সম্পর্কিত জিনের প্রাচুর্য বেশি, এক্সপ্রেশনের হার ভিন্ন হতে পারে (শি এট আল., ২০১৪)। পিপিএ-উৎপাদনকারী জিনের প্রাচুর্য এবং পিপিএ উৎপাদনের মধ্যে সম্পর্ক নিশ্চিত করার জন্য, পিপিএ উৎপাদনে জড়িত জিনগুলির এক্সপ্রেশন নিয়ে গবেষণা প্রয়োজন।
পিপিএ এবং কন্ট্রোল মেটাজিনোমের ফাংশনাল অ্যানোটেশন কিছু পার্থক্য প্রকাশ করেছে। জিনের বিষয়বস্তুর পিসিএ বিশ্লেষণ পিপিএ এবং কন্ট্রোল নমুনার মধ্যে স্বতন্ত্র ক্লাস্টার প্রকাশ করেছে (চিত্র ৫)। নমুনার অভ্যন্তরীণ ক্লাস্টারিং থেকে দেখা যায় যে কন্ট্রোল নমুনার জিনের বিষয়বস্তু অধিক বৈচিত্র্যপূর্ণ ছিল, যেখানে পিপিএ নমুনাগুলো একত্রে ক্লাস্টারবদ্ধ হয়েছে। জিনের বিষয়বস্তু অনুসারে ক্লাস্টারিং, প্রজাতির গঠন অনুসারে ক্লাস্টারিংয়ের সাথে তুলনীয় ছিল। সুতরাং, পাথওয়ের প্রাচুর্যের পার্থক্য নির্দিষ্ট প্রজাতি এবং তাদের মধ্যে থাকা স্ট্রেইনের প্রাচুর্যের পরিবর্তনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। পিপিএ নমুনায়, উল্লেখযোগ্যভাবে উচ্চ প্রাচুর্যসম্পন্ন দুটি পাথওয়ে অ্যামিনোসুগার/নিউক্লিওটাইড সুগার মেটাবলিজম (ko:K21279) এবং একাধিক লিপিড মেটাবলিজম পাথওয়ের (ko:K00647, ko:K03801; পরিপূরক সারণি ৩) সাথে সম্পর্কিত ছিল। ko:K21279-এর সাথে সম্পর্কিত জিনগুলো ব্যাকটেরয়েডস (Bacteroides) গণের সাথে সম্পর্কিত বলে জানা যায়, যা পিপিএ নমুনায় উল্লেখযোগ্যভাবে উচ্চ সংখ্যক প্রজাতিবিশিষ্ট গণগুলোর মধ্যে অন্যতম। এই এনজাইমটি ক্যাপসুলার পলিস্যাকারাইড প্রকাশের মাধ্যমে রোগ প্রতিরোধ ব্যবস্থা এড়াতে পারে (ওয়াং এট আল., ২০০৮)। পিপিএ-এর সংস্পর্শে আসা ইঁদুরদের মধ্যে ব্যাকটেরয়েডিটিস-এর যে বৃদ্ধি পরিলক্ষিত হয়েছে, এটি তার একটি কারণ হতে পারে। এটি পিপিএ মাইক্রোবায়োমে পরিলক্ষিত ফ্যাটি অ্যাসিড সংশ্লেষণের বৃদ্ধিকে সমর্থন করে। ব্যাকটেরিয়া ফ্যাটি অ্যাসিড উৎপাদনের জন্য FASIIko:K00647 (fabB) পথটি ব্যবহার করে, যা পোষকের বিপাকীয় পথগুলোকে প্রভাবিত করতে পারে (ইয়াও এবং রক, ২০১৫; জনসন প্রমুখ, ২০২০), এবং লিপিড বিপাকের পরিবর্তন স্নায়ু-বিকাশে ভূমিকা রাখতে পারে (ইউ প্রমুখ, ২০২০)। পিপিএ নমুনাগুলোতে প্রাচুর্য বৃদ্ধি পাওয়া আরেকটি পথ ছিল স্টেরয়েড হরমোন জৈব-সংশ্লেষণ (ko:K12343)। ক্রমবর্ধমান প্রমাণ রয়েছে যে, অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটার হরমোনের মাত্রাকে প্রভাবিত করার ক্ষমতা এবং হরমোন দ্বারা প্রভাবিত হওয়ার ক্ষমতার মধ্যে একটি বিপরীত সম্পর্ক বিদ্যমান, যার ফলে স্টেরয়েডের মাত্রা বৃদ্ধি পেলে তা পরবর্তীকালে স্বাস্থ্যের ওপর প্রভাব ফেলতে পারে (টেটেল প্রমুখ, ২০১৮)।
এই গবেষণাটি সীমাবদ্ধতা এবং বিবেচ্য বিষয় থেকে মুক্ত নয়। একটি গুরুত্বপূর্ণ পার্থক্য হলো, আমরা প্রাণীগুলোর শারীরবৃত্তীয় মূল্যায়ন করিনি। তাই, মাইক্রোবায়োমের পরিবর্তন কোনো রোগের সাথে সম্পর্কিত কিনা, সে বিষয়ে সরাসরি কোনো সিদ্ধান্তে আসা সম্ভব নয়। আরেকটি বিবেচ্য বিষয় হলো, এই গবেষণার ইঁদুরগুলোকে তাদের মায়েদের মতোই একই খাবার খাওয়ানো হয়েছিল। ভবিষ্যতে গবেষণার মাধ্যমে নির্ধারণ করা যেতে পারে যে, পিপিএ-সমৃদ্ধ খাদ্য থেকে পিপিএ-মুক্ত খাদ্যে পরিবর্তন করলে মাইক্রোবায়োমের উপর এর প্রভাব উন্নত হয় কিনা। অন্যান্য অনেক গবেষণার মতোই আমাদের গবেষণার একটি সীমাবদ্ধতা হলো নমুনার সীমিত আকার। যদিও বৈধ সিদ্ধান্তে আসা সম্ভব, ফলাফল বিশ্লেষণের সময় একটি বৃহত্তর নমুনা আকার আরও বেশি পরিসংখ্যানগত শক্তি প্রদান করবে। আমরা অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমের পরিবর্তন এবং কোনো রোগের মধ্যে সম্পর্ক নিয়ে সিদ্ধান্তে আসার বিষয়েও সতর্ক (Yap et al., 2021)। বয়স, লিঙ্গ এবং খাদ্যাভ্যাসের মতো বিভ্রান্তিকর কারণগুলো অণুজীবের গঠনকে উল্লেখযোগ্যভাবে প্রভাবিত করতে পারে। এই কারণগুলোই জটিল রোগের সাথে অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমের সম্পর্ক বিষয়ে গবেষণাপত্রে পরিলক্ষিত অসঙ্গতিগুলোর ব্যাখ্যা দিতে পারে (Johnson et al., 2019; Lagod and Naser, 2023)। উদাহরণস্বরূপ, ASD আক্রান্ত প্রাণী এবং মানুষের মধ্যে Bacteroidetes গণের সদস্যদের সংখ্যা বৃদ্ধি বা হ্রাস পেতে দেখা গেছে (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017)। একইভাবে, প্রদাহজনক অন্ত্রের রোগে আক্রান্ত রোগীদের অন্ত্রের গঠন নিয়ে করা গবেষণায় একই ট্যাক্সার সংখ্যা বৃদ্ধি এবং হ্রাস উভয়ই পাওয়া গেছে (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023)। লিঙ্গগত পক্ষপাতিত্বের প্রভাব সীমিত করার জন্য, আমরা উভয় লিঙ্গের সমান প্রতিনিধিত্ব নিশ্চিত করার চেষ্টা করেছি, যাতে পার্থক্যগুলো মূলত খাদ্যাভ্যাসের কারণেই ঘটে থাকে। ফাংশনাল অ্যানোটেশনের একটি চ্যালেঞ্জ হলো অপ্রয়োজনীয় জিন সিকোয়েন্স অপসারণ করা। আমাদের জিন ক্লাস্টারিং পদ্ধতির জন্য ৯৫% সিকোয়েন্স আইডেন্টিটি এবং ৮৫% লেংথ সিমিলারিটি প্রয়োজন, সেইসাথে ভুল ক্লাস্টারিং দূর করার জন্য ৯০% অ্যালাইনমেন্ট কভারেজ দরকার। তবে, কিছু ক্ষেত্রে, আমরা একই অ্যানোটেশন (যেমন, MUT) সহ COG লক্ষ্য করেছি (চিত্র ৬)। এই অর্থোলগগুলো স্বতন্ত্র, নির্দিষ্ট গণের সাথে সম্পর্কিত, নাকি এটি জিন ক্লাস্টারিং পদ্ধতির একটি সীমাবদ্ধতা, তা নির্ধারণ করার জন্য আরও গবেষণার প্রয়োজন। কার্যকরী টীকার আরেকটি সীমাবদ্ধতা হলো সম্ভাব্য ভুল শ্রেণিবিন্যাস; ব্যাকটেরিয়ার জিন mmdA প্রোপিওনেট সংশ্লেষণে জড়িত একটি পরিচিত এনজাইম, কিন্তু KEGG এটিকে প্রোপিওনেট বিপাকীয় পথের সাথে যুক্ত করে না। এর বিপরীতে, scpB এবং mmcD অর্থোলগগুলো সম্পর্কিত। নির্দিষ্ট নকআউট ছাড়া বিপুল সংখ্যক জিনের কারণে জিনের প্রাচুর্য মূল্যায়ন করার সময় PPA-সম্পর্কিত জিন শনাক্ত করা সম্ভব নাও হতে পারে। ভবিষ্যতের গবেষণা মেটাট্রান্সক্রিপটোম বিশ্লেষণ থেকে উপকৃত হবে, যা অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটার কার্যকরী বৈশিষ্ট্য সম্পর্কে গভীরতর ধারণা দিতে পারে এবং জিনের প্রকাশকে সম্ভাব্য পরবর্তী প্রভাবের সাথে যুক্ত করতে পারে। নির্দিষ্ট স্নায়ুবিকাশজনিত ব্যাধি বা প্রদাহজনক অন্ত্রের রোগ সম্পর্কিত গবেষণার জন্য, মাইক্রোবায়োমের গঠনের পরিবর্তনকে এই ব্যাধিগুলোর সাথে যুক্ত করতে প্রাণীদের শারীরবৃত্তীয় এবং আচরণগত মূল্যায়ন প্রয়োজন। মাইক্রোবায়োম রোগের চালক নাকি বৈশিষ্ট্য, তা নির্ধারণ করার জন্য জীবাণুমুক্ত ইঁদুরের মধ্যে অন্ত্রের মাইক্রোবায়োম প্রতিস্থাপন করে অতিরিক্ত গবেষণাও সহায়ক হবে।
সারসংক্ষেপে, আমরা দেখিয়েছি যে খাদ্যে থাকা পিপিএ অন্ত্রের অণুজীবগোষ্ঠীর গঠন পরিবর্তনে একটি নিয়ামক হিসেবে কাজ করে। পিপিএ হলো এফডিএ-অনুমোদিত একটি প্রিজারভেটিভ যা বিভিন্ন খাবারে ব্যাপকভাবে পাওয়া যায় এবং দীর্ঘমেয়াদী সংস্পর্শে এটি অন্ত্রের স্বাভাবিক ফ্লোরার ভারসাম্য নষ্ট করতে পারে। আমরা বেশ কিছু ব্যাকটেরিয়ার প্রাচুর্যে পরিবর্তন দেখতে পেয়েছি, যা থেকে বোঝা যায় যে পিপিএ অন্ত্রের অণুজীবগোষ্ঠীর গঠনকে প্রভাবিত করতে পারে। অণুজীবগোষ্ঠীর এই পরিবর্তন কিছু নির্দিষ্ট বিপাকীয় পথের মাত্রায় পরিবর্তন আনতে পারে, যা পোষকদেহের স্বাস্থ্যের জন্য প্রাসঙ্গিক শারীরবৃত্তীয় পরিবর্তন ঘটাতে পারে। অণুজীবগোষ্ঠীর গঠনের উপর খাদ্যে থাকা পিপিএ-এর প্রভাব ডিসবায়োসিস বা অন্যান্য রোগের কারণ হতে পারে কিনা, তা নির্ধারণ করার জন্য আরও গবেষণার প্রয়োজন। এই গবেষণাটি অন্ত্রের গঠনের উপর পিপিএ-এর প্রভাব কীভাবে মানব স্বাস্থ্যকে প্রভাবিত করতে পারে, সে বিষয়ে ভবিষ্যৎ গবেষণার ভিত্তি স্থাপন করে।
এই গবেষণায় উপস্থাপিত ডেটাসেটগুলো অনলাইন রিপোজিটরিগুলোতে পাওয়া যায়। রিপোজিটরির নাম এবং অ্যাকসেশন নম্বর হলো: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431।
এই প্রাণী গবেষণাটি ইউনিভার্সিটি অফ সেন্ট্রাল ফ্লোরিডা ইনস্টিটিউশনাল অ্যানিমেল কেয়ার অ্যান্ড ইউজ কমিটি (UCF-IACUC) কর্তৃক অনুমোদিত হয়েছে (প্রাণী ব্যবহারের অনুমতিপত্র নম্বর: PROTO202000002)। এই গবেষণাটি স্থানীয় আইন, বিধিমালা এবং প্রাতিষ্ঠানিক প্রয়োজনীয়তা মেনে চলে।
এনজি: ধারণা গঠন, ডেটা কিউরেশন, আনুষ্ঠানিক বিশ্লেষণ, অনুসন্ধান, পদ্ধতি, সফটওয়্যার, ভিজ্যুয়ালাইজেশন, লেখা (মূল খসড়া), লেখা (পর্যালোচনা ও সম্পাদনা)। এলএ: ধারণা গঠন, ডেটা কিউরেশন, পদ্ধতি, রিসোর্স, লেখা (পর্যালোচনা ও সম্পাদনা)। এসএইচ: আনুষ্ঠানিক বিশ্লেষণ, সফটওয়্যার, লেখা (পর্যালোচনা ও সম্পাদনা)। এসএ: অনুসন্ধান, লেখা (পর্যালোচনা ও সম্পাদনা)। প্রধান বিচারক: অনুসন্ধান, লেখা (পর্যালোচনা ও সম্পাদনা)। এসএন: ধারণা গঠন, প্রকল্প প্রশাসন, রিসোর্স, তত্ত্বাবধান, লেখা (পর্যালোচনা ও সম্পাদনা)। টিএ: ধারণা গঠন, প্রকল্প প্রশাসন, তত্ত্বাবধান, লেখা (পর্যালোচনা ও সম্পাদনা)।
লেখকগণ ঘোষণা করেছেন যে, এই প্রবন্ধের গবেষণা, রচনা এবং/অথবা প্রকাশের জন্য তাঁরা কোনো আর্থিক সহায়তা পাননি।
লেখকগণ ঘোষণা করেন যে, এই গবেষণাটি এমন কোনো বাণিজ্যিক বা আর্থিক সম্পর্ক ছাড়াই পরিচালিত হয়েছে যা সম্ভাব্য স্বার্থের সংঘাত হিসেবে বিবেচিত হতে পারে। প্রযোজ্য নয়।
এই নিবন্ধে প্রকাশিত সকল মতামত একান্তই লেখকদের নিজস্ব এবং তা তাদের প্রতিষ্ঠান, প্রকাশক, সম্পাদক বা পর্যালোচকদের মতামতকে আবশ্যিকভাবে প্রতিফলিত করে না। এই নিবন্ধে মূল্যায়ন করা কোনো পণ্য, বা তার প্রস্তুতকারকদের করা কোনো দাবি, প্রকাশক কর্তৃক নিশ্চিত বা অনুমোদিত নয়।
এই নিবন্ধটির সম্পূরক উপাদান অনলাইনে পাওয়া যাবে: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
আবদেল্লি এলএস, সামসাম এ, নাসের এসএ (২০১৯)। প্রোপিওনিক অ্যাসিড অটিজম স্পেকট্রাম ডিসঅর্ডারে PTEN/AKT পথ নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে গ্লিওসিস এবং নিউরোইনফ্ল্যামেশন প্ররোচিত করে। সায়েন্টিফিক রিপোর্টস ৯, ৮৮২৪–৮৮২৪। doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
আইচিসন, জে. (১৯৮২)। গঠনমূলক তথ্যের পরিসংখ্যানিক বিশ্লেষণ। জেআর স্ট্যাট সোসাইটি সের বি মেথডোল। ৪৪, ১৩৯–১৬০। ডিওআই: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
আন জে, কোওন এইচ, কিম ওয়াইজে (২০২৩)। স্তন ক্যান্সারের ঝুঁকি উপাদান হিসেবে ফার্মিকিউটিস/ব্যাকটেরয়েডিটিস অনুপাত। জার্নাল অফ ক্লিনিক্যাল মেডিসিন, ১২, ২২১৬। ডিওআই: ১০.৩৩৯০/জেসিএম১২০৬২২১৬
অ্যান্ডার্স এস., হুবার ডব্লিউ. (২০১০)। সিকোয়েন্স কাউন্ট ডেটার ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ। ন্যাচার প্রিভেন্টেশন। ১–১, ১–১০। ডিওআই: ১০.১০৩৮/এনপ্রি.২০১০.৪২৮২.১
অ্যাঞ্জেলিস, এমডি, পিক্কোলো, এম., ভানিনি, এল., সিরাগুসা, এস., গিয়াকোমো, এডি, সেরাজানেত্তি, ডিআই, প্রমুখ। (২০১৩)। অটিজম এবং অনির্দিষ্ট ব্যাপক বিকাশজনিত ব্যাধিতে আক্রান্ত শিশুদের মলের অণুজীব এবং মেটাবোলোম। প্লস ওয়ান ৮, ই৭৬৯৯৩। ডিওআই: ১০.১৩৭১/জার্নাল.পোন.০০৭৬৯৯৩
আভেরিনা ওভি, কোভতুন এএস, পোলিয়াকোভা এসআই, সাভিলোভা এএম, রেব্রিকভ ডিভি, দানিলেনকো ভিএন (২০২০)। অটিজম স্পেকট্রাম ডিসঅর্ডারযুক্ত ছোট শিশুদের অন্ত্রের অণুজীবগোষ্ঠীর ব্যাকটেরিয়াজনিত স্নায়ুবিপাকীয় বৈশিষ্ট্য। জার্নাল অফ মেডিকেল মাইক্রোবায়োলজি ৬৯, ৫৫৮–৫৭১। ডিওআই: ১০.১০৯৯/jmm.0.001178
বাকেরো এফ., নোম্বেলা কে. (২০১২)। মানব অঙ্গ হিসেবে মাইক্রোবায়োম। ক্লিনিক্যাল মাইক্রোবায়োলজি অ্যান্ড ইনফেকশন ১৮, ২–৪। doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
বাউর টি., ড্যুর পি. (২০২৩)। প্রোপায়োনিক অ্যাসিড উৎপাদনকারী ব্যাকটেরিয়ার শারীরবৃত্ত সম্পর্কে নতুন অন্তর্দৃষ্টি: অ্যানেরোটিগনাম প্রোপায়োনিকাম এবং অ্যানেরোটিগনাম নিওপ্রোপায়োনিকাম (পূর্বে ক্লোস্ট্রিডিয়াম প্রোপায়োনিকাম এবং ক্লোস্ট্রিডিয়াম নিওপ্রোপায়োনিকাম)। মাইক্রোঅর্গানিজমস ১১, ৬৮৫। ডিওআই: ১০.৩৩৯০/মাইক্রোঅর্গানিজমস১১০৩০৬৮৫
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004)। মায়ের পুষ্টি এবং ভ্রূণের বিকাশ। জে নুতর। 134, 2169-2172। doi: 10.1093/jn/134.9.2169
বেনজামিনি, ওয়াই., এবং হচবার্গ, জে. (১৯৯৫)। মিথ্যা-ইতিবাচক হার নিয়ন্ত্রণ: একাধিক পরীক্ষার জন্য একটি বাস্তবসম্মত এবং কার্যকর পদ্ধতি। জেআর স্ট্যাট সোসাইটি সের বি মেথডোল. ৫৭, ২৮৯–৩০০। ডিওআই: ১০.১১১১/জে.২৫১৭-৬১৬১.১৯৯৫.টিবি০২০৩১.এক্স