প্রোপিওনিক অ্যাসিড (PPA), একটি অ্যান্টিফাঙ্গাল এজেন্ট এবং সাধারণ খাদ্যতালিকাগত সংযোজন, ইঁদুরের অস্বাভাবিক স্নায়ুবিক বিকাশ ঘটাতে দেখা গেছে যার সাথে গ্যাস্ট্রোইনটেস্টাইনাল কর্মহীনতাও থাকতে পারে, যা অন্ত্রের ডিসবায়োসিসের কারণে হতে পারে। খাদ্যতালিকাগত PPA এক্সপোজার এবং অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটা ডিসবায়োসিসের মধ্যে একটি যোগসূত্র প্রস্তাব করা হয়েছে, কিন্তু সরাসরি তদন্ত করা হয়নি। এখানে, আমরা অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটা গঠনে PPA-সম্পর্কিত পরিবর্তনগুলি তদন্ত করেছি যা ডিসবায়োসিসের দিকে পরিচালিত করতে পারে। অণুজীবের গঠন এবং ব্যাকটেরিয়া বিপাকীয় পথের পার্থক্য মূল্যায়ন করার জন্য দীর্ঘ-পরিসরের মেটাজেনমিক সিকোয়েন্সিং ব্যবহার করে ইঁদুরের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমগুলি (n=9) এবং PPA-সমৃদ্ধ খাদ্য (n=13) ক্রমানুসারে তৈরি করা হয়েছিল। খাদ্যতালিকাগত PPA উল্লেখযোগ্য ট্যাক্সার প্রাচুর্য বৃদ্ধির সাথে যুক্ত ছিল, যার মধ্যে বেশ কয়েকটি ব্যাকটেরয়েড, প্রিভোটেলা এবং রুমিনোকোকাস প্রজাতি রয়েছে, যার সদস্যরা আগে PPA উৎপাদনে জড়িত ছিল। PPA-সংস্পর্শে আসা ইঁদুরের মাইক্রোবায়োমগুলিতে লিপিড বিপাক এবং স্টেরয়েড হরমোন জৈব সংশ্লেষণের সাথে সম্পর্কিত আরও পথ ছিল। আমাদের ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে PPA অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটা এবং এর সাথে সম্পর্কিত বিপাকীয় পথগুলিকে পরিবর্তন করতে পারে। এই পর্যবেক্ষণকৃত পরিবর্তনগুলি তুলে ধরে যে, নিরাপদ হিসেবে শ্রেণীবদ্ধ প্রিজারভেটিভগুলি অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটার গঠন এবং ফলস্বরূপ, মানুষের স্বাস্থ্যের উপর প্রভাব ফেলতে পারে।
মানুষের মাইক্রোবায়োমকে প্রায়শই "শরীরের শেষ অঙ্গ" বলা হয় এবং এটি মানুষের স্বাস্থ্যের ক্ষেত্রে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে (Baquero and Nombela, 2012)। বিশেষ করে, অন্ত্রের মাইক্রোবায়োম তার সিস্টেম-ব্যাপী প্রভাব এবং অনেক প্রয়োজনীয় কাজে ভূমিকার জন্য স্বীকৃত। অন্ত্রে প্রচুর পরিমাণে কমেন্সাল ব্যাকটেরিয়া থাকে, যা একাধিক পরিবেশগত স্থান দখল করে, পুষ্টি ব্যবহার করে এবং সম্ভাব্য রোগজীবাণুগুলির সাথে প্রতিযোগিতা করে (Jandhyala et al., 2015)। অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটার বিভিন্ন ব্যাকটেরিয়া উপাদান ভিটামিনের মতো প্রয়োজনীয় পুষ্টি তৈরি করতে এবং হজমকে উৎসাহিত করতে সক্ষম (Rowland et al., 2018)। ব্যাকটেরিয়াজনিত বিপাকগুলি টিস্যু বিকাশকে প্রভাবিত করে এবং বিপাকীয় এবং রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা উন্নত করে বলেও প্রমাণিত হয়েছে (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022)। মানুষের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমের গঠন অত্যন্ত বৈচিত্র্যময় এবং খাদ্য, লিঙ্গ, ওষুধ এবং স্বাস্থ্যের অবস্থার মতো জেনেটিক এবং পরিবেশগত কারণগুলির উপর নির্ভর করে (Kumbhare et al., 2019)।
মাতৃ খাদ্য ভ্রূণ এবং নবজাতকের বিকাশের একটি গুরুত্বপূর্ণ উপাদান এবং বিকাশকে প্রভাবিত করতে পারে এমন যৌগগুলির একটি সম্ভাব্য উৎস (Bazer et al., 2004; Innis, 2014)। এই ধরণের একটি আকর্ষণীয় যৌগ হল প্রোপায়োনিক অ্যাসিড (PPA), যা ব্যাকটেরিয়া গাঁজন এবং খাদ্য সংযোজন থেকে প্রাপ্ত একটি শর্ট-চেইন ফ্যাটি অ্যাসিড উপজাত (den Besten et al., 2013)। PPA-তে অ্যান্টিব্যাকটেরিয়াল এবং অ্যান্টিফাঙ্গাল বৈশিষ্ট্য রয়েছে এবং তাই এটি খাদ্য সংরক্ষণকারী হিসাবে এবং ছাঁচ এবং ব্যাকটেরিয়ার বৃদ্ধি রোধ করার জন্য শিল্প প্রয়োগে ব্যবহৃত হয় (Wemmenhove et al., 2016)। PPA-এর বিভিন্ন টিস্যুতে বিভিন্ন প্রভাব রয়েছে। লিভারে, ম্যাক্রোফেজে সাইটোকাইন প্রকাশকে প্রভাবিত করে PPA-এর প্রদাহ-বিরোধী প্রভাব রয়েছে (Kawasoe et al., 2022)। এই নিয়ন্ত্রক প্রভাব অন্যান্য রোগ প্রতিরোধক কোষেও লক্ষ্য করা গেছে, যার ফলে প্রদাহের নিয়ন্ত্রণ হ্রাস পায় (Haase et al., 2021)। তবে, মস্তিষ্কে বিপরীত প্রভাব লক্ষ্য করা গেছে। পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে পিপিএ-এর সংস্পর্শে ইঁদুরের মধ্যে অটিজমের মতো আচরণ দেখা যায় (এল-আনসারি এট আল।, ২০১২)। অন্যান্য গবেষণায় দেখা গেছে যে পিপিএ গ্লাইওসিস সৃষ্টি করতে পারে এবং মস্তিষ্কে প্রদাহ-বিরোধী পথ সক্রিয় করতে পারে (আবদেলি এট আল।, ২০১৯)। যেহেতু পিপিএ একটি দুর্বল অ্যাসিড, তাই এটি অন্ত্রের এপিথেলিয়ামের মাধ্যমে রক্তপ্রবাহে ছড়িয়ে পড়তে পারে এবং এইভাবে রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা এবং প্লাসেন্টা সহ সীমাবদ্ধ বাধা অতিক্রম করতে পারে (স্টিনসন এট আল।, ২০১৯), ব্যাকটেরিয়া দ্বারা উৎপাদিত একটি নিয়ন্ত্রক বিপাক হিসাবে পিপিএর গুরুত্ব তুলে ধরে। যদিও অটিজমের ঝুঁকির কারণ হিসাবে পিপিএর সম্ভাব্য ভূমিকা বর্তমানে তদন্তাধীন, অটিজম আক্রান্ত ব্যক্তিদের উপর এর প্রভাব স্নায়বিক পার্থক্যকে প্ররোচিত করার বাইরেও প্রসারিত হতে পারে।
নিউরোডেভেলপমেন্টাল ডিসঅর্ডারে আক্রান্ত রোগীদের মধ্যে ডায়রিয়া এবং কোষ্ঠকাঠিন্যের মতো গ্যাস্ট্রোইনটেস্টাইনাল লক্ষণগুলি সাধারণ (Cao et al., 2021)। পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে অটিজম স্পেকট্রাম ডিসঅর্ডার (ASD) রোগীদের মাইক্রোবায়োম সুস্থ ব্যক্তিদের থেকে আলাদা, যা অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটা ডিসবায়োসিসের উপস্থিতি নির্দেশ করে (Finegold et al., 2010)। একইভাবে, প্রদাহজনক অন্ত্রের রোগ, স্থূলতা, আলঝাইমার রোগ ইত্যাদি রোগীদের মাইক্রোবায়োম বৈশিষ্ট্যগুলিও সুস্থ ব্যক্তিদের থেকে আলাদা (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019)। তবে, আজ পর্যন্ত, অন্ত্রের মাইক্রোবায়োম এবং স্নায়বিক রোগ বা লক্ষণগুলির মধ্যে কোনও কার্যকারণ সম্পর্ক প্রতিষ্ঠিত হয়নি (Yap et al., 2021), যদিও বেশ কয়েকটি ব্যাকটেরিয়া প্রজাতি এই রোগের কিছু অবস্থার ক্ষেত্রে ভূমিকা পালন করে বলে মনে করা হয়। উদাহরণস্বরূপ, অটিজম রোগীদের মাইক্রোবায়োটাতে অ্যাকারম্যানসিয়া, ব্যাকটেরয়েডস, ক্লোস্ট্রিডিয়াম, ল্যাকটোব্যাসিলাস, ডেসালফোভিব্রিও এবং অন্যান্য জেনারার পরিমাণ বেশি (টোমোভা এট আল।, ২০১৫; গোলুবেভা এট আল।, ২০১৭; ক্রিশ্চিয়ানো এট আল।, ২০১৮; জুরিটা এট আল।, ২০২০)। উল্লেখযোগ্যভাবে, এই জেনারার কিছু সদস্য প্রজাতির পিপিএ উৎপাদনের সাথে সম্পর্কিত জিন রয়েছে বলে জানা যায় (রেইচার্ড এট আল।, ২০১৪; ইউন এবং লি, ২০১৬; ঝাং এট আল।, ২০১৯; বাউর এবং ডুর, ২০২৩)। পিপিএ-এর অ্যান্টিমাইক্রোবিয়াল বৈশিষ্ট্যের কারণে, এর প্রাচুর্য বৃদ্ধি পিপিএ-উৎপাদনকারী ব্যাকটেরিয়ার বৃদ্ধির জন্য উপকারী হতে পারে (জ্যাকবসন এট আল।, ২০১৮)। সুতরাং, পিএফএ সমৃদ্ধ পরিবেশ অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটাতে পরিবর্তন আনতে পারে, যার মধ্যে গ্যাস্ট্রোইনটেস্টাইনাল প্যাথোজেনও অন্তর্ভুক্ত, যা গ্যাস্ট্রোইনটেস্টাইনাল লক্ষণগুলির সম্ভাব্য কারণ হতে পারে।
মাইক্রোবায়োম গবেষণায় একটি কেন্দ্রীয় প্রশ্ন হল মাইক্রোবায়োল গঠনের পার্থক্য কি অন্তর্নিহিত রোগের কারণ বা লক্ষণ। খাদ্য, অন্ত্রের মাইক্রোবায়োম এবং স্নায়বিক রোগের মধ্যে জটিল সম্পর্ক ব্যাখ্যা করার প্রথম পদক্ষেপ হল মাইক্রোবায়োল গঠনের উপর খাদ্যের প্রভাব মূল্যায়ন করা। এই লক্ষ্যে, আমরা পিপিএ সমৃদ্ধ বা পিপিএ-হ্রাসপ্রাপ্ত খাদ্য খাওয়ানো ইঁদুরের সন্তানদের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমের তুলনা করার জন্য দীর্ঘ-পঠিত মেটাজেনমিক সিকোয়েন্সিং ব্যবহার করেছি। সন্তানদের তাদের মায়ের মতো একই খাদ্য খাওয়ানো হয়েছিল। আমরা অনুমান করেছিলাম যে পিপিএ সমৃদ্ধ খাদ্য অন্ত্রের মাইক্রোবায়োল গঠন এবং মাইক্রোবায়োল কার্যকরী পথের পরিবর্তন আনবে, বিশেষ করে পিপিএ বিপাক এবং/অথবা পিপিএ উৎপাদনের সাথে সম্পর্কিত।
এই গবেষণায় FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J ট্রান্সজেনিক ইঁদুর (জ্যাকসন ল্যাবরেটরিজ) ব্যবহার করা হয়েছে যারা গ্লিয়া-নির্দিষ্ট GFAP প্রোমোটারের নিয়ন্ত্রণে সবুজ ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন (GFP) অতিরিক্ত প্রকাশ করে, যা সেন্ট্রাল ফ্লোরিডা বিশ্ববিদ্যালয়ের ইনস্টিটিউশনাল অ্যানিমেল কেয়ার অ্যান্ড ইউজ কমিটি (UCF-IACUC) (পশু ব্যবহারের অনুমতি নম্বর: PROTO202000002) এর নির্দেশিকা অনুসরণ করে। দুধ ছাড়ানোর পর, ইঁদুরগুলিকে প্রতিটি খাঁচায় প্রতিটি লিঙ্গের 1-5টি ইঁদুরের সাথে পৃথকভাবে খাঁচায় রাখা হয়েছিল। ইঁদুরগুলিকে একটি বিশুদ্ধ নিয়ন্ত্রণ খাদ্য (পরিবর্তিত ওপেন-লেবেল স্ট্যান্ডার্ড খাদ্য, 16 kcal% চর্বি) অথবা একটি সোডিয়াম প্রোপিওনেট-পরিপূরক খাদ্য (পরিবর্তিত ওপেন-লেবেল স্ট্যান্ডার্ড খাদ্য, 16 kcal% চর্বি, 5,000 ppm সোডিয়াম প্রোপিওনেট ধারণকারী) দিয়ে অ্যাড লিবিটাম খাওয়ানো হয়েছিল। ব্যবহৃত সোডিয়াম প্রোপিওনেটের পরিমাণ 5,000 মিলিগ্রাম PFA/কেজি মোট খাদ্য ওজনের সমতুল্য ছিল। এটি খাদ্য সংরক্ষণকারী হিসাবে ব্যবহারের জন্য অনুমোদিত PPA-এর সর্বোচ্চ ঘনত্ব। এই গবেষণার প্রস্তুতির জন্য, মাতৃ ইঁদুরদের মিলনের ৪ সপ্তাহ আগে উভয় ধরণের খাবার খাওয়ানো হয়েছিল এবং পুরো গর্ভাবস্থায় একই খাবার খাওয়ানো হয়েছিল। সন্তানসন্ততি ইঁদুর [২২টি ইঁদুর, ৯টি নিয়ন্ত্রণ (৬টি পুরুষ, ৩টি মহিলা) এবং ১৩টি পিপিএ (৪টি পুরুষ, ৯টি মহিলা)] কে দুধ ছাড়ানো হয়েছিল এবং তারপর ৫ মাস ধরে মাতৃসন্ততির মতো একই খাবার খাওয়ানো হয়েছিল। ৫ মাস বয়সে সন্তানসন্ততি ইঁদুরকে বলি দেওয়া হয়েছিল এবং তাদের অন্ত্রের মল সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং প্রাথমিকভাবে -২০°C তাপমাত্রায় ১.৫ মিলি মাইক্রোসেন্ট্রিফিউজ টিউবে সংরক্ষণ করা হয়েছিল এবং তারপর -৮০°C ফ্রিজারে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল যতক্ষণ না হোস্ট ডিএনএ নিষ্কাশন হয় এবং মাইক্রোবিয়াল নিউক্লিক অ্যাসিড বের করা হয়।
একটি পরিবর্তিত প্রোটোকল অনুসারে হোস্ট ডিএনএ অপসারণ করা হয়েছিল (Charalampous et al., 2019)। সংক্ষেপে, মলদ্বার 500 μl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) এ স্থানান্তরিত করা হয়েছিল এবং হিমায়িত অবস্থায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল। প্রতি নিষ্কাশন প্রতি সর্বাধিক 1-2 মলদ্বার গুলি প্রক্রিয়াজাত করা হয়েছিল। তারপর মলদ্বার গুলি যান্ত্রিকভাবে একজাত করা হয়েছিল টিউবের ভিতরে একটি প্লাস্টিকের পেস্টেল ব্যবহার করে একটি স্লারি তৈরি করার জন্য। নমুনাগুলিকে 5 মিনিটের জন্য বা নমুনাগুলি পেলেট না হওয়া পর্যন্ত 10,000 RCF তাপমাত্রায় সেন্ট্রিফিউজ করুন, তারপর সুপারনেট্যান্টকে অ্যাসপিরেট করুন এবং পেলেটটিকে 250 μl 1× PBS-এ পুনরায় সাসপেন্ড করুন। ইউক্যারিওটিক কোষের ঝিল্লি আলগা করার জন্য ডিটারজেন্ট হিসাবে নমুনায় 250 μl 4.4% স্যাপোনিন দ্রবণ (TCI, পণ্য নম্বর S0019) যোগ করুন। নমুনাগুলি মসৃণ না হওয়া পর্যন্ত আলতো করে মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং 10 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউব করা হয়েছিল। এরপর, ইউক্যারিওটিক কোষগুলিকে ব্যাহত করার জন্য, নমুনায় 350 μl নিউক্লিজ-মুক্ত জল যোগ করা হয়েছিল, 30 সেকেন্ডের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল, এবং তারপর 12 μl 5 M NaCl যোগ করা হয়েছিল। তারপর নমুনাগুলিকে 5 মিনিটের জন্য 6000 RCF-এ সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। সুপারনেট্যান্টকে অ্যাসপিরেট করুন এবং 100 μl 1X PBS-এ পেলেটটি পুনরায় সাসপেন্ড করুন। হোস্ট DNA অপসারণ করতে, 100 μl HL-SAN বাফার (12.8568 গ্রাম NaCl, 4 মিলি 1M MgCl2, 36 মিলি নিউক্লিজ-মুক্ত জল) এবং 10 μl HL-SAN এনজাইম (ArticZymes P/N 70910-202) যোগ করুন। নমুনাগুলিকে পাইপেটিং করে পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং একটি Eppendorf™ ThermoMixer C-তে 30 মিনিটের জন্য 37 °C তাপমাত্রায় 800 rpm-এ ইনকিউবেট করা হয়েছিল। ইনকিউবেশনের পরে, 3 মিনিটের জন্য 6000 RCF-তে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং 800 µl এবং 1000 µl 1X PBS দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। অবশেষে, 100 µl 1X PBS-এ পেলেটটি পুনরায় সাসপেন্ড করুন।
নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস মোনার্ক জিনোমিক ডিএনএ পিউরিফিকেশন কিট (নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস, ইপসউইচ, এমএ, ক্যাট# T3010L) ব্যবহার করে মোট ব্যাকটেরিয়া ডিএনএ বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। কিটের সাথে প্রদত্ত স্ট্যান্ডার্ড অপারেটিং পদ্ধতিটি সামান্য পরিবর্তিত হয়েছে। চূড়ান্ত নির্গমনের জন্য অপারেশনের আগে 60°C তাপমাত্রায় নিউক্লিয়াস-মুক্ত জল ইনকিউবেট করুন এবং বজায় রাখুন। প্রতিটি নমুনায় 10 µl প্রোটিনেজ K এবং 3 µl RNase A যোগ করুন। তারপর 100 µl সেল লাইসিস বাফার যোগ করুন এবং আলতো করে মিশ্রিত করুন। তারপর নমুনাগুলিকে Eppendorf™ ThermoMixer C-তে 56°C এবং 1400 rpm তাপমাত্রায় কমপক্ষে 1 ঘন্টা এবং সর্বোচ্চ 3 ঘন্টা পর্যন্ত ইনকিউবেট করা হয়েছিল। ইনকিউবেটেড নমুনাগুলিকে 12,000 RCF-তে 3 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং প্রতিটি নমুনা থেকে সুপারন্যাট্যান্টকে 400 µL বাইন্ডিং দ্রবণ ধারণকারী একটি পৃথক 1.5 মিলি মাইক্রোসেন্ট্রিফিউজ টিউবে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল। এরপর টিউবগুলিকে ১ সেকেন্ডের ব্যবধানে ৫-১০ সেকেন্ডের জন্য পালস ঘূর্ণি করা হয়। প্রতিটি নমুনার সম্পূর্ণ তরল পদার্থ (প্রায় ৬০০-৭০০ μL) একটি ফ্লো-থ্রু কালেকশন টিউবে স্থাপন করা একটি ফিল্টার কার্তুজে স্থানান্তর করুন। প্রাথমিক ডিএনএ বাইন্ডিং করার জন্য টিউবগুলিকে ৩ মিনিটের জন্য ১,০০০ RCF-তে সেন্ট্রিফিউজ করা হয় এবং তারপর অবশিষ্ট তরল অপসারণের জন্য ১ মিনিটের জন্য ১২,০০০ RCF-তে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়। নমুনা কলামটি একটি নতুন কালেকশন টিউবে স্থানান্তরিত করা হয় এবং তারপর দুবার ধোয়া হয়। প্রথম ধোয়ার জন্য, প্রতিটি টিউবে ৫০০ μL ওয়াশ বাফার যোগ করুন। টিউবটি ৩-৫ বার উল্টে দিন এবং তারপর ১২,০০০ RCF-তে ১ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করুন। সংগ্রহ টিউব থেকে তরলটি ফেলে দিন এবং ফিল্টার কার্তুজটি আবার একই সংগ্রহ টিউবে রাখুন। দ্বিতীয় ধোয়ার জন্য, উল্টে না দিয়ে ফিল্টারে ৫০০ μL ওয়াশ বাফার যোগ করুন। নমুনাগুলি ১ মিনিটের জন্য ১২,০০০ RCF-তে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়। ফিল্টারটি ১.৫ মিলি LoBind® টিউবে স্থানান্তর করুন এবং ১০০ µL পূর্বে উত্তপ্ত নিউক্লিজ-মুক্ত জল যোগ করুন। ফিল্টারগুলি ১ মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল এবং তারপর ১২,০০০ RCF-তে ১ মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। এলিউটেড ডিএনএ -৮০°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল।
Qubit™ 4.0 ফ্লুরোমিটার ব্যবহার করে DNA ঘনত্ব পরিমাপ করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে Qubit™ 1X dsDNA উচ্চ সংবেদনশীলতা কিট (Cat. No. Q33231) ব্যবহার করে DNA প্রস্তুত করা হয়েছিল। Aglient™ 4150 বা 4200 TapeStation ব্যবহার করে DNA খণ্ডের দৈর্ঘ্য বন্টন পরিমাপ করা হয়েছিল। Agilent™ জিনোমিক DNA রিএজেন্ট (Cat. No. 5067-5366) এবং জিনোমিক DNA স্ক্রিনটেপ (Cat. No. 5067-5365) ব্যবহার করে DNA প্রস্তুত করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) র‍্যাপিড PCR বারকোডিং কিট (SQK-RPB004) ব্যবহার করে লাইব্রেরি প্রস্তুতি সম্পাদিত হয়েছিল। Min106D ফ্লো সেল (R 9.4.1) সহ ONT Gridion™ Mk1 সিকোয়েন্সার ব্যবহার করে DNA সিকোয়েন্স করা হয়েছিল। সিকোয়েন্সিং সেটিংস ছিল: উচ্চ নির্ভুলতা বেস কলিং, সর্বনিম্ন q মান 9, বারকোড সেটআপ এবং বারকোড ট্রিম। নমুনাগুলি ৭২ ঘন্টা ধরে সিকোয়েন্স করা হয়েছিল, তারপরে আরও প্রক্রিয়াকরণ এবং বিশ্লেষণের জন্য বেস কল ডেটা জমা দেওয়া হয়েছিল।
পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতি ব্যবহার করে বায়োইনফরমেটিক্স প্রক্রিয়াকরণ করা হয়েছিল (গ্রিনম্যান এট আল।, ২০২৪)। সিকোয়েন্সিং থেকে প্রাপ্ত FASTQ ফাইলগুলিকে প্রতিটি নমুনার জন্য ডিরেক্টরিতে ভাগ করা হয়েছিল। বায়োইনফরমেটিক্স বিশ্লেষণের আগে, নিম্নলিখিত পাইপলাইন ব্যবহার করে ডেটা প্রক্রিয়া করা হয়েছিল: প্রথমে, নমুনার FASTQ ফাইলগুলিকে একটি একক FASTQ ফাইলে একত্রিত করা হয়েছিল। তারপর, ১০০০ bp এর চেয়ে কম রিডগুলি Filtlong v. 0.2.1 ব্যবহার করে ফিল্টার করা হয়েছিল, একমাত্র প্যারামিটার পরিবর্তন করা হয়েছিল –min_length 1000 (Wick, 2024)। আরও ফিল্টারিংয়ের আগে, নিম্নলিখিত প্যারামিটারগুলির সাথে NanoPlot v. 1.41.3 ব্যবহার করে পড়ার মান নিয়ন্ত্রণ করা হয়েছিল: –fastq –plots dot –N50 -o(ডি কস্টার এবং রেডেমেকারস, ২০২৩)। মিনিম্যাপ২ ভার্সন ২.২৪-আর১১২২ ব্যবহার করে মাউস রেফারেন্স জিনোম GRCm39 (GCF_000001635.27) এর সাথে রিডগুলি সারিবদ্ধ করা হয়েছিল যাতে নিম্নলিখিত প্যারামিটারগুলি ব্যবহার করে হোস্ট-দূষিত রিডগুলি অপসারণ করা যায়: -L -ax map-ont(লি, ২০১৮)। samtools v. 1.16.1-এ samtools view -b (Danecek et al., 2021) ব্যবহার করে জেনারেট করা অ্যালাইনমেন্ট ফাইলগুলিকে BAM ফর্ম্যাটে রূপান্তরিত করা হয়েছিল। তারপর samtools view -b -f 4 ব্যবহার করে আনঅ্যালাইনড রিডগুলি সনাক্ত করা হয়েছিল, যা নির্দেশ করে যে এই রিডগুলি হোস্ট জিনোমের অন্তর্গত ছিল না। ডিফল্ট প্যারামিটার সহ samtools bam2fq ব্যবহার করে আনঅ্যালাইনড রিডগুলি FASTQ ফর্ম্যাটে রূপান্তরিত করা হয়েছিল। পূর্বে বর্ণিত সেটিংস ব্যবহার করে আরও ফিল্টার করা রিডগুলিতে NanoPlot পুনরায় চালানো হয়েছিল। ফিল্টার করার পরে, নিম্নলিখিত প্যারামিটারগুলি সহ মেটাফ্লাই ভার্সন 2.8.2-b1689 ব্যবহার করে মেটাজেনমিক ডেটা একত্রিত করা হয়েছিল: –nano-raw–meta (Kolmogorov et al., 2020)। বাকি প্যারামিটারগুলিকে তাদের ডিফল্ট মানগুলিতে ছেড়ে দিন। অ্যাসেম্বলির পরে, ফিল্টার করা রিডগুলি minimap2 ব্যবহার করে অ্যাসেম্বলিতে ম্যাপ করা হয়েছিল এবং -ax map-ont প্যারামিটারটি SAM ফর্ম্যাটে একটি অ্যালাইনমেন্ট ফাইল তৈরি করতে ব্যবহার করা হয়েছিল। অ্যাসেম্বলিটি প্রথমে racon v. 1.4.20 ব্যবহার করে নিম্নলিখিত প্যারামিটারগুলি ব্যবহার করে পরিমার্জিত করা হয়েছিল: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (Vaser et al., 2017)। racon সম্পূর্ণ হওয়ার পরে, medaka v. 1.7.2 ব্যবহার করে এটি আরও পরিমার্জিত করা হয়েছিল, medaka_consesus ব্যবহার করে, -m প্যারামিটার ছাড়া সমস্ত প্যারামিটার তাদের ডিফল্ট মানগুলিতে রেখে দেওয়া হয়েছিল। -m প্যারামিটারটি r941_min_hac_g507 এ সেট করা হয়েছে যাতে আমাদের ডেটার জন্য ব্যবহৃত ফ্লো সেল রসায়ন এবং উচ্চ-নির্ভুলতা বেস কলিং নির্দিষ্ট করা যায় (nanoporetech/medaka, 2024)। ফিল্টার করা ডেটা (এরপর থেকে মাইক্রোবিয়াল ডেটা হিসাবে উল্লেখ করা হবে) এবং চূড়ান্ত পরিষ্কার করা অ্যাসেম্বলি পরবর্তী বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।
ট্যাক্সোনমিক শ্রেণীবিভাগের জন্য, পঠন এবং একত্রিত কন্টিগগুলিকে Kraken2 v. 2.1.2 (উড এট আল।, 2019) ব্যবহার করে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল। পঠন এবং সমাবেশের জন্য যথাক্রমে প্রতিবেদন এবং আউটপুট ফাইল তৈরি করুন। পঠন এবং সমাবেশ বিশ্লেষণ করতে -use-names বিকল্পটি ব্যবহার করুন। পঠন অংশগুলির জন্য -gzip-সংকুচিত এবং -জোড়া বিকল্পগুলি নির্দিষ্ট করা হয়েছে। মেটাজেনোমে ট্যাক্সার আপেক্ষিক প্রাচুর্য Bracken v. 2.8 (লু এট আল।, 2017) ব্যবহার করে অনুমান করা হয়েছিল। আমরা প্রথমে নিম্নলিখিত পরামিতিগুলি সহ bracken-build ব্যবহার করে 1000টি বেস সমন্বিত একটি kmer ডাটাবেস তৈরি করেছি: -d-k 35 -l 1000 একবার তৈরি হয়ে গেলে, kraken2 দ্বারা তৈরি রিপোর্টের উপর ভিত্তি করে ব্র্যাকেন চলে এবং নিম্নলিখিত বিকল্পগুলি ব্যবহার করে ডেটা ফিল্টার করে: -d -I -O-পৃষ্ঠা ১০০০ -ঠ

তাদের মধ্যে, বিশ্লেষণ করা শ্রেণিবিন্যাস স্তরের উপর নির্ভর করে P, G অথবা S নির্বাচন করা হয়। মিথ্যা ধনাত্মক শ্রেণিবিন্যাসের প্রভাব কমাতে, 1e-4 (1/10,000 পাঠ) এর একটি ন্যূনতম আপেক্ষিক প্রাচুর্যের সীমা গ্রহণ করা হয়েছিল। পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণের আগে, ব্র্যাকেন (fraction_total_reads) দ্বারা রিপোর্ট করা আপেক্ষিক প্রাচুর্যকে কেন্দ্রীভূত লগ-অনুপাত (CLR) রূপান্তর ব্যবহার করে রূপান্তরিত করা হয়েছিল (Aitchison, 1982)। ডেটা রূপান্তরের জন্য CLR পদ্ধতিটি বেছে নেওয়া হয়েছিল কারণ এটি স্কেল-অপরিবর্তনীয় এবং অ-বিচ্ছিন্ন ডেটাসেটের জন্য যথেষ্ট (Gloor et al., 2017)। CLR রূপান্তর প্রাকৃতিক লগারিদম ব্যবহার করে। ব্র্যাকেন দ্বারা রিপোর্ট করা গণনা ডেটা আপেক্ষিক লগ এক্সপ্রেশন (RLE) ব্যবহার করে স্বাভাবিক করা হয়েছিল (Anders and Huber, 2010)। matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 এবং ক্রমিক লগারিদম (Gloor et al., 2017) এর সংমিশ্রণ ব্যবহার করে চিত্রগুলি তৈরি করা হয়েছিল। 0.12.2 এবং স্ট্যান্টানোটেশন v. 0.5.0 (হান্টার, 2007; ওয়াসকম, 2021; চার্লিয়ার এট আল., 2022)। প্রতিটি নমুনার জন্য স্বাভাবিক ব্যাকটেরিয়া গণনা ব্যবহার করে ব্যাসিলাস/ব্যাকটেরোইডেটস অনুপাত গণনা করা হয়েছিল। টেবিলে রিপোর্ট করা মানগুলি 4 দশমিক স্থানে বৃত্তাকারে সাজানো হয়েছে। KrakenTools v. 1.2 প্যাকেজে (Lu et al., 2022) প্রদত্ত alpha_diversity.py স্ক্রিপ্ট ব্যবহার করে সিম্পসন ডাইভারসিটি ইনডেক্স গণনা করা হয়েছিল। স্ক্রিপ্টে ব্র্যাকেন রিপোর্ট প্রদান করা হয়েছে এবং -an প্যারামিটারের জন্য সিম্পসন ইনডেক্স "Si" প্রদান করা হয়েছে। প্রাচুর্যের উল্লেখযোগ্য পার্থক্যগুলিকে গড় CLR পার্থক্য ≥ 1 বা ≤ -1 হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছে। ±1 এর গড় CLR পার্থক্য একটি নমুনা ধরণের প্রাচুর্যে 2.7 গুণ বৃদ্ধি নির্দেশ করে। (+/-) চিহ্নটি নির্দেশ করে যে PPA নমুনা এবং নিয়ন্ত্রণ নমুনায় যথাক্রমে ট্যাক্সন বেশি প্রাচুর্যযুক্ত কিনা। মান-হুইটনি ইউ পরীক্ষা (ভির্টানেন এট আল।, ২০২০) ব্যবহার করে তাৎপর্য নির্ধারণ করা হয়েছিল। স্ট্যাটসমডেলস বনাম ০.১৪ (বেঞ্জামিনী এবং হচবার্গ, ১৯৯৫; সিবোল্ড এবং পারকটল্ড, ২০১০) ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং একাধিক পরীক্ষার জন্য সংশোধনের জন্য বেঞ্জামিনী-হচবার্গ পদ্ধতি প্রয়োগ করা হয়েছিল। পরিসংখ্যানগত তাৎপর্য নির্ধারণের জন্য একটি সমন্বিত p-মান ≤ ০.০৫ থ্রেশহোল্ড হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল।
Maranga et al. (Maranga et al., 2023) দ্বারা বর্ণিত প্রোটোকলের একটি পরিবর্তিত সংস্করণ ব্যবহার করে জিন টীকা এবং আপেক্ষিক প্রাচুর্যের অনুমান করা হয়েছিল। প্রথমে, SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016) ব্যবহার করে সমস্ত অ্যাসেম্বলি থেকে 500 bp এর চেয়ে কম কনটিগগুলি সরানো হয়েছিল। নির্বাচিত অ্যাসেম্বলিগুলিকে তারপর একটি প্যান-মেটাজেনোমে একত্রিত করা হয়েছিল। নিম্নলিখিত পরামিতিগুলির সাথে Prodigal v. 1.0.1 (Prodigal v. 2.6.3 এর একটি সমান্তরাল সংস্করণ) ব্যবহার করে ওপেন রিডিং ফ্রেম (ORF) সনাক্ত করা হয়েছিল: -d-f gff-i -O-T 24 -p meta -C 10000 (Hyett et al., 2012; Jaenicke, 2024)। ফলস্বরূপ নিউক্লিওটাইড ফাইলগুলি পাইথন ব্যবহার করে ফিল্টার করা হয়েছিল যাতে সমস্ত অসম্পূর্ণ জিন অপসারণ করা হয়। এরপর CD-HIT v. 4.8.1 ব্যবহার করে নিম্নলিখিত পরামিতিগুলির সাথে জিনগুলিকে ক্লাস্টার করা হয়েছিল: cd-hit-est -i -O-c 0.95 -s 0.85 -aS 0.9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (Fu et al., 2012)। জিনের প্রাচুর্য এবং টীকা অনুমান করার জন্য তৈরি করা নন-রিডান্ড্যান্ট জিন ক্যাটালগ ব্যবহার করা হয়েছিল। KMA v. 1.4.9 (Clausen et al., 2018) ব্যবহার করে আপেক্ষিক জিনের প্রাচুর্য অনুমান করা হয়েছিল। প্রথমে, নিম্নলিখিত পরামিতি সহ KMA সূচক ব্যবহার করে একটি সূচক ফাইল তৈরি করুন: -i -Oতারপর, বায়োইনফরমেটিক্স পাইপলাইন বিভাগে বর্ণিত প্রতিটি নমুনার জন্য মাইক্রোবায়াল রিডের সাথে তৈরি সূচক ব্যবহার করে, KMA নিম্নলিখিত পরামিতিগুলির সাথে চালানো হয়েছিল: -i -O-টি_ডিবি-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24. তারপর, CLR ব্যবহার করে জিন গণনা স্বাভাবিক করা হয়েছিল, এবং Sci-kit learn-এর প্রধান উপাদান বিশ্লেষণ (PCA) ক্লাস ব্যবহার করা হয়েছিল (Pedregosa et al., 2011)। পূর্বাভাসিত জিন টীকাটি eggNOG v. 2.1.12 এর emapper.py স্ক্রিপ্ট এবং eggNOG ডাটাবেস সংস্করণ 5.0.2 ব্যবহার করে নিম্নলিখিত পরামিতি সহ নন-রিডান্ড্যান্ট জিন ক্যাটালগে সম্পাদিত হয়েছিল: –itype CDS –cpu 24 -i- ডেটা ক্যাটালগ–go_evidence নন-ইলেকট্রনিক – আউটপুট- আউটপুট ডিরেক্টরি–টার্গেট_অর্থোলগস সকল –seed_ortholog_evalue 0.001 –seed_ortholog_score 60 –query_cover 20 –subject_cover 0 –translate –override –temp_dir(Cantalapiedra et al., 2021)। পর্যাপ্ত টেমপ্লেট কভারেজ এবং টেমপ্লেট পরিচয় (≥ 90%) এবং প্রাচুর্য (গভীরতা ≥ 3) সহ জিন নির্বাচন করার জন্য KMA ফলাফলগুলি পরীক্ষা করা হয়েছিল। উপরে বর্ণিত CLR ব্যবহার করে KMA গভীরতার ফলাফল রূপান্তরিত করা হয়েছিল। তারপরে KMA ফলাফলগুলি প্রতিটি জিনের জন্য কন্টিগ উৎস ব্যবহার করে কার্যকরী টীকা এবং শ্রেণীবিভাগ ফলাফল থেকে কন্টিগ আইডিগুলির সাথে তুলনা করা হয়েছিল। ট্যাক্সার মতো, জিন প্রাচুর্যের উল্লেখযোগ্য পার্থক্যগুলিকে এমন জিন হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল যার গড় CLR পার্থক্য ≥ 1 বা ≤ -1 ছিল, একটি চিহ্ন (+/-) দিয়ে নির্দেশ করে যে জিনটি যথাক্রমে PPA বা নিয়ন্ত্রণ নমুনায় বেশি প্রাচুর্যপূর্ণ ছিল।
জিন পাথওয়ে প্রাচুর্যের তুলনা করার জন্য eggNOG দ্বারা নির্ধারিত Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) অর্থলজ (KO) শনাক্তকারী অনুসারে জিনগুলিকে প্রথমে গোষ্ঠীভুক্ত করা হয়েছিল। বিশ্লেষণের আগে নকআউট ছাড়া জিন বা একাধিক নকআউট সহ জিনগুলি সরানো হয়েছিল। তারপর প্রতি নমুনায় প্রতিটি KO এর গড় প্রাচুর্য গণনা করা হয়েছিল এবং পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। PPA বিপাক জিনগুলিকে KEGG_Pathway কলামে একটি সারি ko00640 বরাদ্দ করা যেকোনো জিন হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল, যা KEGG অনুসারে প্রোপিওনেট বিপাকের ভূমিকা নির্দেশ করে। PPA উৎপাদনের সাথে যুক্ত হিসাবে চিহ্নিত জিনগুলি পরিপূরক সারণি 1 এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017)। প্রতিটি নমুনা ধরণের মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি প্রাচুর্যযুক্ত PPA বিপাক এবং উৎপাদন জিন সনাক্ত করার জন্য বিন্যাস পরীক্ষা করা হয়েছিল। বিশ্লেষণ করা প্রতিটি জিনের জন্য এক হাজার বিন্যাস করা হয়েছিল। পরিসংখ্যানগত তাৎপর্য নির্ধারণের জন্য 0.05 এর একটি p-মান একটি কাটঅফ হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল। ক্লাস্টারের মধ্যে প্রতিনিধিত্বমূলক জিনের টীকাগুলির উপর ভিত্তি করে একটি ক্লাস্টারের মধ্যে পৃথক জিনের জন্য কার্যকরী টীকা বরাদ্দ করা হয়েছিল। EggNOG ব্যবহার করে কার্যকরী টীকাকরণের সময় ধরে রাখা একই কন্টিগ আইডিগুলির সাথে Kraken2 আউটপুট ফাইলগুলিতে কন্টিগ আইডিগুলির সাথে মিল রেখে PPA বিপাক এবং/অথবা PPA উৎপাদনের সাথে সম্পর্কিত ট্যাক্সা সনাক্ত করা যেতে পারে। পূর্বে বর্ণিত Mann-Whitney U পরীক্ষা ব্যবহার করে তাৎপর্য পরীক্ষা করা হয়েছিল। বেঞ্জামিনী-হচবার্গ পদ্ধতি ব্যবহার করে একাধিক পরীক্ষার জন্য সংশোধন করা হয়েছিল। পরিসংখ্যানগত তাৎপর্য নির্ধারণের জন্য ≤ 0.05 এর একটি p-মান একটি কাটঅফ হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল।
সিম্পসন ডাইভারসিটি ইনডেক্স ব্যবহার করে ইঁদুরের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমের বৈচিত্র্য মূল্যায়ন করা হয়েছিল। জিনাস এবং প্রজাতির বৈচিত্র্যের ক্ষেত্রে নিয়ন্ত্রণ এবং PPA নমুনার মধ্যে কোনও উল্লেখযোগ্য পার্থক্য পরিলক্ষিত হয়নি (জেনাসের জন্য p-মান: 0.18, প্রজাতির জন্য p-মান: 0.16) (চিত্র 1)। এরপর মূল উপাদান বিশ্লেষণ (PCA) ব্যবহার করে মাইক্রোবায়াল গঠন তুলনা করা হয়েছিল। চিত্র 2 তাদের ফাইলা দ্বারা নমুনাগুলির ক্লাস্টারিং দেখায়, যা নির্দেশ করে যে PPA এবং নিয়ন্ত্রণ নমুনার মধ্যে মাইক্রোবায়োমের প্রজাতির গঠনে পার্থক্য ছিল। এই ক্লাস্টারিং জিনাস স্তরে কম স্পষ্ট ছিল, যা ইঙ্গিত করে যে PPA নির্দিষ্ট ব্যাকটেরিয়াকে প্রভাবিত করে (পরিপূরক চিত্র 1)।
চিত্র ১. ইঁদুরের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমের বংশগতির আলফা বৈচিত্র্য এবং প্রজাতির গঠন। PPA এবং নিয়ন্ত্রণ নমুনায় সিম্পসন বংশগতির (A) এবং প্রজাতির (B) সূচক দেখানো বাক্স প্লট। মান-হুইটনি U পরীক্ষা ব্যবহার করে তাৎপর্য নির্ধারণ করা হয়েছিল, এবং বেঞ্জামিনি-হচবার্গ পদ্ধতি ব্যবহার করে একাধিক সংশোধন করা হয়েছিল। ns, p-মান উল্লেখযোগ্য ছিল না (p>0.05)।
চিত্র ২. প্রজাতি স্তরে ইঁদুরের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োম গঠনের প্রধান উপাদান বিশ্লেষণের ফলাফল। প্রধান উপাদান বিশ্লেষণ প্লটটি তাদের প্রথম দুটি প্রধান উপাদান জুড়ে নমুনার বিতরণ প্রদর্শন করে। রঙগুলি নমুনার ধরণ নির্দেশ করে: PPA-উন্মুক্ত ইঁদুরগুলি বেগুনি এবং নিয়ন্ত্রণ ইঁদুরগুলি হলুদ। প্রধান উপাদান 1 এবং 2 যথাক্রমে x-অক্ষ এবং y-অক্ষে প্লট করা হয়েছে এবং তাদের ব্যাখ্যা করা বৈচিত্র্য অনুপাত হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছে।
RLE রূপান্তরিত গণনা তথ্য ব্যবহার করে, নিয়ন্ত্রণ এবং PPA ইঁদুরের মধ্যে মাঝারি ব্যাকটেরয়েডেট/ব্যাসিলি অনুপাতের উল্লেখযোগ্য হ্রাস লক্ষ্য করা গেছে (নিয়ন্ত্রণ: 9.66, PPA: 3.02; p-মান = 0.0011)। নিয়ন্ত্রণের তুলনায় PPA ইঁদুরে ব্যাকটেরয়েডেটের প্রাচুর্য বেশি থাকার কারণে এই পার্থক্যটি ছিল, যদিও পার্থক্যটি উল্লেখযোগ্য ছিল না (নিয়ন্ত্রণ গড় CLR: 5.51, PPA মানে CLR: 6.62; p-মান = 0.054), যেখানে ব্যাকটেরয়েডেটের প্রাচুর্য একই রকম ছিল (নিয়ন্ত্রণ গড় CLR: 7.76, PPA মানে CLR: 7.60; p-মান = 0.18)।
অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমের ট্যাক্সোনমিক সদস্যদের প্রাচুর্য বিশ্লেষণ করে দেখা গেছে যে ১টি ফাইলাম এবং ৭৭টি প্রজাতি PPA এবং নিয়ন্ত্রণ নমুনার মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে পার্থক্য করেছে (পরিপূরক সারণী ২)। PPA নমুনায় ৫৯টি প্রজাতির প্রাচুর্য নিয়ন্ত্রণ নমুনার তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল, যেখানে নিয়ন্ত্রণ নমুনায় মাত্র ১৬টি প্রজাতির প্রাচুর্য PPA নমুনার তুলনায় বেশি ছিল (চিত্র ৩)।
চিত্র ৩. PPA এবং নিয়ন্ত্রণ ইঁদুরের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমে ট্যাক্সার পার্থক্যমূলক প্রাচুর্য। আগ্নেয়গিরির প্লটগুলি PPA এবং নিয়ন্ত্রণ নমুনার মধ্যে জেনার (A) বা প্রজাতির (B) প্রাচুর্যের মধ্যে পার্থক্য প্রদর্শন করে। ধূসর বিন্দুগুলি ট্যাক্সার প্রাচুর্যের মধ্যে কোনও উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে না। রঙিন বিন্দুগুলি প্রাচুর্যের মধ্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (p-মান ≤ 0.05)। নমুনা প্রকারের মধ্যে প্রাচুর্যের মধ্যে সর্বাধিক পার্থক্য সহ শীর্ষ 20 টি ট্যাক্সা যথাক্রমে লাল এবং হালকা নীল (নিয়ন্ত্রণ এবং PPA নমুনা) রঙে দেখানো হয়েছে। হলুদ এবং বেগুনি বিন্দুগুলি নিয়ন্ত্রণের তুলনায় নিয়ন্ত্রণ বা PPA নমুনায় কমপক্ষে 2.7 গুণ বেশি প্রচুর ছিল। কালো বিন্দুগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন প্রাচুর্য সহ ট্যাক্সাকে প্রতিনিধিত্ব করে, যার গড় CLR পার্থক্য -1 এবং 1 এর মধ্যে রয়েছে। P মানগুলি Mann-Whitney U পরীক্ষা ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল এবং Benjamini-Hochberg পদ্ধতি ব্যবহার করে একাধিক পরীক্ষার জন্য সংশোধন করা হয়েছিল। বোল্ড গড় CLR পার্থক্যগুলি প্রাচুর্যের মধ্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে।
অন্ত্রের জীবাণুর গঠন বিশ্লেষণ করার পর, আমরা মাইক্রোবায়োমের একটি কার্যকরী টীকা সম্পাদন করেছি। নিম্নমানের জিন ফিল্টার করার পর, সমস্ত নমুনা জুড়ে মোট 378,355টি অনন্য জিন সনাক্ত করা হয়েছিল। এই জিনগুলির রূপান্তরিত প্রাচুর্য প্রধান উপাদান বিশ্লেষণের (PCA) জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং ফলাফলগুলি তাদের কার্যকরী প্রোফাইলের উপর ভিত্তি করে নমুনা ধরণের উচ্চ মাত্রার ক্লাস্টারিং দেখিয়েছে (চিত্র 4)।
চিত্র ৪. মাউসের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমের কার্যকরী প্রোফাইল ব্যবহার করে PCA ফলাফল। PCA প্লটটি তাদের প্রথম দুটি প্রধান উপাদান জুড়ে নমুনার বিতরণ প্রদর্শন করে। রঙগুলি নমুনার ধরণ নির্দেশ করে: PPA-উন্মুক্ত ইঁদুরগুলি বেগুনি এবং নিয়ন্ত্রণ ইঁদুরগুলি হলুদ। প্রধান উপাদান 1 এবং 2 যথাক্রমে x-অক্ষ এবং y-অক্ষে প্লট করা হয়েছে এবং তাদের ব্যাখ্যা করা বৈচিত্র্য অনুপাত হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছে।
এরপর আমরা বিভিন্ন ধরণের নমুনায় KEGG নকআউটের প্রাচুর্য পরীক্ষা করেছিলাম। মোট 3648টি অনন্য নকআউট শনাক্ত করা হয়েছিল, যার মধ্যে 196টি নিয়ন্ত্রণ নমুনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি এবং 106টি PPA নমুনায় আরও প্রচুর ছিল (চিত্র 5)। নিয়ন্ত্রণ নমুনায় মোট 145টি জিন এবং PPA নমুনায় 61টি জিন সনাক্ত করা হয়েছিল, যার প্রাচুর্য উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন ছিল। PPA নমুনায় লিপিড এবং অ্যামিনোসুগার বিপাকের সাথে সম্পর্কিত পথগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে আরও সমৃদ্ধ হয়েছিল (পরিপূরক সারণী 3)। নিয়ন্ত্রণ নমুনায় নাইট্রোজেন বিপাক এবং সালফার রিলে সিস্টেমের সাথে সম্পর্কিত পথগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে আরও সমৃদ্ধ হয়েছিল (পরিপূরক সারণী 3)। PPA নমুনায় অ্যামিনোসুগার/নিউক্লিওটাইড বিপাক (ko:K21279) এবং ইনোসিটল ফসফেট বিপাক (ko:K07291) সম্পর্কিত জিনের প্রাচুর্য উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল (চিত্র 5)। নিয়ন্ত্রণ নমুনাগুলিতে বেনজোয়েট বিপাক (ko:K22270), নাইট্রোজেন বিপাক (ko:K00368), এবং গ্লাইকোলাইসিস/গ্লুকোনিওজেনেসিস (ko:K00131) সম্পর্কিত উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি জিন ছিল (চিত্র 5)।
চিত্র ৫. PPA এবং নিয়ন্ত্রণ ইঁদুরের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমে KO-এর ডিফারেনশিয়াল প্রাচুর্য। আগ্নেয়গিরির প্লটে কার্যকরী গোষ্ঠীর (KO) প্রাচুর্যের পার্থক্য চিত্রিত করা হয়েছে। ধূসর বিন্দুগুলি KO-কে নির্দেশ করে যাদের প্রাচুর্য নমুনা ধরণের মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে আলাদা ছিল না (p-মান > 0.05)। রঙিন বিন্দুগুলি প্রাচুর্যের মধ্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (p-মান ≤ 0.05)। নমুনা ধরণের মধ্যে প্রাচুর্যের মধ্যে সর্বাধিক পার্থক্য সহ 20 টি KO যথাক্রমে লাল এবং হালকা নীল রঙে দেখানো হয়েছে, যা নিয়ন্ত্রণ এবং PPA নমুনার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। হলুদ এবং বেগুনি বিন্দুগুলি KO-কে নির্দেশ করে যা যথাক্রমে নিয়ন্ত্রণ এবং PPA নমুনায় কমপক্ষে 2.7 গুণ বেশি প্রচুর ছিল। কালো বিন্দুগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন প্রাচুর্য সহ KO-কে নির্দেশ করে, যার গড় CLR পার্থক্য -1 এবং 1 এর মধ্যে। P মানগুলি Mann-Whitney U পরীক্ষা ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল এবং Benjamini-Hochberg পদ্ধতি ব্যবহার করে একাধিক তুলনার জন্য সামঞ্জস্য করা হয়েছিল। NaN নির্দেশ করে যে KO KEGG-তে কোনও পথের অন্তর্গত নয়। বোল্ড গড় CLR পার্থক্য মান প্রাচুর্যের উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে। তালিকাভুক্ত KO গুলি কোন পথে যায় সে সম্পর্কে বিস্তারিত তথ্যের জন্য, পরিপূরক সারণি 3 দেখুন।
টীকাযুক্ত জিনগুলির মধ্যে, ১৬০১টি জিনের নমুনা ধরণের মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন প্রাচুর্য ছিল (p ≤ 0.05), প্রতিটি জিন কমপক্ষে ২.৭ গুণ বেশি প্রাচুর্যযুক্ত ছিল। এই জিনগুলির মধ্যে, নিয়ন্ত্রণ নমুনাগুলিতে ৪টি জিন বেশি প্রাচুর্যযুক্ত ছিল এবং PPA নমুনাগুলিতে ১৫৯৭টি জিন বেশি প্রাচুর্যযুক্ত ছিল। যেহেতু PPA-র অ্যান্টিমাইক্রোবিয়াল বৈশিষ্ট্য রয়েছে, তাই আমরা নমুনা ধরণের মধ্যে PPA বিপাক এবং উৎপাদন জিনের প্রাচুর্য পরীক্ষা করেছি। ১৩৩২টি PPA বিপাক-সম্পর্কিত জিনের মধ্যে, ২৭টি জিন নিয়ন্ত্রণ নমুনাগুলিতে উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি প্রাচুর্যযুক্ত ছিল এবং ১২টি জিন PPA নমুনাগুলিতে বেশি প্রাচুর্যযুক্ত ছিল। ২২৩টি PPA উৎপাদন-সম্পর্কিত জিনের মধ্যে, ১টি জিন PPA নমুনাগুলিতে উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি প্রাচুর্যযুক্ত ছিল। চিত্র ৬এ আরও দেখায় যে PPA বিপাকের সাথে জড়িত জিনের উচ্চ প্রাচুর্য রয়েছে, নিয়ন্ত্রণ নমুনাগুলিতে উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি প্রাচুর্য এবং বৃহৎ প্রভাব আকার রয়েছে, যেখানে চিত্র ৬বি PPA নমুনাগুলিতে উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি প্রাচুর্যযুক্ত পৃথক জিনগুলিকে হাইলাইট করে।
চিত্র ৬. মাউসের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমে PPA-সম্পর্কিত জিনের ডিফারেনশিয়াল প্রাচুর্য। আগ্নেয়গিরির প্লটগুলি PPA বিপাক (A) এবং PPA উৎপাদন (B) এর সাথে সম্পর্কিত জিনের প্রাচুর্যের পার্থক্য চিত্রিত করে। ধূসর বিন্দুগুলি এমন জিনগুলিকে নির্দেশ করে যাদের প্রাচুর্য নমুনা ধরণের (p-মান > 0.05) মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে আলাদা ছিল না। রঙিন বিন্দুগুলি প্রাচুর্যের উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (p-মান ≤ 0.05)। প্রাচুর্যের মধ্যে সর্বাধিক পার্থক্য সহ 20টি জিন যথাক্রমে লাল এবং হালকা নীল (নিয়ন্ত্রণ এবং PPA নমুনা) রঙে দেখানো হয়েছে। হলুদ এবং বেগুনি বিন্দুর প্রাচুর্য নিয়ন্ত্রণ নমুনার তুলনায় নিয়ন্ত্রণ এবং PPA নমুনায় কমপক্ষে 2.7 গুণ বেশি ছিল। কালো বিন্দুগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন প্রাচুর্য সহ জিনগুলিকে প্রতিনিধিত্ব করে, যার গড় CLR পার্থক্য -1 এবং 1 এর মধ্যে। P মানগুলি Mann-Whitney U পরীক্ষা ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল এবং Benjamini-Hochberg পদ্ধতি ব্যবহার করে একাধিক তুলনার জন্য সংশোধন করা হয়েছিল। জিনগুলি অ-অপ্রয়োজনীয় জিন ক্যাটালগে প্রতিনিধিত্বকারী জিনের সাথে মিলে যায়। জিনের নামগুলিতে KEGG প্রতীক থাকে যা KO জিনকে নির্দেশ করে। বোল্ড গড় CLR পার্থক্য উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন প্রাচুর্য নির্দেশ করে। একটি ড্যাশ (-) নির্দেশ করে যে KEGG ডাটাবেসে জিনের জন্য কোনও প্রতীক নেই।
PPA বিপাক এবং/অথবা উৎপাদনের সাথে সম্পর্কিত জিন সহ ট্যাক্সা সনাক্ত করা হয়েছিল, জিনের কনটিগ আইডির সাথে কন্টিগের ট্যাক্সোনমিক পরিচয়ের মিল খুঁজে পেয়ে। জিনাস স্তরে, 130টি জেনারায় PPA বিপাকের সাথে সম্পর্কিত জিন পাওয়া গেছে এবং 61টি জেনারায় PPA উৎপাদনের সাথে সম্পর্কিত জিন পাওয়া গেছে (পরিপূরক সারণী 4)। তবে, কোনও জেনারায় প্রাচুর্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখা যায়নি (p > 0.05)।
প্রজাতি স্তরে, ১৪৪টি ব্যাকটেরিয়া প্রজাতির PPA বিপাকের সাথে সম্পর্কিত জিন পাওয়া গেছে এবং ৬৮টি ব্যাকটেরিয়া প্রজাতির PPA উৎপাদনের সাথে সম্পর্কিত জিন পাওয়া গেছে (পরিপূরক সারণী ৫)। PPA বিপাককারীর মধ্যে, আটটি ব্যাকটেরিয়া নমুনা ধরণের মধ্যে প্রাচুর্যের উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি দেখিয়েছে এবং সকলের প্রভাবে উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন দেখা গেছে (পরিপূরক সারণী ৬)। প্রাচুর্যের উল্লেখযোগ্য পার্থক্য সহ চিহ্নিত সমস্ত PPA বিপাককারী PPA নমুনায় বেশি পরিমাণে ছিল। প্রজাতি-স্তরের শ্রেণীবিভাগে এমন কিছু বংশের প্রতিনিধি প্রকাশ পেয়েছে যারা নমুনা ধরণের মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে পার্থক্য করেনি, যার মধ্যে রয়েছে বেশ কয়েকটি ব্যাকটেরয়েড এবং রুমিনোকক্কাস প্রজাতি, সেইসাথে ডানকানিয়া ডুবোইস, মাইক্সোব্যাকটেরিয়াম এন্টেরিকা, মনোকোকাস পেকটিনোলাইটিকাস এবং অ্যালকালিজেনেস পলিমর্ফা। PPA-উৎপাদনকারী ব্যাকটেরিয়ার মধ্যে, চারটি ব্যাকটেরিয়া নমুনা ধরণের মধ্যে প্রাচুর্যের উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখিয়েছে। প্রাচুর্যের উল্লেখযোগ্য পার্থক্য সহ প্রজাতির মধ্যে রয়েছে ব্যাকটেরয়েডস নোভোরোসি, ডানকানিয়া ডুবোইস, মাইক্সোব্যাকটেরিয়াম এন্টেরিটিডিস এবং রুমিনোকক্কাস বোভিস।
এই গবেষণায়, আমরা ইঁদুরের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটার উপর PPA এক্সপোজারের প্রভাব পরীক্ষা করেছি। PPA ব্যাকটেরিয়াতে বিভিন্ন প্রতিক্রিয়া সৃষ্টি করতে পারে কারণ এটি নির্দিষ্ট প্রজাতি দ্বারা উত্পাদিত হয়, অন্যান্য প্রজাতি খাদ্য উৎস হিসেবে ব্যবহৃত হয়, অথবা এর অ্যান্টিমাইক্রোবিয়াল প্রভাব রয়েছে। অতএব, খাদ্যতালিকাগত পরিপূরকের মাধ্যমে অন্ত্রের পরিবেশে এর সংযোজন সহনশীলতা, সংবেদনশীলতা এবং পুষ্টির উৎস হিসেবে এটি ব্যবহারের ক্ষমতার উপর নির্ভর করে বিভিন্ন প্রভাব ফেলতে পারে। সংবেদনশীল ব্যাকটেরিয়া প্রজাতিগুলিকে নির্মূল করা যেতে পারে এবং PPA-এর প্রতি বেশি প্রতিরোধী বা খাদ্য উৎস হিসেবে এটি ব্যবহার করতে সক্ষম এমন প্রজাতি দ্বারা প্রতিস্থাপিত করা যেতে পারে, যার ফলে অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটার গঠনে পরিবর্তন আসে। আমাদের ফলাফলগুলি অণুজীবের গঠনে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য প্রকাশ করেছে কিন্তু সামগ্রিক অণুজীবের বৈচিত্র্যের উপর কোনও প্রভাব ফেলেনি। প্রজাতি স্তরে সবচেয়ে বড় প্রভাব পরিলক্ষিত হয়েছে, PPA এবং নিয়ন্ত্রণ নমুনার মধ্যে 70 টিরও বেশি ট্যাক্সার প্রাচুর্য উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন (পরিপূরক সারণী 2)। PPA-উন্মুক্ত নমুনার গঠনের আরও মূল্যায়ন অপ্রকাশিত নমুনার তুলনায় অণুজীবের প্রজাতির বৃহত্তর বৈচিত্র্য প্রকাশ করেছে, যা পরামর্শ দেয় যে PPA ব্যাকটেরিয়ার বৃদ্ধির বৈশিষ্ট্যগুলিকে উন্নত করতে পারে এবং PPA-সমৃদ্ধ পরিবেশে টিকে থাকতে পারে এমন ব্যাকটেরিয়ার জনসংখ্যা সীমিত করতে পারে। সুতরাং, পিপিএ অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটা বৈচিত্র্যের ব্যাপক ব্যাঘাত ঘটানোর পরিবর্তে বেছে বেছে পরিবর্তন আনতে পারে।
PPA-এর মতো খাদ্য সংরক্ষণকারী পদার্থগুলি পূর্বে সামগ্রিক বৈচিত্র্যকে প্রভাবিত না করেই অন্ত্রের মাইক্রোবায়োম উপাদানগুলির প্রাচুর্য পরিবর্তন করতে দেখা গেছে (নাগপাল এট আল।, ২০২১)। এখানে, আমরা ব্যাকটেরয়েডেটস (পূর্বে ব্যাকটেরয়েডেটস নামে পরিচিত) পর্বের মধ্যে ব্যাকটেরয়েডেট প্রজাতির মধ্যে সবচেয়ে আকর্ষণীয় পার্থক্য লক্ষ্য করেছি, যা PPA-সংস্পর্শে আসা ইঁদুরগুলিতে উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ হয়েছিল। ব্যাকটেরয়েড প্রজাতির বর্ধিত প্রাচুর্য শ্লেষ্মা ক্ষয় বৃদ্ধির সাথে সম্পর্কিত, যা সংক্রমণের ঝুঁকি বাড়াতে পারে এবং প্রদাহকে বাড়িয়ে তুলতে পারে (কর্নিক এট আল।, ২০১৫; দেশাই এট আল।, ২০১৬; পেনজল এট আল।, ২০১৯)। একটি গবেষণায় দেখা গেছে যে ব্যাকটেরয়েডস ফ্র্যাজিলিস দিয়ে চিকিৎসা করা নবজাতক পুরুষ ইঁদুরগুলি অটিজম স্পেকট্রাম ডিসঅর্ডার (ASD) (কারমেল এট আল।, ২০২৩) এর মতো সামাজিক আচরণ প্রদর্শন করেছিল এবং অন্যান্য গবেষণায় দেখা গেছে যে ব্যাকটেরয়েড প্রজাতিগুলি রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা পরিবর্তন করতে পারে এবং অটোইমিউন প্রদাহজনক কার্ডিওমায়োপ্যাথির দিকে পরিচালিত করতে পারে (গিল-ক্রুজ এট আল।, ২০১৯)। PPA-এর সংস্পর্শে আসা ইঁদুরগুলিতে Ruminococcus, Prevotella এবং Parabacteroides গণের অন্তর্ভুক্ত প্রজাতিগুলিও উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (Coretti et al., 2018)। কিছু Ruminococcus প্রজাতি প্রোইনফ্ল্যামেটরি সাইটোকাইন উৎপাদনের মাধ্যমে ক্রোনের রোগের মতো রোগের সাথে যুক্ত (Henke et al., 2019), যেখানে Prevotella humani-এর মতো প্রিভোটেলা প্রজাতি উচ্চ রক্তচাপ এবং ইনসুলিন সংবেদনশীলতার মতো বিপাকীয় রোগের সাথে যুক্ত (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017)। অবশেষে, আমরা দেখতে পেলাম যে Bacteroidetes (পূর্বে Firmicutes নামে পরিচিত) এবং Bacteroidetes-এর অনুপাত নিয়ন্ত্রণ ইঁদুরের তুলনায় PPA-সংস্পর্শে আসা ইঁদুরগুলিতে উল্লেখযোগ্যভাবে কম ছিল কারণ Bacteroidetes প্রজাতির মোট প্রাচুর্য বেশি ছিল। এই অনুপাতটি পূর্বে অন্ত্রের হোমিওস্ট্যাসিসের একটি গুরুত্বপূর্ণ সূচক হিসাবে দেখানো হয়েছে, এবং এই অনুপাতের ব্যাঘাত বিভিন্ন রোগের অবস্থার সাথে যুক্ত হয়েছে (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), যার মধ্যে প্রদাহজনক অন্ত্রের রোগ (Stojanov et al., 2020) অন্তর্ভুক্ত। সামগ্রিকভাবে, ব্যাকটেরয়েডেটস পর্বের প্রজাতিগুলি খাদ্যতালিকাগত PPA বৃদ্ধির দ্বারা সবচেয়ে বেশি প্রভাবিত বলে মনে হয়। এটি PPA-এর প্রতি উচ্চতর সহনশীলতা বা শক্তির উৎস হিসাবে PPA ব্যবহার করার ক্ষমতার কারণে হতে পারে, যা কমপক্ষে একটি প্রজাতির জন্য সত্য বলে প্রমাণিত হয়েছে, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022)। বিকল্পভাবে, মাতৃ PPA এক্সপোজার ইঁদুরের বংশধরদের অন্ত্রকে ব্যাকটেরয়েডেটস উপনিবেশের জন্য আরও সংবেদনশীল করে ভ্রূণের বিকাশকে উন্নত করতে পারে; তবে, আমাদের গবেষণার নকশা এই ধরনের মূল্যায়নের অনুমতি দেয়নি।
মেটাজেনমিক কন্টেন্ট মূল্যায়নে PPA বিপাক এবং উৎপাদনের সাথে সম্পর্কিত জিনের প্রাচুর্যের মধ্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখা গেছে, যেখানে PPA-সংস্পর্শিত ইঁদুরগুলিতে PPA উৎপাদনের জন্য দায়ী জিনের প্রাচুর্য বেশি ছিল, যেখানে PPA-সংস্পর্শিত নয় এমন ইঁদুরগুলিতে PAA বিপাকের জন্য দায়ী জিনের প্রাচুর্য বেশি ছিল (চিত্র 6)। এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে মাইক্রোবিয়াল গঠনের উপর PPA-এর প্রভাব কেবল এর ব্যবহারের কারণে নাও হতে পারে, অন্যথায় PPA বিপাকের সাথে যুক্ত জিনের প্রাচুর্য PPA-সংস্পর্শিত ইঁদুরের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমে উচ্চ প্রাচুর্য দেখানো উচিত ছিল। একটি ব্যাখ্যা হল যে PPA ব্যাকটেরিয়ার প্রাচুর্যকে প্রাথমিকভাবে তার অ্যান্টিমাইক্রোবিয়াল প্রভাবের মাধ্যমে মধ্যস্থতা করে, ব্যাকটেরিয়া দ্বারা পুষ্টি হিসাবে ব্যবহারের মাধ্যমে নয়। পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে PPA ডোজ-নির্ভর পদ্ধতিতে সালমোনেলা টাইফিমুরিয়ামের বৃদ্ধিকে বাধা দেয় (জ্যাকবসন এবং অন্যান্য, 2018)। PPA-এর উচ্চ ঘনত্বের সংস্পর্শে এমন ব্যাকটেরিয়া নির্বাচন করতে পারে যা এর অ্যান্টিমাইক্রোবিয়াল বৈশিষ্ট্যের প্রতি প্রতিরোধী এবং অগত্যা এটি বিপাক বা উৎপাদন করতে সক্ষম নাও হতে পারে। উদাহরণস্বরূপ, বেশ কয়েকটি প্যারাব্যাকটেরয়েড প্রজাতির PPA নমুনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি প্রাচুর্য দেখা গেছে, কিন্তু PPA বিপাক বা উৎপাদনের সাথে সম্পর্কিত কোনও জিন সনাক্ত করা যায়নি (পরিপূরক সারণী 2, 4, এবং 5)। তদুপরি, ফার্মেন্টেশন উপজাত হিসাবে PPA উৎপাদন বিভিন্ন ব্যাকটেরিয়ার মধ্যে ব্যাপকভাবে বিতরণ করা হয় (গঞ্জালেজ-গার্সিয়া এট আল।, 2017)। নিয়ন্ত্রণ নমুনায় PPA বিপাকের সাথে সম্পর্কিত জিনের উচ্চ প্রাচুর্যের কারণ উচ্চতর ব্যাকটেরিয়া বৈচিত্র্য হতে পারে (Averina এট আল।, 2020)। তদুপরি, 1332 জিনের মধ্যে মাত্র 27 (2.14%) PPA বিপাকের সাথে একচেটিয়াভাবে যুক্ত জিন বলে পূর্বাভাস দেওয়া হয়েছিল। PPA বিপাকের সাথে যুক্ত অনেক জিন অন্যান্য বিপাকীয় পথগুলিতেও জড়িত। এটি আরও প্রমাণ করে যে নিয়ন্ত্রণ নমুনায় PPA বিপাকের সাথে জড়িত জিনের প্রাচুর্য বেশি ছিল; এই জিনগুলি এমন পথে কাজ করতে পারে যেখানে PPA ব্যবহার বা উপজাত হিসাবে গঠন হয় না। এই ক্ষেত্রে, PPA প্রজন্মের সাথে যুক্ত শুধুমাত্র একটি জিন নমুনা ধরণের মধ্যে প্রাচুর্যের মধ্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখিয়েছে। PPA বিপাকের সাথে সম্পর্কিত জিনের বিপরীতে, PPA উৎপাদনের জন্য মার্কার জিন নির্বাচন করা হয়েছিল কারণ তারা PPA উৎপাদনের ব্যাকটেরিয়া পথের সাথে সরাসরি জড়িত। PPA-সংস্পর্শে আসা ইঁদুরগুলিতে, সমস্ত প্রজাতির PPA উৎপাদনের প্রাচুর্য এবং ক্ষমতা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে বলে দেখা গেছে। এটি এই ভবিষ্যদ্বাণীকে সমর্থন করে যে PPA PPA উৎপাদকদের নির্বাচন করবে এবং তাই PPA উৎপাদন ক্ষমতা বৃদ্ধি পাবে বলে ভবিষ্যদ্বাণী করে। যাইহোক, জিনের প্রাচুর্য অগত্যা জিন প্রকাশের সাথে সম্পর্কিত নয়; অতএব, যদিও নিয়ন্ত্রণ নমুনায় PPA বিপাকের সাথে সম্পর্কিত জিনের প্রাচুর্য বেশি, প্রকাশের হার ভিন্ন হতে পারে (Shi et al., 2014)। PPA উৎপাদনকারী জিনের ব্যাপকতা এবং PPA উৎপাদনের মধ্যে সম্পর্ক নিশ্চিত করার জন্য, PPA উৎপাদনে জড়িত জিনের প্রকাশের অধ্যয়ন প্রয়োজন।
PPA এবং নিয়ন্ত্রণ মেটাজিনোমের কার্যকরী টীকা কিছু পার্থক্য প্রকাশ করেছে। জিনের বিষয়বস্তুর PCA বিশ্লেষণ PPA এবং নিয়ন্ত্রণ নমুনার মধ্যে বিচ্ছিন্ন ক্লাস্টার প্রকাশ করেছে (চিত্র 5)। নমুনার ভিতরে ক্লাস্টারিং প্রকাশ করেছে যে নিয়ন্ত্রণ জিনের বিষয়বস্তু আরও বৈচিত্র্যময় ছিল, যখন PPA নমুনাগুলি একসাথে ক্লাস্টার করা হয়েছিল। জিনের বিষয়বস্তু অনুসারে ক্লাস্টারিং প্রজাতির গঠন অনুসারে ক্লাস্টারিংয়ের সাথে তুলনীয় ছিল। সুতরাং, পথের প্রাচুর্যের পার্থক্য নির্দিষ্ট প্রজাতি এবং তাদের মধ্যে স্ট্রেনের প্রাচুর্যের পরিবর্তনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। PPA নমুনাগুলিতে, উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি প্রাচুর্য সহ দুটি পথ অ্যামিনোসুগার/নিউক্লিওটাইড চিনির বিপাক (ko:K21279) এবং একাধিক লিপিড বিপাক পথ (ko:K00647, ko:K03801; পরিপূরক সারণী 3) এর সাথে সম্পর্কিত ছিল। ko:K21279 এর সাথে যুক্ত জিনগুলি ব্যাকটেরয়েডস গণের সাথে যুক্ত বলে জানা যায়, যা PPA নমুনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি সংখ্যক প্রজাতির বংশের একটি। এই এনজাইম ক্যাপসুলার পলিস্যাকারাইড প্রকাশ করে রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা এড়াতে পারে (ওয়াং এট আল., 2008)। এটি PPA-সংস্পর্শে আসা ইঁদুরগুলিতে ব্যাকটেরয়েডের বৃদ্ধির জন্য দায়ী হতে পারে। এটি PPA মাইক্রোবায়োমে পরিলক্ষিত বর্ধিত ফ্যাটি অ্যাসিড সংশ্লেষণের পরিপূরক। ব্যাকটেরিয়া ফ্যাটি অ্যাসিড তৈরির জন্য FASIIko:K00647 (fabB) পথ ব্যবহার করে, যা হোস্ট বিপাকীয় পথগুলিকে প্রভাবিত করতে পারে (Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020), এবং লিপিড বিপাকের পরিবর্তনগুলি স্নায়ুবিক বিকাশে ভূমিকা পালন করতে পারে (Yu et al., 2020)। PPA নমুনায় বর্ধিত প্রাচুর্য দেখানো আরেকটি পথ ছিল স্টেরয়েড হরমোন জৈব সংশ্লেষণ (ko:K12343)। ক্রমবর্ধমান প্রমাণ রয়েছে যে অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটার হরমোনের মাত্রাকে প্রভাবিত করার এবং হরমোন দ্বারা প্রভাবিত হওয়ার ক্ষমতার মধ্যে একটি বিপরীত সম্পর্ক রয়েছে, যেমন স্টেরয়েডের মাত্রা বৃদ্ধির ফলে নিম্নগামী স্বাস্থ্যের উপর প্রভাব পড়তে পারে (Tetel et al., 2018)।
এই গবেষণায় সীমাবদ্ধতা এবং বিবেচনার অভাব নেই। একটি গুরুত্বপূর্ণ পার্থক্য হল আমরা প্রাণীদের শারীরবৃত্তীয় মূল্যায়ন করিনি। অতএব, মাইক্রোবায়োমের পরিবর্তনগুলি কোনও রোগের সাথে সম্পর্কিত কিনা তা সরাসরি সিদ্ধান্তে পৌঁছানো সম্ভব নয়। আরেকটি বিবেচনা হল যে এই গবেষণায় ইঁদুরগুলিকে তাদের মায়েদের মতো একই খাবার খাওয়ানো হয়েছিল। ভবিষ্যতের গবেষণাগুলি নির্ধারণ করতে পারে যে PPA-সমৃদ্ধ খাদ্য থেকে PPA-মুক্ত খাদ্যে স্যুইচ করলে মাইক্রোবায়োমের উপর এর প্রভাব উন্নত হয় কিনা। আমাদের গবেষণার একটি সীমাবদ্ধতা, অন্য অনেকের মতো, সীমিত নমুনার আকার। যদিও বৈধ সিদ্ধান্ত নেওয়া যেতে পারে, ফলাফল বিশ্লেষণ করার সময় একটি বৃহত্তর নমুনার আকার বৃহত্তর পরিসংখ্যানগত শক্তি প্রদান করবে। আমরা অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমের পরিবর্তন এবং যেকোনো রোগের মধ্যে সম্পর্ক সম্পর্কে সিদ্ধান্ত নেওয়ার বিষয়েও সতর্ক থাকি (Yap et al., 2021)। বয়স, লিঙ্গ এবং খাদ্য সহ বিভ্রান্তিকর কারণগুলি অণুজীবের গঠনকে উল্লেখযোগ্যভাবে প্রভাবিত করতে পারে। এই কারণগুলি জটিল রোগের সাথে অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমের সংযোগ সম্পর্কিত সাহিত্যে পরিলক্ষিত অসঙ্গতিগুলি ব্যাখ্যা করতে পারে (জনসন et al., 2019; Lagod and Naser, 2023)। উদাহরণস্বরূপ, ASD আক্রান্ত প্রাণী এবং মানুষের মধ্যে ব্যাকটেরয়েডেটস গণের সদস্যদের বৃদ্ধি বা হ্রাস দেখানো হয়েছে (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017)। একইভাবে, প্রদাহজনক অন্ত্রের রোগে আক্রান্ত রোগীদের অন্ত্রের গঠনের গবেষণায় একই ট্যাক্সায় বৃদ্ধি এবং হ্রাস উভয়ই পাওয়া গেছে (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023)। লিঙ্গ পক্ষপাতের প্রভাব সীমিত করার জন্য, আমরা লিঙ্গের সমান প্রতিনিধিত্ব নিশ্চিত করার চেষ্টা করেছি যাতে পার্থক্যগুলি সম্ভবত খাদ্য দ্বারা পরিচালিত হয়। কার্যকরী টীকাকরণের একটি চ্যালেঞ্জ হল অপ্রয়োজনীয় জিন ক্রম অপসারণ। আমাদের জিন ক্লাস্টারিং পদ্ধতিতে 95% সিকোয়েন্স পরিচয় এবং 85% দৈর্ঘ্যের মিল, সেইসাথে মিথ্যা ক্লাস্টারিং দূর করার জন্য 90% অ্যালাইনমেন্ট কভারেজ প্রয়োজন। যাইহোক, কিছু ক্ষেত্রে, আমরা একই টীকা (যেমন, MUT) সহ COG পর্যবেক্ষণ করেছি (চিত্র 6)। এই অর্থলগগুলি স্বতন্ত্র কিনা, নির্দিষ্ট জেনারার সাথে সম্পর্কিত কিনা, নাকি এটি জিন ক্লাস্টারিং পদ্ধতির সীমাবদ্ধতা কিনা তা নির্ধারণের জন্য আরও গবেষণা প্রয়োজন। কার্যকরী টীকার আরেকটি সীমাবদ্ধতা হল সম্ভাব্য ভুল শ্রেণীবিভাগ; ​​ব্যাকটেরিয়া জিন mmdA প্রোপিওনেট সংশ্লেষণে জড়িত একটি পরিচিত এনজাইম, কিন্তু KEGG এটি প্রোপিওনেট বিপাকীয় পথের সাথে যুক্ত করে না। বিপরীতে, scpB এবং mmcD অর্থলগগুলি সম্পর্কিত। মনোনীত নকআউট ছাড়া বিপুল সংখ্যক জিন জিনের প্রাচুর্য মূল্যায়ন করার সময় PPA-সম্পর্কিত জিন সনাক্ত করতে অক্ষম হতে পারে। ভবিষ্যতের গবেষণাগুলি মেটাট্রান্সক্রিপ্টোম বিশ্লেষণ থেকে উপকৃত হবে, যা অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটার কার্যকরী বৈশিষ্ট্যগুলির গভীর ধারণা প্রদান করতে পারে এবং সম্ভাব্য নিম্ন প্রবাহের প্রভাবের সাথে জিনের প্রকাশকে সংযুক্ত করতে পারে। নির্দিষ্ট নিউরোডেভেলপমেন্টাল ডিসঅর্ডার বা প্রদাহজনক অন্ত্রের রোগ সম্পর্কিত গবেষণার জন্য, এই ব্যাধিগুলির সাথে মাইক্রোবায়োম গঠনের পরিবর্তনগুলিকে সংযুক্ত করার জন্য প্রাণীদের শারীরবৃত্তীয় এবং আচরণগত মূল্যায়ন প্রয়োজন। অন্ত্রের মাইক্রোবায়োমকে জীবাণুমুক্ত ইঁদুরে প্রতিস্থাপনের অতিরিক্ত গবেষণাও মাইক্রোবায়োম রোগের চালিকাশক্তি বা বৈশিষ্ট্য কিনা তা নির্ধারণ করতে কার্যকর হবে।
সংক্ষেপে, আমরা দেখিয়েছি যে খাদ্যতালিকাগত PPA অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটার গঠন পরিবর্তনের একটি কারণ হিসেবে কাজ করে। PPA হল একটি FDA-অনুমোদিত প্রিজারভেটিভ যা বিভিন্ন খাবারে ব্যাপকভাবে পাওয়া যায়, যা দীর্ঘমেয়াদী সংস্পর্শে এলে স্বাভাবিক অন্ত্রের উদ্ভিদের ব্যাঘাত ঘটাতে পারে। আমরা বেশ কয়েকটি ব্যাকটেরিয়ার প্রাচুর্যে পরিবর্তন পেয়েছি, যা পরামর্শ দেয় যে PPA অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটার গঠনকে প্রভাবিত করতে পারে। মাইক্রোবায়োটার পরিবর্তনের ফলে নির্দিষ্ট বিপাকীয় পথের স্তরে পরিবর্তন আসতে পারে, যা হোস্ট স্বাস্থ্যের সাথে প্রাসঙ্গিক শারীরবৃত্তীয় পরিবর্তন আনতে পারে। মাইক্রোবায়াল গঠনের উপর খাদ্যতালিকাগত PPA এর প্রভাব ডিসবায়োসিস বা অন্যান্য রোগের কারণ হতে পারে কিনা তা নির্ধারণের জন্য আরও গবেষণা প্রয়োজন। এই গবেষণাটি অন্ত্রের গঠনের উপর PPA এর প্রভাব কীভাবে মানুষের স্বাস্থ্যের উপর প্রভাব ফেলতে পারে সে সম্পর্কে ভবিষ্যতের গবেষণার ভিত্তি স্থাপন করে।
এই গবেষণায় উপস্থাপিত ডেটাসেটগুলি অনলাইন সংগ্রহস্থলে পাওয়া যাবে। সংগ্রহস্থলের নাম এবং প্রবেশাধিকার নম্বর হল: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431।
এই প্রাণী গবেষণাটি সেন্ট্রাল ফ্লোরিডা বিশ্ববিদ্যালয়ের ইনস্টিটিউশনাল অ্যানিমেল কেয়ার অ্যান্ড ইউজ কমিটি (UCF-IACUC) (পশু ব্যবহারের অনুমতি নম্বর: PROTO202000002) দ্বারা অনুমোদিত হয়েছে। এই গবেষণাটি স্থানীয় আইন, বিধি এবং প্রাতিষ্ঠানিক প্রয়োজনীয়তা মেনে চলে।
NG: ধারণাকরণ, তথ্য সংগ্রহ, আনুষ্ঠানিক বিশ্লেষণ, তদন্ত, পদ্ধতি, সফ্টওয়্যার, ভিজ্যুয়ালাইজেশন, লেখা (মূল খসড়া), লেখা (পর্যালোচনা এবং সম্পাদনা)। LA: ধারণাকরণ, তথ্য সংগ্রহ, পদ্ধতি, সম্পদ, লেখা (পর্যালোচনা এবং সম্পাদনা)। SH: আনুষ্ঠানিক বিশ্লেষণ, সফ্টওয়্যার, লেখা (পর্যালোচনা এবং সম্পাদনা)। SA: তদন্ত, লেখা (পর্যালোচনা এবং সম্পাদনা)। প্রধান বিচারক: তদন্ত, লেখা (পর্যালোচনা এবং সম্পাদনা)। SN: ধারণাকরণ, প্রকল্প প্রশাসন, সম্পদ, তত্ত্বাবধান, লেখা (পর্যালোচনা এবং সম্পাদনা)। TA: ধারণাকরণ, প্রকল্প প্রশাসন, তত্ত্বাবধান, লেখা (পর্যালোচনা এবং সম্পাদনা)।
লেখকরা ঘোষণা করেছেন যে তারা এই প্রবন্ধের গবেষণা, লেখকত্ব এবং/অথবা প্রকাশনার জন্য কোনও আর্থিক সহায়তা পাননি।
লেখকরা ঘোষণা করেছেন যে গবেষণাটি এমন কোনও বাণিজ্যিক বা আর্থিক সম্পর্কের অনুপস্থিতিতে পরিচালিত হয়েছিল যা সম্ভাব্য স্বার্থের দ্বন্দ্ব হিসাবে ব্যাখ্যা করা যেতে পারে। প্রযোজ্য নয়।
এই প্রবন্ধে প্রকাশিত সমস্ত মতামত কেবল লেখকদের নিজস্ব এবং অগত্যা তাদের প্রতিষ্ঠান, প্রকাশক, সম্পাদক বা পর্যালোচকদের মতামত প্রতিফলিত করে না। এই প্রবন্ধে মূল্যায়ন করা কোনও পণ্য, অথবা তাদের নির্মাতাদের দ্বারা করা কোনও দাবি, প্রকাশক দ্বারা গ্যারান্টিযুক্ত বা অনুমোদিত নয়।
এই প্রবন্ধের জন্য সম্পূরক উপাদান অনলাইনে পাওয়া যাবে: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
আবদেলি এলএস, সামসাম এ, নাসের এসএ (২০১৯)। প্রোপায়োনিক অ্যাসিড অটিজম স্পেকট্রাম ডিসঅর্ডারে PTEN/AKT পথ নিয়ন্ত্রণ করে গ্লাইওসিস এবং নিউরোইনফ্লেমেশনকে প্ররোচিত করে। বৈজ্ঞানিক প্রতিবেদন ৯, ৮৮২৪–৮৮২৪। doi: ১০.১০৩৮/s৪১৫৯৮-০১৯-৪৫৩৪৮-জেড
আইচিসন, জে. (১৯৮২)। রচনাগত তথ্যের পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ। জেআর স্ট্যাট সোক সার্ বি মেথডল। ৪৪, ১৩৯–১৬০। doi: ১০.১১১১/j.২৫১৭-৬১৬১.১৯৮২.tb01195.x
আহন জে, কোওন এইচ, কিম ওয়াইজে (২০২৩)। স্তন ক্যান্সারের ঝুঁকির কারণ হিসেবে ফার্মিকিউট/ব্যাকটেরয়েডেট অনুপাত। জার্নাল অফ ক্লিনিক্যাল মেডিসিন, ১২, ২২১৬। doi: ১০.৩৩৯০/jcm১২০৬২২১৬
অ্যান্ডার্স এস., হুবার ডব্লিউ. (২০১০)। সিকোয়েন্স কাউন্ট ডেটার ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ। ন্যাট পূর্ববর্তী ১-১, ১-১০। doi: ১০.১০৩৮/npre.২০১০.৪২৮২.১
অ্যাঞ্জেলিস, এমডি, পিকোলো, এম., ভ্যানিনি, এল., সিরাগুসা, এস., গিয়াকোমো, এডি, সেরাজানেত্তি, ডিআই, এট আল. (২০১৩)। অটিজম এবং ব্যাপক বিকাশজনিত ব্যাধিযুক্ত শিশুদের মধ্যে মল মাইক্রোবায়োটা এবং বিপাক অন্যথায় নির্দিষ্ট করা হয়নি। PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
অ্যাভেরিনা ওভি, কোভতুন এএস, পলিয়াকোভা এসআই, সাভিলোভা এএম, রেব্রিকভ ডিভি, ড্যানিলেনকো ভিএন (২০২০)। অটিজম স্পেকট্রাম ডিসঅর্ডারে আক্রান্ত ছোট বাচ্চাদের অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটার ব্যাকটেরিয়াল নিউরোমেটাবলিক বৈশিষ্ট্য। জার্নাল অফ মেডিকেল মাইক্রোবায়োলজি ৬৯, ৫৫৮–৫৭১। doi: ১০.১০৯৯/jmm.০.০০১১৭৮
বাকুয়েরো এফ., নোম্বেলা কে. (২০১২)। মানব অঙ্গ হিসেবে মাইক্রোবায়োম। ক্লিনিক্যাল মাইক্রোবায়োলজি এবং সংক্রমণ ১৮, ২–৪। doi: ১০.১১১১/j.১৪৬৯-০৬৯১.২০১২.০৩৯১৬.x
বাউর টি., ডুর পি. (২০২৩)। প্রোপিওনিক অ্যাসিড-উৎপাদনকারী ব্যাকটেরিয়ার শারীরবিদ্যা সম্পর্কে নতুন অন্তর্দৃষ্টি: অ্যানারোটিগনাম প্রোপিওনিকাম এবং অ্যানারোটিগনাম নিওপ্রোপিওনিকাম (পূর্বে ক্লোস্ট্রিডিয়াম প্রোপিওনিকাম এবং ক্লোস্ট্রিডিয়াম নিওপ্রোপিওনিকাম)। অণুজীব ১১, ৬৮৫। doi: ১০.৩৩৯০/অণুজীব ১১০৩০৬৮৫
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004)। মায়ের পুষ্টি এবং ভ্রূণের বিকাশ। জে নুতর। 134, 2169-2172। doi: 10.1093/jn/134.9.2169
বেঞ্জামিনি, ওয়াই., এবং হোচবার্গ, জে. (১৯৯৫)। মিথ্যা-পজিটিভ হার নিয়ন্ত্রণ: একাধিক পরীক্ষার জন্য একটি ব্যবহারিক এবং দক্ষ পদ্ধতি। জেআর স্ট্যাট সোক সার্ বি মেথডল। ৫৭, ২৮৯–৩০০। doi: ১০.১১১১/j.২৫১৭-৬১৬১.১৯৯৫.tb02031.x