টিউমার মাইক্রোএনভায়রনমেন্ট (TME) এর একটি প্রধান বৈশিষ্ট্য হল ইমিউনোমোডুলেটরি মেটাবোলাইট, কিন্তু কিছু ব্যতিক্রম ছাড়া, তাদের পরিচয় মূলত অজানাই রয়ে গেছে। এখানে, আমরা উচ্চ-গ্রেড সিরাস কার্সিনোমা (HGSC) রোগীদের টিউমার এবং অ্যাসাইট থেকে টিউমার এবং টি কোষ বিশ্লেষণ করেছি যাতে এই বিভিন্ন TME কম্পার্টমেন্টের বিপাক প্রকাশ করা যায়। অ্যাসাইট এবং টিউমার কোষের মধ্যে ব্যাপক বিপাকীয় পার্থক্য রয়েছে। অ্যাসাইটগুলির তুলনায়, টিউমার-অনুপ্রবেশকারী টি কোষগুলি 1-মিথাইলনিকোটিনামাইড (MNA) তে উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ হয়। যদিও T কোষে MNA এর মাত্রা বৃদ্ধি পায়, নিকোটিনামাইড N-মিথাইলট্রান্সফেরেজ (একটি এনজাইম যা S-adenosylmethionine থেকে নিকোটিনামাইডে মিথাইল গ্রুপ স্থানান্তরকে অনুঘটক করে) এর প্রকাশ ফাইব্রোব্লাস্ট এবং টিউমার কোষের মধ্যে সীমাবদ্ধ। কার্যকরীভাবে, MNA টি কোষগুলিকে টিউমার-প্রচারকারী সাইটোকাইন টিউমার নেক্রোসিস ফ্যাক্টর আলফা নিঃসরণ করতে প্ররোচিত করে। অতএব, TME-প্রাপ্ত MNA টি কোষের রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা নিয়ন্ত্রণে অবদান রাখে এবং মানুষের ক্যান্সারের চিকিৎসার জন্য একটি সম্ভাব্য ইমিউনোথেরাপি লক্ষ্য উপস্থাপন করে।
টিউমার থেকে প্রাপ্ত বিপাকগুলি টিউমার-বিরোধী রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতার উপর গভীর প্রতিরোধমূলক প্রভাব ফেলতে পারে এবং ক্রমবর্ধমান প্রমাণ দেখায় যে তারা রোগের অগ্রগতির জন্য একটি মূল চালিকা শক্তি হিসাবেও কাজ করতে পারে (1)। ওয়ারবার্গ প্রভাব ছাড়াও, সাম্প্রতিক কাজ টিউমার কোষের বিপাকীয় অবস্থা এবং টিউমার মাইক্রোএনভায়রনমেন্ট (TME) এর রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতার সাথে এর সম্পর্ক চিহ্নিত করতে শুরু করেছে। মাউস মডেল এবং মানব টি কোষের উপর গবেষণায় দেখা গেছে যে গ্লুটামিন বিপাক (2), অক্সিডেটিভ বিপাক (3) এবং গ্লুকোজ বিপাক (4) বিভিন্ন রোগ প্রতিরোধ কোষের উপগোষ্ঠীর উপর স্বাধীনভাবে কাজ করতে পারে। এই পথগুলিতে বেশ কয়েকটি বিপাক টি কোষের টিউমার-বিরোধী কার্যকারিতাকে বাধা দেয়। এটি প্রমাণিত হয়েছে যে কোএনজাইম টেট্রাহাইড্রোবায়োপটেরিন (BH4) এর অবরোধ টি কোষের বিস্তারকে ক্ষতিগ্রস্ত করতে পারে এবং শরীরে BH4 এর বৃদ্ধি CD4 এবং CD8 দ্বারা মধ্যস্থতাকারী টিউমার-বিরোধী রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতাকে বাড়িয়ে তুলতে পারে। এছাড়াও, BH4 (5) প্রয়োগের মাধ্যমে কাইনুরেনিনের ইমিউনোসপ্রেসিভ প্রভাব থেকে মুক্তি পাওয়া যেতে পারে। আইসোসিট্রেট ডিহাইড্রোজেনেস (IDH) মিউট্যান্ট গ্লিওব্লাস্টোমাতে, এন্যান্টিওমেটাবলিক (R)-2-হাইড্রোক্সিগ্লুটারেট (R-2-HG) এর নিঃসরণ টি কোষের সক্রিয়করণ, বিস্তার এবং সাইটোলাইসিস কার্যকলাপকে বাধা দেয় (6)। সম্প্রতি, এটি দেখানো হয়েছে যে গ্লাইকোলাইসিসের একটি উপজাত মিথাইলগ্লায়ক্সাল, মাইলয়েড উৎপত্তির দমনকারী কোষ দ্বারা উত্পাদিত হয় এবং মিথাইলগ্লায়ক্সালের টি কোষ স্থানান্তর ইফেক্টর টি কোষের কার্যকারিতাকে বাধা দিতে পারে। চিকিৎসায়, মিথাইলগ্লায়ক্সালের নিরপেক্ষকরণ মাইলয়েড-প্রাপ্ত দমনকারী কোষ (MDSC) এর কার্যকলাপকে অতিক্রম করতে পারে এবং মাউস মডেলগুলিতে সিনারজিস্টিকভাবে চেকপয়েন্ট ব্লকেড থেরাপিকে উন্নত করতে পারে (7)। এই গবেষণাগুলি সম্মিলিতভাবে টি কোষের কার্যকারিতা এবং কার্যকলাপ নিয়ন্ত্রণে TME-প্রাপ্ত বিপাকগুলির মূল ভূমিকার উপর জোর দেয়।
ডিম্বাশয়ের ক্যান্সারে টি কোষের কর্মহীনতার ব্যাপকভাবে রিপোর্ট করা হয়েছে (8)। ​​এটি আংশিকভাবে হাইপোক্সিয়া এবং অস্বাভাবিক টিউমার ভাস্কুলেচারের অন্তর্নিহিত বিপাকীয় বৈশিষ্ট্যের কারণে (9), যার ফলে গ্লুকোজ এবং ট্রিপটোফান ল্যাকটিক অ্যাসিড এবং কাইনুরেনিনের মতো উপজাতগুলিতে রূপান্তরিত হয়। অতিরিক্ত এক্সট্রাকোষীয় ল্যাকটেট ইন্টারফেরন-γ (IFN-γ) উৎপাদন হ্রাস করে এবং মাইলোসাপ্রেসিভ সাবগ্রুপগুলির পার্থক্যকে চালিত করে (10, 11)। ট্রিপটোফানের ব্যবহার সরাসরি টি কোষের বিস্তারকে বাধা দেয় এবং টি কোষ রিসেপ্টর সংকেতকে বাধা দেয় (12-14)। এই পর্যবেক্ষণগুলি সত্ত্বেও, ইন ভিট্রো টি কোষ সংস্কৃতিতে অপ্টিমাইজড মিডিয়া ব্যবহার করে বা ভিভোতে হোমোলোগাস মাউস মডেলগুলিতে সীমাবদ্ধ ব্যবহার করে ইমিউন বিপাককে ঘিরে প্রচুর কাজ করা হয়েছিল, যার কোনওটিই মানব ক্যান্সারের ভিন্নতা এবং শারীরবৃত্তীয় ম্যাক্রো এবং মাইক্রো পরিবেশকে সম্পূর্ণরূপে প্রতিফলিত করে না।
ডিম্বাশয়ের ক্যান্সারের একটি সাধারণ বৈশিষ্ট্য হল পেরিটোনিয়াল বিস্তার এবং অ্যাসাইটের উপস্থিতি। অ্যাসাইটে কোষের তরল জমা হওয়া উন্নত রোগ এবং দুর্বল পূর্বাভাসের সাথে সম্পর্কিত (15)। প্রতিবেদন অনুসারে, এই অনন্য অংশটি হাইপোক্সিক, এতে উচ্চ মাত্রার ভাস্কুলার এন্ডোথেলিয়াল গ্রোথ ফ্যাক্টর (VEGF) এবং ইন্ডোলেমাইন 2,3-ডাইঅক্সিজেনেস (IDO) রয়েছে এবং এটি T নিয়ন্ত্রক কোষ এবং মাইলয়েড ইনহিবিটরি কোষ দ্বারা অনুপ্রবেশিত হয় (15-18)। অ্যাসাইটের বিপাকীয় পরিবেশ টিউমারের থেকে আলাদা হতে পারে, তাই পেরিটোনিয়াল স্পেসে টি কোষের পুনঃপ্রোগ্রামিং অস্পষ্ট। এছাড়াও, টিউমার পরিবেশে উপস্থিত অ্যাসাইট এবং বিপাকীয় পদার্থের মধ্যে মূল পার্থক্য এবং বৈচিত্র্য রোগ প্রতিরোধক কোষের অনুপ্রবেশ এবং টিউমারে তাদের কার্যকারিতাকে বাধাগ্রস্ত করতে পারে এবং আরও গবেষণা প্রয়োজন।
এই সমস্যাগুলি সমাধানের জন্য, আমরা বিভিন্ন ধরণের কোষ (CD4 + এবং CD8 + T কোষ সহ) অধ্যয়ন করার জন্য একটি সংবেদনশীল কোষ বিচ্ছেদ এবং তরল ক্রোমাটোগ্রাফি ট্যান্ডেম মাস স্পেকট্রোমেট্রি (LC-MS/MS) পদ্ধতি তৈরি করেছি। এর বিপাকগুলি রোগীর একই অ্যাসাইট এবং টিউমার পরিবেশে কোষগুলিকে বিস্তৃত করে। আমরা এই পদ্ধতিটি উচ্চ-মাত্রিক প্রবাহ সাইটোমেট্রি এবং একক-কোষ RNA সিকোয়েন্সিং (scRNA-seq) এর সাথে একত্রে ব্যবহার করি যাতে এই মূল জনসংখ্যার বিপাকীয় অবস্থার একটি অত্যন্ত সমাধানযোগ্য প্রতিকৃতি প্রদান করা যায়। এই পদ্ধতিটি টিউমার টি কোষে 1-মিথাইলনিকোটিনামাইড (MNA) এর স্তরে উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি প্রকাশ করেছে এবং ইন ভিট্রো পরীক্ষায় দেখা গেছে যে T কোষের কার্যকারিতার উপর MNA এর ইমিউনোমোডুলেটরি প্রভাব আগে অজানা ছিল। সাধারণভাবে, এই পদ্ধতিটি টিউমার এবং ইমিউন কোষের মধ্যে পারস্পরিক বিপাকীয় মিথস্ক্রিয়া প্রকাশ করে এবং ইমিউন নিয়ন্ত্রণ বিপাক সম্পর্কে অনন্য অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে, যা T কোষ-ভিত্তিক ডিম্বাশয়ের ক্যান্সার ইমিউনোথেরাপির চিকিৎসার সুযোগের জন্য কার্যকর হতে পারে।
আমরা উচ্চ-মাত্রিক প্রবাহ সাইটোমেট্রি ব্যবহার করে একই সাথে গ্লুকোজ গ্রহণের পরিমাণ নির্ণয় করেছি [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) পাশাপাশি সাধারণ চিহ্নিতকারী যা রোগ প্রতিরোধক কোষ এবং টিউমার কোষের জনসংখ্যার মধ্যে পার্থক্য করে (টেবিল S2 এবং চিত্র S1A)। এই বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে T কোষের তুলনায়, অ্যাসাইট এবং টিউমার কোষের গ্লুকোজ গ্রহণের মাত্রা বেশি, তবে মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপে কম পার্থক্য রয়েছে। টিউমার কোষের গড় গ্লুকোজ গ্রহণ [CD45-EpCAM (EpCAM)+] T কোষের তুলনায় তিন থেকে চার গুণ এবং CD4 + T কোষের গড় গ্লুকোজ গ্রহণ CD8 + T কোষের তুলনায় 1.2 গুণ, যা নির্দেশ করে যে একই TME তেও টিউমার অনুপ্রবেশকারী লিম্ফোসাইট (TIL) এর বিভিন্ন বিপাকীয় প্রয়োজনীয়তা রয়েছে (চিত্র 1A)। বিপরীতে, টিউমার কোষে মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ CD4 + T কোষের অনুরূপ, এবং উভয় কোষের মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ CD8 + T কোষের তুলনায় বেশি (চিত্র 1B)। সাধারণভাবে, এই ফলাফলগুলি বিপাকীয় স্তর প্রকাশ করে। টিউমার কোষের বিপাকীয় কার্যকলাপ CD4 + T কোষের তুলনায় বেশি এবং CD4 + T কোষের বিপাকীয় কার্যকলাপ CD8 + T কোষের তুলনায় বেশি। কোষের ধরণ জুড়ে এই প্রভাব থাকা সত্ত্বেও, টিউমারের তুলনায় CD4 + এবং CD8 + T কোষের বিপাকীয় অবস্থা বা অ্যাসাইটে তাদের আপেক্ষিক অনুপাতের মধ্যে কোনও সামঞ্জস্যপূর্ণ পার্থক্য নেই (চিত্র 1C)। বিপরীতে, CD45-কোষ ভগ্নাংশে, অ্যাসাইটের তুলনায় টিউমারে EpCAM+ কোষের অনুপাত বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 1D)। আমরা EpCAM+ এবং EpCAM- কোষের উপাদানগুলির মধ্যে একটি স্পষ্ট বিপাকীয় পার্থক্যও লক্ষ্য করেছি। EpCAM+ (টিউমার) কোষগুলিতে EpCAM- কোষের তুলনায় গ্লুকোজ গ্রহণ এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ বেশি থাকে, যা TME-তে টিউমার কোষে ফাইব্রোব্লাস্টের বিপাকীয় কার্যকলাপের তুলনায় অনেক বেশি (চিত্র 1, E এবং F)।
(A এবং B) গ্লুকোজ গ্রহণের মধ্যম প্রতিপ্রভ তীব্রতা (MFI) (2-NBDG) (A) এবং CD4 + T কোষের মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ (MitoTracker গাঢ় লাল) (B) প্রতিনিধি গ্রাফ (বামে) এবং সারণীকৃত তথ্য (ডানে), অ্যাসাইট এবং টিউমার থেকে CD8 + T কোষ এবং EpCAM + CD45-টিউমার কোষ। (C) অ্যাসাইট এবং টিউমারে CD4 + এবং CD8 + কোষের (CD3 + T কোষের) অনুপাত। (D) অ্যাসাইট এবং টিউমারে EpCAM + টিউমার কোষের অনুপাত (CD45−)। (E এবং F) EpCAM + CD45-টিউমার এবং EpCAM-CD45-ম্যাট্রিক্স গ্লুকোজ গ্রহণ (2-NBDG) (E) এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ (MitoTracker গাঢ় লাল) (F) প্রতিনিধি গ্রাফ (বামে) এবং সারণীকৃত তথ্য (ডানে) অ্যাসাইট এবং টিউমার কোষ। (G) প্রবাহ সাইটোমেট্রি দ্বারা CD25, CD137 এবং PD1 প্রকাশের প্রতিনিধি গ্রাফ। (H এবং I) CD25, CD137 এবং PD1 এক্সপ্রেশন CD4 + T কোষ (H) এবং CD8 + T কোষ (I) এর উপর। (J এবং K) CCR7 এবং CD45RO এর এক্সপ্রেশনের উপর ভিত্তি করে সাদাসিধা, কেন্দ্রীয় মেমোরি (Tcm), ইফেক্টর (Teff) এবং ইফেক্টর মেমোরি (Tem) ফেনোটাইপ। অ্যাসাইট এবং টিউমারে CD4 + T কোষ (J) এবং CD8 + T কোষ (K) এর প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র (বামে) এবং ট্যাবুলার ডেটা (ডানে)। জোড়াযুক্ত টি-পরীক্ষা (*P<0.05, **P<0.01 এবং ***P<0.001) দ্বারা নির্ধারিত P মান। লাইনটি মিলিত রোগীদের প্রতিনিধিত্ব করে (n = 6)। FMO, ফ্লুরোসেন্স মাইনাস ওয়ান; MFI, মিডিয়ান ফ্লুরোসেন্স তীব্রতা।
আরও বিশ্লেষণে অত্যন্ত দ্রবীভূত T কোষের ফেনোটাইপিক অবস্থার মধ্যে অন্যান্য উল্লেখযোগ্য পার্থক্য প্রকাশ পেয়েছে। টিউমারে সক্রিয় (চিত্র 1, G থেকে I) এবং ইফেক্টর মেমোরি (চিত্র 1, J এবং K) অ্যাসাইট (CD3 + T কোষের অনুপাত) এর তুলনায় অনেক বেশি ঘন ঘন দেখা যায়। একইভাবে, অ্যাক্টিভেশন মার্কার (CD25 এবং CD137) এবং ডিপ্লেশন মার্কার [প্রোগ্রামড সেল ডেথ প্রোটিন 1 (PD1)] এর অভিব্যক্তি দ্বারা ফিনোটাইপ বিশ্লেষণ করে দেখা গেছে যে যদিও এই জনসংখ্যার বিপাকীয় বৈশিষ্ট্যগুলি ভিন্ন (চিত্র S1, B থেকে E), কিন্তু সাদাসিধা, ইফেক্টর বা মেমোরি সাবসেট (চিত্র S1, F থেকে I) এর মধ্যে কোনও উল্লেখযোগ্য বিপাকীয় পার্থক্য ধারাবাহিকভাবে পরিলক্ষিত হয়নি। এই ফলাফলগুলি স্বয়ংক্রিয়ভাবে কোষের ফেনোটাইপ (21) নির্ধারণ করার জন্য মেশিন লার্নিং পদ্ধতি ব্যবহার করে নিশ্চিত করা হয়েছিল, যা রোগীর অ্যাসাইটগুলিতে (চিত্র S2A) বিপুল সংখ্যক অস্থি মজ্জা কোষের (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) উপস্থিতি আরও প্রকাশ করেছে। চিহ্নিত সকল কোষের প্রকারের মধ্যে, এই মাইলয়েড কোষের জনসংখ্যা সর্বোচ্চ গ্লুকোজ গ্রহণ এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ দেখিয়েছে (চিত্র S2, B থেকে G)। এই ফলাফলগুলি HGSC রোগীদের অ্যাসাইট এবং টিউমারে পাওয়া একাধিক কোষের প্রকারের মধ্যে শক্তিশালী বিপাকীয় পার্থক্য তুলে ধরে।
TIL-এর মেটাবোনমিক বৈশিষ্ট্যগুলি বোঝার ক্ষেত্রে প্রধান চ্যালেঞ্জ হল টিউমার থেকে পর্যাপ্ত বিশুদ্ধতা, গুণমান এবং পরিমাণের T কোষের নমুনা আলাদা করার প্রয়োজনীয়তা। সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে প্রবাহ সাইটোমেট্রির উপর ভিত্তি করে বাছাই এবং পুঁতি সমৃদ্ধকরণ পদ্ধতিগুলি কোষীয় বিপাক প্রোফাইলে পরিবর্তন আনতে পারে (22-24)। এই সমস্যাটি কাটিয়ে ওঠার জন্য, আমরা LC-MS/MS দ্বারা বিশ্লেষণের আগে অস্ত্রোপচারের মাধ্যমে পুঁতিযুক্ত মানব ডিম্বাশয়ের ক্যান্সার থেকে TIL কে আলাদা এবং বিচ্ছিন্ন করার জন্য পুঁতি সমৃদ্ধকরণ পদ্ধতিটি অপ্টিমাইজ করেছি (উপাদান এবং পদ্ধতি দেখুন; চিত্র 2A)। বিপাকীয় পরিবর্তনের উপর এই প্রোটোকলের সামগ্রিক প্রভাব মূল্যায়ন করার জন্য, আমরা উপরের পুঁতি পৃথকীকরণ পদক্ষেপের পরে সুস্থ দাতাদের দ্বারা সক্রিয় T কোষের মেটাবোলাইট প্রোফাইলগুলিকে এমন কোষগুলির সাথে তুলনা করেছি যেগুলি পুঁতি পৃথক করা হয়নি কিন্তু বরফের উপর রয়ে গেছে। এই মান নিয়ন্ত্রণ বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে এই দুটি অবস্থার মধ্যে একটি উচ্চ সম্পর্ক রয়েছে (r = 0.77), এবং 86টি বিপাকের গ্রুপের প্রযুক্তিগত পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা উচ্চ পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা (চিত্র 2B)। অতএব, এই পদ্ধতিগুলি কোষের ধরণের সমৃদ্ধকরণের মধ্য দিয়ে যাওয়া কোষগুলিতে সঠিক বিপাক বিশ্লেষণ করতে পারে, এইভাবে HGSC-তে নির্দিষ্ট বিপাক সনাক্তকরণের জন্য প্রথম উচ্চ-রেজোলিউশন প্ল্যাটফর্ম প্রদান করে, যার ফলে লোকেরা কোষের নির্দিষ্টতা যৌন বিপাক প্রোগ্রাম সম্পর্কে আরও গভীর ধারণা অর্জন করতে সক্ষম হয়।
(A) চৌম্বকীয় পুঁতির সমৃদ্ধির পরিকল্পিত চিত্র। LC-MS/MS দ্বারা বিশ্লেষণের আগে, কোষগুলি পরপর তিনটি চৌম্বকীয় পুঁতির সমৃদ্ধির মধ্য দিয়ে যাবে অথবা বরফের উপর থাকবে। (B) বিপাকের প্রাচুর্যের উপর সমৃদ্ধির ধরণের প্রভাব। প্রতিটি সমৃদ্ধির ধরণের জন্য তিনটি পরিমাপের গড় ± SE। ধূসর রেখাটি 1:1 সম্পর্ককে প্রতিনিধিত্ব করে। অক্ষ লেবেলে দেখানো পুনরাবৃত্তি পরিমাপের আন্তঃ-শ্রেণীর পারস্পরিক সম্পর্ক (ICC)। NAD, নিকোটিনামাইড অ্যাডেনিন ডাইনোক্লিওটাইড। (C) রোগীর বিপাক বিশ্লেষণের কর্মপ্রবাহের পরিকল্পিত চিত্র। রোগীদের কাছ থেকে অ্যাসাইট বা টিউমার সংগ্রহ করা হয় এবং ক্রিওপ্রিজারভ করা হয়। প্রতিটি নমুনার একটি ছোট অংশ প্রবাহ সাইটোমেট্রি দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল, যখন অবশিষ্ট নমুনাগুলি CD4+, CD8+ এবং CD45- কোষের জন্য তিনটি সমৃদ্ধির মধ্য দিয়ে গেছে। এই কোষ ভগ্নাংশগুলি LC-MS/MS ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। (D) মানসম্মত বিপাকীয় প্রাচুর্যের তাপ মানচিত্র। ডেনড্রোগ্রাম নমুনাগুলির মধ্যে ইউক্লিডীয় দূরত্বের ওয়ার্ডের ক্লাস্টারিংকে প্রতিনিধিত্ব করে। (ঙ) নমুনা বিপাক মানচিত্রের প্রধান উপাদান বিশ্লেষণ (PCA), প্রতিটি নমুনার তিনটি প্রতিলিপি দেখায়, একই রোগীর নমুনাগুলি একটি লাইন দ্বারা সংযুক্ত করা হয়। (চ) রোগীর উপর শর্তযুক্ত নমুনার বিপাক প্রোফাইলের PCA (অর্থাৎ, আংশিক রিডানডেন্সি ব্যবহার করে); নমুনার ধরণটি উত্তল হাল দ্বারা সীমাবদ্ধ। PC1, প্রধান উপাদান 1; PC2, প্রধান উপাদান 2।
এরপর, আমরা ছয়জন HGSC রোগীর প্রাথমিক অ্যাসাইট এবং টিউমারে CD4 +, CD8 + এবং CD45-কোষ ভগ্নাংশের 99টি বিপাক বিশ্লেষণ করার জন্য এই সমৃদ্ধকরণ পদ্ধতিটি প্রয়োগ করেছি (চিত্র 2C, চিত্র S3A এবং টেবিল S3 এবং S4)। জীবন্ত কোষের মূল বৃহৎ নমুনার 2% থেকে 70% পর্যন্ত আগ্রহের জনসংখ্যা রয়েছে এবং রোগীদের মধ্যে কোষের অনুপাত ব্যাপকভাবে পরিবর্তিত হয়। পুঁতিগুলি পৃথক করার পরে, সমৃদ্ধ ভগ্নাংশ (CD4+, CD8+ বা CD45-) গড়ে নমুনার সমস্ত জীবন্ত কোষের 85% এরও বেশি। এই সমৃদ্ধকরণ পদ্ধতিটি আমাদের মানব টিউমার টিস্যু বিপাক থেকে কোষের জনসংখ্যা বিশ্লেষণ করতে দেয়, যা বৃহৎ নমুনা থেকে করা অসম্ভব। এই প্রোটোকল ব্যবহার করে, আমরা নির্ধারণ করেছি যে l-kynurenine এবং adenosine, এই দুটি সু-বৈশিষ্ট্যযুক্ত ইমিউনোসপ্রেসিভ বিপাক টিউমার T কোষ বা টিউমার কোষে উন্নত ছিল (চিত্র S3, B এবং C)। অতএব, এই ফলাফলগুলি রোগীর টিস্যুতে জৈবিকভাবে গুরুত্বপূর্ণ বিপাক খুঁজে পেতে আমাদের কোষ পৃথকীকরণ এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি প্রযুক্তির বিশ্বস্ততা এবং ক্ষমতা প্রদর্শন করে।
আমাদের বিশ্লেষণে রোগীদের মধ্যে এবং তাদের মধ্যে কোষের ধরণের একটি শক্তিশালী বিপাকীয় বিভাজনও প্রকাশিত হয়েছে (চিত্র 2D এবং চিত্র S4A)। বিশেষ করে, অন্যান্য রোগীদের তুলনায়, রোগী 70 বিভিন্ন বিপাকীয় বৈশিষ্ট্য দেখিয়েছেন (চিত্র 2E এবং চিত্র S4B), যা নির্দেশ করে যে রোগীদের মধ্যে যথেষ্ট বিপাকীয় বৈচিত্র্য থাকতে পারে। এটি লক্ষণীয় যে অন্যান্য রোগীদের (1.2 থেকে 2 লিটার; টেবিল S1) তুলনায়, রোগী 70 (80 মিলি) মোট অ্যাসাইটের পরিমাণ কম ছিল। প্রধান উপাদান বিশ্লেষণের সময় (উদাহরণস্বরূপ, আংশিক রিডানডেন্সি বিশ্লেষণ ব্যবহার করে) আন্তঃরোগী বৈচিত্র্যের নিয়ন্ত্রণ কোষের ধরণের মধ্যে সামঞ্জস্যপূর্ণ পরিবর্তন দেখায় এবং কোষের ধরণের এবং/অথবা মাইক্রোএনভায়রনমেন্ট স্পষ্টভাবে বিপাক প্রোফাইল অনুসারে একত্রিত হয় (চিত্র 2F)। একক মেটাবোলাইটের বিশ্লেষণ এই প্রভাবগুলিকে জোর দিয়েছিল এবং কোষের ধরণের এবং মাইক্রোএনভায়রনমেন্টের মধ্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য প্রকাশ করেছিল। এটি লক্ষণীয় যে সবচেয়ে চরম পার্থক্যটি লক্ষ্য করা যায় MNA, যা সাধারণত CD45- কোষে এবং টিউমারে অনুপ্রবেশকারী CD4+ এবং CD8+ কোষে সমৃদ্ধ হয় (চিত্র 3A)। CD4+ কোষের ক্ষেত্রে, এই প্রভাবটি সবচেয়ে স্পষ্ট, এবং CD8+ কোষের MNA পরিবেশ দ্বারাও তীব্রভাবে প্রভাবিত বলে মনে হয়। তবে, এটি গুরুত্বপূর্ণ নয়, কারণ ছয়জন রোগীর মধ্যে মাত্র তিনজনের টিউমার CD8+ স্কোরের জন্য মূল্যায়ন করা যেতে পারে। MNA ছাড়াও, অ্যাসাইট এবং টিউমারের বিভিন্ন ধরণের কোষে, TIL-তে দুর্বল বৈশিষ্ট্যযুক্ত অন্যান্য বিপাকগুলিও ভিন্নভাবে সমৃদ্ধ (চিত্র S3 এবং S4)। অতএব, এই তথ্যগুলি আরও গবেষণার জন্য ইমিউনোমোডুলেটরি বিপাকের একটি প্রতিশ্রুতিশীল সেট প্রকাশ করে।
(ক) অ্যাসাইট এবং টিউমার থেকে CD4+, CD8+ এবং CD45- কোষে MNA-এর স্বাভাবিক উপাদান। বাক্স প্লটে মধ্যমা (রেখা), আন্তঃচতুর্থাংশ পরিসর (ফ্রেম হিঞ্জ) এবং ডেটা পরিসর দেখানো হয়েছে, যা আন্তঃচতুর্থাংশ পরিসরের (ফ্রেম হুইস্কার) 1.5 গুণ পর্যন্ত। রোগীর উপকরণ এবং পদ্ধতিতে বর্ণিত হিসাবে, P মান নির্ধারণ করতে রোগীর লিমা মান ব্যবহার করুন (*P<0.05 এবং **P<0.01)। (খ) MNA বিপাকের পরিকল্পিত চিত্র (60)। বিপাক: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, নিকোটিনামাইড; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl- 2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, নিকোটিনামাইড রাইবোজ; NMN, নিকোটিনামাইড মনোনিউক্লিওটাইড। এনজাইম (সবুজ): NNMT, নিকোটিনামাইড N-মিথাইলট্রান্সফারেজ; SIRT, sirtuins; NAMPT, নিকোটিনামাইড ফসফোরিবোসিল ট্রান্সফারেজ; AOX1, অ্যালডিহাইড অক্সিডেস 1; NRK, নিকোটিনামাইড রাইবোসাইড কাইনেজ; NMNAT, নিকোটিনামাইড মনো নিউক্লিওটাইড অ্যাডেনাইলেট ট্রান্সফারেজ; Pnp1, পিউরিন নিউক্লিওসাইড ফসফোরাইলেজ। (C) অ্যাসাইট (ধূসর) এবং টিউমার (লাল; n = 3 রোগী) এর scRNA-seq এর t-SNE। (D) scRNA-seq ব্যবহার করে চিহ্নিত বিভিন্ন কোষ জনসংখ্যায় NNMT এক্সপ্রেশন। (E) SK-OV-3, মানব ভ্রূণ কিডনি (HEK) 293T, T কোষ এবং MNA-চিকিত্সা করা T কোষে NNMT এবং AOX1 এর এক্সপ্রেশন। ভাঁজ করা এক্সপ্রেশনটি SK-OV-3 এর সাপেক্ষে দেখানো হয়েছে। SEM সহ এক্সপ্রেশন প্যাটার্নটি দেখানো হয়েছে (n = 6 সুস্থ দাতা)। ৩৫ এর বেশি Ct মান সনাক্ত করা যায় না (UD)। (F) SK-OV-3, HEK293T, T কোষ এবং 8mM MNA দিয়ে চিকিৎসা করা T কোষে SLC22A1 এবং SLC22A2 এর প্রকাশ। SK-OV-3 এর তুলনায় ভাঁজ করা অভিব্যক্তি দেখানো হয়েছে। SEM এর সাথে অভিব্যক্তি প্যাটার্ন দেখানো হয়েছে (n = 6 সুস্থ দাতা)। 35 এর বেশি Ct মান সনাক্ত করা যায় না (UD)। (G) MNA দিয়ে ৭২ ঘন্টা ইনকিউবেশনের পর সক্রিয় সুস্থ দাতা T কোষে কোষ MNA কন্টেন্ট। SEM এর সাথে অভিব্যক্তি প্যাটার্ন দেখানো হয়েছে (n = 4 সুস্থ দাতা)।
নিকোটিনামাইড এন-মিথাইলট্রান্সফেরেজ (NNMT; চিত্র 3B) দ্বারা S-adenosyl-1-methionine (SAM) থেকে নিকোটিনামাইড (NA) তে মিথাইল গ্রুপ স্থানান্তর করে MNA উৎপাদিত হয়। NNMT বিভিন্ন ধরণের মানব ক্যান্সারে অতিরিক্তভাবে প্রকাশিত হয় এবং এটি বিস্তার, আক্রমণ এবং মেটাস্ট্যাসিসের সাথে যুক্ত (25-27)। TME-তে T কোষে MNA-এর উৎস আরও ভালভাবে বোঝার জন্য, আমরা তিনজন HGSC রোগীর অ্যাসাইট এবং টিউমারে কোষের ধরণ জুড়ে NNMT-এর অভিব্যক্তি চিহ্নিত করার জন্য scRNA-seq ব্যবহার করেছি (টেবিল S5)। প্রায় 6,500 কোষের বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে অ্যাসাইট এবং টিউমার পরিবেশে, NNMT প্রকাশ অনুমান করা ফাইব্রোব্লাস্ট এবং টিউমার কোষের জনসংখ্যার মধ্যে সীমাবদ্ধ ছিল (চিত্র 3, C এবং D)। এটি লক্ষণীয় যে PTPRC (CD45 +) প্রকাশ করে এমন কোনও জনসংখ্যায় কোনও স্পষ্ট NNMT প্রকাশ নেই (চিত্র 3D এবং চিত্র S5A), যা নির্দেশ করে যে বিপাক বর্ণালীতে সনাক্ত করা MNA টি কোষে প্রবেশ করানো হয়েছে। অ্যালডিহাইড অক্সিডেস 1 (AOX1) এর প্রকাশ MNA কে 1-মিথাইল-2-পাইরিডোন-5-কারবক্সামাইড (2-PYR) বা 1-মিথাইল-4-পাইরিডোন-5-কারবক্সামাইড (4- PYR) তে রূপান্তরিত করে; চিত্র 3B) COL1A1 প্রকাশ করে এমন ফাইব্রোব্লাস্টের জনসংখ্যার মধ্যেও সীমাবদ্ধ (চিত্র S5A), যা একসাথে নির্দেশ করে যে T কোষগুলিতে প্রচলিত MNA বিপাকের ক্ষমতার অভাব রয়েছে। HGSC রোগীদের অ্যাসাইট থেকে দ্বিতীয় স্বাধীন কোষ ডেটা সেট ব্যবহার করে এই MNA-সম্পর্কিত জিনগুলির প্রকাশ প্যাটার্ন যাচাই করা হয়েছিল (চিত্র S5B; n = 6) (16)। এছাড়াও, MNA দিয়ে চিকিৎসা করা সুস্থ দাতা T কোষের পরিমাণগত পলিমারেজ চেইন বিক্রিয়া (qPCR) বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে নিয়ন্ত্রণ SK-OV-3 ডিম্বাশয়ের টিউমার কোষের তুলনায়, NNMT বা AOX1 প্রায় প্রকাশ করা হয়নি (চিত্র 3E)। এই অপ্রত্যাশিত ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে MNA ফাইব্রোব্লাস্ট বা টিউমার থেকে TME-তে সংলগ্ন T কোষে নিঃসৃত হতে পারে।
যদিও প্রার্থীদের মধ্যে দ্রবণীয় বাহক 22 (SLC22) পরিবার (SLC22A1, SLC22A2 এবং SLC22A3) দ্বারা এনকোড করা জৈব ক্যাটেশন ট্রান্সপোর্টার 1 থেকে 3 (OCT1, OCT2 এবং OCT3) পরিবার অন্তর্ভুক্ত রয়েছে, MNA-এর সম্ভাব্য ট্রান্সপোর্টারগুলি এখনও অনির্ধারিত (28)। সুস্থ দাতা T কোষ থেকে mRNA-এর QPCR SLC22A1-এর কম প্রকাশের মাত্রা দেখিয়েছে কিন্তু SLC22A2-এর অজ্ঞাত মাত্রা দেখিয়েছে, যা নিশ্চিত করেছে যে এটি পূর্বে সাহিত্যে রিপোর্ট করা হয়েছিল (চিত্র 3F) (29)। বিপরীতে, SK-OV-3 ওভারিয়ান টিউমার কোষ লাইন উভয় ট্রান্সপোর্টারের উচ্চ মাত্রা প্রকাশ করেছে (চিত্র 3F)।
T কোষগুলির বিদেশী MNA শোষণ করার ক্ষমতা আছে কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য, সুস্থ দাতা T কোষগুলিকে MNA-এর বিভিন্ন ঘনত্বের উপস্থিতিতে 72 ঘন্টা ধরে কালচার করা হয়েছিল। বহির্মুখী MNA-এর অনুপস্থিতিতে, MNA-এর কোষীয় উপাদান সনাক্ত করা যায় না (চিত্র 3G)। তবে, বহির্মুখী MNA দিয়ে চিকিত্সা করা সক্রিয় T কোষগুলিতে কোষগুলিতে MNA-এর পরিমাণ 6 mM MNA পর্যন্ত ডোজ-নির্ভর বৃদ্ধি দেখা গেছে (চিত্র 3G)। এই ফলাফলটি নির্দেশ করে যে পরিবহনকারী প্রকাশের নিম্ন স্তর এবং আন্তঃকোষীয় MNA বিপাকের জন্য দায়ী প্রধান এনজাইমের অভাব সত্ত্বেও, TIL এখনও MNA গ্রহণ করতে পারে।
রোগীদের টি কোষ এবং ইন ভিট্রো এমএনএ শোষণ পরীক্ষায় বিপাকের বর্ণালী ক্যান্সার-সম্পর্কিত ফাইব্রোব্লাস্ট (CAF) দ্বারা MNA নিঃসৃত হওয়ার সম্ভাবনা বৃদ্ধি করে এবং টিউমার কোষগুলি TIL-এর ফেনোটাইপ এবং কার্যকারিতা নিয়ন্ত্রণ করতে পারে। টি কোষের উপর MNA-এর প্রভাব নির্ধারণের জন্য, MNA-এর উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিতে সুস্থ দাতা টি কোষগুলিকে ইন ভিট্রো সক্রিয় করা হয়েছিল এবং তাদের বিস্তার এবং সাইটোকাইন উৎপাদন মূল্যায়ন করা হয়েছিল। সর্বোচ্চ মাত্রায় MNA যোগ করার 7 দিন পরে, জনসংখ্যা দ্বিগুণ সংখ্যা মাঝারিভাবে হ্রাস করা হয়েছিল, যখন সমস্ত মাত্রায় প্রাণশক্তি বজায় রাখা হয়েছিল (চিত্র 4A)। এছাড়াও, বহির্মুখী MNA-এর চিকিৎসার ফলে টিউমার নেক্রোসিস ফ্যাক্টর-α প্রকাশকারী CD4 + এবং CD8 + T কোষের অনুপাত বৃদ্ধি পেয়েছিল (TNFα; চিত্র 4B)। বিপরীতে, CD4 + T কোষে IFN-γ-এর অন্তঃকোষীয় উৎপাদন উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে, কিন্তু CD8 + T কোষে নয়, এবং ইন্টারলিউকিন 2-তে কোনও উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন হয়নি (IL-2; চিত্র 4, C এবং D)। অতএব, এই MNA-চিকিৎসা করা T কোষ সংস্কৃতি থেকে প্রাপ্ত সুপারন্যাটেন্টগুলির এনজাইম-লিঙ্কড ইমিউনোসর্বেন্ট অ্যাসে (ELISA) TNFα-তে উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি, IFN-γ-তে হ্রাস এবং IL-2-তে কোনও পরিবর্তন দেখায়নি (চিত্র 4, E থেকে G)। IFN-γ-এর হ্রাস ইঙ্গিত দেয় যে MNA T কোষের অ্যান্টি-টিউমার কার্যকলাপকে বাধা দিতে ভূমিকা পালন করতে পারে। T কোষ-মধ্যস্থতাকারী সাইটোটক্সিসিটির উপর MNA-এর প্রভাব অনুকরণ করার জন্য, সবুজ ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন (GFP) -CAR-T) কোষ দ্বারা নিয়ন্ত্রিত ফোলেট রিসেপ্টর α এবং CAR-T (GFP) কে লক্ষ্য করে কাইমেরিক অ্যান্টিজেন রিসেপ্টর T (FRα-CAR-T) কোষগুলি সুস্থ দাতা পেরিফেরাল রক্তের মনোনিউক্লিয়ার কোষ (PBMC) দ্বারা উত্পাদিত হয়। CAR-T কোষগুলিকে MNA-এর উপস্থিতিতে 24 ঘন্টা ধরে কালচার করা হয়েছিল, এবং তারপর 10:1 এর ইফেক্টর থেকে টার্গেট অনুপাতে ফোলেট রিসেপ্টর α প্রকাশকারী মানব SK-OV-3 ডিম্বাশয়ের টিউমার কোষগুলির সাথে সহ-কালচার করা হয়েছিল। MNA চিকিৎসার ফলে FRα-CAR-T কোষের হত্যা কার্যকলাপে উল্লেখযোগ্য হ্রাস ঘটে, যা অ্যাডেনোসিন দিয়ে চিকিৎসা করা FRα-CAR-T কোষের অনুরূপ ছিল (চিত্র 4H)।
(A) ৭ম দিনে কালচার থেকে সরাসরি মোট কার্যকর কোষ গণনা এবং জনসংখ্যা দ্বিগুণ (PD)। বার গ্রাফটি ছয়জন সুস্থ দাতার গড় + SEM প্রতিনিধিত্ব করে। কমপক্ষে n = 3টি স্বাধীন পরীক্ষার তথ্য উপস্থাপন করে। (B থেকে D) CD3/CD28 এবং IL-2 7 দিনের জন্য তাদের নিজ নিজ MNA ঘনত্বে T কোষগুলিকে সক্রিয় করতে ব্যবহার করা হয়েছিল। বিশ্লেষণের আগে, কোষগুলিকে PMA/ionomycin দিয়ে GolgiStop দিয়ে 4 ঘন্টা ধরে উদ্দীপিত করা হয়েছিল। T কোষে TNFα (B) প্রকাশ। জীবিত কোষে TNFα প্রকাশের উদাহরণ চিত্র (বামে) এবং ট্যাবুলার ডেটা (ডানে)। T কোষে IFN-γ (C) এবং IL-2 (D) প্রকাশ। সাইটোকাইনের প্রকাশ প্রবাহ সাইটোমেট্রি দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল। বার গ্রাফটি গড় (n = 6টি সুস্থ দাতা) + SEM প্রতিনিধিত্ব করে। P মান নির্ধারণ করতে বৈচিত্র্যের একমুখী বিশ্লেষণ এবং পুনরাবৃত্তি পরিমাপ (*P<0.05 এবং **P<0.01) ব্যবহার করুন। কমপক্ষে n = 3টি স্বাধীন পরীক্ষার তথ্য উপস্থাপন করে। (E থেকে G) CD3/CD28 এবং IL-2 7 দিন ধরে তাদের নিজ নিজ MNA ঘনত্বে T কোষগুলিকে সক্রিয় করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। PMA/ionomycin উদ্দীপনার 4 ঘন্টা আগে এবং পরে মাধ্যমটি সংগ্রহ করা হয়েছিল। TNFα (E), IFN-γ (F) এবং IL-2 (G) এর ঘনত্ব ELISA দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল। বার গ্রাফটি গড় (n = 5 সুস্থ দাতা) + SEM প্রতিনিধিত্ব করে। P মানটি একমুখী বিশ্লেষণ এবং পুনরাবৃত্তি পরিমাপ (*P<0.05) ব্যবহার করে নির্ধারিত হয়। বিন্দুযুক্ত রেখাটি সনাক্তকরণের সনাক্তকরণ সীমা নির্দেশ করে। (H) কোষ লাইসিস অ্যাসে। FRα-CAR-T বা GFP-CAR-T কোষগুলিকে 24 ঘন্টা ধরে অ্যাডেনোসিন (250μM) বা MNA (10 mM) দিয়ে সামঞ্জস্য করা হয়েছিল, অথবা চিকিৎসা না করে রেখে দেওয়া হয়েছিল (Ctrl)। SK-OV-3 কোষের শতকরা হার হত্যা পরিমাপ করা হয়েছিল। P মান Welch t পরীক্ষা (*P<0.5 এবং **P<0.01) দ্বারা নির্ধারিত হয়েছিল।
MNA-নির্ভর TNFα এক্সপ্রেশন নিয়ন্ত্রণের একটি যান্ত্রিক ধারণা অর্জনের জন্য, MNA-চিকিৎসা করা T কোষগুলির TNFα mRNA-তে পরিবর্তনগুলি মূল্যায়ন করা হয়েছিল (চিত্র 5A)। MNA দিয়ে চিকিত্সা করা সুস্থ দাতা T কোষগুলিতে TNFα ট্রান্সক্রিপশন স্তরে দ্বিগুণ বৃদ্ধি দেখা গেছে, যা নির্দেশ করে যে MNA TNFα ট্রান্সক্রিপশনাল নিয়ন্ত্রণের উপর নির্ভরশীল। এই সম্ভাব্য নিয়ন্ত্রক প্রক্রিয়াটি তদন্ত করার জন্য, TNFα নিয়ন্ত্রণকারী দুটি পরিচিত ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর, যথা সক্রিয় T কোষ নিউক্লিয়ার ফ্যাক্টর (NFAT) এবং নির্দিষ্ট প্রোটিন 1 (Sp1), প্রক্সিমাল TNFα প্রমোটারের সাথে MNA বাইন্ডিংয়ের প্রতিক্রিয়ায় মূল্যায়ন করা হয়েছিল (30)। TNFα প্রমোটারে 6টি চিহ্নিত NFAT বাইন্ডিং সাইট এবং 2টি Sp1 বাইন্ডিং সাইট রয়েছে, যা একটি স্থানে ওভারল্যাপ করে [5'cap থেকে -55 বেস পেয়ার (bp)] (30)। ক্রোমাটিন ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন (ChIP) দেখিয়েছে যে MNA দিয়ে চিকিত্সা করা হলে, TNFα প্রমোটারের সাথে Sp1 এর বাইন্ডিং তিনগুণ বৃদ্ধি পায়। NFAT-এর অন্তর্ভুক্তিও বৃদ্ধি পেয়েছে এবং গুরুত্বের কাছাকাছি পৌঁছেছে (চিত্র 5B)। এই তথ্যগুলি ইঙ্গিত দেয় যে MNA Sp1 ট্রান্সক্রিপশনের মাধ্যমে TNFα এর প্রকাশ নিয়ন্ত্রণ করে, এবং কিছুটা কম পরিমাণে NFAT এর প্রকাশ নিয়ন্ত্রণ করে।
(A) MNA ছাড়া কালচার করা T কোষের সাথে তুলনা করলে, MNA দিয়ে চিকিৎসা করা T কোষে TNFα প্রকাশের ভাঁজ পরিবর্তন দেখা যায়। SEM দিয়ে প্রকাশের ধরণ দেখানো হয়েছে (n = 5 জন সুস্থ দাতা)। কমপক্ষে n = 3টি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে প্রাপ্ত তথ্য উপস্থাপন করে। (B) NFAT এবং Sp1 এর পরে 8 mM MNA দিয়ে বা ছাড়া চিকিৎসা করা T কোষের TNFα প্রমোটারকে (Ctrl) এবং PMA/ionomycin উদ্দীপনার সাথে 4 ঘন্টা ধরে একত্রিত করা হয়েছিল। ইমিউনোগ্লোবুলিন G (IgG) এবং H3 যথাক্রমে ইমিউনোপ্রিসিপিটেশনের জন্য নেতিবাচক এবং ধনাত্মক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল। ChIP এর পরিমাণ নির্ধারণে দেখা গেছে যে MNA-চিকিৎসা করা কোষে TNFα প্রমোটারের সাথে Sp1 এবং NFAT এর বাঁধাই নিয়ন্ত্রণের তুলনায় কয়েকগুণ বৃদ্ধি পেয়েছে। কমপক্ষে n = 3টি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে প্রাপ্ত তথ্য উপস্থাপন করে। একাধিক t-পরীক্ষা দ্বারা নির্ধারিত P মান (*** P <0.01)। (C) HGSC এর অ্যাসাইটের সাথে তুলনা করলে, T কোষ (অ-সাইটোটক্সিক) টিউমারে TNF এর বর্ধিত প্রকাশ দেখিয়েছে। রঙগুলি বিভিন্ন রোগীর প্রতিনিধিত্ব করে। প্রদর্শিত কোষগুলিকে এলোমেলোভাবে 300-এ নমুনা করা হয়েছে এবং ওভারড্রয়িং সীমিত করার জন্য ঝাঁকুনি দেওয়া হয়েছে (** Padj = 0.0076)। (D) ডিম্বাশয়ের ক্যান্সারের জন্য MNA-এর প্রস্তাবিত মডেল। MNA টিউমার কোষ এবং TME-তে ফাইব্রোব্লাস্টে উৎপাদিত হয় এবং T কোষ দ্বারা গ্রহণ করা হয়। MNA TNFα প্রমোটারের সাথে Sp1-এর আবদ্ধতা বৃদ্ধি করে, যার ফলে TNFα ট্রান্সক্রিপশন এবং TNFα সাইটোকাইন উৎপাদন বৃদ্ধি পায়। MNA IFN-γ-এরও হ্রাস ঘটায়। T কোষের কার্যকারিতা বাধাগ্রস্ত হওয়ার ফলে হত্যা ক্ষমতা হ্রাস পায় এবং টিউমার বৃদ্ধি ত্বরান্বিত হয়।
রিপোর্ট অনুসারে, TNFα এর সামনের এবং পিছনের উপর নির্ভরশীল অ্যান্টি-টিউমার এবং অ্যান্টি-টিউমার প্রভাব রয়েছে, তবে ডিম্বাশয়ের ক্যান্সারের বৃদ্ধি এবং মেটাস্ট্যাসিসকে উৎসাহিত করার ক্ষেত্রে এটির একটি সুপরিচিত ভূমিকা রয়েছে (31-33)। রিপোর্ট অনুসারে, ডিম্বাশয়ের ক্যান্সারে আক্রান্ত রোগীদের অ্যাসাইট এবং টিউমার টিস্যুতে TNFα এর ঘনত্ব সৌম্য টিস্যুর তুলনায় বেশি (34-36)। প্রক্রিয়ার দিক থেকে, TNFα শ্বেত রক্তকণিকার সক্রিয়করণ, কার্যকারিতা এবং বিস্তার নিয়ন্ত্রণ করতে পারে এবং ক্যান্সার কোষের ফেনোটাইপ পরিবর্তন করতে পারে (37, 38)। এই ফলাফলগুলির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, ডিফারেনশিয়াল জিন এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে অ্যাসাইটসের তুলনায় টিউমার টিস্যুতে T কোষগুলিতে TNF উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 5C)। TNF এক্সপ্রেশনের বৃদ্ধি কেবলমাত্র নন-সাইটোটক্সিক ফেনোটাইপ (চিত্র S5A) সহ T কোষ জনসংখ্যার ক্ষেত্রে স্পষ্ট ছিল। সংক্ষেপে, এই তথ্যগুলি এই দৃষ্টিভঙ্গিকে সমর্থন করে যে HGSC-তে MNA-এর দ্বৈত ইমিউনোসপ্রেসিভ এবং টিউমার প্রচারকারী প্রভাব রয়েছে।
ফ্লো সাইটোমেট্রির উপর ভিত্তি করে ফ্লুরোসেন্ট লেবেলিং TIL বিপাক অধ্যয়নের প্রধান পদ্ধতি হয়ে উঠেছে। এই গবেষণায় দেখা গেছে যে পেরিফেরাল রক্তের লিম্ফোসাইট বা সেকেন্ডারি লিম্ফয়েড অঙ্গের T কোষের তুলনায়, মুরিন এবং মানুষের TIL-এর গ্লুকোজ গ্রহণের প্রবণতা বেশি (4, 39) এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ফাংশন ধীরে ধীরে হ্রাস পায় (19, 40)। যদিও আমরা এই গবেষণায় একই ফলাফল লক্ষ্য করেছি, মূল উন্নয়ন হল একই রিসেক্টেড টিউমার টিস্যু থেকে টিউমার কোষ এবং TIL-এর বিপাক তুলনা করা। পূর্ববর্তী কিছু প্রতিবেদনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, অ্যাসাইট এবং টিউমার থেকে টিউমার (CD45-EpCAM +) কোষের CD8 + এবং CD4 + T কোষের তুলনায় বেশি গ্লুকোজ গ্রহণ থাকে, যা সমর্থন করে যে টিউমার কোষের উচ্চ গ্লুকোজ গ্রহণকে T কোষের সাথে তুলনা করা যেতে পারে। T কোষ প্রতিযোগিতার ধারণা। TME। যাইহোক, টিউমার কোষের মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ CD8 + T কোষের তুলনায় বেশি, তবে মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ CD4 + T কোষের অনুরূপ। এই ফলাফলগুলি উদীয়মান থিমকে আরও শক্তিশালী করে যে টিউমার কোষের জন্য অক্সিডেটিভ বিপাক গুরুত্বপূর্ণ (41, 42)। তারা আরও পরামর্শ দেয় যে CD8 + T কোষগুলি CD4 + T কোষের তুলনায় অক্সিডেটিভ কর্মহীনতার জন্য বেশি সংবেদনশীল হতে পারে, অথবা CD4 + T কোষগুলি মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ বজায় রাখার জন্য গ্লুকোজ ছাড়া অন্য কার্বন উৎস ব্যবহার করতে পারে (43, 44)। এটি লক্ষ করা উচিত যে আমরা অ্যাসাইটে CD4 + T প্রভাবক, T প্রভাবক মেমোরি এবং T কেন্দ্রীয় মেমোরি কোষের মধ্যে গ্লুকোজ গ্রহণ বা মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপের কোনও পার্থক্য লক্ষ্য করিনি। একইভাবে, টিউমারে CD8 + T কোষের পার্থক্যের অবস্থা গ্লুকোজ গ্রহণের পরিবর্তনের সাথে কোনও সম্পর্ক রাখে না, যা ইন ভিট্রো কালচারড টি কোষ এবং ইন ভিভোতে মানব TIL এর মধ্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য তুলে ধরে (22)। এই পর্যবেক্ষণগুলি নিরপেক্ষ স্বয়ংক্রিয় কোষ জনসংখ্যা বরাদ্দের ব্যবহার দ্বারাও নিশ্চিত করা হয়েছিল, যা আরও প্রকাশ করেছে যে টিউমার কোষের তুলনায় উচ্চ গ্লুকোজ গ্রহণ এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপ সহ CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + কোষগুলি প্রচলিত কিন্তু তাদের বিপাকীয় সক্রিয় কোষ জনসংখ্যা রয়েছে। এই জনসংখ্যা scRNA-seq বিশ্লেষণে চিহ্নিত মাইলয়েড দমনকারী কোষ বা প্লাজমাসাইটোয়েড ডেনড্রাইটিক কোষের সম্ভাব্য উপ-জনসংখ্যা প্রতিনিধিত্ব করতে পারে। যদিও এই দুটিই মানুষের ডিম্বাশয়ের টিউমারে রিপোর্ট করা হয়েছে [45], তবুও তাদের আরও কাজ করা প্রয়োজন এই মাইলয়েড উপ-জনসংখ্যা বর্ণনা করার জন্য।
যদিও ফ্লো সাইটোমেট্রি-ভিত্তিক পদ্ধতিগুলি কোষের ধরণের মধ্যে গ্লুকোজ এবং অক্সিডেটিভ বিপাকের সাধারণ পার্থক্য স্পষ্ট করতে পারে, তবুও TME-তে মাইটোকন্ড্রিয়াল বিপাকের জন্য গ্লুকোজ বা অন্যান্য কার্বন উৎস দ্বারা উৎপাদিত সুনির্দিষ্ট বিপাক এখনও নির্ধারণ করা হয়নি। একটি নির্দিষ্ট TIL উপসেটে বিপাকের উপস্থিতি বা অনুপস্থিতি নির্ধারণের জন্য এক্সাইজড টিস্যু থেকে কোষের জনসংখ্যার পরিশোধন প্রয়োজন। অতএব, ভর স্পেকট্রোমেট্রির সাথে মিলিত আমাদের কোষ সমৃদ্ধকরণ পদ্ধতি রোগীর নমুনার সাথে মিলিত টি কোষ এবং টিউমার কোষের জনসংখ্যায় পৃথকভাবে সমৃদ্ধ বিপাকগুলির অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করতে পারে। যদিও এই পদ্ধতির ফ্লুরোসেন্স-সক্রিয় কোষ বাছাইয়ের তুলনায় সুবিধা রয়েছে, তবে কিছু বিপাকীয় গ্রন্থাগার অন্তর্নিহিত স্থিতিশীলতা এবং/অথবা দ্রুত টার্নওভার হারের কারণে প্রভাবিত হতে পারে (22)। তবুও, আমাদের পদ্ধতি দুটি স্বীকৃত ইমিউনোসপ্রেসিভ বিপাক, অ্যাডেনোসিন এবং কাইনুরেনিন সনাক্ত করতে সক্ষম হয়েছিল, কারণ তারা নমুনা ধরণের মধ্যে ব্যাপকভাবে পরিবর্তিত হয়।
টিউমার এবং TIL সাবটাইপের আমাদের মেটাবোনমিক বিশ্লেষণ ডিম্বাশয়ের TME-তে বিপাকীয় পদার্থের ভূমিকা সম্পর্কে আরও অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে। প্রথমত, ফ্লো সাইটোমেট্রি ব্যবহার করে, আমরা নির্ধারণ করেছি যে টিউমার এবং CD4 + T কোষের মধ্যে মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপে কোনও পার্থক্য ছিল না। যাইহোক, LC-MS/MS বিশ্লেষণ এই জনসংখ্যার মধ্যে বিপাকের প্রাচুর্যের উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন প্রকাশ করেছে, যা ইঙ্গিত করে যে TIL বিপাক এবং এর সামগ্রিক বিপাকীয় কার্যকলাপ সম্পর্কে সিদ্ধান্তগুলি সতর্কতার সাথে ব্যাখ্যা করা প্রয়োজন। দ্বিতীয়ত, MNA হল সেই বিপাক যার মধ্যে CD45-কোষ এবং অ্যাসাইটসে T কোষের মধ্যে সর্বাধিক পার্থক্য রয়েছে, টিউমার নয়। অতএব, কম্পার্টমেন্টালাইজেশন এবং টিউমারের অবস্থান TIL বিপাকের উপর বিভিন্ন প্রভাব ফেলতে পারে, যা একটি নির্দিষ্ট মাইক্রোএনভায়রনমেন্টে সম্ভাব্য বৈচিত্র্যকে হাইলাইট করে। তৃতীয়ত, MNA-উৎপাদনকারী এনজাইম NNMT-এর প্রকাশ মূলত CAF-তে সীমাবদ্ধ, যা কিছুটা হলেও টিউমার কোষ, তবে টিউমার-প্রাপ্ত T কোষগুলিতে সনাক্তযোগ্য MNA স্তর পরিলক্ষিত হয়। ডিম্বাশয়ের CAF-তে NNMT-এর অত্যধিক প্রকাশের একটি পরিচিত ক্যান্সার-প্রচারক প্রভাব রয়েছে, আংশিকভাবে CAF বিপাক, টিউমার আক্রমণ এবং মেটাস্ট্যাসিসের প্রচারের কারণে (27)। যদিও TIL-এর সামগ্রিক স্তর মাঝারি, CAF-তে NNMT-এর প্রকাশ ক্যান্সার জিনোম অ্যাটলাস (TCGA) মেসেনকাইমাল সাবটাইপের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত, যা খারাপ পূর্বাভাসের সাথে সম্পর্কিত (27, 46, 47)। পরিশেষে, MNA অবক্ষয়ের জন্য দায়ী এনজাইম AOX1-এর প্রকাশও CAF জনসংখ্যার মধ্যে সীমাবদ্ধ, যা নির্দেশ করে যে T কোষগুলির MNA বিপাক করার ক্ষমতার অভাব রয়েছে। এই ফলাফলগুলি এই ধারণাটিকে সমর্থন করে যে যদিও এই আবিষ্কারটি যাচাই করার জন্য আরও কাজ করা প্রয়োজন, T কোষগুলিতে MNA-এর উচ্চ মাত্রা একটি ইমিউনোসপ্রেসিভ CAF মাইক্রোএনভায়রনমেন্টের উপস্থিতি নির্দেশ করতে পারে।
MNA ট্রান্সপোর্টারদের কম প্রকাশের স্তর এবং MNA বিপাকের সাথে জড়িত মূল প্রোটিনের অদৃশ্য মাত্রার কারণে, T কোষে MNA-এর উপস্থিতি অপ্রত্যাশিত। NNMT বা AOX1-এর কোনওটিই scRNA-seq বিশ্লেষণ এবং দুটি স্বাধীন কোহোর্টের লক্ষ্যযুক্ত qPCR দ্বারা সনাক্ত করা যায়নি। এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে MNA টি কোষ দ্বারা সংশ্লেষিত হয় না, বরং পার্শ্ববর্তী TME থেকে শোষিত হয়। ইন ভিট্রো পরীক্ষায় দেখা গেছে যে T কোষগুলি বহির্মুখী MNA জমা করার প্রবণতা রাখে।
আমাদের ইন ভিট্রো গবেষণায় দেখা গেছে যে বহির্মুখী MNA টি কোষে TNFα এর প্রকাশকে প্ররোচিত করে এবং TNFα প্রমোটারের সাথে Sp1 এর বন্ধন বৃদ্ধি করে। যদিও TNFα এর টিউমার-বিরোধী এবং টিউমার-বিরোধী উভয় কার্যকারিতা রয়েছে, ডিম্বাশয়ের ক্যান্সারে, TNFα ডিম্বাশয়ের ক্যান্সারের বৃদ্ধিকে উৎসাহিত করতে পারে (31-33)। ডিম্বাশয়ের টিউমার কোষ সংস্কৃতিতে TNFα এর নিরপেক্ষকরণ বা মাউস মডেলগুলিতে TNFα সংকেত নির্মূল TNFα-মধ্যস্থ প্রদাহজনক সাইটোকাইন উৎপাদন উন্নত করতে পারে এবং টিউমার বৃদ্ধিকে বাধা দিতে পারে (32, 35)। অতএব, এই ক্ষেত্রে, TME-প্রাপ্ত MNA অটোক্রাইন লুপের মাধ্যমে TNFα-নির্ভর প্রক্রিয়ার মাধ্যমে একটি প্রো-ইনফ্ল্যামেটরি মেটাবোলাইট হিসাবে কাজ করতে পারে, যার ফলে ডিম্বাশয়ের ক্যান্সারের ঘটনা এবং বিস্তার বৃদ্ধি পায় (31)। এই সম্ভাবনার উপর ভিত্তি করে, ডিম্বাশয়ের ক্যান্সারের জন্য একটি সম্ভাব্য থেরাপিউটিক এজেন্ট হিসাবে TNFα ব্লকেড অধ্যয়ন করা হচ্ছে (37, 48, 49)। এছাড়াও, MNA ডিম্বাশয়ের টিউমার কোষগুলিতে CAR-T কোষের সাইটোটক্সিসিটিকে দুর্বল করে, MNA-মধ্যস্থতাযুক্ত রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা দমনের জন্য আরও প্রমাণ প্রদান করে। সম্মিলিতভাবে, এই ফলাফলগুলি এমন একটি মডেলের পরামর্শ দেয় যেখানে টিউমার এবং CAF কোষগুলি MNA কে বহির্কোষীয় TME-তে নিঃসরণ করে। (i) TNF-প্ররোচিত ডিম্বাশয়ের ক্যান্সার বৃদ্ধির উদ্দীপনা এবং (ii) MNA-প্ররোচিত T কোষ সাইটোটক্সিক কার্যকলাপ বাধাদানের মাধ্যমে, এর দ্বৈত টিউমার প্রভাব থাকতে পারে (চিত্র 5D)।
উপসংহারে, দ্রুত কোষ সমৃদ্ধকরণ, একক-কোষ সিকোয়েন্সিং এবং বিপাকীয় প্রোফাইলিংয়ের সংমিশ্রণ প্রয়োগ করে, এই গবেষণায় HGSC রোগীদের টিউমার এবং অ্যাসাইট কোষের মধ্যে বিশাল ইমিউনোমেটাবোলোমিক পার্থক্য প্রকাশ করা হয়েছে। এই বিস্তৃত বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে টি কোষের মধ্যে গ্লুকোজ গ্রহণ এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপের মধ্যে পার্থক্য রয়েছে এবং MNA কে একটি নন-কোষ স্বায়ত্তশাসিত ইমিউন নিয়ন্ত্রক বিপাক হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছে। এই তথ্যগুলি মানব ক্যান্সারে টিএমই কীভাবে টি কোষ বিপাককে প্রভাবিত করে তার উপর প্রভাব ফেলে। যদিও টি কোষ এবং ক্যান্সার কোষের মধ্যে পুষ্টির জন্য সরাসরি প্রতিযোগিতার খবর পাওয়া গেছে, বিপাকগুলি টিউমারের অগ্রগতি বৃদ্ধি করতে এবং সম্ভবত এন্ডোজেনাস ইমিউন প্রতিক্রিয়া দমন করতে পরোক্ষ নিয়ন্ত্রক হিসাবেও কাজ করতে পারে। এই নিয়ন্ত্রক বিপাকগুলির কার্যকরী ভূমিকার আরও বর্ণনা টিউমার-বিরোধী ইমিউন প্রতিক্রিয়া বৃদ্ধির জন্য বিকল্প কৌশলগুলি উন্মুক্ত করতে পারে।
কানাডিয়ান টিস্যু রিপোজিটরি নেটওয়ার্ক দ্বারা প্রত্যয়িত BC ক্যান্সার টিউমার টিস্যু রিপোজিটরির মাধ্যমে রোগীর নমুনা এবং ক্লিনিকাল ডেটা সংগ্রহ করা হয়েছিল। BC ক্যান্সার রিসার্চ এথিক্স কমিটি এবং ব্রিটিশ কলাম্বিয়া বিশ্ববিদ্যালয় (H07-00463) দ্বারা অনুমোদিত প্রোটোকল অনুসারে, সমস্ত রোগীর নমুনা এবং ক্লিনিকাল ডেটা লিখিত সম্মতি গ্রহণ করে অথবা আনুষ্ঠানিকভাবে তাদের সম্মতি ত্যাগ করে। নমুনাগুলি প্রত্যয়িত বায়োব্যাঙ্কে (BRC-00290) সংরক্ষণ করা হয়। রোগীর বিস্তারিত বৈশিষ্ট্যগুলি টেবিল S1 এবং S5 এ দেখানো হয়েছে। ক্রায়োপ্রিজারভেশনের জন্য, রোগীর টিউমার নমুনা যান্ত্রিকভাবে পচানোর জন্য একটি স্ক্যাল্পেল ব্যবহার করা হয় এবং তারপরে একটি একক কোষ সাসপেনশন পেতে 100-মাইক্রন ফিল্টারের মধ্য দিয়ে ঠেলে দেওয়া হয়। রোগীর অ্যাসাইটগুলিকে 4°C তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য 1500 rpm-এ সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল যাতে কোষগুলিকে গুলি করা যায় এবং সুপারন্যাট্যান্ট অপসারণ করা যায়। টিউমার এবং অ্যাসাইট থেকে প্রাপ্ত কোষগুলিকে ৫০% তাপ-নিষ্ক্রিয় মানব AB সিরাম (সিগমা-অ্যালড্রিচ), ৪০% RPMI-1640 (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) এবং ১০% ডাইমিথাইল সালফক্সাইডে ক্রিওপ্রিজারভ করা হয়েছিল। এই সংরক্ষিত একক কোষ সাসপেনশনগুলিকে গলানো হয়েছিল এবং নীচে বর্ণিত বিপাক এবং বিপাক নির্ধারণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।
সম্পূর্ণ মাধ্যমের মধ্যে রয়েছে 0.22 μm ফিল্টার করা 50:50 পরিপূরক RPMI 1640: AimV। RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) 10% তাপ-নিষ্ক্রিয় মানব AB সিরাম (সিগমা-অ্যালড্রিচ), 12.5 mM Hepes (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক), 2 mM l-glutamine (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ফিশার সায়েন্টিফিক), 1 x পেনিসিলিন স্ট্রেপ্টোমাইসিন (পেনস্ট্রেপ) দ্রবণ (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) এবং 50 μMB-mercaptoethanol। AimV (ইনভিট্রোজেন) 20 mM Hepes (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) এবং 2 mM l-glutamine (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) দিয়ে পরিপূরক। ফ্লো সাইটোমিটার স্টেইনিং বাফারে 0.22 μm ফিল্টার করা ফসফেট বাফারযুক্ত স্যালাইন (PBS; ইনভিট্রোজেন) 3% তাপ-নিষ্ক্রিয় AB মানব সিরাম (সিগমা) দিয়ে পরিপূরক থাকে। কোষ সমৃদ্ধকরণ বাফারটি 0.22μm ফিল্টার করা PBS দিয়ে গঠিত এবং 0.5% তাপ-নিষ্ক্রিয় মানব AB সিরাম (সিগমা-অ্যালড্রিচ) দিয়ে পরিপূরক।
৩৭°C সম্পূর্ণ মাধ্যমে, কোষগুলিকে ১০ nM MT DR এবং ১০০ μM 2-NBDG দিয়ে ৩০ মিনিটের জন্য দাগ দেওয়া হয়েছিল। এরপর, কোষগুলিকে ৪°C তাপমাত্রায় ১৫ মিনিটের জন্য কার্যকরতা রঞ্জক eF506 দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল। FC ব্লক (eBioscience) এবং Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) এ কোষগুলিকে পুনরায় সাসপেন্ড করুন, ফ্লো সাইটোমিটার স্টেইনিং বাফারে (নির্মাতার নির্দেশ অনুসারে) পাতলা করুন এবং ঘরের তাপমাত্রায় ১০ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করুন। ৪°C তাপমাত্রায় ফ্লো সাইটোমেট্রি স্টেইনিং বাফারে ২০ মিনিটের জন্য অ্যান্টিবডি (টেবিল S2) দিয়ে কোষগুলিকে দাগ দিন। বিশ্লেষণের আগে ফ্লো সাইটোমেট্রি স্টেইনিং বাফারে (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R কনফিগারেশন) কোষগুলিকে পুনরায় সাসপেন্ড করুন। কোষ গণনা ডেটা বিশ্লেষণ করতে SpectroFlo এবং FlowJo V10 ব্যবহার করুন এবং ডেটা তৈরি করতে GraphPad Prism 8 ব্যবহার করুন। 2-NBDG এবং MT DR-এর মধ্যম প্রতিপ্রভ তীব্রতা (MFI) লগ-স্বাভাবিক করা হয়েছিল, এবং তারপর মিলে যাওয়া রোগীদের হিসাব করার জন্য পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণের জন্য একটি জোড়াযুক্ত t পরীক্ষা ব্যবহার করা হয়েছিল। বিশ্লেষণ থেকে 40 টিরও কম ইভেন্ট সহ সমস্ত জনসংখ্যা বাদ দিন; পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ এবং ডেটা ভিজ্যুয়ালাইজেশন করার আগে যেকোনো নেতিবাচক মানের জন্য 1 এর MFI মান লিখুন।
উপরের প্রক্রিয়া প্যানেলের ম্যানুয়াল গেটিং কৌশলের পরিপূরক হিসেবে, আমরা FlowJo-তে মৃত কোষগুলি অপসারণের পরে জনসংখ্যার জন্য স্বয়ংক্রিয়ভাবে কোষ বরাদ্দ করার জন্য আকৃতি সীমাবদ্ধতা ট্রি (FAUST) (21) দ্বারা সম্পূর্ণ টীকা ব্যবহার করেছি। আমরা ভুলভাবে বরাদ্দ করা বলে মনে হয় এমন জনসংখ্যা (PD1+ এবং PD1-টিউমার কোষের সমন্বয়) এবং ধরে রাখা জনসংখ্যা একত্রিত করার জন্য ম্যানুয়ালি আউটপুট পরিচালনা করি। প্রতিটি নমুনায় মোট 11টি জনসংখ্যার জন্য গড়ে 2% এর বেশি কোষ থাকে।
লিউকোসাইট বিচ্ছেদ পণ্য (STEMCELL Technologies) থেকে PBMC আলাদা করার জন্য Ficoll গ্রেডিয়েন্ট ডেনসিটি সেন্ট্রিফিউগেশন ব্যবহার করা হয়েছিল। CD8 মাইক্রোবিডস (Miltenyi) ব্যবহার করে CD8 + T কোষগুলিকে PBMC থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে TransAct (Miltenyi) ব্যবহার করে 2 সপ্তাহের জন্য সম্পূর্ণ মাধ্যমে প্রসারিত করা হয়েছিল। IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) ধারণকারী সম্পূর্ণ মাধ্যমে কোষগুলিকে 5 দিন ধরে দাঁড়াতে দেওয়া হয়েছিল, এবং তারপর TransAct দিয়ে পুনরায় উদ্দীপিত করা হয়েছিল। সপ্তম দিনে, প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে, মানব CD45 মাইক্রোবিডস (Miltenyi) পরপর তিনটি রাউন্ডে কোষ সমৃদ্ধ করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। কোষগুলিকে প্রবাহ সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণের জন্য (উপরে বর্ণিত হিসাবে) অ্যালিকোট করা হয়েছিল, এবং LC-MS/MS বিশ্লেষণের জন্য তিনবার অ্যালিকোট করা হয়েছিল। নমুনাগুলি LC-MS/MS দ্বারা নীচে বর্ণিত হিসাবে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল। আমরা অনুপস্থিত বিপাকীয় মান 1,000 আয়ন সংখ্যা দিয়ে অনুমান করেছি। প্রতিটি নমুনা মোট আয়ন সংখ্যা (TIC) দ্বারা স্বাভাবিক করা হয়, লগারিদমিকভাবে রূপান্তরিত হয় এবং বিশ্লেষণের আগে MetaboAnalystR-এ স্বয়ংক্রিয়ভাবে স্বাভাবিক করা হয়।
প্রতিটি রোগীর একক কোষ সাসপেনশন গলানো হয়েছিল এবং 40 μm ফিল্টারের মাধ্যমে সম্পূর্ণ মাধ্যমে (উপরে বর্ণিত) ফিল্টার করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে, CD8+, CD4+ এবং CD45- কোষের নমুনাগুলিকে (বরফের উপর) সমৃদ্ধ করার জন্য মাইক্রোবিডস (মিল্টেনি) ব্যবহার করে চৌম্বকীয় পুঁতি পৃথকীকরণের মাধ্যমে পরপর তিনটি রাউন্ড ধনাত্মক নির্বাচন করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, কোষগুলিকে কোষ সমৃদ্ধকরণ বাফারে (উপরে বর্ণিত) পুনঃস্থাপন করা হয়েছিল এবং গণনা করা হয়েছিল। কোষগুলিকে 4°C তাপমাত্রায় 15 মিনিটের জন্য মানব CD8 পুঁতি, মানব CD4 পুঁতি বা মানব CD45 পুঁতি (মিল্টেনি) দিয়ে ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল এবং তারপর কোষ সমৃদ্ধকরণ বাফার দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। নমুনাটি LS কলামের (মিল্টেনি) মধ্য দিয়ে পাস করা হয় এবং ধনাত্মক এবং ঋণাত্মক ভগ্নাংশ সংগ্রহ করা হয়। সময়কাল কমাতে এবং কোষ পুনরুদ্ধারের ধাপ সর্বাধিক করার জন্য, CD8-ভগ্নাংশটি CD4+ সমৃদ্ধকরণের দ্বিতীয় রাউন্ডের জন্য ব্যবহার করা হয় এবং CD4-ভগ্নাংশটি পরবর্তী CD45- সমৃদ্ধকরণের জন্য ব্যবহার করা হয়। পৃথকীকরণ প্রক্রিয়া জুড়ে দ্রবণটি বরফের উপর রাখুন।
বিপাক বিশ্লেষণের জন্য নমুনা প্রস্তুত করার জন্য, কোষগুলিকে একবার বরফ-ঠান্ডা লবণের দ্রবণ দিয়ে ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল, এবং প্রতিটি নমুনায় 1 মিলি 80% মিথানল যোগ করা হয়েছিল, তারপর ঘূর্ণিঝড় এবং তরল নাইট্রোজেনে স্ন্যাপ হিমায়িত করা হয়েছিল। নমুনাগুলিকে তিনটি ফ্রিজ-থো চক্রের অধীনে রাখা হয়েছিল এবং 4°C তাপমাত্রায় 15 মিনিটের জন্য 14,000 rpm এ সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। বিপাক ধারণকারী সুপারন্যাট্যান্ট শুকিয়ে না যাওয়া পর্যন্ত বাষ্পীভূত হয়। বিপাকগুলিকে 0.03% ফর্মিক অ্যাসিডের 50 μl এ পুনরায় দ্রবীভূত করা হয়েছিল, মিশ্রিত করার জন্য ঘূর্ণিঝড় করা হয়েছিল এবং তারপর ধ্বংসাবশেষ অপসারণের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল।
উপরে বর্ণিত বিপাকীয় পদার্থ নিষ্কাশন করুন। বিপাক গবেষণার জন্য সুপারনাট্যান্টকে একটি উচ্চ কার্যকারিতা তরল ক্রোমাটোগ্রাফি বোতলে স্থানান্তর করুন। ব্যাচ প্রভাব প্রতিরোধ করার জন্য প্রতিটি নমুনাকে একই সংখ্যক কোষ দিয়ে চিকিত্সা করার জন্য একটি র্যান্ডম ট্রিটমেন্ট প্রোটোকল ব্যবহার করুন। আমরা AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) এ পূর্বে প্রকাশিত গ্লোবাল বিপাকীয় পদার্থের একটি গুণগত মূল্যায়ন করেছি। মাল্টিকোয়ান্ট সংস্করণ 2.1 সফ্টওয়্যার (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেমস SCIEX) ব্যবহার করে ক্রোমাটোগ্রাফিক বিশ্লেষণ এবং শীর্ষ অঞ্চল একীকরণ করা হয়েছিল।
অনুপস্থিত বিপাকীয় মান অনুমান করার জন্য 1000 এর একটি আয়ন গণনা ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং প্রতিটি নমুনার TIC নমুনা প্রক্রিয়াকরণ থেকে যন্ত্র বিশ্লেষণ দ্বারা প্রবর্তিত পরিবর্তনগুলি সংশোধন করার জন্য প্রতিটি সনাক্ত করা বিপাকের স্বাভাবিক শীর্ষ এলাকা গণনা করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। TIC স্বাভাবিক করার পরে, লগারিদমিক রূপান্তর এবং স্বয়ংক্রিয় আদর্শ লাইন স্কেলিং এর জন্য MetaboAnalystR(51) (ডিফল্ট প্যারামিটার) ব্যবহার করা হয়। আমরা নমুনা প্রকারের মধ্যে বিপাকীয় পার্থক্যের অনুসন্ধানমূলক বিশ্লেষণ সম্পাদন করতে vegan R প্যাকেজ সহ PCA ব্যবহার করেছি এবং রোগীদের বিশ্লেষণের জন্য আংশিক রিডানডেন্সি বিশ্লেষণ ব্যবহার করেছি। নমুনাগুলির মধ্যে ইউক্লিডীয় দূরত্ব ক্লাস্টার করার জন্য একটি তাপ মানচিত্র ডেনড্রোগ্রাম তৈরি করতে ওয়ার্ড পদ্ধতি ব্যবহার করেছি। আমরা সমগ্র কোষের ধরণ এবং মাইক্রোএনভায়রনমেন্ট জুড়ে ডিফারেনশিয়ালি প্রচুর পরিমাণে বিপাকীয় সনাক্ত করতে মানকৃত বিপাকীয় প্রাচুর্যের উপর লিমা (52) ব্যবহার করেছি। ব্যাখ্যাটি সহজ করার জন্য, আমরা মডেলটি নির্দিষ্ট করতে গ্রুপ গড় প্যারামিটার ব্যবহার করি এবং মাইক্রোএনভায়রনমেন্টে কোষের প্রকারগুলিকে প্রতিটি গ্রুপ (n = 6 গ্রুপ) হিসাবে বিবেচনা করি; তাৎপর্য পরীক্ষার জন্য, আমরা প্রতিটি বিপাকের জন্য তিনটি পুনরাবৃত্তি পরিমাপ করেছি। মিথ্যা প্রতিলিপি এড়াতে, রোগীকে লিমা নকশায় একটি বাধা হিসাবে অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল। বিভিন্ন রোগীর মধ্যে বিপাকের পার্থক্য পরীক্ষা করার জন্য, আমরা রোগীদের অন্তর্ভুক্ত করে লিমা মডেলটি একটি নির্দিষ্ট উপায়ে সামঞ্জস্য করেছি। আমরা কোষের ধরণ এবং প্যাড <0.05 (বেঞ্জামিন-হচবার্গ সংশোধন) এর মাইক্রোএনভায়রনমেন্টের মধ্যে পূর্ব-নির্দিষ্ট বৈসাদৃশ্যের তাৎপর্য প্রতিবেদন করি।
Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viability) ব্যবহার করে প্রাণশক্তি সমৃদ্ধ করার পর, 10x 5′ জিন এক্সপ্রেশন প্রোটোকল ব্যবহার করে মোট জীবন্ত হিমায়িত অ্যাসাইট এবং টিউমার নমুনার উপর একক-কোষ ট্রান্সক্রিপ্টোম সিকোয়েন্সিং করা হয়েছিল। মিলিত টিউমার এবং অ্যাসাইট সহ পাঁচটি কেস বিশ্লেষণ করা হয়েছিল, যদিও একটি টিউমার নমুনার কম viability এর অন্তর্ভুক্তিকে বাধা দেয়। রোগীদের একাধিক নির্বাচন অর্জনের জন্য, আমরা 10x ক্রোমিয়াম কন্ট্রোলারের লেনে প্রতিটি রোগীর নমুনা একত্রিত করেছি এবং অ্যাসাইট এবং টিউমার সাইটগুলি আলাদাভাবে বিশ্লেষণ করেছি। সিকোয়েন্সিংয়ের পরে [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec জিনোম; টিউমার এবং অ্যাসাইটসের জন্য প্রতি কোষে গড়ে 73,488 এবং 41,378 রিড]], আমরা CellSNP এবং Vireo (53) ব্যবহার করেছি (CellSNP এর উপর ভিত্তি করে GRCh38 দ্বারা প্রদত্ত সাধারণ মানব SNP (VCF) একটি দাতার পরিচয় নির্ধারণ করে। আমরা রোগীর জিনোটাইপ স্ট্যাটাসের (IBS) নিকটতম পরিচয় (IBS) নির্ণয় করতে SNPRelate ব্যবহার করি, অনির্ধারিত কোষ এবং ডুপ্লেক্স হিসাবে চিহ্নিত কোষগুলি বাদ দিয়ে এবং অ্যাসাইট এবং টিউমার নমুনার মধ্যে দাতাদের মিল (54)। এই কাজের ভিত্তিতে, আমরা ডাউনস্ট্রিম বিশ্লেষণের জন্য টিউমার এবং অ্যাসাইটসে প্রচুর কোষ প্রতিনিধিত্ব সহ তিনটি কেস ধরে রেখেছি। স্ক্যাটার (55) এবং স্ক্রান (56) বায়োকন্ডাক্টর প্যাকেজিংয়ে একটি ভর পরিস্রাবণ পদক্ষেপ সম্পাদন করার পরে, বিশ্লেষণের জন্য এটি 6975 কোষ (যথাক্রমে টিউমার এবং অ্যাসাইট থেকে 2792 এবং 4183 কোষ) পেয়েছে। আমরা শেয়ার্ড নেজারস্ট নেবারহোবার নেটওয়ার্ক (SNN) এর igraph's (57) Louvain ক্লাস্টারিং ব্যবহার করি জ্যাকার্ড কোষ থেকে ক্লাস্টারের দূরত্ব প্রকাশের মাধ্যমে। মার্কার জিনের প্রকাশের উপর ভিত্তি করে ক্লাস্টারগুলিকে ম্যানুয়ালি পুটেটিভ কোষের ধরণে টীকা দেওয়া হয়েছিল এবং t-SNE দিয়ে ভিজ্যুয়ালাইজ করা হয়েছিল। সাইটোটক্সিক টি কোষগুলি CD8A এবং GZMA এর প্রকাশ দ্বারা সংজ্ঞায়িত করা হয়, কম রাইবোসোমাল প্রোটিন প্রকাশের সাবক্লাস্টারগুলি বাদ দিয়ে। আমরা Izar et al. (16) এর প্রকাশিত ডেটা অ্যাক্সেস করেছি, যার মধ্যে তাদের t-SNE এমবেডিং অন্তর্ভুক্ত রয়েছে, যা ইমিউন কোষ মার্কার এবং NNMT প্রকাশের মধ্যে প্রকাশ ওভারল্যাপ নিয়ন্ত্রণ করতে পারে।
Ficoll গ্রেডিয়েন্ট ডেনসিটি সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে PBMC কে লিউকোসাইট সেপারেশন প্রোডাক্ট (STEMCELL Technologies) থেকে আলাদা করা হয়েছিল। CD3 পুঁতি (Miltenyi) ব্যবহার করে PBMC থেকে CD3 + কোষগুলিকে আলাদা করা হয়েছিল। MNA এর উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিতে, CD3+ কোষগুলিকে প্লেট-বাউন্ড CD3 (5μg/ml), দ্রবণীয় CD28 (3μg/ml) এবং IL-2 (300 U/ml; Proleukin) দিয়ে সক্রিয় করা হয়েছিল। সম্প্রসারণের শেষ দিনে, কার্যকারিতা (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) এবং বিস্তার (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) প্রবাহ সাইটোমেট্রি দ্বারা মূল্যায়ন করা হয়েছিল। GolgiStop দিয়ে ৪ ঘন্টা ধরে PMA (২০ ng/ml) এবং ionomycin (১μg/ml) দিয়ে কোষগুলিকে উদ্দীপিত করে ইফেক্টর ফাংশন মূল্যায়ন করুন এবং CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) এবং TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD) পর্যবেক্ষণ করুন। ৪ ঘন্টা ধরে PMA (২০ ng/ml) এবং ionomycin (১μg/ml) দিয়ে qPCR এবং ChIP কোষগুলিকে উদ্দীপিত করুন। PMA (২০ ng/ml) এবং ionomycin (১ μg/ml) দিয়ে ৪ ঘন্টা ধরে উদ্দীপনার আগে এবং পরে ELISA সুপারনাট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল।
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ব্যবহার করে RNA বিচ্ছিন্ন করার জন্য প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসরণ করুন। নমুনাকে একজাত করতে QIAshredder (QIAGEN) ব্যবহার করুন। পরিপূরক DNA (cDNA) সংশ্লেষণের জন্য cDNA কিটে উচ্চ-ক্ষমতার RNA (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করুন। নিম্নলিখিত প্রোবগুলির সাহায্যে জিনের প্রকাশ (নির্মাতার প্রোটোকল অনুসারে) পরিমাপ করতে TaqMan Rapid Advanced Master Mix (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করুন: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [গ্লিসারালডিহাইড-3-ফসফেট অফ হাইড্রোজেন (GAPDH)] এবং Hs01010726_m1 (SLC22A2)। নমুনাগুলি StepOnePlus রিয়েল-টাইম PCR সিস্টেম (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেমস) (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেমস) -এ MicroAmp ফাস্ট অপটিক্যাল 96-ওয়েল রিঅ্যাকশন প্লেটে (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেমস) মাইক্রোঅ্যাম্প অপটিক্যাল ফিল্ম সহ চালানো হয়েছিল। যেকোনো Ct মান যা 35 এর বেশি হয় তা সনাক্তকরণ থ্রেশহোল্ডের উপরে বলে বিবেচিত হয় এবং সনাক্তকরণযোগ্য নয় বলে চিহ্নিত করা হয়।
পূর্বে বর্ণিত (58) পদ্ধতিতে ChIP করুন। সংক্ষেপে, কোষগুলিকে ফর্মালডিহাইড (চূড়ান্ত ঘনত্ব 1.42%) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং 10 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করা হয়েছিল। 10 মিনিটের জন্য বরফের উপর সম্পূরক ফোলা বাফার (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl এবং 0.1% NP-40) ব্যবহার করুন, তারপর বর্ণিত (58) পদ্ধতিতে ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন বাফারে পুনরায় সাসপেন্ড করুন। এরপর নমুনাটি নিম্নলিখিত চক্রের সাথে সোনিকেটেড করা হয়েছিল: 10 চক্র (20 1-সেকেন্ড পালস) এবং 40 সেকেন্ডের একটি স্ট্যাটিক সময়। নমুনার সাথে ChIP-গ্রেড ইমিউনোগ্লোবুলিন G (কোষ সংকেত প্রযুক্তি; 1μl), হিস্টোন H3 (কোষ সংকেত প্রযুক্তি; 3μl), NFAT (ইনভিট্রোজেন; 3μl) এবং SP1 (কোষ সংকেত প্রযুক্তি; 3μl) অ্যান্টিবডিগুলিকে 4°CC তাপমাত্রায় রাতারাতি ঝাঁকান। ৪°C তাপমাত্রায় নমুনাটি ১ ঘন্টা ধরে হালকা ঝাঁকান এবং প্রোটিন A বিডস (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ইনকিউবেট করুন, তারপর DNA সমৃদ্ধ করার জন্য চেলেক্স বিডস (বায়ো-র‍্যাড) ব্যবহার করুন এবং প্রোটিন হজমের জন্য প্রোটিনেজ K (থার্মো ফিশার) ব্যবহার করুন। TNFα প্রোমোটার PCR দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল: ফরোয়ার্ড, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; বিপরীতে, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp পণ্য)। ছবিগুলি Image Lab (Bio-Rad) দ্বারা তৈরি করা হয়েছিল এবং ImageJ সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল।
উপরে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে কোষ সংস্কৃতি সুপারনাট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল। মানব TNFα ELISA কিট (ইনভিট্রোজেন), মানব IL-2 ELISA কিট (ইনভিট্রোজেন) এবং মানব IFN-γ ELISA কিট (অ্যাবক্যাম) এর নির্মাতার পদ্ধতি অনুসারে নির্ধারণ করা হয়েছিল। নির্মাতার প্রোটোকল অনুসারে, TNFα এবং IL-2 সনাক্ত করার জন্য সুপারনাট্যান্টকে 1:100 এবং IFN-γ সনাক্ত করার জন্য 1:3 পাতলা করা হয়েছিল। 450 nm এ শোষণ পরিমাপ করতে EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) ব্যবহার করুন।
Ficoll গ্রেডিয়েন্ট ডেনসিটি সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে লিউকোসাইট সেপারেশন প্রোডাক্ট (STEMCELL টেকনোলজিস) থেকে PBMC আলাদা করা হয়েছিল। CD3 বিডস (Miltenyi) ব্যবহার করে CD3 + কোষগুলিকে PBMC থেকে আলাদা করা হয়েছিল। MNA এর উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিতে, CD3+ কোষগুলিকে প্লেট-বাউন্ড CD3 (5μg/ml), দ্রবণীয় CD28 (3μg/ml) এবং IL-2 (300 U/ml; Proleukin) দিয়ে 3 দিনের জন্য সক্রিয় করা হয়েছিল। 3 দিন পরে, কোষগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং 0.9% স্যালাইন দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল, এবং পেলেটটি স্ন্যাপ ফ্রোজেন করা হয়েছিল। 123count eBeads ব্যবহার করে ফ্লো সাইটোমেট্রি (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R কনফিগারেশন) দ্বারা কোষ গণনা করা হয়েছিল।
উপরে বর্ণিত বিপাকীয় পদার্থ নির্যাস। শুকনো নির্যাসটি 4000 কোষ সমতুল্য/μl ঘনত্বে পুনর্গঠিত হয়েছিল। বিপরীত-পর্যায়ের ক্রোমাটোগ্রাফি (1290 ইনফিনিটি II, অ্যাজিলেন্ট টেকনোলজিস, সান্তা ক্লারা, CA) এবং CORTECS T3 কলাম (2.1×150 মিমি, কণার আকার 1.6-μm, ছিদ্রের আকার 120-Å; #186008500, ওয়াটার্স) দ্বারা নমুনাটি বিশ্লেষণ করুন। পোলার ভর স্পেকট্রোমিটার (6470, অ্যাজিলেন্ট), যেখানে ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়নীকরণ ধনাত্মক মোডে কাজ করে। মোবাইল ফেজ A হল 0.1% ফর্মিক অ্যাসিড (H2O তে), মোবাইল ফেজ B হল 90% অ্যাসিটোনিট্রাইল, 0.1% ফর্মিক অ্যাসিড। ১০০% A এর জন্য LC গ্রেডিয়েন্ট ০ থেকে ২ মিনিট, ৯৯% B এর জন্য ২ থেকে ৭.১ মিনিট এবং ৯৯% B এর জন্য ৭.১ থেকে ৮ মিনিট। তারপর ৩ মিনিটের জন্য ০.৬ মিলি/মিনিট প্রবাহ হারে মোবাইল ফেজ A দিয়ে কলামটিকে পুনরায় ভারসাম্যপূর্ণ করুন। । প্রবাহ হার ০.৪ মিলি/মিনিট, এবং কলাম চেম্বারটি ৫০°C তাপমাত্রায় উত্তপ্ত করা হয়। ধারণ সময় (RT) এবং রূপান্তর (RT = 0.882 মিনিট, রূপান্তর 1 = 137→94.1, রূপান্তর 2 = 137→92, রূপান্তর 3 = 137→78) স্থাপন করতে MNA এর বিশুদ্ধ রাসায়নিক মান (M320995, টরন্টো রিসার্চ কেমিক্যাল কোম্পানি, নর্থ ইয়র্ক, অন্টারিও, কানাডা) ব্যবহার করুন। যখন তিনটি রূপান্তরই সঠিক ধারণ সময়ে ঘটে, তখন নির্দিষ্টতা নিশ্চিত করার জন্য পরিমাণ নির্ধারণের জন্য ট্রানজিশন 1 ব্যবহার করা হয়। MNA (টরন্টো রিসার্চ কেমিক্যাল কোম্পানি) এর স্ট্যান্ডার্ড কার্ভ স্টক দ্রবণের (1 mg/ml) ছয়টি সিরিয়াল ডিলিউশন দ্বারা তৈরি করা হয়েছিল যাতে যথাক্রমে 0.1, 1.0, 10 এবং 100 ng/ml এবং 1.0 এবং 10μg/ml তরল মান পাওয়া যায়। সনাক্তকরণ সীমা হল 1 ng/ml, এবং রৈখিক প্রতিক্রিয়া 10 ng/ml এবং 10μg/ml এর মধ্যে। LC/MS বিশ্লেষণের জন্য দুটি মাইক্রোলিটার নমুনা এবং স্ট্যান্ডার্ডের প্রতিটি ইনজেকশন ব্যবহার করা হয় এবং বিশ্লেষণ প্ল্যাটফর্মের স্থিতিশীলতা নিশ্চিত করার জন্য প্রতি আটটি ইনজেকশনে একটি মিশ্র মান নিয়ন্ত্রণ নমুনা চালানো হয়। সমস্ত MNA-চিকিত্সা করা কোষের নমুনার MNA প্রতিক্রিয়াগুলি পরীক্ষার রৈখিক পরিসরের মধ্যে ছিল। MassHunter পরিমাণগত বিশ্লেষণ সফ্টওয়্যার (v9.0, Agilent) ব্যবহার করে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
দ্বিতীয় প্রজন্মের αFR-CAR গঠনটি Song et al. (59) থেকে নেওয়া হয়েছে। সংক্ষেপে, গঠনটিতে নিম্নলিখিত বিষয়বস্তু রয়েছে: CD8a লিডার সিকোয়েন্স, মানব αFR-নির্দিষ্ট একক-চেইন ভেরিয়েবল ফ্র্যাগমেন্ট, CD8a হিঞ্জ এবং ট্রান্সমেমব্রেন অঞ্চল, CD27 অন্তঃকোষীয় ডোমেন এবং CD3z অন্তঃকোষীয় ডোমেন। সম্পূর্ণ CAR ক্রমটি GenScript দ্বারা সংশ্লেষিত করা হয়েছিল, এবং তারপর ট্রান্সডাকশন দক্ষতা মূল্যায়নের জন্য ব্যবহৃত GFP এক্সপ্রেশন ক্যাসেটের আপস্ট্রিমের দ্বিতীয় প্রজন্মের লেন্টিভাইরাল এক্সপ্রেশন ভেক্টরে ক্লোন করা হয়েছিল।
HEK293T কোষের [আমেরিকান টাইপ কালচার কালেকশন (ATCC)] ট্রান্সফেকশনের মাধ্যমে লেন্টিভাইরাস উৎপন্ন হয়; ডালবেকোর পরিবর্তিত ঈগল মাধ্যমে জন্মানো হয় যার মধ্যে 10% ভ্রূণ বোভাইন সিরাম (FBS) এবং 1% পেনস্ট্রেপ থাকে এবং CAR-GFP ভেক্টর ব্যবহার করা হয় এবং প্যাকেজিং প্লাজমিড (psPAX2 এবং pMD2.G, Addgene) লাইপোফেকশন অ্যামাইন (সিগমা-অ্যালড্রিচ) ব্যবহার করে। ভাইরাস-ধারণকারী সুপারনাট্যান্ট ট্রান্সফেকশনের 48 এবং 72 ঘন্টা পরে সংগ্রহ করা হয়, ফিল্টার করা হয় এবং আল্ট্রাসেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা ঘনীভূত করা হয়। ট্রান্সডাকশন না হওয়া পর্যন্ত ঘনীভূত ভাইরাল সুপারনাট্যান্ট -80°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করুন।
Ficoll গ্রেডিয়েন্ট ডেনসিটি সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে PBMC কে সুস্থ দাতা লিউকোসাইট বিচ্ছেদ পণ্য (STEMCELL টেকনোলজিস) থেকে আলাদা করা হয়। PBMC থেকে CD8+ কোষ আলাদা করতে পজিটিভ সিলেকশন CD8 মাইক্রোবিড (Miltenyi) ব্যবহার করুন। TransAct (Miltenyi) দিয়ে এবং TexMACS মাধ্যমে T কোষগুলিকে উদ্দীপিত করুন [Miltenyi; 3% তাপ-নিষ্ক্রিয় মানব সিরাম, 1% PenStrep এবং IL-2 (300 U/ml) দিয়ে পরিপূরক]। উদ্দীপনার চব্বিশ ঘন্টা পরে, T কোষগুলিকে লেন্টিভাইরাস (প্রতি 106 কোষে 10 μl ঘনীভূত ভাইরাস সুপারনাট্যান্ট) দিয়ে ট্রান্সডিউস করা হয়েছিল। Cytek Aurora (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+-এ ট্রান্সডাকশনের 1 থেকে 3 দিন পরে), কোষগুলির GFP এক্সপ্রেশন মূল্যায়ন করুন যাতে কমপক্ষে 30% ট্রান্সডাকশন দক্ষতা প্রদর্শন করা যায়।
CAR-T কোষগুলিকে Immunocult (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep দিয়ে পরিপূরক) 24 ঘন্টা ধরে নিম্নলিখিত অবস্থার অধীনে কালচার করা হয়েছিল: চিকিৎসা না করা, 250 μM অ্যাডেনোসিন বা 10 mM MNA দিয়ে চিকিত্সা করা। প্রিট্রিটমেন্টের পরে, CAR-T কোষগুলিকে PBS দিয়ে ধুয়ে 20,000 SK-OV-3 কোষের সাথে মিলিত করা হয়েছিল [ATCC; McCoy 5A মাধ্যমের (Sigma-Aldrich) 10% FBS এবং 10% PenStrep দিয়ে পরিপূরক করা হয়েছিল: 1 এর ইফেক্টর থেকে লক্ষ্য অনুপাতকে সম্পূরক Immunocult মাধ্যমের ট্রিপ্লিকেটে প্রশস্ত করা হয়েছিল। SK-OV-3 কোষ এবং SK-OV-3 কোষগুলিকে ডিজিটালিস স্যাপোনিন (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) দিয়ে লিজ করা হয়েছিল যথাক্রমে নেতিবাচক এবং ধনাত্মক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে। ২৪ ঘন্টা সহ-চাষের পর, সুপারনেট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে ল্যাকটেট ডিহাইড্রোজেনেস (LDH) পরিমাপ করা হয়েছিল (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega)। LDH সুপারনেট্যান্টকে LDH বাফারে ১:৫০ মিশ্রিত করা হয়েছিল। হত্যার শতাংশ নিম্নলিখিত সূত্র ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল: হত্যার শতাংশ = সংশোধনের শতাংশ / সর্বাধিক হত্যার হার x ১০০%, যেখানে সংশোধনের শতাংশ = শুধুমাত্র সহ-সংস্কৃতি-T কোষ, এবং সর্বাধিক হত্যার হার = ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ-নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ।
টেক্সট বা উপকরণ এবং পদ্ধতিতে বর্ণিত হিসাবে, পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণের জন্য গ্রাফপ্যাড প্রিজম 8, মাইক্রোসফ্ট এক্সেল বা R v3.6.0 ব্যবহার করুন। যদি একই রোগীর (যেমন অ্যাসাইট এবং টিউমার) একাধিক নমুনা সংগ্রহ করা হয়, তাহলে আমরা একটি জোড়াযুক্ত টি পরীক্ষা ব্যবহার করি অথবা রোগীকে যথাযথভাবে একটি রৈখিক বা সাধারণীকৃত মডেলে র্যান্ডম প্রভাব হিসাবে অন্তর্ভুক্ত করি। বিপাক বিশ্লেষণের জন্য, গুরুত্ব পরীক্ষাটি তিনটি প্রতিলিপিতে সঞ্চালিত হয়।
এই প্রবন্ধের জন্য সম্পূরক উপকরণের জন্য, অনুগ্রহ করে http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 দেখুন।
এটি একটি উন্মুক্ত প্রবেশাধিকার নিবন্ধ যা ক্রিয়েটিভ কমন্স অ্যাট্রিবিউশন-নন-কমার্শিয়াল লাইসেন্সের শর্তাবলীর অধীনে বিতরণ করা হয়েছে, যা যেকোনো মাধ্যমে ব্যবহার, বিতরণ এবং পুনরুৎপাদনের অনুমতি দেয়, যতক্ষণ না চূড়ান্ত ব্যবহার বাণিজ্যিক লাভের জন্য না হয় এবং মূল কাজটি সঠিক বলে মনে করা হয়। তথ্যসূত্র।
দ্রষ্টব্য: আমরা আপনাকে কেবল আপনার ইমেল ঠিকানাটি সরবরাহ করতে বলব যাতে আপনি পৃষ্ঠাটিতে যাকে সুপারিশ করবেন তিনি জানেন যে আপনি চান যে তারা ইমেলটি দেখুক এবং এটি স্প্যাম নয়। আমরা কোনও ইমেল ঠিকানা ক্যাপচার করব না।
এই প্রশ্নটি আপনি একজন ভিজিটর কিনা তা পরীক্ষা করতে এবং স্বয়ংক্রিয় স্প্যাম জমা প্রতিরোধ করতে ব্যবহৃত হয়।
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Luren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. N. R. B. J. R. B.), ব্র্যাড এইচ. DeBerardinis), রাসেল জি. জোন্স (রাসেল জি. জোন্স), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA টি কোষের রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা দমনে অবদান রাখে এবং মানুষের ক্যান্সারের চিকিৎসার জন্য একটি সম্ভাব্য ইমিউনোথেরাপি লক্ষ্যের প্রতিনিধিত্ব করে।
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Luren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. N. R. B. J. R. B.), ব্র্যাড এইচ. DeBerardinis), রাসেল জি. জোন্স (রাসেল জি. জোন্স), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA টি কোষের রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা দমনে অবদান রাখে এবং মানুষের ক্যান্সারের চিকিৎসার জন্য একটি সম্ভাব্য ইমিউনোথেরাপি লক্ষ্যের প্রতিনিধিত্ব করে।
©2021 আমেরিকান অ্যাসোসিয়েশন ফর দ্য অ্যাডভান্সমেন্ট অফ সায়েন্স। সমস্ত অধিকার সংরক্ষিত AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef এবং COUNTER এর অংশীদার। Science Advances ISSN 2375-2548.