ইমিউনোমডুলেটরি মেটাবোলাইট হলো টিউমার মাইক্রোএনভায়রনমেন্ট (TME)-এর একটি প্রধান বৈশিষ্ট্য, কিন্তু কিছু ব্যতিক্রম ছাড়া এদের পরিচয় মূলত অজানাই থেকে যায়। এখানে, আমরা হাই-গ্রেড সেরাস কার্সিনোমা (HGSC) রোগীদের টিউমার এবং অ্যাসাইটিস থেকে টিউমার ও টি কোষ বিশ্লেষণ করেছি, যাতে TME-এর এই বিভিন্ন অংশের মেটাবোলোম উন্মোচন করা যায়। অ্যাসাইটিস এবং টিউমার কোষের মেটাবোলাইটে ব্যাপক পার্থক্য রয়েছে। অ্যাসাইটিসের তুলনায়, টিউমারে অনুপ্রবেশকারী টি কোষে ১-মিথাইলনিকোটিনামাইড (MNA) উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি থাকে। যদিও টি কোষে MNA-এর মাত্রা বেশি, নিকোটিনামাইড এন-মিথাইলট্রান্সফারেজ (একটি এনজাইম যা এস-অ্যাডেনোসাইলমিথিওনিন থেকে নিকোটিনামাইডে মিথাইল গ্রুপ স্থানান্তরের অনুঘটক হিসেবে কাজ করে) এর প্রকাশ ফাইব্রোব্লাস্ট এবং টিউমার কোষের মধ্যেই সীমাবদ্ধ। কার্যকারিতার দিক থেকে, MNA টি কোষকে টিউমার-বর্ধক সাইটোকাইন টিউমার নেক্রোসিস ফ্যাক্টর আলফা নিঃসরণ করতে প্ররোচিত করে। অতএব, TME থেকে প্রাপ্ত MNA টি কোষের ইমিউন নিয়ন্ত্রণে অবদান রাখে এবং মানুষের ক্যান্সারের চিকিৎসার জন্য একটি সম্ভাব্য ইমিউনোথেরাপি লক্ষ্যবস্তু হিসেবে বিবেচিত হতে পারে।
টিউমার থেকে উৎপন্ন মেটাবোলাইটগুলি টিউমার-বিরোধী অনাক্রম্যতার উপর একটি গভীর প্রতিরোধমূলক প্রভাব ফেলতে পারে, এবং ক্রমবর্ধমান প্রমাণ দেখাচ্ছে যে এগুলি রোগের অগ্রগতির জন্য একটি মূল চালিকা শক্তি হিসাবেও কাজ করতে পারে (1)। ওয়ারবার্গ প্রভাব ছাড়াও, সাম্প্রতিক গবেষণা টিউমার কোষের বিপাকীয় অবস্থা এবং টিউমার মাইক্রোএনভায়রনমেন্টের (TME) অনাক্রম্য অবস্থার সাথে এর সম্পর্ককে চিহ্নিত করতে শুরু করেছে। ইঁদুরের মডেল এবং মানুষের টি কোষের উপর গবেষণায় দেখা গেছে যে গ্লুটামিন বিপাক (2), জারণ বিপাক (3) এবং গ্লুকোজ বিপাক (4) বিভিন্ন অনাক্রম্য কোষের উপগোষ্ঠীর উপর স্বাধীনভাবে কাজ করতে পারে। এই পথগুলির বেশ কয়েকটি মেটাবোলাইট টি কোষের টিউমার-বিরোধী কার্যকারিতাকে বাধা দেয়। এটি প্রমাণিত হয়েছে যে কোএনজাইম টেট্রাহাইড্রোবায়োপটেরিন (BH4) এর অবরোধ টি কোষের বিস্তারকে ক্ষতিগ্রস্ত করতে পারে, এবং শরীরে BH4 এর বৃদ্ধি CD4 এবং CD8 দ্বারা মধ্যস্থতাকৃত টিউমার-বিরোধী অনাক্রম্য প্রতিক্রিয়া বাড়াতে পারে। এছাড়াও, BH4 প্রয়োগের মাধ্যমে কাইনুরেনিনের অনাক্রম্যতা দমনকারী প্রভাব থেকে মুক্তি পাওয়া যেতে পারে (5)। আইসোসাইট্রেট ডিহাইড্রোজিনেজ (IDH) মিউট্যান্ট গ্লিওব্লাস্টোমায়, এনান্টিওমেটাবলিক (R)-2-হাইড্রোক্সিগ্লুটারেট (R-2-HG) এর নিঃসরণ টি কোষের সক্রিয়করণ, বিস্তার এবং সাইটোলাইসিস ক্রিয়াকলাপকে বাধা দেয় (6)। সম্প্রতি, এটি দেখানো হয়েছে যে মিথাইলগ্লাইঅক্সাল, গ্লাইকোলাইসিসের একটি উপজাত, মায়েলয়েড উৎসের সাপ্রেসর কোষ দ্বারা উৎপাদিত হয়, এবং মিথাইলগ্লাইঅক্সালের টি কোষ স্থানান্তর ইফেক্টর টি কোষের কার্যকারিতাকে বাধা দিতে পারে। চিকিৎসায়, মিথাইলগ্লাইঅক্সালের নিষ্ক্রিয়করণ মায়েলয়েড-উদ্ভূত সাপ্রেসর কোষের (MDSC) ক্রিয়াকলাপকে অতিক্রম করতে পারে এবং মাউস মডেলে চেকপয়েন্ট ব্লকেড থেরাপিকে সিনারজিস্টিকভাবে উন্নত করতে পারে (7)। এই গবেষণাগুলি সম্মিলিতভাবে টি কোষের কার্যকারিতা এবং ক্রিয়াকলাপ নিয়ন্ত্রণে TME-উদ্ভূত মেটাবোলাইটগুলির মূল ভূমিকার উপর জোর দেয়।
ডিম্বাশয়ের ক্যান্সারে টি কোষের কর্মহীনতা ব্যাপকভাবে পরিলক্ষিত হয়েছে (8)। ​​এর আংশিক কারণ হলো হাইপোক্সিয়া এবং অস্বাভাবিক টিউমার ভাস্কুলাচারের (9) অন্তর্নিহিত বিপাকীয় বৈশিষ্ট্য, যার ফলে গ্লুকোজ এবং ট্রিপটোফ্যান ল্যাকটিক অ্যাসিড এবং কাইনুরেনিনের মতো উপজাত পদার্থে রূপান্তরিত হয়। অতিরিক্ত বহিঃকোষীয় ল্যাকটেট ইন্টারফেরন-γ (IFN-γ) এর উৎপাদন হ্রাস করে এবং মায়েলোসাপ্রেসিভ উপগোষ্ঠীগুলির পার্থক্যকরণকে চালিত করে (10, 11)। ট্রিপটোফ্যানের ব্যবহার সরাসরি টি কোষের বিস্তারকে বাধা দেয় এবং টি কোষ রিসেপ্টর সংকেতকে বাধা দেয় (12-14)। এই পর্যবেক্ষণগুলি সত্ত্বেও, রোগ প্রতিরোধ ব্যবস্থার বিপাক সম্পর্কিত বেশিরভাগ কাজ অপ্টিমাইজড মিডিয়া ব্যবহার করে ইন ভিট্রো টি কোষ কালচারে করা হয়েছে, অথবা ইন ভিভোতে সমজাতীয় ইঁদুরের মডেলের মধ্যে সীমাবদ্ধ ছিল, যার কোনোটিই মানুষের ক্যান্সার এবং শারীরবৃত্তীয় ম্যাক্রো ও মাইক্রো পরিবেশের ভিন্নতাকে সম্পূর্ণরূপে প্রতিফলিত করে না।
ডিম্বাশয়ের ক্যান্সারের একটি সাধারণ বৈশিষ্ট্য হলো পেরিটোনিয়াল বিস্তার এবং অ্যাসাইটিসের উপস্থিতি। অ্যাসাইটিসে কোষীয় তরলের জমা হওয়া রোগের উন্নত পর্যায় এবং খারাপ পূর্বাভাসের সাথে সম্পর্কিত (15)। প্রতিবেদন অনুসারে, এই অনন্য প্রকোষ্ঠটি হাইপোক্সিক, এতে উচ্চ মাত্রার ভাস্কুলার এন্ডোথেলিয়াল গ্রোথ ফ্যাক্টর (VEGF) এবং ইন্ডোলঅ্যামাইন 2,3-ডাইঅক্সিজিনেজ (IDO) থাকে এবং এটি টি রেগুলেটরি কোষ এবং মায়েলয়েড ইনহিবিটরি কোষ দ্বারা অনুপ্রবেশিত হয় (15-18)। অ্যাসাইটিসের বিপাকীয় পরিবেশ টিউমারের নিজস্ব পরিবেশ থেকে ভিন্ন হতে পারে, তাই পেরিটোনিয়াল স্থানে টি কোষের পুনঃপ্রোগ্রামিং অস্পষ্ট। এছাড়াও, অ্যাসাইটিস এবং টিউমার পরিবেশে উপস্থিত বিপাকগুলির মধ্যে মূল পার্থক্য এবং ভিন্নতা ইমিউন কোষের অনুপ্রবেশ এবং টিউমারে তাদের কার্যকারিতাকে বাধাগ্রস্ত করতে পারে এবং আরও গবেষণার প্রয়োজন।
এই সমস্যাগুলো সমাধানের জন্য, আমরা একটি সংবেদনশীল কোষ পৃথকীকরণ এবং লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি ট্যান্ডেম মাস স্পেকট্রোমেট্রি (LC-MS/MS) পদ্ধতি ডিজাইন করেছি। এর মাধ্যমে রোগীর একই অ্যাসাইটিস এবং টিউমার পরিবেশে থাকা বিভিন্ন ধরণের কোষ (CD4+ এবং CD8+ টি কোষ সহ) এবং টিউমারের অভ্যন্তরে ও আন্তঃকোষীয় মেটাবোলাইটগুলো অধ্যয়ন করা যায়। এই গুরুত্বপূর্ণ কোষগুচ্ছের বিপাকীয় অবস্থার একটি অত্যন্ত সুস্পষ্ট চিত্র প্রদানের জন্য আমরা এই পদ্ধতিটি হাই-ডাইমেনশনাল ফ্লো সাইটোমেট্রি এবং সিঙ্গেল-সেল আরএনএ সিকোয়েন্সিং (scRNA-seq)-এর সাথে একত্রে ব্যবহার করি। এই পদ্ধতিটি টিউমার টি কোষে ১-মিথাইলনিকোটিনামাইড (MNA)-এর মাত্রার একটি উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি প্রকাশ করেছে, এবং ইন ভিট্রো পরীক্ষায় দেখা গেছে যে টি কোষের কার্যকারিতার উপর MNA-এর ইমিউনোমডুলেটরি প্রভাব পূর্বে অজানা ছিল। সাধারণভাবে, এই পদ্ধতিটি টিউমার এবং ইমিউন কোষের মধ্যে পারস্পরিক বিপাকীয় মিথস্ক্রিয়া প্রকাশ করে এবং ইমিউন রেগুলেশন মেটাবোলাইট সম্পর্কে অনন্য অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে, যা টি কোষ-ভিত্তিক ওভারিয়ান ক্যান্সার ইমিউনোথেরাপি চিকিৎসার সুযোগের জন্য সহায়ক হতে পারে।
আমরা উচ্চ-মাত্রিক ফ্লো সাইটোমেট্রি ব্যবহার করে একই সাথে গ্লুকোজ গ্রহণ [2-(N-(7-নাইট্রোফেনাইল-2-অক্সা-1,3-ডায়াজা-4-yl)অ্যামিনো)-2-ডিঅক্সিগ্লুকোজ (2-NBDG)] এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) পরিমাপ করেছি, যা ইমিউন কোষ এবং টিউমার কোষের জনসংখ্যাকে আলাদা করার জন্য পাশাপাশি সাধারণ চিহ্নিতকারী (টেবিল S2 এবং চিত্র S1A)। এই বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে টি কোষের তুলনায়, অ্যাসাইটিস এবং টিউমার কোষের গ্লুকোজ গ্রহণের মাত্রা বেশি, কিন্তু মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপে পার্থক্য কম। টিউমার কোষের [CD45-EpCAM (EpCAM)+] গড় গ্লুকোজ গ্রহণ টি কোষের তুলনায় তিন থেকে চার গুণ বেশি, এবং CD4 + টি কোষের গড় গ্লুকোজ গ্রহণ CD8 + টি কোষের তুলনায় 1.2 গুণ বেশি, যা নির্দেশ করে যে একই TME-তে থাকা সত্ত্বেও টিউমার অনুপ্রবেশকারী লিম্ফোসাইট (TIL)-এর বিপাকীয় চাহিদা ভিন্ন (চিত্র 1A)। এর বিপরীতে, টিউমার কোষের মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ CD4 + T কোষের অনুরূপ, এবং উভয় প্রকার কোষের মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ CD8 + T কোষের চেয়ে বেশি (চিত্র 1B)। সাধারণভাবে, এই ফলাফলগুলো বিপাকীয় স্তর প্রকাশ করে। টিউমার কোষের বিপাকীয় কার্যকলাপ CD4 + T কোষের চেয়ে বেশি, এবং CD4 + T কোষের বিপাকীয় কার্যকলাপ CD8 + T কোষের চেয়ে বেশি। কোষের প্রকারভেদে এই প্রভাব থাকা সত্ত্বেও, টিউমারের তুলনায় অ্যাসাইটিসে CD4 + এবং CD8 + T কোষের বিপাকীয় অবস্থা বা তাদের আপেক্ষিক অনুপাতে কোনো ধারাবাহিক পার্থক্য নেই (চিত্র 1C)। এর বিপরীতে, CD45-কোষ অংশে, অ্যাসাইটিসের তুলনায় টিউমারে EpCAM+ কোষের অনুপাত বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 1D)। আমরা EpCAM+ এবং EpCAM- কোষ উপাদানগুলোর মধ্যে একটি স্পষ্ট বিপাকীয় পার্থক্যও পর্যবেক্ষণ করেছি। EpCAM+ (টিউমার) কোষগুলোর গ্লুকোজ গ্রহণ এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ EpCAM- কোষের চেয়ে বেশি, যা TME-তে টিউমার কোষের ফাইব্রোব্লাস্টের বিপাকীয় কার্যকলাপের চেয়ে অনেক বেশি (চিত্র 1, E এবং F)।
(A এবং B) গ্লুকোজ গ্রহণের (2-NBDG) মিডিয়ান ফ্লুরোসেন্স ইনটেনসিটি (MFI) (A) এবং CD4 + T কোষের মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ (MitoTracker গাঢ় লাল) (B) প্রতিনিধি গ্রাফ (বামে) এবং সারণিবদ্ধ ডেটা (ডানে), অ্যাসাইটিস এবং টিউমার থেকে প্রাপ্ত CD8 + T কোষ এবং EpCAM + CD45-টিউমার কোষ। (C) অ্যাসাইটিস এবং টিউমারে CD4 + এবং CD8 + কোষের (CD3 + T কোষের) অনুপাত। (D) অ্যাসাইটিস এবং টিউমারে EpCAM + টিউমার কোষের (CD45−) অনুপাত। (E এবং F) EpCAM + CD45-টিউমার এবং EpCAM-CD45-ম্যাট্রিক্সের গ্লুকোজ গ্রহণ (2-NBDG) (E) এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ (MitoTracker গাঢ় লাল) (F) প্রতিনিধি গ্রাফ (বামে) এবং সারণিবদ্ধ ডেটা (ডানে) অ্যাসাইটিস এবং টিউমার কোষ। (G) ফ্লো সাইটোমেট্রি দ্বারা CD25, CD137 এবং PD1 এক্সপ্রেশনের প্রতিনিধি গ্রাফ। (H এবং I) CD4 + T কোষ (H) এবং CD8 + T কোষ (I)-এর উপর CD25, CD137 এবং PD1-এর প্রকাশ। (J এবং K) CCR7 এবং CD45RO-এর প্রকাশের উপর ভিত্তি করে Naive, central memory (Tcm), effector (Teff) এবং effector memory (Tem) ফেনোটাইপ। অ্যাসাইটিস এবং টিউমারে CD4 + T কোষ (J) এবং CD8 + T কোষ (K)-এর প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র (বামে) এবং সারণিবদ্ধ তথ্য (ডানে)। জোড়বদ্ধ t-পরীক্ষার মাধ্যমে P-মান নির্ধারণ করা হয়েছে (*P<0.05, **P<0.01 এবং ***P<0.001)। রেখাটি মিলে যাওয়া রোগীদের (n = 6) প্রতিনিধিত্ব করে। FMO, ফ্লুরোসেন্স মাইনাস ওয়ান; MFI, মিডিয়ান ফ্লুরোসেন্স ইনটেনসিটি।
আরও বিশ্লেষণে অত্যন্ত সুনির্দিষ্ট টি কোষের ফিনোটাইপিক অবস্থার মধ্যে অন্যান্য উল্লেখযোগ্য পার্থক্য প্রকাশ পেয়েছে। টিউমারে সক্রিয় (চিত্র 1, G থেকে I) এবং ইফেক্টর মেমরি (চিত্র 1, J এবং K) কোষগুলি অ্যাসাইটিসের (CD3 + টি কোষের অনুপাত) তুলনায় অনেক বেশি। একইভাবে, অ্যাক্টিভেশন মার্কার (CD25 এবং CD137) এবং ডিপ্লেশন মার্কার [প্রোগ্রামড সেল ডেথ প্রোটিন 1 (PD1)] এর এক্সপ্রেশনের মাধ্যমে ফিনোটাইপ বিশ্লেষণ করে দেখা গেছে যে, যদিও এই পপুলেশনগুলির মেটাবলিক বৈশিষ্ট্য ভিন্ন (চিত্র S1, B থেকে E), কিন্তু নেভ, ইফেক্টর বা মেমরি সাবসেটগুলির মধ্যে ধারাবাহিকভাবে কোনও উল্লেখযোগ্য মেটাবলিক পার্থক্য পরিলক্ষিত হয়নি (চিত্র S1, F থেকে I)। এই ফলাফলগুলি মেশিন লার্নিং পদ্ধতি ব্যবহার করে স্বয়ংক্রিয়ভাবে কোষের ফিনোটাইপ নির্ধারণ করে নিশ্চিত করা হয়েছিল (21), যা রোগীর অ্যাসাইটিসে প্রচুর পরিমাণে অস্থিমজ্জার কোষের (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) উপস্থিতি প্রকাশ করে (চিত্র S2A)। শনাক্তকৃত সমস্ত কোষের প্রকারের মধ্যে, এই মায়েলয়েড কোষের গোষ্ঠীটি সর্বোচ্চ গ্লুকোজ গ্রহণ এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ দেখিয়েছে (চিত্র S2, B থেকে G)। এই ফলাফলগুলি HGSC রোগীদের অ্যাসাইটিস এবং টিউমারে পাওয়া একাধিক কোষের প্রকারের মধ্যে শক্তিশালী বিপাকীয় পার্থক্যকে তুলে ধরে।
টিউমার ইনফেকশন ইনহিবিটর (TIL)-এর মেটাবোনোমিক বৈশিষ্ট্য বোঝার প্রধান চ্যালেঞ্জ হলো টিউমার থেকে পর্যাপ্ত বিশুদ্ধতা, গুণমান এবং পরিমাণ সহ টি কোষের নমুনা আলাদা করার প্রয়োজনীয়তা। সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে ফ্লো সাইটোমেট্রির উপর ভিত্তি করে বাছাই এবং বিড সমৃদ্ধকরণ পদ্ধতি কোষীয় মেটাবোলাইট প্রোফাইলে পরিবর্তন আনতে পারে (22-24)। এই সমস্যাটি কাটিয়ে ওঠার জন্য, আমরা LC-MS/MS দ্বারা বিশ্লেষণের আগে অস্ত্রোপচারের মাধ্যমে অপসারণ করা মানুষের ডিম্বাশয়ের ক্যান্সার থেকে TIL আলাদা করার জন্য বিড সমৃদ্ধকরণ পদ্ধতিটি অপ্টিমাইজ করেছি (উপকরণ এবং পদ্ধতি দেখুন; চিত্র 2A)। মেটাবোলাইট পরিবর্তনের উপর এই প্রোটোকলের সামগ্রিক প্রভাব মূল্যায়ন করার জন্য, আমরা উপরের বিড পৃথকীকরণ ধাপের পরে সুস্থ দাতার দ্বারা সক্রিয় টি কোষের মেটাবোলাইট প্রোফাইলকে সেইসব কোষের সাথে তুলনা করেছি যেগুলিকে বিড দ্বারা পৃথক করা হয়নি কিন্তু বরফের উপর রাখা হয়েছিল। এই গুণমান নিয়ন্ত্রণ বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে এই দুটি অবস্থার মধ্যে একটি উচ্চ পারস্পরিক সম্পর্ক রয়েছে (r = 0.77), এবং 86টি মেটাবোলাইটের গোষ্ঠীর প্রযুক্তিগত পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা উচ্চ (চিত্র 2B)। অতএব, এই পদ্ধতিগুলো কোষের প্রকারভেদ সমৃদ্ধকরণের মধ্য দিয়ে যাওয়া কোষগুলোতে নির্ভুল মেটাবোলাইট বিশ্লেষণ করতে পারে, যার ফলে HGSC-তে নির্দিষ্ট মেটাবোলাইট শনাক্ত করার জন্য প্রথম উচ্চ-রেজোলিউশন প্ল্যাটফর্ম তৈরি হয় এবং এর মাধ্যমে কোষ-নির্দিষ্ট যৌন বিপাক কার্যক্রম সম্পর্কে গভীরতর ধারণা লাভ করা সম্ভব হয়।
(A) ম্যাগনেটিক বিড এনরিচমেন্টের স্কিম্যাটিক ডায়াগ্রাম। LC-MS/MS দ্বারা বিশ্লেষণের আগে, কোষগুলিকে পরপর তিন রাউন্ড ম্যাগনেটিক বিড এনরিচমেন্টের মধ্য দিয়ে নিয়ে যাওয়া হবে অথবা বরফের উপর রাখা হবে। (B) মেটাবোলাইটের প্রাচুর্যের উপর এনরিচমেন্টের ধরনের প্রভাব। প্রতিটি এনরিচমেন্টের ধরনের জন্য তিনটি পরিমাপের গড় ± SE। ধূসর রেখাটি একটি ১:১ সম্পর্ককে প্রতিনিধিত্ব করে। পুনরাবৃত্ত পরিমাপের ইন্ট্রা-ক্লাস কোরিলেশন (ICC) অক্ষের লেবেলে দেখানো হয়েছে। NAD, নিকোটিনামাইড অ্যাডেনিন ডাইনিউক্লিওটাইড। (C) রোগীর মেটাবোলাইট বিশ্লেষণের কার্যপ্রবাহের স্কিম্যাটিক ডায়াগ্রাম। রোগীদের থেকে অ্যাসাইটিস বা টিউমার সংগ্রহ করে ক্রায়োপ্রিজার্ভ করা হয়। প্রতিটি নমুনার একটি ছোট অংশ ফ্লো সাইটোমেট্রি দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল, যখন বাকি নমুনাগুলি CD4+, CD8+ এবং CD45- কোষের জন্য তিন রাউন্ড এনরিচমেন্টের মধ্য দিয়ে গিয়েছিল। এই কোষের অংশগুলি LC-MS/MS ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। (D) স্ট্যান্ডার্ডাইজড মেটাবোলাইট প্রাচুর্যের হিট ম্যাপ। ডেনড্রোগ্রামটি নমুনাগুলির মধ্যে ইউক্লিডিয়ান দূরত্বের ওয়ার্ডস ক্লাস্টারিং উপস্থাপন করে। (E) নমুনা মেটাবোলাইট ম্যাপের প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট অ্যানালাইসিস (PCA), যেখানে প্রতিটি নমুনার তিনটি প্রতিলিপি দেখানো হয়েছে, একই রোগীর নমুনাগুলো একটি রেখা দ্বারা সংযুক্ত। (F) রোগীর উপর শর্তযুক্ত নমুনার মেটাবোলাইট প্রোফাইলের PCA (অর্থাৎ, পার্শিয়াল রিডানডেন্সি ব্যবহার করে); নমুনার ধরণ কনভেক্স হাল দ্বারা সীমাবদ্ধ। PC1, প্রধান উপাদান ১; PC2, প্রধান উপাদান ২।
এরপর, আমরা ছয়জন HGSC রোগীর প্রাথমিক অ্যাসাইটিস এবং টিউমারের CD4+, CD8+ এবং CD45- কোষের অংশ থেকে ৯৯টি মেটাবোলাইট বিশ্লেষণ করার জন্য এই এনরিচমেন্ট পদ্ধতিটি প্রয়োগ করেছি (চিত্র 2C, চিত্র S3A এবং সারণি S3 ও S4)। কাঙ্ক্ষিত কোষের এই পপুলেশনটি জীবন্ত কোষের মূল বৃহৎ নমুনার ২% থেকে ৭০% পর্যন্ত হয়ে থাকে, এবং রোগীদের মধ্যে কোষের এই অনুপাত ব্যাপকভাবে পরিবর্তিত হয়। বিডগুলো আলাদা করার পর, কাঙ্ক্ষিত এনরিচড অংশটি (CD4+, CD8+ বা CD45-) গড়ে নমুনার সমস্ত জীবন্ত কোষের ৮৫%-এরও বেশি হয়ে থাকে। এই এনরিচমেন্ট পদ্ধতিটি আমাদের মানব টিউমার টিস্যুর মেটাবলিজম থেকে কোষের পপুলেশন বিশ্লেষণ করার সুযোগ দেয়, যা বৃহৎ নমুনা থেকে করা অসম্ভব। এই প্রোটোকল ব্যবহার করে, আমরা নির্ধারণ করেছি যে এল-কাইনুরেনিন এবং অ্যাডেনোসিন, এই দুটি সুপরিচিত ইমিউনোসাপ্রেসিভ মেটাবোলাইট, টিউমার টি কোষ বা টিউমার কোষে উচ্চ মাত্রায় উপস্থিত ছিল (চিত্র S3, B এবং C)। অতএব, এই ফলাফলগুলো রোগীর টিস্যুতে জৈবিকভাবে গুরুত্বপূর্ণ মেটাবোলাইট খুঁজে বের করার ক্ষেত্রে আমাদের কোষ বিভাজন এবং ভর বর্ণালিবীক্ষণ প্রযুক্তির নির্ভুলতা ও সক্ষমতা প্রমাণ করে।
আমাদের বিশ্লেষণে রোগীদের মধ্যে এবং রোগীদের নিজেদের মধ্যে কোষের প্রকারভেদের একটি শক্তিশালী বিপাকীয় বিভাজনও প্রকাশ পেয়েছে (চিত্র ২ডি এবং চিত্র এস৪এ)। বিশেষ করে, অন্যান্য রোগীদের তুলনায়, রোগী ৭০ ভিন্ন বিপাকীয় বৈশিষ্ট্য প্রদর্শন করেছেন (চিত্র ২ই এবং চিত্র এস৪বি), যা ইঙ্গিত করে যে রোগীদের মধ্যে যথেষ্ট বিপাকীয় ভিন্নতা থাকতে পারে। এটি লক্ষণীয় যে, অন্যান্য রোগীদের (১.২ থেকে ২ লিটার; সারণি এস১) তুলনায়, রোগী ৭০-এর ক্ষেত্রে সংগৃহীত অ্যাসাইটিসের মোট পরিমাণ (৮০ মিলি) কম ছিল। প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট অ্যানালাইসিসের সময় আন্তঃ-রোগী ভিন্নতার নিয়ন্ত্রণ (উদাহরণস্বরূপ, পার্শিয়াল রিডানডেন্সি অ্যানালাইসিস ব্যবহার করে) কোষের প্রকারভেদের মধ্যে সামঞ্জস্যপূর্ণ পরিবর্তন দেখায়, এবং মেটাবোলাইট প্রোফাইল অনুসারে কোষের প্রকারভেদ এবং/অথবা মাইক্রোএনভায়রনমেন্ট স্পষ্টভাবে একত্রিত হয় (চিত্র ২এফ)। একক মেটাবোলাইটের বিশ্লেষণ এই প্রভাবগুলোকে আরও জোরদার করেছে এবং কোষের প্রকারভেদ ও মাইক্রোএনভায়রনমেন্টের মধ্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য প্রকাশ করেছে। এটি লক্ষণীয় যে, সবচেয়ে চরম পার্থক্যটি পরিলক্ষিত হয়েছে এমএনএ-এর ক্ষেত্রে, যা সাধারণত সিডি৪৫- কোষে এবং টিউমারে অনুপ্রবেশকারী সিডি৪+ ও সিডি৮+ কোষে সমৃদ্ধ থাকে (চিত্র ৩এ)। CD4+ কোষের ক্ষেত্রে এই প্রভাব সবচেয়ে সুস্পষ্ট, এবং CD8+ কোষের MNA-ও পরিবেশ দ্বারা ব্যাপকভাবে প্রভাবিত হয় বলে মনে হয়। তবে, এটি গুরুত্বপূর্ণ নয়, কারণ ছয়জন রোগীর মধ্যে মাত্র তিনজনের টিউমার CD8+ স্কোর মূল্যায়ন করা সম্ভব হয়েছে। MNA ছাড়াও, অ্যাসাইটিস এবং টিউমারের বিভিন্ন ধরণের কোষে, TIL-এ ভালোভাবে চিহ্নিত নয় এমন অন্যান্য মেটাবোলাইটও ভিন্নভাবে সমৃদ্ধ থাকে (চিত্র S3 এবং S4)। অতএব, এই তথ্যগুলো পরবর্তী গবেষণার জন্য একগুচ্ছ সম্ভাবনাময় ইমিউনোমডুলেটরি মেটাবোলাইটের সন্ধান দেয়।
(A) অ্যাসাইটিস এবং টিউমার থেকে প্রাপ্ত CD4+, CD8+ এবং CD45- কোষগুলিতে MNA-এর স্বাভাবিককৃত পরিমাণ। বক্স প্লটটি মধ্যক (রেখা), আন্তঃচতুর্থক পরিসর (ফ্রেম হিঞ্জ) এবং আন্তঃচতুর্থক পরিসরের ১.৫ গুণ পর্যন্ত ডেটা পরিসর (ফ্রেম হুইস্কার) দেখায়। রোগীর উপকরণ এবং পদ্ধতি বিভাগে বর্ণিত হিসাবে, P মান নির্ধারণ করতে রোগীর লিম্মা মান ব্যবহার করুন (*P<0.05 এবং **P<0.01)। (B) MNA বিপাকের পরিকল্পিত চিত্র (60)। বিপাকজাত পদার্থ: S-অ্যাডেনোসিল-1-মিথিওনিন; SAH, S-অ্যাডেনোসিন-1-হোমোসিস্টিন; NA, নিকোটিনামাইড; MNA, 1-মিথাইলনিকোটিনামাইড; 2-PY, 1-মিথাইল-2-পাইরিডোন-5-কার্বক্সামাইড; 4-PY, 1-মিথাইল-4-পাইরিডোন-5-কার্বক্সামাইড; NR, নিকোটিনামাইড রাইবোজ; NMN, নিকোটিনামাইড মনোনিউক্লিওটাইড। এনজাইমসমূহ (সবুজ): NNMT, নিকোটিনামাইড এন-মিথাইলট্রান্সফারেজ; SIRT, সার্টুইনস; NAMPT, নিকোটিনামাইড ফসফোরিবোসিল ট্রান্সফারেজ; AOX1, অ্যালডিহাইড অক্সিডেজ ১; NRK, নিকোটিনামাইড রাইবোসাইড কাইনেজ; NMNAT, নিকোটিনামাইড মনোনিউক্লিওটাইড অ্যাডেনাইলেট ট্রান্সফারেজ; Pnp1, পিউরিন নিউক্লিওসাইড ফসফোরিলেজ। (C) অ্যাসাইটিস (ধূসর) এবং টিউমারের (লাল; n = ৩ জন রোগী) scRNA-seq-এর t-SNE। (D) scRNA-seq ব্যবহার করে শনাক্তকৃত বিভিন্ন কোষের পপুলেশনে NNMT-এর এক্সপ্রেশন। (E) SK-OV-3, হিউম্যান এমব্রায়োনিক কিডনি (HEK) 293T, T কোষ এবং MNA-চিকিৎসিত T কোষে NNMT এবং AOX1-এর এক্সপ্রেশন। ফোল্ডেড এক্সপ্রেশনটি SK-OV-3-এর সাপেক্ষে দেখানো হয়েছে। SEM সহ এক্সপ্রেশন প্যাটার্ন দেখানো হয়েছে (n = ৬ জন সুস্থ দাতা)। ৩৫-এর বেশি Ct মান শনাক্ত করা যায় না (UD) বলে গণ্য করা হয়। (F) SK-OV-3, HEK293T, T কোষ এবং 8mM MNA দ্বারা চিকিৎসাকৃত T কোষে SLC22A1 এবং SLC22A2-এর প্রকাশ। SK-OV-3-এর সাপেক্ষে ফোল্ডেড প্রকাশ দেখানো হয়েছে। SEM সহ প্রকাশের ধরণ দেখানো হয়েছে (n = ৬ জন সুস্থ দাতা)। ৩৫-এর বেশি Ct মান শনাক্ত করা যায় না (UD) বলে গণ্য করা হয়। (G) MNA-এর সাথে ৭২ ঘন্টা ইনকিউবেশনের পর সক্রিয়কৃত সুস্থ দাতার T কোষে MNA-এর পরিমাণ। SEM সহ প্রকাশের ধরণ দেখানো হয়েছে (n = ৪ জন সুস্থ দাতা)।
নিকোটিনামাইড এন-মিথাইলট্রান্সফারেজ (NNMT; চিত্র 3B) দ্বারা এস-অ্যাডেনোসিল-১-মিথিওনিন (SAM) থেকে নিকোটিনামাইড (NA)-তে মিথাইল গ্রুপ স্থানান্তরের মাধ্যমে MNA উৎপাদিত হয়। NNMT বিভিন্ন ধরনের মানব ক্যান্সারে অতিরিক্ত পরিমাণে প্রকাশিত হয় এবং এটি কোষের বৃদ্ধি, আক্রমণ এবং মেটাস্টেসিসের সাথে সম্পর্কিত (25-27)। টিউমার মাইক্রোএনভায়রনমেন্টে (TME) টি কোষে MNA-এর উৎস আরও ভালোভাবে বোঝার জন্য, আমরা তিনজন HGSC রোগীর অ্যাসাইটিস এবং টিউমারের বিভিন্ন কোষে NNMT-এর প্রকাশকে চিহ্নিত করতে scRNA-seq ব্যবহার করেছি (সারণী S5)। প্রায় 6,500 কোষের বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে অ্যাসাইটিস এবং টিউমার পরিবেশে, NNMT-এর প্রকাশ শুধুমাত্র ফাইব্রোব্লাস্ট এবং টিউমার কোষের মধ্যেই সীমাবদ্ধ ছিল (চিত্র 3, C এবং D)। এটি লক্ষণীয় যে PTPRC (CD45+) প্রকাশকারী কোনো কোষে NNMT-এর সুস্পষ্ট প্রকাশ নেই (চিত্র 3D এবং চিত্র S5A), যা নির্দেশ করে যে মেটাবোলাইট বর্ণালীতে শনাক্তকৃত MNA টি কোষে প্রবেশ করেছে। অ্যালডিহাইড অক্সিডেজ 1 (AOX1)-এর প্রকাশ MNA-কে 1-মিথাইল-2-পাইরিডোন-5-কার্বক্সামাইড (2-PYR) বা 1-মিথাইল-4-পাইরিডোন-5-কার্বক্সামাইড (4-PYR)-এ রূপান্তরিত করে; চিত্র 3B) এটি COL1A1 প্রকাশকারী ফাইব্রোব্লাস্টের জনসংখ্যার মধ্যেও সীমাবদ্ধ (চিত্র S5A), যা একত্রে নির্দেশ করে যে T কোষগুলির প্রচলিত MNA বিপাকের ক্ষমতা নেই। এই MNA-সম্পর্কিত জিনগুলির প্রকাশের ধরণ HGSC রোগীদের অ্যাসাইটিস থেকে প্রাপ্ত একটি দ্বিতীয় স্বাধীন কোষ ডেটা সেট ব্যবহার করে যাচাই করা হয়েছিল (চিত্র S5B; n = 6) (16)। এছাড়াও, MNA দিয়ে চিকিৎসা করা সুস্থ দাতার T কোষের পরিমাণগত পলিমারেজ চেইন রিঅ্যাকশন (qPCR) বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে নিয়ন্ত্রণ SK-OV-3 ওভারিয়ান টিউমার কোষের তুলনায়, NNMT বা AOX1 প্রায় প্রকাশিত হয়নি (চিত্র 3E)। এই অপ্রত্যাশিত ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে MNA ফাইব্রোব্লাস্ট বা টিউমার থেকে TME-তে সংলগ্ন T কোষগুলিতে নিঃসৃত হতে পারে।
যদিও প্রার্থীদের মধ্যে সলিউবল ক্যারিয়ার 22 (SLC22) পরিবার (SLC22A1, SLC22A2 এবং SLC22A3) দ্বারা এনকোড করা অর্গানিক কেশন ট্রান্সপোর্টার 1 থেকে 3 (OCT1, OCT2 এবং OCT3) পরিবার অন্তর্ভুক্ত রয়েছে, MNA-এর সম্ভাব্য ট্রান্সপোর্টারগুলি এখনও সংজ্ঞায়িত করা হয়নি (28)। সুস্থ দাতার T কোষ থেকে mRNA-এর QPCR SLC22A1-এর কম এক্সপ্রেশন স্তর দেখিয়েছে কিন্তু SLC22A2-এর সনাক্ত করা যায়নি, যা নিশ্চিত করে যে এটি পূর্বে সাহিত্যে রিপোর্ট করা হয়েছিল (চিত্র 3F) (29)। বিপরীতে, SK-OV-3 ওভারিয়ান টিউমার কোষ লাইনটি উভয় ট্রান্সপোর্টারের উচ্চ স্তর প্রকাশ করেছে (চিত্র 3F)।
টি কোষের বহিরাগত MNA শোষণ করার ক্ষমতা আছে কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য, সুস্থ দাতার টি কোষকে ৭২ ঘণ্টা ধরে বিভিন্ন ঘনত্বের MNA-এর উপস্থিতিতে কালচার করা হয়েছিল। বহিরাগত MNA-এর অনুপস্থিতিতে, কোষের অভ্যন্তরে MNA-এর উপস্থিতি শনাক্ত করা যায়নি (চিত্র ৩জি)। তবে, বহিরাগত MNA দ্বারা ট্রিট করা সক্রিয় টি কোষের অভ্যন্তরে MNA-এর পরিমাণ ৬ mM MNA পর্যন্ত মাত্রা-নির্ভরভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র ৩জি)। এই ফলাফল ইঙ্গিত দেয় যে, ট্রান্সপোর্টার এক্সপ্রেশনের নিম্ন স্তর এবং অন্তঃকোষীয় MNA বিপাকের জন্য দায়ী প্রধান এনজাইমের অভাব থাকা সত্ত্বেও, TIL কোষ MNA গ্রহণ করতে পারে।
রোগীদের টি কোষে মেটাবোলাইটের বর্ণালী এবং ইন ভিট্রো MNA শোষণ পরীক্ষা এই সম্ভাবনা বাড়িয়ে তোলে যে ক্যান্সার-সংশ্লিষ্ট ফাইব্রোব্লাস্ট (CAF) MNA নিঃসরণ করে এবং টিউমার কোষ TIL-এর ফেনোটাইপ ও কার্যকারিতা নিয়ন্ত্রণ করতে পারে। টি কোষের উপর MNA-এর প্রভাব নির্ধারণ করার জন্য, সুস্থ দাতার টি কোষগুলোকে MNA-এর উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিতে ইন ভিট্রো পদ্ধতিতে সক্রিয় করা হয়েছিল এবং তাদের সংখ্যাবৃদ্ধি ও সাইটোকাইন উৎপাদন মূল্যায়ন করা হয়েছিল। সর্বোচ্চ মাত্রায় MNA যোগ করার ৭ দিন পর, কোষের সংখ্যা দ্বিগুণ হওয়ার হার মাঝারিভাবে হ্রাস পেয়েছিল, যদিও সমস্ত মাত্রাতেই কোষের সজীবতা বজায় ছিল (চিত্র ৪ক)। এছাড়াও, বহিরাগত MNA প্রয়োগের ফলে টিউমার নেক্রোসিস ফ্যাক্টর-আলফা (TNFα) প্রকাশকারী CD4+ এবং CD8+ টি কোষের অনুপাত বৃদ্ধি পেয়েছিল (চিত্র ৪খ)। এর বিপরীতে, CD4+ টি কোষে IFN-γ-এর অন্তঃকোষীয় উৎপাদন উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছিল, কিন্তু CD8+ টি কোষে তা ঘটেনি এবং ইন্টারলিউকিন ২ (IL-2)-এর ক্ষেত্রে কোনো উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন দেখা যায়নি (চিত্র ৪, গ এবং ঘ)। অতএব, এই MNA-চিকিৎসিত টি কোষ কালচারের সুপারন্যাট্যান্টের এনজাইম-লিঙ্কড ইমিউনোসরবেন্ট অ্যাসে (ELISA) পরীক্ষায় TNFα-এর উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি, IFN-γ-এর হ্রাস এবং IL-2-এর কোনো পরিবর্তন দেখা যায়নি (চিত্র ৪, E থেকে G)। IFN-γ-এর এই হ্রাস ইঙ্গিত দেয় যে টি কোষের টিউমার-বিরোধী কার্যকলাপকে বাধা দেওয়ার ক্ষেত্রে MNA একটি ভূমিকা পালন করতে পারে। টি কোষ-মধ্যস্থ সাইটোটক্সিসিটির উপর MNA-এর প্রভাব অনুকরণ করার জন্য, সুস্থ দাতার পেরিফেরাল ব্লাড মনোনিউক্লিয়ার সেল (PBMC) থেকে ফোলেট রিসেপ্টর α-কে লক্ষ্য করে কাইমেরিক অ্যান্টিজেন রিসেপ্টর টি (FRα-CAR-T) কোষ এবং গ্রিন ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন (GFP) দ্বারা নিয়ন্ত্রিত CAR-T (GFP)-CAR-T) কোষ তৈরি করা হয়। CAR-T কোষগুলোকে MNA-এর উপস্থিতিতে ২৪ ঘণ্টা ধরে কালচার করা হয় এবং তারপর ফোলেট রিসেপ্টর α প্রকাশকারী মানব SK-OV-3 ওভারিয়ান টিউমার কোষের সাথে ১০:১ ইফেক্টর-টু-টার্গেট অনুপাতে কো-কালচার করা হয়। MNA প্রয়োগের ফলে FRα-CAR-T কোষের ধ্বংস করার ক্ষমতা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পায়, যা অ্যাডেনোসিন দ্বারা চিকিৎসাপ্রাপ্ত FRα-CAR-T কোষের অনুরূপ ছিল (চিত্র 4H)।
(A) ৭ম দিনে কালচার থেকে সরাসরি প্রাপ্ত মোট কার্যকর কোষের সংখ্যা এবং পপুলেশন ডাবলিং (PD)। বার গ্রাফটি ছয়জন সুস্থ দাতার গড় + SEM উপস্থাপন করে। এটি কমপক্ষে n = ৩টি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে প্রাপ্ত ডেটা। (B থেকে D) ৭ দিনের জন্য টি কোষ সক্রিয় করতে CD3/CD28 এবং IL-2 তাদের নিজ নিজ MNA ঘনত্বে ব্যবহার করা হয়েছিল। বিশ্লেষণের আগে, কোষগুলোকে ৪ ঘণ্টার জন্য GolgiStop সহ PMA/ionomycin দ্বারা উদ্দীপিত করা হয়েছিল। টি কোষে TNFα (B) এর প্রকাশ। জীবন্ত কোষে TNFα প্রকাশের উদাহরণ চিত্র (বামে) এবং সারণিবদ্ধ ডেটা (ডানে)। টি কোষে IFN-γ (C) এবং IL-2 (D) এর প্রকাশ। সাইটোকাইনের প্রকাশ ফ্লো সাইটোমেট্রি দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল। বার গ্রাফটি গড় (n = ৬ জন সুস্থ দাতা) + SEM উপস্থাপন করে। P মান নির্ধারণ করতে ওয়ান-ওয়ে অ্যানালাইসিস অফ ভ্যারিয়েন্স এবং রিপিটেড মেজারস (*P<0.05 এবং **P<0.01) ব্যবহার করুন। এটি কমপক্ষে n = ৩টি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে প্রাপ্ত ডেটা। (E থেকে G) ৭ দিন ধরে টি কোষ সক্রিয় করার জন্য CD3/CD28 এবং IL-2 তাদের নিজ নিজ MNA ঘনত্বে ব্যবহার করা হয়েছিল। PMA/আয়নোমাইসিন উদ্দীপনার ৪ ঘন্টা আগে এবং পরে মিডিয়াম সংগ্রহ করা হয়েছিল। TNFα (E), IFN-γ (F) এবং IL-2 (G)-এর ঘনত্ব ELISA দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল। বার গ্রাফটি গড় (n = ৫ জন সুস্থ দাতা) + SEM উপস্থাপন করে। একমুখী বৈশ্লেষিক ভেদ এবং পুনরাবৃত্ত পরিমাপ ব্যবহার করে P মান নির্ধারণ করা হয়েছে (*P<0.05)। ডটেড লাইনটি সনাক্তকরণের সীমা নির্দেশ করে। (H) কোষ লিসিস পরীক্ষা। FRα-CAR-T বা GFP-CAR-T কোষগুলিকে ২৪ ঘন্টার জন্য অ্যাডেনোসিন (২৫০μM) বা MNA (১০ mM) দিয়ে সামঞ্জস্য করা হয়েছিল, অথবা চিকিৎসা ছাড়াই রাখা হয়েছিল (Ctrl)। SK-OV-3 কোষের শতকরা ধ্বংস পরিমাপ করা হয়েছিল। ওয়েলচ টি পরীক্ষা দ্বারা P মান নির্ধারণ করা হয়েছে (*P<0.5 এবং **P<0.01)।
MNA-নির্ভর TNFα এক্সপ্রেশন নিয়ন্ত্রণের কার্যপ্রণালীগত ধারণা লাভের জন্য, MNA-চিকিৎসিত T কোষের TNFα mRNA-এর পরিবর্তনগুলি মূল্যায়ন করা হয়েছিল (চিত্র 5A)। MNA দ্বারা চিকিৎসিত সুস্থ দাতার T কোষে TNFα ট্রান্সক্রিপশনের মাত্রা দ্বিগুণ বৃদ্ধি পেয়েছে, যা নির্দেশ করে যে TNFα ট্রান্সক্রিপশনাল নিয়ন্ত্রণে MNA নির্ভরশীল। এই সম্ভাব্য নিয়ন্ত্রক প্রক্রিয়াটি তদন্ত করার জন্য, TNFα নিয়ন্ত্রণকারী দুটি পরিচিত ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর, যথা অ্যাক্টিভেটেড টি সেল নিউক্লিয়ার ফ্যাক্টর (NFAT) এবং স্পেসিফিক প্রোটিন 1 (Sp1), প্রক্সিমাল TNFα প্রোমোটারে (30) MNA সংযুক্তির প্রতিক্রিয়ায় মূল্যায়ন করা হয়েছিল। TNFα প্রোমোটারে 6টি চিহ্নিত NFAT বাইন্ডিং সাইট এবং 2টি Sp1 বাইন্ডিং সাইট রয়েছে, যা একটি সাইটে ওভারল্যাপ করে [5'ক্যাপ থেকে -55 বেস পেয়ার (bp) দূরে] (30)। ক্রোমাটিন ইমিউনোপ্রেসিপিটেশন (ChIP) দেখিয়েছে যে MNA দ্বারা চিকিৎসিত হলে, TNFα প্রোমোটারে Sp1-এর বাইন্ডিং তিনগুণ বৃদ্ধি পায়। NFAT-এর অন্তর্ভুক্তিও বৃদ্ধি পায় এবং গুরুত্বপূর্ণ পর্যায়ে পৌঁছায় (চিত্র 5B)। এই তথ্য থেকে বোঝা যায় যে, MNA, Sp1 ট্রান্সক্রিপশনের মাধ্যমে TNFα-এর এক্সপ্রেশন এবং কিছুটা কম পরিমাণে NFAT-এর এক্সপ্রেশন নিয়ন্ত্রণ করে।
(A) MNA ছাড়া কালচার করা T কোষের তুলনায়, MNA দিয়ে ট্রিট করা T কোষে TNFα এক্সপ্রেশনের ফোল্ড পরিবর্তন। SEM সহ এক্সপ্রেশন প্যাটার্ন দেখানো হয়েছে (n = ৫ জন সুস্থ দাতা)। কমপক্ষে n = ৩টি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে প্রাপ্ত ডেটা উপস্থাপন করে। (B) ৪ ঘন্টা ধরে NFAT এবং Sp1-কে (Ctrl) এবং PMA/আয়নোমাইসিন স্টিমুলেশনের সাথে একত্রিত করার পর, ৮ mM MNA সহ বা ছাড়া ট্রিট করা T কোষের TNFα প্রোমোটার। ইমিউনোপ্রেসিপিটেশনের জন্য যথাক্রমে নেগেটিভ এবং পজিটিভ কন্ট্রোল হিসেবে ইমিউনোগ্লোবুলিন জি (IgG) এবং H3 ব্যবহার করা হয়েছিল। ChIP-এর কোয়ান্টিফিকেশন দেখিয়েছে যে কন্ট্রোলের তুলনায় MNA-ট্রিট করা কোষগুলিতে TNFα প্রোমোটারের সাথে Sp1 এবং NFAT-এর বাইন্ডিং কয়েকগুণ বৃদ্ধি পেয়েছে। কমপক্ষে n = ৩টি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে প্রাপ্ত ডেটা উপস্থাপন করে। একাধিক t-টেস্টের মাধ্যমে P মান নির্ধারণ করা হয়েছে (*** P <০.০১)। (C) HGSC-এর অ্যাসাইটিসের তুলনায়, টিউমারে T কোষ (নন-সাইটোটক্সিক) TNF-এর বর্ধিত এক্সপ্রেশন দেখিয়েছে। রঙগুলো বিভিন্ন রোগীকে প্রতিনিধিত্ব করে। প্রদর্শিত সেলগুলো এলোমেলোভাবে ৩০০টি নমুনায় নেওয়া হয়েছে এবং অতিরিক্ত অঙ্কন সীমিত করার জন্য জিটার করা হয়েছে (** Padj = 0.0076)। (D) ডিম্বাশয়ের ক্যান্সারের জন্য MNA-এর প্রস্তাবিত মডেল। MNA টিউমার কোষ এবং TME-এর ফাইব্রোব্লাস্টে উৎপাদিত হয় এবং T কোষ দ্বারা গৃহীত হয়। MNA, TNFα প্রোমোটারের সাথে Sp1-এর বন্ধন বৃদ্ধি করে, যার ফলে TNFα ট্রান্সক্রিপশন এবং TNFα সাইটোকাইন উৎপাদন বৃদ্ধি পায়। MNA এছাড়াও IFN-γ হ্রাস করে। T কোষের কার্যকারিতা বাধাগ্রস্ত হলে কোষ ধ্বংস করার ক্ষমতা কমে যায় এবং টিউমারের বৃদ্ধি ত্বরান্বিত হয়।
প্রতিবেদন অনুসারে, TNFα-এর সম্মুখ এবং পশ্চাৎ-নির্ভর টিউমার-বিরোধী প্রভাব রয়েছে, তবে ডিম্বাশয়ের ক্যান্সারের বৃদ্ধি এবং মেটাস্ট্যাসিসকে উৎসাহিত করার ক্ষেত্রে এর একটি সুপরিচিত ভূমিকা রয়েছে (৩১-৩৩)। প্রতিবেদন অনুসারে, ডিম্বাশয়ের ক্যান্সারে আক্রান্ত রোগীদের অ্যাসাইটিস এবং টিউমার টিস্যুতে TNFα-এর ঘনত্ব সৌম্য টিস্যুর তুলনায় বেশি থাকে (৩৪-৩৬)। কার্যপ্রণালীর দিক থেকে, TNFα শ্বেত রক্তকণিকার সক্রিয়করণ, কার্যকারিতা এবং বিস্তার নিয়ন্ত্রণ করতে পারে এবং ক্যান্সার কোষের ফেনোটাইপ পরিবর্তন করতে পারে (৩৭, ৩৮)। এই ফলাফলগুলির সাথে সামঞ্জস্য রেখে, ডিফারেনশিয়াল জিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে অ্যাসাইটিসের তুলনায় টিউমার টিস্যুর টি কোষে TNF উল্লেখযোগ্যভাবে আপ-রেগুলেটেড ছিল (চিত্র ৫সি)। TNF এক্সপ্রেশনের এই বৃদ্ধি শুধুমাত্র নন-সাইটোটক্সিক ফেনোটাইপযুক্ত টি কোষের পপুলেশনেই স্পষ্ট ছিল (চিত্র এস৫এ)। সারসংক্ষেপে, এই তথ্যগুলি এই দৃষ্টিভঙ্গিকে সমর্থন করে যে HGSC-তে MNA-এর দ্বৈত ইমিউনোসাপ্রেসিভ এবং টিউমার বর্ধনকারী প্রভাব রয়েছে।
ফ্লো সাইটোমেট্রির উপর ভিত্তি করে ফ্লুরোসেন্ট লেবেলিং টিআইএল মেটাবলিজম অধ্যয়নের প্রধান পদ্ধতিতে পরিণত হয়েছে। এই গবেষণাগুলি দেখিয়েছে যে পেরিফেরাল রক্ত ​​লিম্ফোসাইট বা সেকেন্ডারি লিম্ফয়েড অঙ্গের টি কোষের তুলনায়, ইঁদুর এবং মানুষের টিআইএল-এর গ্লুকোজ গ্রহণের প্রবণতা বেশি (4, 39) এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকারিতার ধীরে ধীরে হ্রাস ঘটে (19, 40)। যদিও আমরা এই গবেষণায় অনুরূপ ফলাফল পর্যবেক্ষণ করেছি, মূল অগ্রগতি হল একই রিসেক্টেড টিউমার টিস্যু থেকে টিউমার কোষ এবং টিআইএল-এর মেটাবলিজমের তুলনা করা। এই পূর্ববর্তী কিছু প্রতিবেদনের সাথে সামঞ্জস্য রেখে, অ্যাসাইটিস এবং টিউমার থেকে টিউমার (CD45-EpCAM +) কোষগুলি CD8 + এবং CD4 + টি কোষের তুলনায় বেশি গ্লুকোজ গ্রহণ করে, যা এই ধারণাকে সমর্থন করে যে টিউমার কোষের উচ্চ গ্লুকোজ গ্রহণকে টি কোষের সাথে তুলনা করা যেতে পারে। টি কোষ প্রতিযোগিতা (TME) ধারণা। যাইহোক, টিউমার কোষের মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ CD8 + টি কোষের চেয়ে বেশি, কিন্তু মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ CD4 + টি কোষের অনুরূপ। এই ফলাফলগুলি এই উদীয়মান ধারণাকে শক্তিশালী করে যে অক্সিডেটিভ মেটাবলিজম টিউমার কোষের জন্য গুরুত্বপূর্ণ (41, 42)। তারা আরও পরামর্শ দেন যে CD8 + T কোষগুলি CD4 + T কোষের তুলনায় জারণজনিত কর্মহীনতার প্রতি বেশি সংবেদনশীল হতে পারে, অথবা CD4 + T কোষগুলি মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ বজায় রাখার জন্য গ্লুকোজ ছাড়া অন্য কার্বন উৎস ব্যবহার করতে পারে (43, 44)। এটি উল্লেখ্য যে আমরা অ্যাসাইটিসে CD4 + T ইফেক্টর, T ইফেক্টর মেমরি এবং T সেন্ট্রাল মেমরি কোষগুলির মধ্যে গ্লুকোজ গ্রহণ বা মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপে কোনও পার্থক্য লক্ষ্য করিনি। একইভাবে, টিউমারে CD8 + T কোষের পার্থক্যকরণ অবস্থার সাথে গ্লুকোজ গ্রহণের পরিবর্তনের কোনও সম্পর্ক নেই, যা ইন ভিট্রোতে কালচার করা T কোষ এবং ইন ভিভোতে মানব TIL-এর মধ্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য তুলে ধরে (22)। এই পর্যবেক্ষণগুলি পক্ষপাতহীন স্বয়ংক্রিয় কোষ জনসংখ্যা বরাদ্দের ব্যবহারের মাধ্যমেও নিশ্চিত করা হয়েছিল, যা আরও প্রকাশ করে যে টিউমার কোষের তুলনায় উচ্চতর গ্লুকোজ গ্রহণ এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ সহ CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + কোষগুলি প্রচলিত কিন্তু বিপাকীয়ভাবে সক্রিয় কোষ জনসংখ্যা। এই জনসংখ্যা scRNA-seq বিশ্লেষণে চিহ্নিত মায়েলয়েড সাপ্রেসর কোষ বা প্লাজমাটয়েড ডেনড্রাইটিক কোষের অনুমিত উপ-জনসংখ্যার প্রতিনিধিত্ব করতে পারে। যদিও মানুষের ডিম্বাশয়ের টিউমারে এই দুটিরই খবর পাওয়া গেছে [45], তবুও এই মায়েলয়েড উপগোষ্ঠীর বর্ণনা দেওয়ার জন্য আরও কাজ করা প্রয়োজন।
যদিও ফ্লো সাইটোমেট্রি-ভিত্তিক পদ্ধতিগুলি বিভিন্ন কোষের মধ্যে গ্লুকোজ এবং জারণ বিপাকের সাধারণ পার্থক্যগুলি স্পষ্ট করতে পারে, টিএমই-তে মাইটোকন্ড্রিয়াল বিপাকের জন্য গ্লুকোজ বা অন্যান্য কার্বন উৎস দ্বারা উৎপাদিত সুনির্দিষ্ট মেটাবোলাইটগুলি এখনও নির্ধারণ করা হয়নি। একটি নির্দিষ্ট টিআইএল উপসেটে মেটাবোলাইটের উপস্থিতি বা অনুপস্থিতি নির্ধারণের জন্য কর্তিত টিস্যু থেকে কোষের জনসংখ্যাকে বিশুদ্ধ করা প্রয়োজন। অতএব, ভর বর্ণালিবীক্ষণের সাথে মিলিত আমাদের কোষ সমৃদ্ধকরণ পদ্ধতি, রোগীর নমুনাগুলিতে টি কোষ এবং টিউমার কোষের জনসংখ্যায় ভিন্নভাবে সমৃদ্ধ মেটাবোলাইটগুলি সম্পর্কে অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করতে পারে। যদিও এই পদ্ধতির ফ্লুরোসেন্স-অ্যাক্টিভেটেড সেল সর্টিং-এর তুলনায় সুবিধা রয়েছে, কিছু মেটাবোলাইট লাইব্রেরি তাদের অন্তর্নিহিত স্থিতিশীলতা এবং/অথবা দ্রুত টার্নওভার হারের কারণে প্রভাবিত হতে পারে (22)। তা সত্ত্বেও, আমাদের পদ্ধতি দুটি স্বীকৃত ইমিউনোসাপ্রেসিভ মেটাবোলাইট, অ্যাডেনোসিন এবং কাইনুরেনিন সনাক্ত করতে সক্ষম হয়েছে, কারণ নমুনার প্রকারভেদে এগুলির মধ্যে ব্যাপক পার্থক্য দেখা যায়।
টিউমার এবং টিআইএল উপপ্রকারের উপর আমাদের মেটাবোনোমিক বিশ্লেষণ ডিম্বাশয়ের টিএমই-তে মেটাবোলাইটের ভূমিকা সম্পর্কে আরও অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে। প্রথমত, ফ্লো সাইটোমেট্রি ব্যবহার করে, আমরা নির্ধারণ করেছি যে টিউমার এবং CD4 + T কোষের মধ্যে মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপে কোনও পার্থক্য ছিল না। যাইহোক, LC-MS/MS বিশ্লেষণ এই পপুলেশনগুলির মধ্যে মেটাবোলাইটের প্রাচুর্যে উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন প্রকাশ করেছে, যা ইঙ্গিত করে যে টিআইএল বিপাক এবং এর সামগ্রিক বিপাকীয় কার্যকলাপ সম্পর্কে সিদ্ধান্তে পৌঁছানোর জন্য সতর্ক ব্যাখ্যার প্রয়োজন। দ্বিতীয়ত, অ্যাসাইটিসে CD45-কোষ এবং T কোষের মধ্যে MNA মেটাবোলাইটের পার্থক্য সবচেয়ে বেশি, টিউমারে নয়। অতএব, কম্পার্টমেন্টালাইজেশন এবং টিউমারের অবস্থান টিআইএল বিপাকের উপর ভিন্ন প্রভাব ফেলতে পারে, যা একটি নির্দিষ্ট মাইক্রোএনভায়রনমেন্টে সম্ভাব্য ভিন্নতাকে তুলে ধরে। তৃতীয়ত, MNA-উৎপাদনকারী এনজাইম NNMT-এর প্রকাশ প্রধানত CAF-এর মধ্যে সীমাবদ্ধ, যা টিউমার কোষে কম পরিমাণে থাকে, কিন্তু টিউমার-উদ্ভূত T কোষে সনাক্তযোগ্য MNA স্তর পরিলক্ষিত হয়। ডিম্বাশয়ের CAF-এ NNMT-এর অতিরিক্ত প্রকাশের একটি পরিচিত ক্যান্সার-প্রোমোটিং প্রভাব রয়েছে, যা আংশিকভাবে CAF বিপাক, টিউমার আক্রমণ এবং মেটাস্ট্যাসিসের প্রচারের কারণে ঘটে (27)। যদিও টিআইএল-এর সামগ্রিক মাত্রা মাঝারি, সিএএফ-এ এনএনএমটি-এর প্রকাশ ক্যান্সার জিনোম অ্যাটলাস (টিসিজিএ) মেসেনকাইমাল সাবটাইপের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত, যা খারাপ পূর্বাভাসের সাথে যুক্ত (২৭, ৪৬, ৪৭)। পরিশেষে, এমএনএ অবক্ষয়ের জন্য দায়ী এনজাইম এওএক্স১-এর প্রকাশও সিএএফ পপুলেশনের মধ্যেই সীমাবদ্ধ, যা নির্দেশ করে যে টি কোষের এমএনএ বিপাক করার ক্ষমতা নেই। এই ফলাফলগুলি এই ধারণাকে সমর্থন করে যে, যদিও এই আবিষ্কারটি যাচাই করার জন্য আরও কাজের প্রয়োজন, টি কোষে এমএনএ-এর উচ্চ মাত্রা একটি ইমিউনোসাপ্রেসিভ সিএএফ মাইক্রোএনভায়রনমেন্টের উপস্থিতি নির্দেশ করতে পারে।
MNA ট্রান্সপোর্টারগুলির নিম্ন এক্সপ্রেশন লেভেল এবং MNA মেটাবলিজমের সাথে জড়িত মূল প্রোটিনগুলির শনাক্ত করা যায় না এমন মাত্রার পরিপ্রেক্ষিতে, টি কোষে MNA-এর উপস্থিতি অপ্রত্যাশিত। দুটি স্বাধীন কোহর্টের scRNA-seq বিশ্লেষণ এবং টার্গেটেড qPCR দ্বারা NNMT বা AOX1 কোনটিই শনাক্ত করা যায়নি। এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে MNA টি কোষ দ্বারা সংশ্লেষিত হয় না, বরং পারিপার্শ্বিক TME থেকে শোষিত হয়। ইন ভিট্রো পরীক্ষাগুলি দেখায় যে টি কোষগুলি বহিরাগত MNA জমা করার প্রবণতা দেখায়।
আমাদের ইন ভিট্রো গবেষণায় দেখা গেছে যে বহিরাগত MNA টি কোষে TNFα-এর প্রকাশকে প্ররোচিত করে এবং TNFα প্রোমোটারে Sp1-এর বন্ধনকে উন্নত করে। যদিও TNFα-এর টিউমার-বিরোধী এবং টিউমার-প্রতিরোধী উভয় কার্যকারিতাই রয়েছে, ডিম্বাশয়ের ক্যান্সারের ক্ষেত্রে, TNFα ক্যান্সারের বৃদ্ধিকে ত্বরান্বিত করতে পারে (৩১-৩৩)। ডিম্বাশয়ের টিউমার কোষ কালচারে TNFα-কে নিষ্ক্রিয় করা অথবা ইঁদুরের মডেলে TNFα সংকেত নির্মূল করা হলে TNFα-মধ্যস্থ প্রদাহজনক সাইটোকাইন উৎপাদন উন্নত হতে পারে এবং টিউমারের বৃদ্ধি বাধাগ্রস্ত হতে পারে (৩২, ৩৫)। অতএব, এক্ষেত্রে, TME-থেকে প্রাপ্ত MNA অটোক্রাইন লুপের মাধ্যমে একটি TNFα-নির্ভর প্রক্রিয়ায় একটি প্রো-ইনফ্ল্যামেটরি মেটাবোলাইট হিসেবে কাজ করতে পারে, যার ফলে ডিম্বাশয়ের ক্যান্সারের উৎপত্তি এবং বিস্তারকে ত্বরান্বিত করে (৩১)। এই সম্ভাবনার উপর ভিত্তি করে, TNFα ব্লকেডকে ডিম্বাশয়ের ক্যান্সারের জন্য একটি সম্ভাব্য থেরাপিউটিক এজেন্ট হিসেবে অধ্যয়ন করা হচ্ছে (৩৭, ৪৮, ৪৯)। এছাড়াও, MNA ডিম্বাশয়ের টিউমার কোষের প্রতি CAR-T কোষের সাইটোটক্সিসিটি হ্রাস করে, যা MNA-মধ্যস্থ ইমিউন সাপ্রেশনের আরও প্রমাণ দেয়। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলো এমন একটি মডেলের ইঙ্গিত দেয় যেখানে টিউমার এবং CAF কোষগুলো বহির্কোষীয় TME-তে MNA নিঃসরণ করে। (i) TNF-প্ররোচিত ডিম্বাশয়ের ক্যান্সার বৃদ্ধির উদ্দীপনা এবং (ii) MNA-প্ররোচিত T কোষের সাইটোটক্সিক কার্যকলাপের বাধাদানের মাধ্যমে, এটি টিউমারের উপর দ্বৈত প্রভাব ফেলতে পারে (চিত্র 5D)।
উপসংহারে, দ্রুত কোষ সমৃদ্ধকরণ, একক-কোষ সিকোয়েন্সিং এবং মেটাবলিক প্রোফাইলিং-এর সমন্বিত প্রয়োগের মাধ্যমে এই গবেষণাটি HGSC রোগীদের টিউমার এবং অ্যাসাইটিস কোষের মধ্যে বিশাল ইমিউনোমেটাবোলোমিক পার্থক্য উন্মোচন করেছে। এই ব্যাপক বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে টি কোষের মধ্যে গ্লুকোজ গ্রহণ এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপে পার্থক্য রয়েছে, এবং MNA-কে একটি নন-সেল অটোনমাস ইমিউন নিয়ন্ত্রক মেটাবোলাইট হিসেবে চিহ্নিত করা হয়েছে। এই তথ্যগুলো মানব ক্যান্সারে TME কীভাবে টি কোষের বিপাককে প্রভাবিত করে, তার উপর প্রভাব ফেলে। যদিও টি কোষ এবং ক্যান্সার কোষের মধ্যে পুষ্টির জন্য সরাসরি প্রতিযোগিতার কথা জানা গেছে, মেটাবোলাইটগুলো টিউমারের অগ্রগতি ত্বরান্বিত করতে এবং সম্ভবত অন্তঃস্থ প্রতিরোধ ব্যবস্থাকে দমন করতে পরোক্ষ নিয়ন্ত্রক হিসেবেও কাজ করতে পারে। এই নিয়ন্ত্রক মেটাবোলাইটগুলোর কার্যকরী ভূমিকার আরও বিশদ বিবরণ টিউমার-বিরোধী প্রতিরোধ ব্যবস্থা উন্নত করার জন্য বিকল্প কৌশলের দ্বার উন্মোচন করতে পারে।
কানাডিয়ান টিস্যু রিপোজিটরি নেটওয়ার্ক দ্বারা প্রত্যয়িত বিসি ক্যান্সার টিউমার টিস্যু রিপোজিটরি থেকে রোগীর নমুনা এবং ক্লিনিক্যাল ডেটা সংগ্রহ করা হয়েছিল। বিসি ক্যান্সার রিসার্চ এথিক্স কমিটি এবং ইউনিভার্সিটি অফ ব্রিটিশ কলাম্বিয়া (H07-00463) দ্বারা অনুমোদিত প্রোটোকল অনুসারে, সমস্ত রোগীর নমুনা এবং ক্লিনিক্যাল ডেটা অবহিত লিখিত সম্মতির ভিত্তিতে অথবা আনুষ্ঠানিকভাবে তাদের সম্মতি ত্যাগের মাধ্যমে সংগ্রহ করা হয়েছিল। নমুনাগুলো প্রত্যয়িত বায়োব্যাঙ্কে (BRC-00290) সংরক্ষণ করা আছে। রোগীর বিস্তারিত বৈশিষ্ট্য সারণি S1 এবং S5-এ দেখানো হয়েছে। ক্রায়োপ্রিজারভেশনের জন্য, একটি স্ক্যালপেল ব্যবহার করে রোগীর টিউমারের নমুনাকে যান্ত্রিকভাবে ভেঙে ফেলা হয় এবং তারপর একটি একক কোষের সাসপেনশন পাওয়ার জন্য এটিকে একটি ১০০-মাইক্রন ফিল্টারের মধ্য দিয়ে চালনা করা হয়। কোষগুলোকে থিতানো করতে এবং সুপারন্যাট্যান্ট অপসারণ করতে রোগীর অ্যাসাইটিসকে ৪°C তাপমাত্রায় ১০ মিনিটের জন্য ১৫০০ rpm গতিতে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। টিউমার এবং অ্যাসাইটিস থেকে প্রাপ্ত কোষগুলোকে ৫০% তাপ-নিষ্ক্রিয় মানব এবি সিরাম (সিগমা-অলড্রিচ), ৪০% আরপিএমআই-১৬৪০ (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) এবং ১০% ডাইমিথাইল সালফোক্সাইডে ক্রায়োপ্রিজার্ভ করা হয়েছিল। এই সংরক্ষিত একক কোষের সাসপেনশনগুলোকে গলিয়ে নিচে বর্ণিত মেটাবোলোমিক্স এবং মেটাবোলাইট নির্ধারণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।
সম্পূর্ণ মিডিয়ামটি ০.২২ μm ফিল্টার করা ৫০:৫০ সম্পূরকযুক্ত RPMI 1640: AimV দ্বারা গঠিত। RPMI 1640 + ২.০৫ mM l-গ্লুটামিন (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক)-এর সাথে সম্পূরক হিসেবে রয়েছে ১০% তাপ-নিষ্ক্রিয় মানব AB সিরাম (সিগমা-অলড্রিচ), ১২.৫ mM Hepes (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক), ২ mM l-গ্লুটামিন (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক), ১ x পেনিসিলিন স্ট্রেপ্টোমাইসিন (পেনস্ট্রেপ) দ্রবণ (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) এবং ৫০ μMB-মারক্যাপটোইথানল। AimV (ইনভিট্রোজেন)-এর সাথে সম্পূরক হিসেবে রয়েছে ২০ mM Hepes (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) এবং ২ mM l-গ্লুটামিন (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক)। ফ্লো সাইটোমিটার স্টেইনিং বাফারটি ০.২২ মাইক্রোমিটার ফিল্টার করা ফসফেট বাফার্ড স্যালাইন (পিবিএস; ইনভিট্রোজেন) এবং এর সাথে ৩% তাপ-নিষ্ক্রিয় এবি হিউম্যান সিরাম (সিগমা) দ্বারা গঠিত। সেল এনরিচমেন্ট বাফারটি ০.২২ মাইক্রোমিটার ফিল্টার করা পিবিএস এবং এর সাথে ০.৫% তাপ-নিষ্ক্রিয় এবি হিউম্যান সিরাম (সিগমা-অলড্রিচ) দ্বারা গঠিত।
৩৭°C সম্পূর্ণ মিডিয়ামে, কোষগুলোকে ৩০ মিনিটের জন্য ১০ nM MT DR এবং ১০০ μM 2-NBDG দিয়ে স্টেইন করা হয়েছিল। এরপর, কোষগুলোকে ৪°C তাপমাত্রায় ১৫ মিনিটের জন্য ভায়াবিলিটি ডাই eF506 দিয়ে স্টেইন করা হয়েছিল। কোষগুলোকে FC Block (eBioscience) এবং Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences)-এ সাসপেন্ড করে, ফ্লো সাইটোমিটার স্টেইনিং বাফারে (প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুযায়ী) লঘু করে, এবং ঘরের তাপমাত্রায় ১০ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। কোষগুলোকে ৪°C তাপমাত্রায় ২০ মিনিটের জন্য ফ্লো সাইটোমেট্রি স্টেইনিং বাফারে এক সেট অ্যান্টিবডি (টেবিল S2) দিয়ে স্টেইন করা হয়েছিল। বিশ্লেষণের আগে কোষগুলোকে ফ্লো সাইটোমেট্রি স্টেইনিং বাফারে (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R কনফিগারেশন) সাসপেন্ড করা হয়েছিল। কোষ গণনার ডেটা বিশ্লেষণ করতে SpectroFlo এবং FlowJo V10 ব্যবহার করুন, এবং ডেটা তৈরি করতে GraphPad Prism 8 ব্যবহার করুন। 2-NBDG এবং MT DR-এর মিডিয়ান ফ্লুরোসেন্স ইনটেনসিটি (MFI)-কে লগ-নরম্যালাইজ করা হয়েছিল এবং তারপর ম্যাচ করা রোগীদের বিষয়টি বিবেচনা করার জন্য পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণে একটি পেয়ার্ড টি টেস্ট ব্যবহার করা হয়েছিল। বিশ্লেষণ থেকে ৪০টির কম ইভেন্টযুক্ত সমস্ত পপুলেশন বাদ দিন; পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ এবং ডেটা ভিজ্যুয়ালাইজেশন করার আগে যেকোনো নেতিবাচক মানের জন্য MFI-এর মান ১ লিখুন।
উপরের প্রসেস প্যানেলের ম্যানুয়াল গেটিং কৌশলের পরিপূরক হিসেবে, আমরা FlowJo-তে মৃত কোষ বাদ দেওয়ার পর কোষগুলোকে স্বয়ংক্রিয়ভাবে পপুলেশনে বরাদ্দ করার জন্য শেপ রেস্ট্রিকশন ট্রি (FAUST) (21) দ্বারা সম্পূর্ণ অ্যানোটেশন ব্যবহার করেছি। ভুলভাবে বরাদ্দকৃত (PD1+ এবং PD1- টিউমার কোষের মিশ্রণ) বলে মনে হওয়া পপুলেশন এবং ধরে রাখা পপুলেশনগুলোকে একত্রিত করার জন্য আমরা আউটপুটটি ম্যানুয়ালি পরিচালনা করি। প্রতিটি নমুনায় গড়ে ২% এর বেশি কোষ রয়েছে, যার ফলে মোট ১১টি পপুলেশন তৈরি হয়।
লিউকোসাইট পৃথকীকরণ পণ্য থেকে পিবিএমসি (PBMC) আলাদা করার জন্য ফিকল গ্রেডিয়েন্ট ডেনসিটি সেন্ট্রিফিউগেশন ব্যবহার করা হয়েছিল (স্টেমসেল টেকনোলজিস)। প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুসারে, পিবিএমসি থেকে সিডি৮ মাইক্রোবিডস (মিলটেনি) ব্যবহার করে সিডি৮+ টি কোষ পৃথক করা হয়েছিল এবং ট্রান্সঅ্যাক্ট (মিলটেনি) ব্যবহার করে সম্পূর্ণ মাধ্যমে ২ সপ্তাহের জন্য সংখ্যাবৃদ্ধি করা হয়েছিল। কোষগুলোকে আইএল-৭ (১০ ন্যানোগ্রাম/মিলি; পেপ্রোটেক) যুক্ত সম্পূর্ণ মাধ্যমে ৫ দিন রাখা হয়েছিল এবং তারপর ট্রান্সঅ্যাক্ট দিয়ে পুনরায় উদ্দীপিত করা হয়েছিল। ৭ম দিনে, প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুসারে, পরপর তিন দফায় কোষগুলোকে সমৃদ্ধ করার জন্য হিউম্যান সিডি৪৫ মাইক্রোবিডস (মিলটেনি) ব্যবহার করা হয়েছিল। ফ্লো সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণের জন্য কোষগুলোকে অ্যালিকোট করা হয়েছিল (যেমন উপরে বর্ণনা করা হয়েছে), এবং এলসি-এমএস/এমএস বিশ্লেষণের জন্য দশ লক্ষ কোষকে তিনবার অ্যালিকোট করা হয়েছিল। নমুনাগুলোকে নীচে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে এলসি-এমএস/এমএস দ্বারা প্রক্রিয়াজাত করা হয়েছিল। আমরা ১,০০০ আয়ন সংখ্যা দিয়ে অনুপস্থিত মেটাবোলাইটের মান অনুমান করেছি। বিশ্লেষণের পূর্বে প্রতিটি নমুনাকে মোট আয়ন সংখ্যা (TIC) দ্বারা স্বাভাবিক করা হয়, লগারিদমিকভাবে রূপান্তরিত করা হয় এবং MetaboAnalystR-এ স্বয়ংক্রিয়ভাবে স্বাভাবিক করা হয়।
প্রতিটি রোগীর একক কোষের সাসপেনশন গলানো হয়েছিল এবং একটি ৪০ μm ফিল্টারের মাধ্যমে সম্পূর্ণ মিডিয়ামে (উপরে বর্ণিত পদ্ধতি অনুযায়ী) ফিল্টার করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে, CD8+, CD4+ এবং CD45- কোষের জন্য নমুনাগুলিকে সমৃদ্ধ করতে মাইক্রোবিডস (মিল্টেনি) ব্যবহার করে ম্যাগনেটিক বিড সেপারেশনের মাধ্যমে পরপর তিন রাউন্ড পজিটিভ সিলেকশন করা হয়েছিল (বরফের উপর রেখে)। সংক্ষেপে, কোষগুলিকে সেল এনরিচমেন্ট বাফারে (উপরে বর্ণিত পদ্ধতি অনুযায়ী) পুনরায় সাসপেন্ড করে গণনা করা হয়। কোষগুলিকে ৪°C তাপমাত্রায় ১৫ মিনিটের জন্য হিউম্যান CD8 বিডস, হিউম্যান CD4 বিডস বা হিউম্যান CD45 বিডস (মিল্টেনি)-এর সাথে ইনকিউবেট করা হয় এবং তারপর সেল এনরিচমেন্ট বাফার দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়। নমুনাটি LS কলামের (মিল্টেনি) মধ্য দিয়ে চালনা করা হয় এবং পজিটিভ ও নেগেটিভ অংশগুলি সংগ্রহ করা হয়। সময়কাল কমাতে এবং কোষ পুনরুদ্ধারের ধাপটিকে সর্বাধিক করতে, CD8- অংশটি CD4+ সমৃদ্ধকরণের দ্বিতীয় রাউন্ডের জন্য এবং CD4- অংশটি পরবর্তী CD45- সমৃদ্ধকরণের জন্য ব্যবহার করা হয়। পৃথকীকরণ প্রক্রিয়া চলাকালীন দ্রবণটিকে বরফের উপর রাখুন।
মেটাবোলাইট বিশ্লেষণের জন্য নমুনা প্রস্তুত করতে, কোষগুলোকে বরফ-ঠান্ডা লবণ দ্রবণ দিয়ে একবার ধোয়া হয়েছিল এবং প্রতিটি নমুনায় ১ মিলি ৮০% মিথানল যোগ করে ভর্টেক্স করা হয়েছিল ও তরল নাইট্রোজেনে দ্রুত হিমায়িত করা হয়েছিল। নমুনাগুলোকে তিনটি হিমায়িত-গলন চক্রের মধ্য দিয়ে নিয়ে যাওয়া হয়েছিল এবং ৪° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ১৫ মিনিটের জন্য ১৪,০০০ আরপিএম-এ সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। মেটাবোলাইটযুক্ত সুপারন্যাট্যান্ট শুকিয়ে যাওয়া পর্যন্ত বাষ্পীভূত করা হয়। মেটাবোলাইটগুলোকে ৫০ মাইক্রোলিটার ০.০৩% ফরমিক অ্যাসিডে পুনরায় দ্রবীভূত করে মেশানোর জন্য ভর্টেক্স করা হয় এবং তারপর আবর্জনা অপসারণের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়।
উপরে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে মেটাবোলাইট নিষ্কাশন করুন। মেটাবোলোমিক্স গবেষণার জন্য সুপারন্যাট্যান্ট একটি হাই পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি বোতলে স্থানান্তর করুন। ব্যাচ এফেক্ট প্রতিরোধ করার জন্য প্রতিটি নমুনাকে প্রায় একই সংখ্যক কোষ দিয়ে ট্রিট করতে একটি র‍্যান্ডম ট্রিটমেন্ট প্রোটোকল ব্যবহার করুন। আমরা AB SCIEX QTRAP 5500 ট্রিপল কোয়াড্রুপল মাস স্পেকট্রোমিটারে (50) পূর্বে প্রকাশিত গ্লোবাল মেটাবোলাইটের একটি গুণগত মূল্যায়ন করেছি। ক্রোমাটোগ্রাফিক বিশ্লেষণ এবং পিক এরিয়া ইন্টিগ্রেশন মাল্টিকোয়ান্ট সংস্করণ 2.1 সফটওয়্যার (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেমস সাইক্স) ব্যবহার করে করা হয়েছিল।
অনুপস্থিত মেটাবোলাইটের মান অনুমান করার জন্য 1000 এর একটি আয়ন গণনা ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং নমুনা প্রক্রিয়াকরণ থেকে যন্ত্রগত বিশ্লেষণের কারণে সৃষ্ট পরিবর্তনগুলি সংশোধন করার জন্য প্রতিটি সনাক্তকৃত মেটাবোলাইটের স্বাভাবিককৃত শীর্ষ ক্ষেত্রফল গণনা করতে প্রতিটি নমুনার TIC ব্যবহার করা হয়েছিল। TIC স্বাভাবিক করার পরে, লগারিদমিক রূপান্তর এবং স্বয়ংক্রিয় নর্ম লাইন স্কেলিংয়ের জন্য MetaboAnalystR(51) (ডিফল্ট প্যারামিটার) ব্যবহার করা হয়। আমরা নমুনার প্রকারের মধ্যে মেটাবোলোমের পার্থক্যের অনুসন্ধানমূলক বিশ্লেষণ করার জন্য vegan R প্যাকেজের সাথে PCA ব্যবহার করেছি, এবং রোগীদের বিশ্লেষণ করার জন্য আংশিক রিডানডেন্সি বিশ্লেষণ ব্যবহার করেছি। নমুনাগুলির মধ্যে ইউক্লিডীয় দূরত্বকে ক্লাস্টার করার জন্য একটি হিট ম্যাপ ডেনড্রোগ্রাম তৈরি করতে ওয়ার্ড পদ্ধতি ব্যবহার করুন। আমরা সমগ্র কোষের প্রকার এবং মাইক্রোএনভায়রনমেন্ট জুড়ে ভিন্নভাবে প্রচুর পরিমাণে থাকা মেটাবোলাইটগুলি সনাক্ত করতে প্রমিত মেটাবোলাইট প্রাচুর্যের উপর limma (52) ব্যবহার করেছি। ব্যাখ্যা সহজ করার জন্য, আমরা মডেলটি নির্দিষ্ট করতে গ্রুপ গড় প্যারামিটার ব্যবহার করি, এবং মাইক্রোএনভায়রনমেন্টের কোষের প্রকারগুলিকে প্রতিটি গ্রুপ হিসাবে বিবেচনা করি (n = 6 গ্রুপ); তাৎপর্য পরীক্ষার জন্য, আমরা প্রতিটি মেটাবোলাইটের তিনটি পুনরাবৃত্ত পরিমাপ করেছি। ভুল পুনরাবৃত্তি এড়ানোর জন্য, লিম্মা ডিজাইনে রোগীকে একটি বাধা হিসেবে অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল। বিভিন্ন রোগীর মধ্যে মেটাবোলাইটের পার্থক্য যাচাই করার জন্য, আমরা রোগীদের একটি নির্দিষ্ট উপায়ে অন্তর্ভুক্ত করে লিম্মা মডেলটি সামঞ্জস্য করেছি। আমরা কোষের ধরন এবং Padj-এর মাইক্রোএনভায়রনমেন্টের মধ্যে পূর্ব-নির্ধারিত বৈসাদৃশ্যের তাৎপর্য <0.05 (বেঞ্জামিনি-হকবার্গ সংশোধন) হিসেবে রিপোর্ট করছি।
মিলতেনি ডেড সেল রিমুভাল কিট (Miltenyi Dead Cell Removal Kit) ব্যবহার করে কোষের সজীবতা বৃদ্ধি করার পর (>৮০% কার্যক্ষমতা), একটি ১০x ৫′ জিন এক্সপ্রেশন প্রোটোকল ব্যবহার করে মোট জীবন্ত হিমায়িত অ্যাসাইটিস এবং টিউমারের নমুনাগুলোর উপর একক-কোষ ট্রান্সক্রিপটোম সিকোয়েন্সিং করা হয়েছিল। একই রকম টিউমার এবং অ্যাসাইটিসযুক্ত পাঁচটি কেস বিশ্লেষণ করা হয়েছিল, যদিও একটি টিউমার নমুনার কম কার্যক্ষমতার কারণে এটিকে অন্তর্ভুক্ত করা সম্ভব হয়নি। রোগীদের একাধিক নির্বাচন নিশ্চিত করার জন্য, আমরা ১০x ক্রোমিয়াম কন্ট্রোলারের লেনগুলোতে প্রতিটি রোগীর নমুনা একত্রিত করেছিলাম এবং অ্যাসাইটিস ও টিউমারের স্থানগুলো আলাদাভাবে বিশ্লেষণ করেছিলাম। সিকোয়েন্সিং-এর পর [ইলুমিনা হাইসিক ৪০০০ ২৮×৯৮ বিপি পেয়ার্ড এন্ড (পিই), কুইবেক জিনোম; টিউমার এবং অ্যাসাইটিসের জন্য যথাক্রমে প্রতি কোষে গড়ে 73,488 এবং 41,378 রিড]], আমরা CellSNP এবং Vireo (53) ব্যবহার করেছি (CellSNP-এর উপর ভিত্তি করে GRCh38 দ্বারা প্রদত্ত সাধারণ মানব SNP (VCF)-কে একটি দাতা পরিচয় দেওয়া হয়। আমরা রোগীর জিনোটাইপ স্থিতির (IBS) নিকটতম পরিচয় (IBS) অনুমান করার জন্য SNPRelate ব্যবহার করি, অনির্ধারিত কোষ এবং ডুপ্লেক্স হিসাবে চিহ্নিত কোষগুলিকে বাদ দিয়ে এবং অ্যাসাইটিস এবং টিউমার নমুনার মধ্যে মিলে যাওয়া দাতাগুলিকে (54)। এই কাজের উপর ভিত্তি করে, আমরা পরবর্তী বিশ্লেষণের জন্য টিউমার এবং অ্যাসাইটিসে প্রচুর কোষ প্রতিনিধিত্ব সহ তিনটি কেস রেখেছি। scater (55) এবং scran (56) BioConductor প্যাকেজিংয়ে একটি ব্যাপক পরিস্রাবণ ধাপ সম্পাদন করার পরে, এটি বিশ্লেষণের জন্য 6975 টি কোষ (যথাক্রমে টিউমার এবং অ্যাসাইটিস থেকে 2792 এবং 4183 টি কোষ) প্রদান করে। আমরা igraph-এর (57) জ্যাকার্ড দূরত্বের উপর ভিত্তি করে শেয়ার্ড নিকটতম প্রতিবেশী নেটওয়ার্ক (SNN) এর লুভাইন ক্লাস্টারিং ব্যবহার করি। এক্সপ্রেশনের মাধ্যমে কোষগুলোকে ক্লাস্টার করা হয়েছে। মার্কার জিনের এক্সপ্রেশনের উপর ভিত্তি করে ক্লাস্টারগুলোকে ম্যানুয়ালি সম্ভাব্য কোষের প্রকারে চিহ্নিত করা হয়েছিল এবং t-SNE দিয়ে দৃশ্যমান করা হয়েছিল। কম রাইবোসোমাল প্রোটিন এক্সপ্রেশনযুক্ত সাবক্লাস্টারগুলোকে বাদ দিয়ে, CD8A এবং GZMA-এর এক্সপ্রেশনের মাধ্যমে সাইটোটক্সিক টি কোষকে সংজ্ঞায়িত করা হয়। আমরা ইজার এট আল. (16)-এর প্রকাশিত ডেটা অ্যাক্সেস করেছি, যার মধ্যে তাদের t-SNE এমবেডিং অন্তর্ভুক্ত, যা ইমিউন কোষের মার্কার এবং NNMT এক্সপ্রেশনের মধ্যে এক্সপ্রেশন ওভারল্যাপ নিয়ন্ত্রণ করতে পারে।
ফিকল গ্রেডিয়েন্ট ডেনসিটি সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে লিউকোসাইট সেপারেশন প্রোডাক্টস (স্টেমসেল টেকনোলজিস) থেকে পিবিএমসি (PBMC) আলাদা করা হয়েছিল। সিডি৩ বিডস (মিলটেনি) ব্যবহার করে পিবিএমসি থেকে সিডি৩+ কোষ পৃথক করা হয়েছিল। এমএনএ (MNA)-এর উপস্থিতিতে বা অনুপস্থিতিতে, প্লেট-বাউন্ড সিডি৩ (৫μg/ml), সলিউবল সিডি২৮ (৩μg/ml) এবং আইএল-২ (৩০০ U/ml; প্রোলিউকিন) দিয়ে সিডি৩+ কোষগুলোকে সক্রিয় করা হয়েছিল। এক্সপ্যানশনের শেষ দিনে, ফ্লো সাইটোমেট্রির মাধ্যমে কোষের কার্যক্ষমতা (ফিক্সেবল ভায়াবিলিটি ডাই ইফ্লুর৪৫০, ইবায়োসায়েন্স) এবং প্রলিফারেশন (১২৩কাউন্ট ইবিডস, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) মূল্যায়ন করা হয়েছিল। GolgiStop ব্যবহার করে PMA (20 ng/ml) এবং আয়োনোমাইসিন (1μg/ml) দিয়ে কোষগুলোকে ৪ ঘন্টা ধরে উদ্দীপিত করে ইফেক্টর ফাংশন মূল্যায়ন করুন এবং CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4, BioLegend) এবং TNFα-ফ্লুরেসিন আইসোথায়োসায়ানেট (FITC) (MAb11, BD) পর্যবেক্ষণ করুন। qPCR এবং ChIP কোষগুলোকে PMA (20 ng/ml) এবং আয়োনোমাইসিন (1μg/ml) দিয়ে ৪ ঘন্টা ধরে উদ্দীপিত করুন। PMA (20 ng/ml) এবং আয়োনোমাইসিন (1μg/ml) দিয়ে ৪ ঘন্টা ধরে উদ্দীপিত করার আগে ও পরে ELISA সুপারন্যাট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল।
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ব্যবহার করে RNA পৃথক করার জন্য প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসরণ করুন। নমুনাটিকে সমজাতীয় করতে QIAshredder (QIAGEN) ব্যবহার করুন। পরিপূরক DNA (cDNA) সংশ্লেষণ করতে high-capacity RNA to cDNA kit (Thermo Fisher Scientific) ব্যবহার করুন। নিম্নলিখিত প্রোবগুলির সাহায্যে জিনের অভিব্যক্তি পরিমাপ করতে (প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুযায়ী) TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ব্যবহার করুন: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] এবং Hs01010726_m1 (SLC22A2)। নমুনাগুলো মাইক্রোঅ্যাম্প অপটিক্যাল ফিল্মসহ মাইক্রোঅ্যাম্প ফাস্ট অপটিক্যাল ৯৬-ওয়েল রিঅ্যাকশন প্লেটে (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেমস) স্টেপওয়ানপ্লাস রিয়েল-টাইম পিসিআর সিস্টেমে (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেমস) চালানো হয়েছিল। ৩৫-এর বেশি যেকোনো Ct মানকে শনাক্তকরণ সীমার ঊর্ধ্বে বলে গণ্য করা হয় এবং এটিকে অশনাক্তযোগ্য হিসেবে চিহ্নিত করা হয়।
পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতি (58) অনুযায়ী ChIP সম্পাদন করুন। সংক্ষেপে, কোষগুলিকে ফর্মালডিহাইড (চূড়ান্ত ঘনত্ব 1.42%) দিয়ে ট্রিট করা হয়েছিল এবং 10 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করা হয়েছিল। সম্পূরক সোয়েলিং বাফার (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl এবং 0.1% NP-40) ব্যবহার করে বরফের উপর 10 মিনিট রাখুন, তারপর বর্ণিত পদ্ধতি (58) অনুযায়ী ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন বাফারে পুনরায় সাসপেন্ড করুন। এরপর নমুনাটিকে নিম্নলিখিত চক্রগুলিতে সনিকেট করা হয়েছিল: 10 চক্র (20টি 1-সেকেন্ডের পালস) এবং 40 সেকেন্ডের একটি স্ট্যাটিক সময়। ChIP-গ্রেড ইমিউনোগ্লোবুলিন G (সেল সিগন্যালিং টেকনোলজি; 1μl), হিস্টোন H3 (সেল সিগন্যালিং টেকনোলজি; 3μl), NFAT (ইনভিট্রোজেন; 3μl) এবং SP1 (সেল সিগন্যালিং টেকনোলজি; 3μl) অ্যান্টিবডিগুলিকে নমুনার সাথে 4°CC তাপমাত্রায় সারারাত ঝাঁকিয়ে ইনকিউবেট করুন। নমুনাটির সাথে প্রোটিন এ বিডস (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ৪°C তাপমাত্রায় ১ ঘন্টা ধরে হালকা ঝাঁকুনি দিয়ে ইনকিউবেট করুন, তারপর ডিএনএ সমৃদ্ধ করার জন্য চেলেক্স বিডস (বায়ো-র‍্যাড) এবং প্রোটিন হজমের জন্য প্রোটিনেজ কে (থার্মো ফিশার) ব্যবহার করুন। পিসিআর দ্বারা TNFα প্রোমোটার শনাক্ত করা হয়েছিল: ফরওয়ার্ড, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; অপরদিকে, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (২০৭-বিপি প্রোডাক্ট)। ছবিগুলো ইমেজ ল্যাব (বায়ো-র‍্যাড) দ্বারা তৈরি করা হয়েছিল এবং ইমেজজে সফটওয়্যার ব্যবহার করে পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল।
উপরে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে সেল কালচার সুপারন্যাট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল। হিউম্যান TNFα ELISA কিট (ইনভিট্রোজেন), হিউম্যান IL-2 ELISA কিট (ইনভিট্রোজেন) এবং হিউম্যান IFN-γ ELISA কিট (অ্যাবক্যাম)-এর প্রস্তুতকারকের কার্যপ্রণালী অনুসারে পরিমাপ সম্পন্ন করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুযায়ী, TNFα এবং IL-2 শনাক্ত করার জন্য সুপারন্যাট্যান্টকে ১:১০০ অনুপাতে এবং IFN-γ শনাক্ত করার জন্য ১:৩ অনুপাতে লঘু করা হয়েছিল। ৪৫০ nm-এ অ্যাবজরবেন্স পরিমাপ করার জন্য EnVision 2104 মাল্টিলেবেল রিডার (পারকিনএলমার) ব্যবহার করা হয়েছিল।
ফিকল গ্রেডিয়েন্ট ডেনসিটি সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে লিউকোসাইট সেপারেশন প্রোডাক্টস (স্টেমসেল টেকনোলজিস) থেকে পিবিএমসি (PBMC) আলাদা করা হয়েছিল। সিডি৩ বিডস (মিলটেনি) ব্যবহার করে পিবিএমসি থেকে সিডি৩+ কোষ পৃথক করা হয়েছিল। এমএনএ (MNA)-এর উপস্থিতিতে বা অনুপস্থিতিতে, সিডি৩+ কোষগুলোকে প্লেট-বাউন্ড সিডি৩ (৫μg/ml), সলিউবল সিডি২৮ (৩μg/ml) এবং আইএল-২ (৩০০ U/ml; প্রোলিউকিন) দিয়ে ৩ দিন ধরে সক্রিয় করা হয়েছিল। ৩ দিন পর, কোষগুলো সংগ্রহ করে ০.৯% স্যালাইন দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয় এবং পেললেটটি দ্রুত হিমায়িত করা হয়। ১২৩কাউন্ট ই-বিডস ব্যবহার করে ফ্লো সাইটোমেট্রি (সাইটেক অরোরা; 3L-16V-14B-8R কনফিগারেশন) দ্বারা কোষ গণনা করা হয়েছিল।
উপরে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে মেটাবোলাইট নিষ্কাশন করুন। শুষ্ক নির্যাসটিকে ৪০০০ সেল ইকুইভ্যালেন্ট/μl ঘনত্বে পুনর্গঠন করা হয়েছিল। রিভার্সড-ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফি (১২৯০ ইনফিনিটি II, অ্যাজিলেন্ট টেকনোলজিস, সান্তা ক্লারা, সিএ) এবং করটেক্স টি৩ কলাম (২.১×১৫০ মিমি, কণার আকার ১.৬-μm, ছিদ্রের আকার ১২০-Å; #১৮৬০০৮৫০০, ওয়াটার্স) ব্যবহার করে নমুনাটি বিশ্লেষণ করুন। পোলার মাস স্পেকট্রোমিটার (৬৪৭০, অ্যাজিলেন্ট), যেখানে ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়োনাইজেশন পজিটিভ মোডে কাজ করে। মোবাইল ফেজ A হলো ০.১% ফরমিক অ্যাসিড (H2O-তে), মোবাইল ফেজ B হলো ৯০% অ্যাসিটোনাইট্রাইল, ০.১% ফরমিক অ্যাসিড। ১০০% A-এর জন্য LC গ্রেডিয়েন্ট ০ থেকে ২ মিনিট, ৯৯% B-এর জন্য ২ থেকে ৭.১ মিনিট এবং ৯৯% B-এর জন্য ৭.১ থেকে ৮ মিনিট। তারপর ০.৬ মিলি/মিনিট প্রবাহ হারে ৩ মিনিটের জন্য মোবাইল ফেজ A দিয়ে কলামটিকে পুনরায় সাম্যাবস্থায় আনা হয়। প্রবাহ হার ০.৪ মিলি/মিনিট এবং কলাম চেম্বারটি ৫০°C তাপমাত্রায় উত্তপ্ত করা হয়। রিটেনশন টাইম (RT) এবং ট্রান্সফরমেশন (RT = ০.৮৮২ মিনিট, ট্রান্সফরমেশন ১ = ১৩৭→৯৪.১, ট্রান্সফরমেশন ২ = ১৩৭→৯২, কনভার্সন ৩ = ১৩৭→৭৮) নির্ধারণ করতে MNA-এর বিশুদ্ধ রাসায়নিক স্ট্যান্ডার্ড (M320995, টরন্টো রিসার্চ কেমিক্যাল কোম্পানি, নর্থ ইয়র্ক, অন্টারিও, কানাডা) ব্যবহার করা হয়। যখন তিনটি ট্রানজিশনই সঠিক রিটেনশন টাইমে ঘটে, তখন সুনির্দিষ্টতা নিশ্চিত করার জন্য পরিমাণ নির্ধারণে ট্রানজিশন ১ ব্যবহার করা হয়। স্টক সলিউশন (১ মিগ্রা/মিলি) থেকে ছয়টি ধারাবাহিক লঘুকরণের মাধ্যমে এমএনএ (টরন্টো রিসার্চ কেমিক্যাল কোম্পানি)-এর স্ট্যান্ডার্ড কার্ভ তৈরি করা হয়েছিল, যার ফলে যথাক্রমে ০.১, ১.০, ১০ ও ১০০ ন্যানোগ্রাম/মিলি এবং ১.০ ও ১০ মাইক্রোগ্রাম/মিলি ঘনত্বের তরল স্ট্যান্ডার্ড পাওয়া যায়। এর শনাক্তকরণ সীমা হলো ১ ন্যানোগ্রাম/মিলি এবং রৈখিক প্রতিক্রিয়া ১০ ন্যানোগ্রাম/মিলি থেকে ১০ মাইক্রোগ্রাম/মিলি-এর মধ্যে। এলসি/এমএস বিশ্লেষণের জন্য নমুনা এবং স্ট্যান্ডার্ডের দুই মাইক্রোলিটার করে প্রতিটি ইনজেকশন ব্যবহার করা হয় এবং বিশ্লেষণ প্ল্যাটফর্মের স্থিতিশীলতা নিশ্চিত করার জন্য প্রতি আটটি ইনজেকশন পর পর একটি মিশ্র কোয়ালিটি কন্ট্রোল নমুনা চালানো হয়। এমএনএ দ্বারা ট্রিটমেন্ট করা সমস্ত কোষ নমুনার এমএনএ প্রতিক্রিয়া অ্যাসের রৈখিক সীমার মধ্যে ছিল। ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল ম্যাসহান্টার কোয়ান্টিটেটিভ অ্যানালাইসিস সফটওয়্যার (ভি৯.০, অ্যাজিলেন্ট) ব্যবহার করে।
দ্বিতীয় প্রজন্মের αFR-CAR কনস্ট্রাক্টটি সং এট আল. (59) থেকে নেওয়া হয়েছিল। সংক্ষেপে, কনস্ট্রাক্টটিতে নিম্নলিখিত উপাদানগুলি রয়েছে: CD8a লিডার সিকোয়েন্স, মানব αFR-নির্দিষ্ট একক-শৃঙ্খল পরিবর্তনশীল খণ্ড, CD8a হিঞ্জ এবং ট্রান্সমেমব্রেন অঞ্চল, CD27 ইন্ট্রাসেলুলার ডোমেইন এবং CD3z ইন্ট্রাসেলুলার ডোমেইন। সম্পূর্ণ CAR সিকোয়েন্সটি GenScript দ্বারা সংশ্লেষিত করা হয়েছিল, এবং তারপরে ট্রান্সডাকশন দক্ষতা মূল্যায়নের জন্য ব্যবহৃত GFP এক্সপ্রেশন ক্যাসেটের উজানে দ্বিতীয় প্রজন্মের লেন্টিভাইরাল এক্সপ্রেশন ভেক্টরে ক্লোন করা হয়েছিল।
HEK293T কোষ [আমেরিকান টাইপ কালচার কালেকশন (ATCC)]-এর ট্রান্সফেকশনের মাধ্যমে লেন্টিভাইরাস তৈরি করা হয়; এই কোষগুলো ১০% ফিটাল বোভাইন সিরাম (FBS) এবং ১% পেনস্ট্রেপ যুক্ত ডুলবেকো'স মডিফায়েড ঈগল মিডিয়ামে চাষ করা হয়। এতে CAR-GFP ভেক্টর এবং প্যাকেজিং প্লাজমিড (psPAX2 ও pMD2.G, Addgene) ব্যবহার করা হয় এবং লিপোফেকশন অ্যামাইন (Sigma-Aldrich) দিয়ে প্রস্তুত করা হয়। ট্রান্সফেকশনের ৪৮ ও ৭২ ঘণ্টা পর ভাইরাসযুক্ত সুপারন্যাট্যান্ট সংগ্রহ করে, ফিল্টার করা হয় এবং আল্ট্রাসেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে ঘনীভূত করা হয়। ট্রান্সডাকশনের আগ পর্যন্ত ঘনীভূত ভাইরাল সুপারন্যাট্যান্ট -৮০°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করুন।
ফিকল গ্রেডিয়েন্ট ডেনসিটি সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে সুস্থ দাতার লিউকোসাইট সেপারেশন প্রোডাক্ট (স্টেমসেল টেকনোলজিস) থেকে পিবিএমসি (PBMC) আলাদা করা হয়। পিবিএমসি থেকে সিডি৮+ (CD8+) কোষ পৃথক করার জন্য পজিটিভ সিলেকশন সিডি৮ মাইক্রোবিডস (মিলটেনি) ব্যবহার করুন। ট্রান্সঅ্যাক্ট (মিলটেনি) এবং টেক্সম্যাক্স মিডিয়ামে [মিলটেনি; যাতে ৩% তাপ-নিষ্ক্রিয় মানব সিরাম, ১% পেনস্ট্রেপ এবং আইএল-২ (৩০০ ইউ/মিলি) যোগ করা হয়েছে] টি কোষগুলোকে উদ্দীপিত করুন। উদ্দীপনার চব্বিশ ঘণ্টা পর, টি কোষগুলোকে লেন্টিভাইরাস (প্রতি ১০⁶ কোষে ১০ মাইক্রোলিটার ঘনীভূত ভাইরাস সুপারন্যাট্যান্ট) দ্বারা ট্রান্সডিউস করা হয়েছিল। সাইটেক অরোরাতে (এফএসসি (ফরওয়ার্ড স্ক্যাটার)/এসএসসি (সাইড স্ক্যাটার), সিঙ্গলেট, জিএফপি+) ট্রান্সডিউশনের ১ থেকে ৩ দিন পর, কমপক্ষে ৩০% ট্রান্সডিউশন দক্ষতা প্রদর্শনের জন্য কোষগুলোর জিএফপি এক্সপ্রেশন মূল্যায়ন করুন।
CAR-T কোষগুলোকে ইমিউনোকাল্ট (স্টেমসেল টেকনোলজিস; ১% পেনস্ট্রেপ সহ) মাধ্যমে নিম্নলিখিত শর্তে ২৪ ঘন্টা ধরে কালচার করা হয়েছিল: অপরিশোধিত, ২৫০ μM অ্যাডেনোসিন বা ১০ mM MNA দ্বারা পরিশোধিত। প্রিট্রিটমেন্টের পর, CAR-T কোষগুলোকে PBS দিয়ে ধুয়ে ২০,০০০ SK-OV-3 কোষের [ATCC; ম্যাককয় ৫এ মিডিয়ামে (সিগমা-অলড্রিচ) ১০% FBS এবং ১% পেনস্ট্রেপ সহ] সাথে ১০:১ অনুপাতে যুক্ত করা হয়েছিল। এই ইফেক্টর-টু-টার্গেট অনুপাতটি সম্পূরক ইমিউনোকাল্ট মিডিয়ামে ট্রিপ্লিকেট পদ্ধতিতে বিবর্ধন করা হয়েছিল। SK-OV-3 কোষ এবং ডিজিটালিস স্যাপোনিন (০.৫ মিলিগ্রাম/মিলি; সিগমা-অলড্রিচ) দ্বারা লাইস করা SK-OV-3 কোষগুলোকে যথাক্রমে নেগেটিভ এবং পজিটিভ কন্ট্রোল হিসেবে ব্যবহার করা হয়েছিল। ২৪ ঘন্টা সহ-চাষের পর, সুপারন্যাট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) অনুসারে ল্যাকটেট ডিহাইড্রোজিনেজ (LDH) পরিমাপ করা হয়েছিল। LDH সুপারন্যাট্যান্টকে LDH বাফারে ১:৫০ অনুপাতে লঘু করা হয়েছিল। নিম্নলিখিত সূত্র ব্যবহার করে কোষ হত্যার শতাংশ পরিমাপ করা হয়েছিল: কোষ হত্যার শতাংশ = সংশোধনের শতাংশ / সর্বোচ্চ কোষ হত্যার হার x ১০০%, যেখানে সংশোধনের শতাংশ = সহ-চাষ-শুধুমাত্র টি কোষ, এবং সর্বোচ্চ কোষ হত্যার হার = পজিটিভ কন্ট্রোল-নেগেটিভ কন্ট্রোল।
পাঠ্য বা উপকরণ ও পদ্ধতি অংশে বর্ণিত অনুযায়ী, পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণের জন্য গ্রাফপ্যাড প্রিজম ৮, মাইক্রোসফট এক্সেল বা আর ভি৩.৬.০ ব্যবহার করুন। যদি একই রোগীর কাছ থেকে একাধিক নমুনা সংগ্রহ করা হয় (যেমন অ্যাসাইটিস এবং টিউমার), তবে আমরা প্রয়োজন অনুযায়ী পেয়ার্ড টি টেস্ট ব্যবহার করি অথবা রোগীকে একটি লিনিয়ার বা জেনারেলাইজড মডেলে র‍্যান্ডম এফেক্ট হিসেবে অন্তর্ভুক্ত করি। মেটাবোলোমিক্স বিশ্লেষণের জন্য, ইম্পর্টেন্স টেস্টটি তিনবার করা হয়।
এই প্রবন্ধের সম্পূরক উপকরণের জন্য, অনুগ্রহ করে http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 দেখুন।
এটি ক্রিয়েটিভ কমন্স অ্যাট্রিবিউশন-নন-কমার্শিয়াল লাইসেন্সের শর্তাবলীর অধীনে বিতরণ করা একটি উন্মুক্ত প্রবেশাধিকার নিবন্ধ, যা যেকোনো মাধ্যমে এর ব্যবহার, বিতরণ এবং পুনরুৎপাদনের অনুমতি দেয়, যতক্ষণ পর্যন্ত চূড়ান্ত ব্যবহারটি বাণিজ্যিক লাভের জন্য না হয় এবং মূল কাজটি সঠিক থাকার শর্ত থাকে। তথ্যসূত্র।
দ্রষ্টব্য: আমরা শুধুমাত্র আপনার ইমেল ঠিকানাটি এই কারণে প্রদান করতে অনুরোধ করছি, যাতে আপনি যাকে এই পেজটি সুপারিশ করছেন, তিনি যেন জানতে পারেন যে আপনি চান তিনি ইমেলটি দেখুন এবং এটি কোনো স্প্যাম নয়। আমরা কোনো ইমেল ঠিকানা সংগ্রহ করব না।
আপনি একজন পরিদর্শক কিনা তা যাচাই করতে এবং স্বয়ংক্রিয় স্প্যাম জমা হওয়া রোধ করতে এই প্রশ্নটি ব্যবহার করা হয়।
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Luren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. N. J. R. B. বেলন) ডিবেরার্ডিনিস), রাসেল জি. জোন্স (রাসেল জি. জোন্স), ফিনিয়াস টি. হ্যামিল্টন (ফিনিয়াস টি।
এমএনএ টি কোষের রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা দমনে ভূমিকা রাখে এবং এটি মানুষের ক্যান্সারের চিকিৎসার জন্য একটি সম্ভাব্য ইমিউনোথেরাপি লক্ষ্যবস্তু হিসেবে বিবেচিত হতে পারে।
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Luren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. N. J. R. B. বেলন) ডিবেরার্ডিনিস), রাসেল জি. জোন্স (রাসেল জি. জোন্স), ফিনিয়াস টি. হ্যামিল্টন (ফিনিয়াস টি।
এমএনএ টি কোষের রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা দমনে ভূমিকা রাখে এবং এটি মানুষের ক্যান্সারের চিকিৎসার জন্য একটি সম্ভাব্য ইমিউনোথেরাপি লক্ষ্যবস্তু হিসেবে বিবেচিত হতে পারে।
©2021 আমেরিকান অ্যাসোসিয়েশন ফর দ্য অ্যাডভান্সমেন্ট অফ সায়েন্স। সমস্ত অধিকার সংরক্ষিত AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef এবং COUNTER এর অংশীদার। Science Advances ISSN 2375-2548.